Αφξθςθ κυττάρων ςε τρυβλίο. In vivo: αντίδραςθ ςε ηωντανό κφτταρο In vitro: αντίδραςθ ςε δοκιμαςτικό ςωλινα απουςία κυττάρων

Transcript

1 Τεχνολογία του DNA

2 Αφξθςθ κυττάρων ςε τρυβλίο In vivo: αντίδραςθ ςε ηωντανό κφτταρο In vitro: αντίδραςθ ςε δοκιμαςτικό ςωλινα απουςία κυττάρων

3 Ανάλυςθ DNA Κλειδί θ χριςθ ειδικϊν νουκλεαςϊν που «κόβουν» το DNA με ςυγκεκριμζνο τρόπο αναγνωρίηοντασ ςυγκεκριμζνθ αλλθλουχία 4-8 τυπικά βάςεων Ονομάηονται νουκλεάςεσ περιοριςμοφ (restriction nucleases)

4 Νουκλεάςεσ περιοριςμοφ

5 Ηλεκτροφόρθςθ ςε πθκτι (gel electrophoresis) Πθκτι αγαρόηθσ ι πολυακρυλαμίδθσ Τα κομμάτια DNA είναι αρνθτικά φορτιςμζνα και κινοφνται προσ το κετικό θλεκτρόδιο με ταχφτθτα που εξαρτάται από το μζγεκόσ τουσ (τα μεγαλφτερα βραδφτερα) Ανιχνεφονται με τθν προςκικθ χρωςτικισ που φκορίηει ι με ιςότοπα και αυτοραδιογραφία

6 Ηλεκτροφόρθςθ ςε πθκτι

7 Κακοριςμόσ τθσ αλλθλουχίασ των βάςεων (DNA sequencing) Μζκοδοσ των διδεοξυριβονουκλεοςιδίων Αντιγραφι μονοκλωνικοφ αντιγράφου του DNA in vitro παρουςία DNA πολυμεράςθσ, εκκινθτι, τριφωςφορικϊν δεοξυριβονουκλεοςιδίων, και μικρισ ποςότθτασ διδεοξυριβονουκλεοςιδίων ενόσ μόνο τφπου (A,G,C,T). Τα τελευταία προκαλοφν πρόωρο τερματιςμό Ηλεκτροφόρθςθ ςε πθκτι επιτρζπει απζυκείασ τθν ανάγνωςθ τθσ αλλθλουχίασ!

8 DNA sequencing

9 Υβριδιςμόσ νουκλεϊνικϊν οξζων Αναδιάταξθ ομόλογων αλλθλουχιϊν

10 Ανιχνευτισ (probe) Βραχφ μονόκλωνο μόριο DNA με μικοσ νουκλεοτίδια που χρθςιμοποιείται για τθν ανίχνευςθ μορίων DNA με ςυμπλθρωματικι αλλθλουχία Πλζον υπάρχουν μθχανιματα που παράγουν ανιχνευτζσ κατά παραγγελία Εφαρμογι π.χ. ςτθν διάγνωςθ τθσ δρεπανοκυτταρικισ αναιμίασ

11

12 Υβριδιςμόσ ςε μικροςυςτοιχίεσ Χρθςιμοποιοφνται για εκτίμθςθ τθσ ζκφραςθσ των γονιδίων (mrna) Γυάλινεσ πλάκεσ με χιλιάδεσ ανιχνευτζσ με διαφορετικζσ αλλθλουχίεσ Η ζνταςθ του φκοριςμοφ εκτιμά τθν ζνταςθ τθσ ζκφραςθσ

13 Μικροςυςτοιχίεσ

14 Κλωνοποίθςθ του DNA Παραγωγι πολλϊν ταυτόςθμων αντιγράφων DNA

15 φυςικζσ τροποποιιςεισ DNA Τα κφτταρα μποροφν κάτω από οριςμζνεσ προχποκζςεισ να απορροφιςουν εξωτερικό ελεφκερο DNA. Αυτι θ διεργαςία ονομάηεται μεταςχθματιςμόσ (transformation). Επίςθσ εκτόσ από το κυτταρικό DNA πολφ οργανιςμοί περιζχουν πλαςμίδια, δθλαδι μικρά κυκλικά τεμάχια DNA που ςυχνά περιζχουν τθν πλθροφορία που απαιτείται για να ανκίςτανται οι οργανιςμοί ςε αντιβιοτικά. Τα πλαςμίδια αντιγράφονται ανεξάρτθτα από το κυτταρικό DNA και ειςάγονται ςτα κφτταρα με μεταςχθματιςμό.

