Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΩΝ ADA2a, ADA2b ΚΑΙ GCN5 ΣΤΙΣ ΑΠΟΚΡΙΣΕΙΣ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΤΟ ΦΩΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΩΝ ADA2a, ADA2b ΚΑΙ GCN5 ΣΤΙΣ ΑΠΟΚΡΙΣΕΙΣ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΤΟ ΦΩΣ ΘΕΟΔΩΡΟΠΟΥΛΟΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Επιβλέπων: Λέκτορας ΒΛΑΧΟΝΑΣΙΟΣ Κ. Συνεπιβλέπουσα: Καθηγήτρια ΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ-ΚΛΑΔΑΡΑ Μ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 4 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η χρωματίνη Ακετυλτρανσφεράσες των ιστονών (ΗΑΤ) To σύμπλοκο SAGA O ρόλος των GCN5 και ADA2 στο Arabidopsis thaliana Αποκρίσεις των φυτών στο φως Ρύθμιση μεταγραφικών παραγόντων από το φως Δίκτυα φωτομορφογένεσης νεαρών φυταρίων α Φωτο-αποκρινόμενοι μεταγραφικοί παράγοντες b. Σηματοδότηση που σχετίζεται ειδικά με την ποιότητα του φωτός γ Ενσωμάτωση των σημάτων που σχετίζονται ειδικά με την ποιότητα του φωτός Ρύθμιση φωτοεπαγώμενων γονιδίων Αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις ιστονών σε φωτοεπαγώμενα γονίδια Ακετυλίωση ιστονών στη ρύθμιση των φωτοεπαγώμενων μονοπατιών Σκοπός ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Οικότυποι και μεταλλάγματα Συνθήκες ανάπτυξης των φυτών Μέτρηση της επιμήκυνσης του υποκοτυλίου Έλεγχος της έκφρασης φωτοεπαγώμενων γονιδίων Απομόνωση RNA και RT-PCR ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η φωτομορφογένεση των φυτών εξαρτάται από τη δράση των γονιδίων GCN5, ADA2a και ADA2b Η έκφραση των φωτοεπαγώμενων γονιδίων επηρεάζεται διαφορετικά από τη δράση των μεταγραφικών προσαρμοστών. 36 1

3 3.3. Οι μεταγραφικοί προσαρμοστές ρυθμίζουν την πρώιμη έκφρασης των φωτοεπαγώμενων γονιδίων Συγκριτική ανάλυση φωτορυθμιζόμενων γονιδίων και ADA2b και GCN5 εξαρτόμενων γονιδίων ΣΥΖΗΤΗΣΗ H δράση των μεταγραφικών προσαρμοστών επηρεάζουν τη φωτομορφογένεση Τα ADA2b και GCN5 δρουν ως θετικοί ρυθμιστές των φωτοεπαγώμενων γονιδίων Η έκφραση των πρώιμα φωτοεπαγώμενων γονιδίων επηρεάζεται από την δράση των ADA2a, ADA2b, GCN5 και HDA Tα ADA2b και GCN5 ρυθμίζουν ένα μέρος των φωτοεπαγώμενων γονιδίων ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ παράρτημα παράρτημα

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Προσωπικά, ευχαριστώ θερμά τον κ. Βλαχονάσιο Κωνσταντίνο, Λέκτορα του Τμήματος Βιολογίας και την κ. Χατζοπούλου-Κλαδαρά Μαργαρίτα, Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν και για τη βοήθεια τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου εργασίας, καθώς επίσης και τον κ. Μόσιαλο Γεώργιο, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας για τη συμμέτοχή του στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Ευχαριστώ επίσης, όλους τους προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές του εργαστήριου Φυσιολογίας Φυτών για την άψογη συνεργασία και τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα το μεταδιδακτορικό συνεργάτη του κ. Βλαχονάσιου, Καλδή Αθανάσιο, για την πολύτιμη βοήθεια του σε μεγάλο μέρος της εργασία αυτής. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Εφαρμοσμένη Γενετική και Βιοτεχνολογία» του Τμήματος Βιολογίας και από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας, στα πλαίσια της διακρατικής συνεργασίας Ελλάδα-Γαλλία, , #

5 ABSTRACT Histone acetylation, is a major post-translational modification of chromatin, correlated with the regulation of gene expression. In yeast GCN5 protein is a histone acetyltransferase of H3 and H2B and physically associated with ADA2 protein large transcriptional coactivator complexes, such as SAGA. Arabidopsis thaliana has one GCN5 ortholog and two ADA2 orthologs, designated ADA2a and ADA2b. In this report, we studied the effect of ADA2a, ADA2b and GCN5 on plant light responses. Using mutants, we investigated the role of the transcriptional coactivators ADA2a, ADA2b and GCN5 in hypocotyl elongation, as well as the expression patterns of lightregulated genes of plants grown under different light wavelength, and at early light reponses. We observed that ADA2a, ADA2b and GCN5 affect the hypocotyl elongtion as well as the expression of light induced genes under different light conditions. In white light, gcn5-1 and ada2b-1 mutants displayed reduced expression of light-regulated genes, in red light, only ADA2b positively regulated the expression of light-induced genes, under blue light conditions, ADA2b and GCN5 may have common as well as distinct roles acting as positive regulators of different lightinduced genes. The ADA2b gene affect negatively the early expression of CAB2, RBCS-1A, LHCB2 and LHCB4.3 light induced genes. Additionally, ADA2a, ADA2b and GCN5 act as inducers of COR6.6 gene early expression. Finally, we accomplish transcriptional analysis of gnes that are regulated by ADA2b and GCN5 to identify the light induced genes and the target genes of transcrioptional factor HY5 and GCN5. 4

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ακετυλίωση των ιστονών θεωρείται μία από τις πιο σημαντικές μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις της χρωματίνης και συσχετίζεται άμεσα με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Στη ζύμη η πρωτεΐνη GCN5 δρα ως ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών Η3 και Η2Β και συνδέεται φυσικά με την ADA2 σε μεγάλα σύμπλοκα μεταγραφικών προσαρμοστών, όπως το SAGA. Στο Arabidopsis thaliana υπάρχει μία ορθόλογη GCN5 πρωτεΐνη και δύο ορθόλογες ADA2 πρωτεΐνες, οι ADA2a και ADA2b. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η επίδραση των γονιδίων ADA2a, ADA2b και GCN5 στις αποκρίσεις των φυτών στο φως. Με τη χρήση μεταλλαγμάτων, ελέγχθηκε ο ρόλος των μεταγραφικών προσαρμοστών ADA2a, ADA2b και GCN5 στην επιμήκυνση του υποκοτυλίου, καθώς και στην έκφραση των γονίδιων CAB2, RBCS-1A, LHCB2, LHCB4.3 και COR6.6, σε φυτά που αναπτύχτηκαν σε διαφορετικά μήκη κύματος φωτός. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση που έχουν τα γονίδια ADA2a, ADA2b, GCN5 και HDA19 (HD1) κατά τα πρώιμα στάδια της επαγωγής των γονίδιων αυτών. Διαπιστώθηκε ότι το ADA2b δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της επιμήκυνσης του υποκοτυλίου στο λευκό φως, ενω τα ADA2b και GCN5 δρουν ως θετικοί ρυθμιστές της επιμήκυνσης του υποκοτυλίου στο σκοτάδι, στο κυανό και ερυθρό φως. Στο λευκό φως τα μεταλλάγματα gcn5-1 και ada2b-1 εμφανίζουν μειωμένη έκφραση των φωτοεπαγώμενων γονιδίων, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο πρωτεΐνες παίζουν θετικό ρόλο στη ρύθμισή τους. Αντίθετα στο ερυθρό φως φαίνεται πως μόνο το ADA2b διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο, ως θετικός ρυθμιστής στην έκφραση των φωτοεπαγώμενων γονιδίων. Στο κυανό φως τα γονίδια ADA2b και GCN5 έχουν κοινούς αλλά και διακριτούς ρόλους, επηρεάζοντας θετικά την έκφραση διαφορετικών γονιδίων. Μετά από 30 λεπτά από τη μεταφορά των φυτών από το σκοτάδι στο φως τα ada2b-1 εμφάνισαν παροδική αύξηση στην έκφραση των CAB2, RBCS-1A, LHCB2, και LHCB4.3 υποδηλώνοντας ότι η ADA2b δρα ως αρνητικός ρυθμιστής των πρώιμα φωτοεπαγώμενων γονιδίων. Αντίθετα, η ADA2a μπορεί να λειτουργεί ως θετικός ρυθμιστής της πρώιμης έκφρασης των CAB2 και RBCS-1A. Επιπλέον, η έκφραση του πρώιμα φωτοεπαγώμενου γονιδίου COR6.6, μειώθηκε δραματικά στα ada2a-2, ada2b-1 και gcn5-1 μεταλλάγματα υποδηλώνοντας ότι οι ADA2a, ADA2b και GCN5 δρουν ως ενεργοποιητές των πρώιμα φωτοεπαγώμενων γονιδίων. Συγκριτική ανάλυση του τρανσκριπτόματος έδειξε ότι το 40% των ada2b-1 και gcn5-1 εξαρτώμεωνων γονιδίων ήταν και φωτορυθμιζόμενα γονίδια. Οι ADA2b και GCN5 δουλεύουν σε πολλαπλά φωτορυθμιζόμενα μονοπάτια σηματοδότησης καθώς μόνο το 33% των ADA2b και GCN5-εξαρτώμενων φωτοευθμιζόμενων γονιδίων είναι στόχοι του μεταγραφικού παράγοντα HY5. Επιπρόσθετα, 15% των γονιδίων αυτών αποτελούν στόχους του GCN5 και μόνο το 5% είναι στόχοι του HY5 και της GCN5. 5