16 Άλλεσ φυςικζσ τροποποιιςεισ DNA Τζλοσ ςε οριςμζνεσ περιςτάςεισ μπορεί να παρατθρθκεί συνένωση (fusion) δφο διαφορετικϊν κυττάρων που να ςχθματίηει ζνα νζο τφπο ολοκλθρωμζνου κυττάρου το οποίο ονομάηεται υβρίδωμα. Η διεργαςία αυτι βρίςκει ιδιαίτερθ εφαρμογι ςτθν παραγωγι μονοκλωνικών αντιςωμάτων.

17 ΣΕΧΝΗΣΗ ΣΡΟΠΟΠΟΙΗΗ ΣΟΤ DNA - ΓΕΝΕΣΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Τα τελευταία χρόνια ζχει επζλκει πραγματικι επανάςταςθ ςτον χϊρο τθσ Βιοτεχνολογίασ λόγω τθσ ανάπτυξθσ τθσ ονομαηόμενθσ γενετικισ μθχανικισ ι τεχνολογίασ αναςυνδυαςμζνου DNA. Έτςι ζχει καταςτεί ικανι θ παραγωγι π.χ. ανκρϊπινθσ ινςουλίνθσ (ορμόνθσ) από βακτιρια. Η όλθ ιδζα ζγκειται ςτθ μεταφορά και ενςωμάτωςθ κάποιου γόνου από ζναν οργανιςμό ςε άλλο, ο οποίοσ πλζον ζχει τθν ικανότθτα να τον εκφράηει.

18 Αυξότροφοι ΑΠΑΡΣΙΚΟ ΟΞΤ ΑΠΑΡΣΙΚΗ ΗΜΙΑΛΔΕΫΔΗ Χ ΛΤΙΝΗ ΘΡΕΟΝΙΝΗ Τόςο θ Θρεονίνθ όςο και θ Λυςίνθ παρεμποδίηουν τθν παραγωγι τουσ ρυκμίηοντασ τθν ενεργότθτα του πρϊτου ενηφμου του δικτφου. Ένασ αυξοτροφικόσ οργανιςμόσ (προϊόν μετάλλαξθσ) που ςτερείται του ενηφμου για τθν ςφνκεςθ τθσ Θρεονίνθσ, παράγει αυξθμζνεσ ποςότθτεσ Λυςίνθσ, αλλά απαιτεί προςκικθ Θρεονίνθσ ςτο κρεπτικό μζςο.

19 Αναςυνδυαςμόσ DNA (α) στον σωλήνα (β) με τη καλλιέπγεια 1. Απομονϊνουμε το ξζνο DNA. 2. Παίρνουμε ζνα πλαςμίδιο ι άλλο φορέα και κάνουμε μία τομι. 3. Προςκζτουμε το ξζνο DNA και το ςυνενϊνουμε (αναςυνδυάηουμε) με τον φορζα, παράγοντασ ζτςι αναςυνδυαςμζνο DNA. 1. Ειςάγουμε με μεταςχθματιςμό το αναςυνδυαςμζνο DNA ςτον ξενιστή οργανισμό. 2. Αναπτφςςουμε τθν αναςυνδυαςμζνθ καλλιζργεια εκφράηοντασ τον ξζνο γόνο.