7 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Η χρωματίνη H οργάνωση της χρωματίνης των φυτών παρουσιάζει ομοιότητες με εκείνη των άλλων ευκαρυωτικών οργανισμών, όπου το DNA τυπικά απαντάται in vivo ως επαναλαμβανόμενη σειρά από νουκλεοσώματα, στην οποία 146 bp DNA περιτυλίσσονται γύρω από ένα ιστονικό οκταμερές, αποτελούμενο από δυο αντίγραφα από κάθε μία από τις ιστόνες H2A, H2B, H3, και H4 (Kornberg and Lorch, 1992). Τα νουκλεοσώματα είναι το πρώτο επίπεδο οργάνωσης της χρωματίνης, τα οποία με τη σειρά τους οργανώνονται σε υψηλότερης διαμόρφωσης δομές αυξανόμενης πολυπλοκότητας (Kornberg and Lorch, 1999), μέχρι και τα συμπυκνωμένα μεταφασικά χρωμοσώματα (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Χρωματινική δομή: από το χρωμόσωμα στις ιστόνες των νουκλεοσωμάτων (Grant-Downton and, Dickinson, 2005) H κατάλληλη ρύθμιση της χρωματίνης ενορχηστρώνει ποικίλες πυρηνικές διαδικασίες, όπως η μεταγραφή, η αντιγραφή, η επιδιόρθωση του DNA, η μίτωση και η απόπτωση. Ειδικότερα για τη μεταγραφή, η νουκλεοσωμική δομή περιορίζει την προσβασιμότητα της βασικής μεταγραφικής μηχανής και άλλων μεταγραφικών παραγόντων στο DNA. Συνεχώς εκφραζόμενα γονίδια, τόσο στα φυτά όσο και σε άλλους οργανισμούς έχουν συχνά ελεύθερες από νουκλεοσώματα περιοχές στους υποκινητές τους (Rando and Ahmad, 2007). Η έκφραση πολλών ακόμα γονιδίων ρυθμίζεται με την αλλαγή αυτών των περιορισμών που επιβάλει η χρωματίνη σε συνάρτηση με ενδογενή και εξωγενή ερεθίσματα. 6

8 Οι πρωτεΐνες, ή τα σχετιζόμενα πρωτεϊνικά σύμπλοκα, τα οποία ρυθμίζουν τη δραστικότητα της χρωματίνης, κατατάσσονται σε τουλάχιστον τρεις διαφορετικές ομάδες: (α) ΑΤP-εξαρτώμενες πρωτεΐνες αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης, οι οποίες ρυθμίζουν την κινητικότητα των ιστονών στη χρωματίνη (Varga-Weisz and Becker, 2006), (β) συνοδές πρωτεΐνες των ιστονών, οι οποίες εμπλέκονται στη συγκρότηση, αποσυγκρότηση ή αντικατάσταση των ιστονικών παραλλαγών στη χρωματίνη (Loyola and Almouzni, 2004), (γ) ένζυμα μετα-μεταφραστικής τροποποίησης, τα οποία προσθέτουν ή αφαιρούν λειτουργικές ομάδες στις ιστόνες (Nightingale et al., 2006). Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών περιλαμβάνουν την προσθήκη ή την αφαίρεση ακετυλομάδων, μεθυλομάδων ή φωσφορικών ομάδων καθώς και την αμφίδρομη μεταφορά ουβικουιτίνης και sumo πρωτεϊνών (Εικόνα 2). Μεταξύ των ενζύμων, τα οποία μεσολαβούν τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, οι πρωτεΐνες που καταλύουν την ακετυλίωση σε συγκεκριμένες λυσίνες των Ν- τελικών ακρών των ιστονών, είναι από τις καλύτερα μελετημένες τόσο σε επίπεδο λειτουργίας όσο και δομής (Hodawadekar and Marmorstein, 2007). Η ακετυλίωση των ιστονών καταλύεται από μια ομάδα ενζύμων, γνωστά ως ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών (histone acetyl-transferases HATs) και αποακετυλάσες των ιστονών (histone deacetylases HDACs). Αυτά τα ένζυμα HATs καταλύουν τη μεταφορά μιας ακετυλομάδας από μόρια ακετυλοσυνενζύμου A στις ε-αμινομάδες των λυσινών στα Ν-τελικά άκρα των ιστονών (Yang, 2004). Εικόνα 2: Τα Ν-τελικά άκρα των πυρηνικών ιστονών υπόκεινται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Οι τροποποιήσεις που σημειώνονται με τον αστερίσκο (*) έχουν προσδιοριστεί μόνο για τις ιστόνες των φυτών (Lusser et al., 2001) 7

9 Η ακετυλίωση των ιστονών είναι μία δυναμική και αναστρέψιμη διαδικασία. Από καιρό έχει συνδεθεί με αλλαγές στην χρωματίνη κατά τη μεταγραφή, τον ανασυνδυασμό και την επιδιόρθωση του DNA in vivo (Smerdon, 1991; Struhl, 1998; Bradbury, 1992). Συνδέεται κυρίως με τη μεταγραφική ενεργοποίηση (Allfrey et al., 1964), χωρίς η συσχέτιση αυτή να είναι απόλυτη. Η ακετυλίωση σε συντηρημένα κατάλοιπα λυσίνης εξουδετερώνει το θετικό τους φορτίο και μειώνει τη συγγένεια σύνδεσης των ιστονών με το DNA προωθώντας κατά αυτόν τον τρόπο την προσβασιμότητα μεταγραφικών παραγόντων στην χρωματίνη (Kuo and Allis, 1998). Η υπόθεση του ιστονικού κώδικα προτείνει ότι ο συνδυασμός των διαφορετικών ομοιοπολικών τροποποιήσεων στις λυσίνες και αργινίνες των ιστονικών ακρών παρέχουν σήματα για τη στρατολόγηση παραγόντων ρύθμισης της χρωματίνης, οι οποίοι επηρεάζουν ακολούθως τη γονιδιακή έκφραση (Jenuwein and Allis, 2001; Tse et al., 1998). Πολυάριθμοι ενεργοποιητικοί παράγοντες φέρουν την περιοχή bromodomain, η οποία αλληλεπιδρά ειδικά με ακετυλιωμένες λυσίνες (Mujtaba et al., 2004). Η ακετυλίωση των ιστονών και στα φυτά αποτελεί ένα σημαντικό ρυθμιστικό μηχανισμό για τη μεταγραφική ρύθμιση παραγόντων που συμμετέχουν είτε σε αναπτυξιακά μονοπάτια είτε στην απόκριση των φυτών σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα (Lusser et al., 2001; Verbsky and Richards, 2001). Μια σειρά παρατηρήσεων τονίζουν τη σημασία της ακετυλίωσης στη βιολογία των φυτών και τη συσχετίζουν άμεσα με τη μεταγραφική ρύθμιση ως απόκριση σε διαφορετικές συνθήκες, συμπεριλαμβανομένων της φωτοπεριόδου (Tian et al., 2003), της άνθισης (He et al., 2003; Ausin et al., 2004; Kim et al., 2004), του ωσμωτικού και οξειδωτικού στρες (Brunet et al., 2004; De Nadal et al., 2004), της γήρανσης των κυττάρων (Imai et al., 2000) και τις αποκρίσεις των φυτών στο φως (Benhamed et al., 2006; Guo et al., 2008) Ακετυλτρανσφεράσες των ιστονών (ΗΑΤ) Το πρώτο ένζυμο με δραστικότητα HAT στις ιστόνες, το p55, απομονώθηκε από την Tetrahymena και αποδείχθηκε ότι ήταν ομόλογο του μεταγραφικού προσαρμοστή 8

10 GCN5 (general control nonderepressible 5) της ζύμης. Αυτό αποτέλεσε την πρώτη σύνδεση μεταξύ της ακετυλίωσης των ιστονών και της μεταγραφικής ενεργοποίησης (Brownell and Allis, 1996). Έκτοτε, έχουν ταυτοποιηθεί πολλά HAT ένζυμα, τα οποία κατηγοριοποιούνται σε διακριτές οικογένειες (Πίνακας 1), (Carrozza et al., 2003). Στο Arabidopsis υπάρχουν τουλάχιστον 12 ομόλογα HAT ένζυμα που ανήκουν στις τέσσερις από αυτές τις οικογένειες HAT (Πίνακας 1), (Pandey et al., 2002). Πίνακας 1: Οι πέντε οικογένειες των HAT ενζύμων και τα σύμπλοκα στα οποία συμμετέχουν. HAT Σύμπλοκο HAT Λειτουργία Οργανισμός Gcn5-related N-acetyltransferases (GNAT) Gcn5* ADA, SAGA, STAGA Ακετυλίωση H3, H2Β Ευρέως διαδεδομένο Hat1* Σύμπλοκο με την Rbap48 Ακετυλίωση H4 (κυτταρόπλασμα) Ευρέως διαδεδομένο PCAF PCAF σύμπλοκο Ακετυλίωση Θηλαστικά Hpa2 Hpa2 Άγνωστη Ζύμη Elp3* Σύμπλοκο RNApol.II Ακετυλίωση Ζύμη ATF-2 Ακετυλίωση Θηλαστικά CBP/p300 CBP/p300* Συσχετιζόμενο με ρυθμιστικές πρωτεΐνες Ακετυλίωση Ευρέως διαδεδομένο Συνενεργοποιητές πυρηνικών υποδοχέων ACTR Μεταγραφικός προσαρμοστής Θηλαστικά SRC-1 Μεταγραφικός προσαρμοστής Θηλαστικά TIF2 Μεταγραφικός προσαρμοστής Θηλαστικά Οικογένεια ΗΑΤ γενικών μεταγραφικών παραγόντων TAF II 250* TFIID Παράγοντας συσχετιζόμενος με TBP Ευρέως διαδεδομένο TFIIIC (90,110,220) TFIIC σύμπλοκο Μεταγραφή από RNApol.ΙΙΙ Άνθρωπος Οικογένεια MYST Sas3 ΝuA3 Μεταγραφική καταστολή Ζύμη Esa1* NuA4 Ρύθμιση κυτταρικού κύκλου Ευρέως διαδεδομένο MOF MSL Αντιστάθμιση γονιδιακής δόσης Έντομα MOZ MOZ/MORF Κακοήθης ασθένειες Άνθρωπος Tip60* Tip60 Αλληλεπίδραση με HIV-Tat Άνθρωπος HBO1 HBO Αλληλεπίδραση με σύμπλοκο έναρξης αντιγραφής Άνθρωπος *Αναλύσεις ομολογίας προβλέπουν ότι υπάρχουν ομόλογες πρωτεΐνες στα φυτά, και μάλιστα στις περισσότερες περιπτώσεις σε δύο αντίγραφα. 9

11 Σήμερα γνωρίζουμε ότι τα περισσότερα HAT ένζυμα είναι συντηρημένα από τη ζύμη μέχρι και τον άνθρωπο, ότι δρουν στα πλαίσια μεγάλων πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων προσαρμοστών της μεταγραφής, και ότι η καταλυτική δράση τους στα σύμπλοκα αυτά, εξαρτάται σε πολύ μεγάλο βαθμό από τις υπόλοιπες υπομονάδες. Τα περισσότερα σύμπλοκα HAT δρουν ως προσαρμοστές της μεταγραφής είτε ακετυλιώνοντας τις νουκλεοσωμικές ιστόνες, είτε παρέχοντας μια φυσική διασύνδεση μεταξύ των ενεργοποιητών που αναγνωρίζουν ειδικά ακολουθίες, και της βασικής μεταγραφικής μηχανής (Roth et al., 2001). Και για τις δύο περιπτώσεις, ο συνδυασμός των διαφόρων υπομονάδων των συμπλόκων αυτών συμβάλει στα μοναδικά χαρακτηριστικά και στην ειδικότητα της δράσης τους. Το καλύτερο παράδειγμα αποτελούν οι υπομονάδες εκείνες που περιέχουν ειδικά μοτίβα πρόσδεσης στην χρωματίνη και ρυθμίζουν τη στρατολόγηση των συμπλόκων στις κατάλληλες περιοχές του γενώματος (Lee and Workman, 2007) To σύμπλοκο SAGA Το SAGA (Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase) είναι ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο ΗΑΤ, το οποίο είναι συντηρημένο από τη ζύμη μέχρι και τον άνθρωπο (Carrozza et al., 2003; Brown et al., 2000; Bhaumik and Green 2001). Μέσω της καταλυτικής του υπομονάδας GCN5, ακετυλιώνει συγκεκριμένα κατάλοιπα λυσίνης στις ιστόνες Η3 και Η2Β (Grant et al., 1997; Henry et al., 2003). Το σύμπλοκο αυτό, λειτουργεί ως μεταγραφικός προσαρμοστής για μια μεγάλη ομάδα μεταγραφικών ενεργοποιητών, που περιλαμβάνουν από την πρωτεΐνη GAL4 της ζύμης ως και το γονιδιακό προϊόν του πρωτο-ογκογονιδίου c-myc του ανθρώπου (Carrozza et al., 2002; Flinn et al., 2002). Είναι απαραίτητο για την έκφραση του 10% των γονιδίων της ζύμης, γονίδια τα οποία σχετίζονται κυρίως με αβιοτικές καταπονήσεις (Lee et al., 2000, 2005; Huisinga and Pugh, 2004). Το SAGA περιέχει περισσότερες από 20 πρωτεϊνικές υπομονάδες, ο ρόλος των οποίων έχει μελετηθεί κυρίως στη ζύμη (Πίνακας 2). Εκτός από το Gcn5, περιέχει συστατικά από τουλάχιστον τρεις πρωτεϊνικές οικογένειες παραγόντων, οι οποίοι ρυθμίζουν τη μεταγραφή: τις Ada (Alteration/ deficiency in Activation) και Spt (Supressor of Ty) πρωτεϊνικές οικογένειες, και μια ομάδα TAF (TATA-binding 10

12 protein (TBP)-associated factors) παραγόντων. Οι Ada2 και Ada3 είναι απαραίτητες για την ακετυλίωση, μέσω του Gcn5, των νουκλεοσωμικών ιστονών σε συγκεκριμένα κατάλοιπα λυσίνης (Balasubramanian et al., 2002). Επιπλέον οι αλληλεπιδράσεις του SAGA με ενεργοποιητές μεσολαβούνται από την Tra1 και αρκετές άλλες υπομονάδες, όπως οι Ada1, Taf6, καιtaf12 (Brown et al., 2001; Hall and Struhl, 2002; Klein et al., 2003). Πολλές από τις Spt και Taf υπομονάδες εξασφαλίζουν τη δομική ακεραιότητα του συμπλόκου (Εικόνα 3)(Grant et al., 1997; Wu et al., 2004). Εικόνα 3: Οι πολλαπλοί ρόλοι του συμπλόκου SAGA στη ρύθμιση της χρωματίνης. Οι υπομονάδες του SAGA οργανώνονται σε διακριτές ομάδες που εκτελούν διακριτές λειτουργίες. Αναπαράσταση του SAGA καθώς προσελκύεται σε έναν υποκινητή και ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση. Η Tra1 αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες (transcription factor/activator) που αναγνωρίζουν το DNA και η αλληλεπίδραση αυτή ενδυναμώνεται από το 19S RP (regulatory particle) πρωτεόσωμα. Η πρωτεΐνη Set1 μεθυλιώνει τις ιστόνες H3-K4 και η πρωτεΐνη Snf1 φωσφορυλιώνει την H3-S10, και οι τροποποιήσεις αυτές προσελκύουν και ενισχύουν την HAT δράση του Gcn5. Στα διάφορα μοτίβα αναγνώρισης της χρωματίνης στο SAGA μεσολαβούν επιπλέον αλληλεπιδράσεις σε σχέση με τις τροποποιημένες ιστόνες. Η ομάδα των Ubp8/Sgf11/Sus1 καταλύει την αφαίρεση ομάδων μονοουβικουϊτίνης από την H2B καθώς συμμετέχει και στην έξοδο του mrna μέσω αλληλεπιδράσεων με συστατικά των πόρων της πυρηνικής μεμβράνης. Οι Ada2 και Ada3, καθώς και οι Sca7, Taf12, και Chd1 λειτουργούν εν μέρη, στη ρύθμιση της HAT του Gcn5. Οι Spt3/Spt8 υπομονάδες αλληλεπιδρούν με την TBP (TATA-binding protein), και η TBP μαζί με το SAGA αλληλεπιδρούν με το γενικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIA και τον παράγοντα επιμήκυνσης TFIIS. Τα βέλη αντιπροσωπεύουν ενζυμική δραστικότητα και οι διακεκομμένες γραμμές αλληλεπιδράσεις (Daniel and Grant, 2007). 11