20 ΕΡΓΑΛΕΙΑ: 1. Νοσθιεάσες περηορησκού, οη οποίες αλαγλωρίδοσλ θαη θόβοσλ το DNA σε σσγθεθρηκέλα σεκεία. Έτση π.τ. ε λοσθιεάσε ECORI τοσ E.Coli επηυέρεη τελ αθόιοσζε θοπή: ενδονουκλεάζη

21 2. DNA λιγκάςθ, που χρθςιμεφει ςτθν ςυνζνωςθ (κόλλθμα) κομματιϊν DNA που ζχουν πάρει κζςθ με ηευγάρωμα βάςεων. 3. DNA πολυμεράςθ, που χρθςιμεφει ςτθν παραςκευι διπλοφ κλϊνου DNA. 4. Αντίςτροφθ Τρανςκριπτάςθ, που χρθςιμεφει ςτθν παραςκευι DNA από μινυμα RNA. 5. Τερματικι Τρανςφεράςθ, που προςκζτει ομοιοπολυμερικζσ ουρζσ (-AAAAAAΑΑΑΑ ι - TTTTTT)

22 Φορζασ, δθλαδι κάποιο μόριο DNA που να επιτρζπει τθν διάδοςθ ξζνου τμιματοσ DNA ςε αναπτυςςόμενθ καλλιζργεια. Οι απαιτοφμενεσ ιδιότθτεσ είναι: 1. Πρζπει να ζχει τθν ικανότθτα αντιγραφισ ςτον ξενιςτι οργανιςμό. 2. Πρζπει να ζχει τθν ικανότθτα ενςωμάτωςθσ ξζνων γόνων διαφόρων διαςτάςεων χωρίσ βλάβθ τθσ αντιγραφικισ ικανότθτασ. 3. Πρζπει να ειςζρχεται εφκολα ςτο κφτταρο-ξενιςτι (μεταςχθματιςμόσ) μετά τουσ χειριςμοφσ in vitro (ςτον δοκιμαςτικό ςωλινα). 4. Πρζπει να περιζχει κάποιο ςθματοδότθ επιλογισ που να επιτρζπει τθν εφκολθ και γριγορθ επιλογι των οργανιςμϊν που τον περιζχουν. 5. Πρζπει να ζχει μία μόνο κζςθ κοπισ για μία ι περιςςότερεσ ενδονουκλεάςεσ υψθλισ εξειδίκευςθσ. Πλαςμίδια είναι οι ςυνικεισ φορείσ.

23 Πλαςμίδιο pbr322 Γόνορ αντίστασηρ κατά amp Θέσειρ κοπήρ από ECORI από BamHI Γόνορ αντίστασηρ PBR322 κατά tet έναπξη αντιγπαυήρ

24

25 Πλαςμίδιο pbr322 ζχει ςθμείο ζναρξθσ αντιγραφισ και μπορεί να αντιγραφεί (πολλαπλαςιαςτεί) ανεξάρτθτα μζςα ςτο κφτταρο. ζχει δφο ςθματοδότεσ επιλογισ, δθλαδι δφο γόνουσ που προςδίνουν ςτον οργανιςμό που φζρει το πλαςμίδιο αντίςταςθ κατά των αντιβιοτικϊν Τετρακυκλίνθ και Αμπιςιλίνθ. ζχει δφο κζςεισ για ενδονουκλεάςεσ, μία για τθν ECORI και μία για τθν BamHI.

26 Αρικμόσ αντιγράφων (copy number) Tα πλαςμίδια μποροφν να αντιγράφονται ανεξάρτθτα από το κυτταρικό DNA, οπότε μποροφμε να ζχουμε πολλά αντίγραφα ανά κφτταρο, π.χ. 30. Ο αρικμόσ αντιγράφων μπορεί να αυξθκεί ζωσ και 1000 προςκζτοντασ χλωραμφενικόλθ, μία ουςία που αναςτζλλει τθν πρωτεϊνοςφνκεςθ. Στθν επιλογι φορζα είναι ςυχνά δυνατόν να χρθςιμοποιθκεί ρυκμιηόμενοσ υποκινθτισ, που μπορεί να τεκεί εντόσ και εκτόσ λειτουργίασ με κάποια μεταβολι ςτο περιβάλλον (π.χ. προςκικθ διεγζρτθ, αλλαγι κερμοκραςίασ κ.λ.π.)