13 Πίνακας 2: Οι υπομονάδες του SAGA στη ζύμη και οι ομόλογες τους στο Arabidopsis. Αrabidopsis S.cereviciae Ρόλος στο σύμπλοκο (στη ζύμη) GCN5/HAG1 Gcn5 Ακετυλίωση λυσινών H3, H2B, μεταγραφική ρύθμιση, αναγνώριση ακετυλιωμένων λυσινών μέσω bromodomain, σταθερότητα συμπλόκου --- Ada1 Σταθερότητα συμπλόκου --- Ada3 Απαιτούνται για την ακετυλίωση των νουκλεοσωμάτων ADA2b, ADA2a Ada2 από την GCN5 --- Spt3 --- Spt8 Αλληλεπίδραση με TBP --- Spt7 --- Spt20 Σταθερότητα συμπλόκου TAF5 TAF5 TAF6a, TAF6b TAF6 Δομική ακεραιότητα του συμπλόκου, αλληλεπίδραση με TAF9 TAF9 τη βασική μεταγραφική μηχανή TAF10 TAF10 TAF12a,TAF12b TAF12 Απαιτούνται για την ακετυλίωση των νουκλεοσωμάτων από την GCN5. Αλληλεπίδραση με μεταγραφικούς ενεργοποιητές TRA1a, TRA1b Tra1 Αλληλεπίδραση με μεταγραφικούς ενεργοποιητές UBP8 Ubp8 Αφαίρεση ομάδων μονο-ουβικουϊτίνης από την H2BK123, μεταγραφική ενεργοποίηση CHD1 Chd1 Αναγνώριση meη3κ4 μέσω chromodomain SGF29a, SGF29b Sgf29 Άγνωστος Sca7 Ακεραιότητα του συμπλόκου SUS1 Sus1 Έξοδος mrna από τον πυρήνα SGF11 Sgf11 Απαιτείται για την συσχέτιση των Ubp8 και Sus1 με το SAGA O ρόλος των GCN5 και ADA2 στο Arabidopsis thaliana Όπως φαίνεται και στον πίνακα 2, στο Arabidopsis υπάρχουν πολλές ομόλογες υπομονάδες του SAGA. Στο Arabidopsis η GCN5, διαθέτει το μοτίβο bromodomain και ακετυλιώνει την Η3 in vitro (Stockinger et al., 2001, Mao et al., 2006, Earley et al., 2007). Στα μεταλλάγματα gcn5 η ολική ακετυλίωση της Η3 είναι μειωμένη (Bertrand et al., 2003) και ειδικότερα, η ακετυλίωση της Η3 στη λυσίνη 14 (Η3Κ14) και στη λυσίνη 27 (Η3Κ27) μειώνεται σε συγκεκριμένες γονιδιωματικές 12

14 περιοχές (Βenhamed et al., 2006). Η GCN5 έχει βρεθεί ότι έχει τη δυνατότητα να προσδένεται στο 40% των υποκινητών των γονιδίων του Arabidopsis (Benhamed et al, 2008). Επίσης, η GCN5 έχει τη δυνατότητα να αναγνωρίζει και να δεσμεύεται ακετυλιωμένες ιστόνες μέσω του μοτίβου bromodοmain (Imoberdorf et al., 2006; Mujtaba et al., 2007) το οποίο συσχετίζεται άμεσα με την ακετυλίωση της Η3Κ14 και είναι απαραίτητο για τη πρόσδεση του GCN5 στο 5% των υποκινητών των γονιδίων του Arabidopsis (Benhamed et al, 2008) Στο Arabidopsis το GCN5 εμπλέκεται σε αναπτυξιακές διεργασίες, Τα μεταλλάγματα gcn5 εμφανίζουν πλειοτροπικούς φαινοτύπους, όπως η μειωμένη αύξηση και ανάπτυξη, η περιορισμένη κυριαρχία της κορυφή και ανάπτυξη του ριζικού συστήματος, καθώς και προβλήματα στην ανάπτυξη των ανθεών (Βertrand et al., 2003, Vlachonasios et al., 2003, Benhamed et al, 2008). Στα άνθη του gcn5 εμφανίζεται αυξημένη έκφραση του WUS (Βertrand et al., 2003) η οποία καταστέλλει το φαινότυπο του topless (tpl) μεταλλάγματος (Long et al., 2006). O μεταγραφικός καταστολέας TPL κατά την εμβρυογένεση δρα ως καταστολέας της ταυτότητας της ρίζας στο βλαστικό μερίστωμα (Long et al., 2006). Πρόσφατα ο TPL βρέθηκε ότι δρα μαζί με τον καταστολέα ΙΑΑ12/BODENLOS που εξουδετερώενι τη δράση του ARF5/MONOPTERΟS στην ανάπτυξη της ρίζας κατά την εμβρυογένεση (Szemenyei et al., 2008). Επιπρόσθετα, το GCN5 σύμπλοκο συμμετέχει στις μεταγραφικές αποκρίσεις των φυτών σε αβιοτικές καταπονήσεις όπως η ρύθμιση της γονιδιακή έκφρασης από χαμηλές θερμοκρασίες (Vlachonasios et al., 2003) και η φωτορυθμιζόμενη γονιδιακή έκφραση (Benhamed et al., 2006). Στο Arabidopsis υπάρχουν δύο ADA2 πρωτεΐνες, οι ADA2a και η ADA2b (Stockinger et al., 2001).. Στη ζύμη όσο και στα φυτά οι πρωτεΐνες ΑDA2 να αλληλεπιδρούν με την GCN5 (Marcus et al., 1994; Candau et al., 1996a, 1996b, 1997; Stockinger et al., 2001; Sterner et al., 2002; Mao et al., 2006). Στο Αrabidopsis, η ADA2b ενισχύει την ΗΑΤ δράση της GCN5 (Mao et al., 2006). Μεταλλάγματα στο ADA2b εμφανίζουν πλειοτροπικούς φαινότυπους, οι κυριότεροι από τους οποίους είναι ο εκτεταμένος νανισμός, το περιορισμένο μεγέθους του ριζικού συστήματος, η επιμήκυνση του υποκοτυλίου και η μειωμένη επιμήκυνση του νήματος των στημόνων, με αποτέλεσμα την αδυναμία αυτογονιμοποίησης των ανθέων του (Vlachonasios et al., 2003). Στα ada2b-1 μεταλλάγματα βρέθηκε ότι επηρεάζονται οι αποκρίσεις των φυτών στο ψύχος (Vlachonasios et al., 2003) και στην αλατότητα (Hark et al., 2009). Πιο συγκεκριμένα, πιστεύεται ότι η ADA2b 13

15 εμπλέκεται στον έλεγχο της μεταγραφής των επαγόμενων από περιβαλλοντικά ερεθίσματα γονιδίων, τόσο μέσω της μακροπρόθεσμης ρύθμισης των επιγενετικών τροποποιήσεων καθώς και μέσω της ρύθμισης των άμεσα επαγομένων γονιδίων. Επίσης, η ΑDA2b φαίνεται να ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στη κυτταροδιαίρεση (Sieberer et al., 2003). Οι ADA2b και GCN5 ρυθμίζουν την έκφραση του περίπου 5% των γονιδίων (Vlachonasios et al., 2003; Benhamed et al., 2008). Η ADA2a πρωτεΐνη είναι κατά 55% όμοια με την ADA2b σε επίπεδο αμινοξικής ακολουθίας. Όμως, το ADA2a δεν συμμετέχει στις αποκρίσεις των φυτών σε αβιοτικές καταπονήσεις καθώςκαι στην ανάπτυξη του φυτού (Hark et al.2009) Αποκρίσεις των φυτών στο φως Τα φυτά, ως φωτοσυνθετικοί οργανισμοί, για την αύξηση, ανάπτυξη και ολοκλήρωση του βιολογικού τους κύκλου χρειάζονται το φως και μία σειρά πολυσύνθετων ρυθμιστικών μηχανισμών, οι οποίοι συμμετέχουν στην απόκριση των φυτών στo φως. Η μετάβαση από την σκοτομορφογένεση στη φωτομορφογένεση είναι ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα για το πώς τα φυτά αντιλαμβάνονται και διαφοροποιούν την ανάπτυξη τους παρουσία ή απουσία φωτός. Όταν νεαρά φυτά αναπτύσσονται στο λευκό φως καταστέλλεται η επιμήκυνση του υποκοτύλιου και οι κοτυληδόνες τους είναι πράσινες και ανοιχτές. Αντίθετα, νεαρά φυτά που αναπτύσσονται στο σκοτάδι χαρακτηρίζονται από υψηλό υποκοτύλιο, με κλειστές χλωρωτικές και μικρού μεγέθους. Τα φυτά που αναπτύσσονται σε διαφορετική ποιότητα φωτός διαμορφώνουν χαρακτηριστικούς φαινοτύπους. Στο υπέρυθρο φως, τα νεαρά φυτά καταστέλλουν το μήκος του υποκοτυλίου τους, αλλά σε μικρότερο βαθμό από τα φυτά που αναπτύσσονται στο λευκό φως διατηρώντας τις κοτυληδόνες τους ανοιχτές και χλωρωτικές (Jiao et al., 2005). Ενώ, όταν τα φυτά αναπτύσσονται σε ερυθρό και κυανό φως καταστέλλουν το μήκος του υποκοτυλίου τους, αλλά σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με το λευκό φως, και διατηρούν της κοτυληδόνες τους ανοιχτές και πράσινες (Εικόνα 4). Η επίδραση του φωτός στην επιμήκυνση του υποκοτυλίου έχει μελετηθεί διεξοδικά σε επίπεδο φυσιολογίας, γενετικής και βιοχημείας (Yeh and Lagarias, 1998; Neff et al., 2000), καθώς επίσης σε μοριακό και σε γονιδιωματικό επίπεδο (Ma et al., 2001, 2005; Tepperman et al., 2001, 2004, 2006; Ohgishi et al., 2004; Kleine et al., 2007 ). 14

16 Εικόνα 4: Νεαρά φυτά αγρίου τύπου Arabidopsis thaliana ηλικίας 6 ημερών που αναπτύχτηκαν σε λευκό φως (W), σκοτάδι (D), υπέρυθρο φως (FR), ερυθρό φως (R) και κυανό φως (B) αντίστοιχα. (Jiao et al., 2005) Το φως γίνεται αντιληπτό από τα φυτά μέσω των φωτοϋποδοχέων τους (Jiao et al., 2007). Μελέτες στο Arabidopsis thaliana έχουν αποσαφηνίσει τα μοριακά μονοπάτια που σχετίζονται με τον τρόπο που τα φυτά αντιλαμβάνονται το φως (Jiao et al., 2007). Τέσσερεις είναι οι σημαντικότεροι τύποι φωτοϋποδοχέων, τα φυτοχρώματα, τα κρυπτοχρώματα οι φωτοτροπίνες και οι μη-προσδιοριζόμενοι UVB φωτοϋποδοχείς (Εικόνα 5). Οι αποκρίσεις των φυτών στο φως συμβαίνουν κατά τη διάρκεια πολλαπλών αναπτυξιακών διαδικασιών όπως η φύτρωση των σπερμάτων, η φωτομορφογένεση νεαρών φυταρίων, ο φωτοτροπισμός, ο γεωτροπισμός, η μετακίνηση των χλωροπλαστών, η αποφυγή σκίασης, οι ημερονύκτιοι ρυθμοί και η επαγωγή της άνθησης (Εικόνα 6). Τα κρυπτοχρώματα και οι φωτοτροπίνες αντιλαμβάνονται τα μήκη κύματος στο κυανό και υπεριώδες Α φως. Τα φυτοχρώματα απορροφούν βασικά στο υπέρυθρο και ερυθρό μήκος κύματος φωτός, και οι μη-προσδιορισμένοι φωτοϋποδοχείς που αποροφούν στο υπεριώδες Β φως (Εικόνα 5). 15

17 Εικόνα 5: Οι τύποι φωτουποδοχέων και τα μήκη κύματος τα οποία αντιλαμβάνονται (Jiao et al., 2007). Τα φυτοχρώματα είναι μια μικρή οικογένεια πρωτεϊνών που μεσολαβούν στις αποκρίσεις των φυτών που σχετίζονται με την υπέρυθρη και ερυθρή περιοχή του φάσματος του φωτός (Εικόνα 5). Τα φυτοχρώματα in vivo υπάρχουν σε δύο μορφές, οι οποίες εναλλάσσονται ανάλογα με την ποιότητα του φωτός που δέχονται τα φυτά. Στο σκοτάδι τα φυτοχρώματα βρίσκονται στην ανενεργή μορφή Pr ενώ όταν απορροφήσουν ερυθρό φως μετατρέπονται στην ενεργή μορφή Pfr (Quail, 1997). Η ενεργή μορφή των φυτοχρωμάτων Pfr μπορεί να μετατραπεί στην ανενεργή μορφή Pr με την απορρόφηση υπερύθρου φωτός. Στο Arabidopsis thaliana έχουν χαρακτηριστεί πέντε γονίδια του φυτοχρώματος, τα PHYA-E (Sharrock and Quail, 1989). Τα φυτοχρώματα PHYA και PHYB διαδραματίζουν κυρίαρχο ρόλο στην ανάπτυξη των φυτών, ενώ τα PHYD και PHYE και εν μέρει το PHYC έχουν παρόμοιους ρόλους με το PHYB (Franklin et al., 2003; Monte et al., 2003). Τα φυτοχρώματα διακρίνονται σε δύο τύπους, στον τύπο Ι που ανήκει μόνο το PHYA, το οποίο συσσωρεύεται στο σκοτάδι και καταστρέφεται γρήγορα μετά από έκθεσή του στο φως και στον τύπο ΙΙ, στα οποία ανήκουν τα PHYB έως E (Hirschfeld et al., 1998) τα οποία είναι σταθερά στο φως (Sharrok and Clark, 2002). Τα φυτοχρώματα είναι διμερείς χρωμοπρωτεΐνες. Κάθε πολυπεπτίδιο περιέχει την αμινοτελική φωτοευαίσθητη περιοχή η οποία συνδέεται με ένα χρωμοφόρο βιλίνης (ΡΦΒ) και την καρβοξυτελική περιοχή η οποία αποτελείται από διάφορα μοτίβα και συμμετέχει στο διμερισμό της πρωτεΐνης, στη φωτο-εξαρτόμενη μετακίνησή της στο πυρήνα και πιθανώς στη ρύθμιση της σηματοδότησης (Krall and Reed, 2000). Το PHYA είναι υπεύθυνο για την αντίληψη του υπέρυθρου φωτός από τα φυτά, διαδραματίζει 16

18 σημαντικό ρόλο στη φύτρωση των σπερμάτων (Botto et al., 1996; Shinomura et al., 1996), καθώς και στη φωτοπερίοδο και ιδιαίτερα στον προσδιορισμό των μεγάλων ημερών που επιταχύνουν την άνθιση (Johnson et al., 1994; Yanovsky and Kay, 2002). Τα PHYB-Ε είναι υπεύθυνα για την αντίληψη του λευκού και ερυθρού φωτός, συσχετίζονται άμεσα με τη φύτρωση των σπεμάτων, την επιμήκυνση των μεσογονατίων διαστημάτων, τη φωτοπερίοδο και το χρόνο άνθισης των φυτών (Εικόνα 6) (Nagy and Schäfer, 2002; Quail, 2002). Μικρής έντασης ερυθρό φως προάγει τη φύτρωση των σπερμάτων ή οποία καταστέλλεται από ακολουθούμενη μεταχείρηση με υπέρυθρο φως (Quail, 2002). Η PHYB με τη βοήθεια των PHYA και PHYΕ είναι υπεύθυνες για τη αναστρέψιμη ρύθμιση της φύτρωσης από το ερυθρό και υπέρυθρο φως. Το φυτόχρωμα PHYB παίζει σημαντικό ρόλο στην ικανότητα των φυτών να αποφεύγουν την σκίαση (Quail, 2002). Ο δεύτερος τύπος φωτοϋποδοχέων είναι τα κρυπτοχρώματα, τα οποία είναι υπεύθυνα για τις αποκρίσεις των φυτών στο κυανό και υπεριώδες Α φάσμα (Εικόνα 5). Έχουν βρεθεί δύο γονίδια που κωδικοποιούν για τα κρυπτοχρώματα, τα CRY1 και CRY2 στο Arabidopsis (Quail, 2002). Στο αμινοτελικό άκρο περιέχουν μια περιοχή φωτολυάσης (ΡΗR) και στο καρβοξυτελικό άκρο μια DAS/CCT περιοχή. Η ΡΗR προσκολά σε δύο χρωμοφόρα, την πτερίνη και μια φλαβίνη ενώ η CCT περιοχή επιτυγχάνει συνεχόμενη απόκριση στο φως μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασής της με την πρωτεΐνη CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) (Wang et al., 2001, Yang et al., 2000, 2001). Το CRY2 εντοπίζεται στον πυρήνα ενώ το CRY1 στο σκοτάδι βρίσκεται στον πυρήνα ενώ μεταφέρεται στο κυτόπλασμα κατά την έκθεσή του στο φως (Lin and Skalitin, 2003). Τα εντοπίζομενα στο πυρήνα κρυπτοχρώματα αλληλεπιδρούν με την χρωματίνη. Και τα δύο κρυπτοχρώματα, CRY1 και CRY2, είναι υπεύθυνα για τη φωτομορφογένεση στο κυανό και υπεριώδες Α φως ενώ επηρεάζουν και τη ρύθμιση των ημερονύκτιων ρυθμών (Guo et al., 1998; Somers et al., 1998). Η αλληλεπίδραση των ερεθισμάτων του φωτός και των εγγενών ημερονυκτίων ρυθμών μετρούν το μέγεθος της ημέρας. Στο Arabidopsis, τα φυτοχρώματα και κρυπτοχρώματα συντονίζουν μαζί το βιολογικό ρολόι (Jiao et al., 2007). Το CRY2 καθορίζει το χρόνο άνθισης, καθώς τα cry2 μεταλλάγματα εμφανίζουν καθυστερημένη άνθιση σε μεγάλες ημέρες (Koornneef et al., 1991). Επιπλέον, τα κρυπτοχρώματα έχουν κυρίαρχο ρόλο στα αρχικά στάδια της επιμήκυνσης της ρίζας σε φυτά που αναπτύσσονται σε κυανό φως, με το γονίδιο CRY1 να δρα ως θετικός ρυθμιστής της επιμήκυνσης της ρίζας και το γονίδιο CRY2 17