27 Ξενιςτισ οργανιςμόσ (Host) Ο πιο ςυνθκιςμζνοσ είναι το E.Coli. Ένα πρόβλθμα που ςυχνά παρατθρείται όταν επικυμοφμε να εκφράςουμε ζναν ευκαρυωτικό γόνο ςε ζνα προκαρυωτικό ξενιςτι είναι το ότι ο τελευταίοσ δεν είναι ςε κζςθ να κάνει τθν απαιτοφμενθ απάλειψθ για να παραχκεί ϊριμο DNA (χωρίσ ιντρόνια).

28 Ξενιςτισ οργανιςμόσ (Host) Αν λοιπόν ο ξζνοσ γόνοσ περιζχει ιντρόνια, τότε ο ξενιςτισ αδυνατεί να τον εκφράςει. Αυτό το πρόβλθμα πλζον αντιμετωπίηεται με δφο τρόπουσ 1. απ' ευκείασ χθμικι ςφνκεςθ τθσ επικυμθτισ ςειράσ νουκλεοτιδίων 2. χριςθ αντίςτροφθσ μεταγραφάςθσ για τθν παραγωγι τθσ επικυμθτισ ςειράσ από ϊριμο μινυμα RNA. Άλλοι εναλλακτικοί ξενιςτζσ όπωσ μφκθτεσ κ.λ.π. χρθςιμοποιοφνται πλζον κακθμερινά.

29

30 Αλυςιδωτι αντίδραςθ πολυμεράςθσ (polymerase chain reaction) PCR In vitro πολλαπλαςιαςμόσ ενόσ τμιματοσ DNA που ζχει ςυμπλθρωματικι ακολουκία ενόσ εκκινθτι Έτςι πολλαπλαςιάηονται μόνο τα τμιματα που ζχουν τθ ςυγκεκριμζνθ αλλθλουχία Εφαρμογζσ ςτθν ιατρικι και ςτθν ιατροδικαςτικι

31

32 Ταυτοποίθςθ DNA

33 Προβλιματα επιλογισ ξενιςτι (α) Οι νουκλεάςεσ (ζνηυμα που διαςποφν νουκλεϊνικά οξζα) του ξενιςτι μπορεί να προςβάλουν τον ξζνο γόνο. (β) Μπορεί να παρατθρθκεί δυςλειτουργία του ςυςτιματοσ αντιγραφισ του φορζα. (γ) Πικανά χαμθλι ενεργότθτα του υποκινθτι ι τθσ τερμάτωςθσ μεταγραφισ. (δ) Μθ πλιρθ απάλειψθ RNA (για ευκαρυωτικοφσ ξενιςτζσ). (ε) Μθ αποδοτικι μετάφραςθ. (ςτ) Προςβολι των ξζνων πρωτεϊνϊν από πρωτεάςεσ (ζνηυμα που διαςποφν πρωτεΐνεσ) του ξενιςτι.

34 Γενικά είναι δυνατόν θ παραγωγι μιασ ξζνθσ πρωτείνθσ από αναςυνδυαςμζνο ξενιςτι να ανζλκει ςτο 70% τθσ ςυνολικισ παραγωγισ πρωτεϊνϊν, με τίμθμα βζβαια αργότερουσ ρυκμοφσ ανάπτυξθσ!

35 Προβλιματα που παρουςιάηουν αναςυνδυαςμζνα ςυςτιματα (ξενιςτισ -φορζασ-ξζνοσ γόνοσ) (α) Αςτάκεια Προϊόντοσ: το προϊόν πρωτεΐνθ μπορεί να διαςπαςτεί από τισ πρωτεάςεσ του ξενιςτι. Η λφςθ ςυχνά είναι θ παραςκευι ςυντθγμζνθσ πρωτεΐνθσ που να μθν υπόκειται ςε διάςπαςθ. (β) Διαχωρθτικι Αςτάκεια: δθμιουργία κυττάρων κατά τον πολλαπλαςιαςμό που ςτεροφνται πλαςμιδίων και γριγορα εκτοπίηουν τα πλαςμιδικά κφτταρα μια και αυξάνονται με ταχφτερουσ ρυκμοφσ. (γ) Δομικι Αςτάκεια: κάποια μετάλλαξθ αφαιρεί από τον οργανιςμό τθν ικανότθτα παραγωγισ του ξζνου πρωτεϊνικοφ προϊόντοσ.