19 να δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της επιμήκυνσης της ρίζα στο κυανό φως (Canamero et al., 2006). Οι φωτοτροπίνες είναι φωτοϋποδοχείς που αντιλαμβάνονται την κυανή περιοχή του φάσματος και ο λειτουργικός τους ρόλος σχετίζεται με αλλαγές στη φυσιολογία του φυτού, όπως ο φωτοτροπισμός, το άνοιγμα και το κλείσιμο των στομάτων(εικόνα 5 και 6). Έχουν χαρακτηριστεί δύο γονίδια που κωδικοποιούν για τις φωτοτροπίνες τα PHOT1 και PHOT2 (Liscum et al., 2003; Wada et al., 2003). Και οι δύο φωτοτροπίνες βρίσκονται στη πλασματική μεμβράνη (Chen et al., 2004) και έχουν μικρή επίδραση στη γονιδιακή ρύθμιση καθώς επηρεάζουν ένα μικρό αριθμό γονιδίων. Εικόνα 6: Φωτοϋποδοχείς και ο ρόλος τους στην αύξηση και ανάπτυξη του φυτού (Jiao et al., 2007). Τα δίκτυα μεταγραφικής ρύθμισης έχουν θεμελιώδη ρόλο στην επίτευξη της σηματοδότησης του φωτός μέσω της συντονισμένης ενεργοποίησης ή καταστολής των γονιδιακών στόχων. Για κάθε αναπτυξιακή απόκριση, περισσότεροι από ένα φωτοϋποδοχέα συμμετέχουν στην αντίληψη των ερεθισμάτων του φωτός, συνιστώντας ότι θα πρέπει να υπάρχουν πολλαπλά σημεία ενσωμάτωσης διαφορετικών φωτεινών σημάτων. Στην παραπάνω πολυπλοκότητα θα πρέπει να προστεθούν οι φωτο-αποκρίσεις που παρατηρούνται σε συγκεκεριμένα όργανα ή 18

20 αναπτυξιακά στάδια του φυτού. Επιπλέον, το φως και άλλα περιβαλλοντικά ερεθίσματα λειτουργούν ταυτόχρονα για τη διέγερση ειδικών αναπτυξιακών αποκρίσεων υποδηλώνοντας την ύπαρξη σημείων ενσωμάτωσης μεταξύ διαφορετικών δικτύων σηματοδότησης (Jiao et al., 2007). Τα τελευταία χρόνια σημαντική πρόοδος παρατηρήθηκε στο χαρακτηρισμό της οργάνωσης των φωτο-ρυθμιζόμενων μεταγραφικών δικτύων στο Arabidopsis. Και πιο συγκεκριμένα στο χαρακτηρισμό των δικτύων που ρυθμίζουν τη φωτομορφογένεση νεαρών φυταρίων. Μέθοδοι μοριακής και κλασσικής γενετικής έχουν προσδιορίσει δίαφορους ρυθμιστές που δρουν μετά τους φωτοϋποδοχείς (Chen et al., 2004). Πολλοί από αυτούς κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες, κινάσες, φωσφατάσες και πρωτεΐνες που σημμετέχουν σε μονοπάτια καταστροφής των πρωτεϊνών. Το φως επάγει ένα μαζικό επανα-προγραμματισμό της γονιδιακής έκφρασης. Περίπου 20% των γονιδίων δείχνουν διαφορετική έκφραση μεταξύ φωτομορφογένεσης και σκοτομορφογένεσης (Ma et al., 2001; Tepperman et al., 2001, Jiao et al., 2005). Η ενεργοποίηση των φωτοϋποδοχέων και κυρίως των φυτοχρωμάτων και των κρυπτοχρωμάτων επηρεάζουν σημαντικά τη μεταγραφή μέσω μονοπατιών της μεταγωγής του σήματος και σε ορισμένες περιπτώσεις επηρεάζουν άμεσα τους μεταγραφικούς παράγοντες Ρύθμιση μεταγραφικών παραγόντων από το φως Φωτο-αποκρινόμενοι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν προσδιορισθεί από πειράματα για τον προσδιορισμό πρωτεϊνών που προσκολούν σε φωτο-αποκρινόμενα cisστοιχεία (LRE, light-regulated element) και από γενετικές αναλύσεις μεταλλαγμάτων που είναι ανεπαρκής στις αποκρίσεις σε συγκεκριμένους τύπους φωτός. Μερικοί από τους μεταγραφικούς παράγοντες ρυθμίζονται από ένα είδος φωτός ενώ πολλοί αποκρίνονται σε ένα ευρήτατο φάσμα φωτός. Ο φωτο-ρυθμιζόμενος έλεγχος της ανάπτυξης των φυτών επηρεάζεται από τη μεταγραφική ρύθμιση, τις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις και την καταστροφή των μεταγραφικών παραγόντων (Jiao et al., 2007). 19

21 Στον μαϊντανό, η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα COMMON PLANT REGULATORY FACTORS 1 (CPRF1) επάγεται ταχύτατα από το φως (Weisshaar et al., 1991). O CPRF1 προσκολλά σε LRE και συγκεκριμένα στο στοιχείο G (Weisshaar et al., 1991). Αλλά τα επίπεδα του CPRF1 αυξάνουν παροδικά μετά από την έκθεση στο φως και η μεταγραφή του εμποδίζεται από την προσκόλησή του στον προαγωγέα του. Διάφοροι μετα-μεταφραστικοί μηχανισμοί συμμετέχουν στη ρύθμιση της δράσης των μεταγραφικών παραγόντων στις αποκρίσεις των φυτών στο φως. Μία από αυτές είναι η φωσφορυλίωση των μεταγραφικών παραγόντων. Για παράδειγμα, τα επίπεδα του G-BOX BINDING FACTOR 1 (GBF1) είναι σταθερά αλλά η προσκόλησή του στο G-στοιχείο προσαρμόζεται ανάλογα με τα επίπεδα φωσφορυλίωσής του (Klimax et al., 1992). Τέλος, πρόσφατες μελέτες ενέδειξαν την σημαντικότητα της πρωτεόλυσης μέσω της ουβικιτινίωσης στη σηματοδότηση του φωτός (Osterlund et al., 2000). Η καταστολή της φωτομορφογένεσης στο σκοτάδι προϋποθέτει τη δράση του καταστολέα CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1), μία Ε3 λιγάση ουβικιτίνης τύπου RING-finger (Yi and Deng, 2005). Στο σκοτάδι, μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν θετικά τη γονιδιακή έκφραση στο φως όπως ο LONG AFTER FAR RED LIGHT 1 (LAF1) ουβικιτινιώνονται από τον COP1 στο υπέρυθρο φως και στη συνέχεια καταστρέφονται από το 26S πρωτεόσωμα με τη βοήθεια της πρωτεΐνης PHYTOCHROME A SUPPRESSOR 1 (SPA1) (Seo et al., 2003). To φως καταστέλλει τη δράση της E3 λιγάσης απογορεύοντας την είσοδο της COP1 στο πυρήνα. Σε πολλές περιπτώσεις, το φως επηρεάζει πολλαπλά βήματα της ρύθμισης των μεταγραφικών παραγόντων, όπως για παράδειγμα η ρύθμιση του θετικού ρυθμιστή ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5) και του αρνητικού ρυθμιστή PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 3 (PIF3) της φωτομορφογένεσης. Τα επίπεδα του HY5 ρυθμίζονται από το φως σε μεταγραφικό επίπεδο (Oyama et al., 1997). Επιπρόσθετα, τα επίπεδα της COP1 στο πυρήνα ρυθμίζουν τη δράση του HY5 ουβικιτινιώνοντας των και στη συνέχεια καταστρέφοντας των μέσω του 26S πρωτεοσώματος (Osterlund et al., 2003). Ο ΗΥ5 φωσφορυλιώνεται στο σκοτάδι (Ang et al., 1998) ενώ ο μη-φωσφορυλιωμένη ΗΥ5 αλληλεπιδρά με την COP1, είναι 20

22 το καταλληλότερο υπόστρωμα για την καταστροφή και εμφανίζει υψηλότερη προσκολητική δράση στους προαγωγείς των γονιδίων στόχων (Ang et al., 1998). Ο PIF3 επάγει την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την σκοτομορφογένεση. Το ερυθρό φως επάγει την είσοδο στο πυρήνα της Pfr του φυτοχρώματος τα οποία αλληλεπιδρούν με τον PIF3. Στην συνέχεια ταχύτατη φωσφορυλίωση του PIF3 τον καθιστά ασταθή στο φως (Al-Sady et al., 2006) καθώς η φωσφορυλιώμενη PIF3 ουβικιτινιώνεται και καταστρέφεται (Bauer et al., 2004). Mερικές φωτο-ρυθμιζόμενες οικογένειες μεταγραφικών παραγόντων δημιουργούν διμερή, όπως οι bhlh και οι bzip οικογένειες (Jakoby et al., 2002, Toledo-Ortiz et al., 2003). O βαθμός του ομοδιμερισμού ή του ετεροδιμερισμού υποδεικνύει ότι αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν τη δυνατότητα να συμμετέχουν σε πολλαπλά σύνολα συνδυαστικών αλληλεπιδράσεων. Ετσι είναι προικισμένοι με την ικανότητα να λειτουργούν σε διάφορα προγράμματα μεταγραφής (Schindler et al., 1992) Δίκτυα φωτομορφογένεσης νεαρών φυταρίων. Η διαδικασία της φωτομορφογένεσης είναι μια από τις πιο εκτενέστερα μελετημένες αποκρίσεις των φυτών στο φως. Μετά τη φύτρωση των σπερμάτων τα φυτάρια ακολουθούν ένα από τα δύο αναπτυξιακά πρότυπα. Σκοτομορφογένεση ή εκχλοίωση (etiolation) στο σκοτάδι, η οποία χαρακτηρίζεται από υψηλό υποκοτύλιο, κλειστές κοτυληδόνες και την ανάπτυξη των προπλαστών σε ετιοπλάστες. Κατ αντίθεση, η αύξηση στο φως έχει ως αποτέλεσμα την φωτομορφογένεση ή αποεκχλοίωση (deetiolation) η οποία χαρακτηρίζεται από κοντά υποκοτύλια, ανοικτές κοτυληδόνες και την ανάπτυξη ώριμων πράσινων χλωροπλαστών που φωτοσυνθέτουν. Εκτεταμένες μελέτες κλασικής γενετικής αναγνώρισαν πολλούς σημαντικούς παράγοντες που συμμετέχουν στο δίκτυο σηματοδότησης. Επιπρόσθετα ανάλυση γονιδιακής έκφρασης επέκτυναι την κατανόηση της φωτομορφογένεσης σε επίπεδο γονιδιώματος. Μεταγραφικοί παράγοντες φαίνεται να είναι οι κύριοι πρωταγωνιστές στα δίκτυα φωτομορφογένεσης και οι μοριακοί μηχανισμοί των δράσεων τους αρχίζουν να αποκαλύπτονται (Jiao et al., 2007). 21

23 1.2.2.α Φωτο-αποκρινόμενοι μεταγραφικοί παράγοντες Από την ανάλυση μικροσυστοιχιών ανακαλήφθηκε ότι κατά τη φωτομορφογένεση ανάμεσα στα φωτο-επαγώμενα γονίδια υπάρχουν πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες, ιδιαίτερα αμέσως μετά την έκθεση στο φως (Jiao et al., 2003, Tepperman et al., 2001, 2004). Για παράδειγμα, στα πρώιμα φωτοεπαγώμενα γονίδια μετά από 1 ώρα έκθεση στο υπέρυθρο, ερυθρό ή κυανό φως τα περίπου 25% είναι μεταγραφικοί παράγοντες (Jiao et al., 2003, Tepperman et al., 2001, 2004). Εκτός από την ενεργοποίηση των γονιδίων παρατηρήθηκε και η παρουσία ενός άλλου μονοπατιού στο οποίο καταστέλλεται ταχύτατα η έκφραση μεταγραφικών παραγόντων μετά από έκθεση των φυτών στο φως (Tepperman et al., 2001, 2004, Jiao et al., 2003). Το PHYA παίζει κυρίαρχο ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής των πρώιμα αποκρινόμενων γονιδίων στο υπερυθρο και ερυθρό φως (Tepperman et al., 2001, 2006), παρόλο που το ΡΗΥΒ είναι ο κύριος υποδοχέας του ερυθρού φωτός (Chen et al., 2004) b. Σηματοδότηση που σχετίζεται ειδικά με την ποιότητα του φωτός. Γενετικές και γονιδιωματικές αναλύσεις, προτείνουν την ύπαρξη πολλαπλών μονοπατιών σηματοδότησης στη φωτομορφογένεση μετά τη δράση των φυτοχρωμάτων και των κρυπτοχρωμάτων (Εικόνα 7). FAR-RED IMPAIRED RESPONSE 1 (FAR1) και FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 3 (FHY3) είναι μεταγραφικοί παράγοντες που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και δρουν ειδικά στο μονοπάτι της σηματοδότησης του υπέρυθρου φωτός (Hudson et al, 1999, Wang and Deng, 2002). Επίσης ο LAF1, μεταγραφικός παράγοντας της οικογένειας R2R3-MYB, δρα μετά το ΡΗΥΑ (Ballesteros et al., 2001). Μη-λειτουργικές μεταλλάξεις στα far1, fhy3 και laf1 έδειξαν αναπτυξιακές ατέλιες στη φωτομορφογένεση στο υπέρυθρο φως μέσω της δράσης του ΡΗΥΑ, ενώ δεν έδειξαν φαινοτυπικές διαφορές στην έκθεση τους σε άλλη ποιότητα φωτός (Ballesteros et al., 2001, Hudson et al, 1999, Wang and Deng, 2002). Ένα παρόμοιο υπερ-ευαίσθητο στο φως φαίνοτυπο εμφανίζουν τα μεταλλάγματα του LONG HYPOCOTYL IN FAR-RED (HFR1) όταν εκτεθούν σε υπέρυθρο ή κυανό φως (Fairchild et al., 2000) υποδηλώνοντας ότι η ΗFR1 συμμετέχει στην σηματοδότηση του ΡΗΥΑ και των κρυπτοχρωμάτων. 22

24 O μεταγραφικός παράγοντας COGWHEEL 1 (COG1) συμμετέχει στη σηματοδότηση του ερυθρού φωτός και είναι αρνητικός ρυθμιστής του ερυθρού και υπέρυθρου φωτός (Park et al., 2003). Αντίθετα ο μεταγραφικός παράγοντας ΟΒF4 BINDING PROTEIN 3 (OBP3) δρα ως θετικός ρυθμιστής της καταστολής της επιμήκυνσης του υποκοτυλίου στα μονοπάτια της σηματοδότησης από ΡΗΥΒ και CRY1 (Ward et al., 2005). O, bhlh μεταγραφικός παράγοντας, MYC2 λειτουργείι ως καταστολέας της φωτομορφογένεσης μέσω του κυανού και υπέρυθρου φωτός (Yadav et al., 2005). Ενώ ο GBF1 δρα αποκλειστικά ως καταστολέας της φωτομορφογένεσης στο κυανό φως (Μallappa et al., 2006). Μια από τις πιο σημαντικές ομάδες γονιδίων που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω των φυτοχρωμάτων είναι οι παράγοντες που αλληλεπιδρούν με τα φυτοχρώματα (Phytochrome Interacting Factors, PIFs). Αποτελούν το άμεσο κρίκο αλυσίδας μεταξύ φωτοχρώματος και μεταγραφικής ρύθμισης και αλληλεπιδρούν ειδικά με την μορφή Pfr των φυτοχρωμάτων (Khanna et al., 2004). Οι PIF3,4,5, και 6 αλληλεπιδρούν με το ΡΗΥΒ ενώ η ΡIF1 αλληλεπιδρά και με τα δύο φυτοχρώματα (Huq and Quail 2002, Huq et al., 2004, Khanna et al., 2004, Ni et al., 1998, Oh et al., 2004, Zhu et al., 2000). Τα μη-λειτουργικά μεταλλάγματα pif3, pif4 και pif5 εμφανίζουν κοντά υποκοτύλια στο ερυθρό φως (Fujimori et al., 2004, Huq and Quail 2002, Kim et al., 2003) ενώ παρόμοιο φαινότυπο στο υπέρυθρο φως εμφανίζουν τα pif1 μεταλλάγματα (Huq et al., 2004), υποδηλώνοντας ότι οι PIFs δρουν ως αρνητικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης των φυτοχρωμάτων. Ωστόσο, o PIF3 επηρεάζει διαφορετικά κλαδιά της σηματοδότησης του ΡΗΥΒ και δρα ως θετικός ρυθμιστής της πρώιμης ανάπτυξης των χλωροπλαστών και της έκφρασης των φωτοσυνθετικών γονιδίων (Monte et al., 2004). Μία από τις κυριότερες λειτουργίες των φυτοχρωμάτων είναι η μείωση της ρύθμισης των PIFs, τουλάχιστον στα αρχικά στάδια, μέσω της φωτο-επαγώμενης καταστροφής τους (Shen et al., 2005). Το UVB φως είναι ένα άλλο συστατικό της ηλιακής ακτινοβολίας. Τα φυτά λαμβάνουν το UVB ως πληροφοριακό μήνυμα και ως παράγοντα περιβαλλοντικής καταπόνησης. Ο UVB RESISTANCE 8 (UVR8) ρυθμίζει την έκφραση του ΗΥ5 όταν τα φυτά εκτεθούν σε UVB φως (Brown et al., 2005). 23

25 1.2.2.γ Ενσωμάτωση των σημάτων που σχετίζονται ειδικά με την ποιότητα του φωτός Η ποιότητα του φωτός επιδρά παρόμοια στη μεταγραφή των γονιδίων κατά τη φωτομορφογένεση νεαρών φυτων, ακολουθώντας τις φαινοτυπικές παρατηρήσεις (Jiao et al., 2005, Ma et al., 2001). Εχει προταθεί ότι τα σήματα του φωτός συγκεντρώνεται σε περισσότερα από σημεία. Κατά συνέπεια, μερικοί μεταγραφικοί παράγοντες παίζουν κυρίαρχο ρόλο στη φωτομορφογένεση νεαρών φυτών. Το μετάλλαγμα hy5 δείχνει φαινότυπο εκχλοίωσης σε ευρή φάσμα φωτός υποδηλώνοντας ότι ο ΗΥ5 δρα μετά από τους φωτοϋποδοχείς (Oyama et al., 1997). Η ρύθμιση του είναι ταχύτατη στο επίπεδο της μεταγραφής, αλλά και σε μεταμεταφραστικό επίπεδο (Osterlund et al., 2000; Oyama et al., 1997; Hardtke et al., 2000). Σε in vitro αναλύσεις βρέθηκε ότι ο ΗΥ5 έχει τη δυνατότητα να προσδένεται στους υποκινητές μεγάλου αριθμού φωτορυθμιζόμενων γονιδίων (Ang et al., 1998; Chattopadhyay et al., 1998). Πρόσφατα σε αναλύσεις κατακρήμνισης της χρωματίνης βρέθηκε ότι ο ΗΥ5 προσκολλά στους υποκινητές πολλών γονιδίων ρυθμιζόμενα ή μη ρυθνιζόμενα από το φως (Lee et al., 2007). O ΗΥ5 έχει άμεση συσχέτιση με την αύξηση και τη μείωση της έκφρασης των φωτορυθμιζόμενων γονίδιων. Επηρεάζει πρίπου το 20% του συνόλου των φοτορυθμιζόμενων γονιδίων (Ma et al., 2002). Επομένως, φαίνεται ότι ο ΗΥ5 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που διαδραματίζει κυρίαρχο ρολό στη φωτομορφογένεση. Παρόμοια, οι μεταγραφικοί παράγοντες CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) και LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY), επάγωνται ταχύτατα κατά τη φωτομορφογένεση (Jiao et al., 2003, Tepperman et al., 2001, 2004). Ο CCA1 αλληλεπιδρά άμεσα με τους προαγωγείς των γονιδιακών στόχων για να μεταγάγει τα σήματα του φωτός (Wang et al., 1997). Είναι αξιοσημείωτο ότι, οι CCA1 και LHY αποτελούν συστατικά του ημερονύκτιου ρολογιού (Schaffer et al., 1998, Wang and Tobin, 1998) και συνεπώς παρέχουν κατά τον έλεγχο της γονιδιωματικής έκφρασης. τον σύνδεσμο μεταξύ της φωτοσηματοδότησης και των ημερονύκτιων ρυθμών (Jiao et al., 2007) 24

26 Ρύθμιση φωτοεπαγώμενων γονιδίων Πολλές φυσιολογικές τροποποιήσεις που επάγονται από τα φωτορυθμιζόμενα μονοπάτια, προκαλούνται από αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Σε μια σειρά μελετών έχει βρεθεί ότι το φως επηρεάζει το 20-30% του συνόλου των γονιδίων του φυτού (Ma et al., 2001, 2005; Jiao et al., 2005). Αν και υπάρχουν πολλές μελέτες, στις οποίες έχει ταυτοποιηθεί πληθώρα ρυθμιστικών παραγόντων που εμπλέκονται στα φωτοεπαγώμενα μονοπάτια, οι μοριακοί μηχανισμοί της φωτοεπαγώμενης μεταγραφικής ενεργοποίησης παραμένουν ασαφής. Παρόλα αυτά, η ανάλυση υποκινητών φωτοεπαγώμενων γονιδίων οδήγησε σε μία σειρά φωτο-αποκρινόμενων στοιχείων. Για παράδειγμα, η περιοχή G-box που περιλαμβάνει μία κεντρική ακολουθία ACGT, έχει ταυτοποιηθεί στα φωτοεπαγώμενα γονίδια CAB2 (ή LHCB1.1) και RBCS-1A. Η περιοχή αυτή δεσμεύεται in vitro από το βασικό μοτίβο φερμουάρ λευκίνης (Leu zipper) του μεταγραφικού παράγοντα HY5 (Chattopadhyay et al., 1998). Για τη φωτοεπαγόμενη γονιδιακή ενεργοποίηση απαιτείται ένας συνδυασμός αρκετών φωτο-αποκρινόμενων στοιχείων και παραγόντων σύνδεσης στο DNA που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους (Martinez-Hernandez et al., 2002; Yadav et al., 2002, 2005; Maxwell et al., 2003). Εντούτοις, δεν είναι γνωστό πώς δρουν οι παράγοντες σύνδεσης στο DNA για να ενεργοποιήσουν τη φωτοεπαγώμενη μεταγραφή. Εικόνα 7: Βασικό σχήμα, στο οποίο φαίνονται τα δίκτυα με τους κυριότερους παράγοντες που επηρεάζουν την φωτομορφογένεση σε νεαρά φυτά Arabidopsis thaliana. (Jiao et al., 2007). 25

27 1.3. Αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις ιστονών σε φωτοεπαγώμενα γονίδια Οι τροποποιήσεις της χρωματίνης είναι σημαντικές για την έκφραση των φωτορυθμιζόμενων γονιδίων. Αυτές οι τροποποιήσεις δρουν μετά τους μεταγραφικούς παράγοντες (Jiao et al., 2007). Αυξημένη ακετυλίωση ιστόνης Η3 και Η4 στο προαγωγέα του γονιδίου της πλαστοκυανίνης συσχετίζεται με την φωτοεπαγώμενη μεταγραφή του (Chua et al., 2001) Ακετυλίωση ιστονών στη ρύθμιση των φωτοεπαγώμενων μονοπατιών Πρόσφατα βρέθηκε ότι η ακετυλίωση και η μεθυλίωση των ιστονών διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τις αποκρίσεις των φυτών στο φως. Γονίδια που επάγονται από την έκθεση των φυτών στο φως, όπως τα LHCB1.4 και RBCS-1B, εμφανίζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα H3K4me3 ή H3K9ac στους υποκινητές τους (Guo et al., 2008). Η ακετυλίωση H3K9ac στους υποκινητές αυτών των γονιδίων αρχίζει αμέσως μετά την έκθεση των φυτών στο φως, και σε χρονικό διάστημα τεσσάρων ωρών φτάνει στο μέγιστο επίπεδο της. Αντίθετα, σε γονίδια όπως η peroxidase 21, του οποίου τα επίπεδα της έκφρασης μειώνονται μετά από την έκθεση του στο φως, η ακετυλίωση της H3K9ac μειώνεται, αλλά η μείωση αυτή διαρκεί για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 24 ωρών (Guo et al., 2008). Μεταλλάξεις σε δύο ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών HISTONE ACETYLTARNSFERASE OF THE TAF11250 FAMILY (HAF2) και GCN5 καταστέλλουν τη φωτομορφογένεση σε διαφορετικές συνθήκες φωτός (Bertrand et al., 2005, Benhamed et al, 2006), ενώ μεταλλάξεις σε αποακετυλάσες των ιστονών δείχνουν το αντίθετο αποτέλεσμα (Benhamed et al, 2006). Έχει παρατηρηθεί ότι σε gcn5 μεταλλάγματα εμφανίζεται μειωμένη γονιδιακή έκφραση, με ταυτόχρονη μείωση της ακετυλίωσης στους υποκινητές ορισμένων φωτο-επαγώμενων γονιδίων,, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι η GCN5 είναι ένας θετικός ρυθμιστής της έκφρασης αυτών των γονιδίων. (Benhamed et al, 2006, 2008). Η προσέλκυση της GCN5 στους προαγωγείς των γονιδίων αυτών, μπορεί να οφείλεται στις αλληλεπιδράσεις της με μεταγραφικούς παράγοντες που διαθέτουν μοτίβα για την αναγνώριση DNA ακολουθιών, ή σε απευθείας προσέλκυση της μέσω του bromodomain. Η πρόσδεση της GCN5 στους υποκινητές των γονιδίων αυτών, 26

28 προκαλεί είτε μία γενικευμένη ακετυλίωση, είτε μία πιο στοχευμένη ακετυλίωση σε συγκεκριμένα κατάλοιπα λυσίνης στις ουρές των ιστονών, με αποτέλεσμα μία μικρή ενεργοποίηση της μεταγραφής. 27

29 1.5. Σκοπός Το βασικό ερώτημα της παρούσας εργασίας ήταν πώς επηρεάζει η ακετυλίωση της ιστόνης Η3 επηρεάζει τις αποκρίσεις των φυτών στο φως. Πιο συγκεκριμένα, ελέγχθηκε πώς η ποιότητα του φωτός και η δράση των μεταγραφικών προσαρμοστών ADA2a, ADA2b και GCN5 επηρεάζουν την επιμήκυνση του υποκοτυλίου σε νεαρά φυτά. Σε μοριακό επίπεδο, αναλύθηκε αρχικά, πώς η ποιότητα του φωτός και η δράση των γονιδίων ADA2a, ADA2b και GCN5 επηρεάζουν την έκφραση των φωτοεπαγώμενων γονιδίων, και πώς τα ίδια γονίδια ρυθμίζουν τα πρώιμα στάδια της έκφρασης των φωτορυθμιζόμενων γονιδίων. Τέλος, μελετήθηκε συγκριτικά η έκφραση των γονιδίων που εξαρτώνται από την δράση του ADA2b και GCN5 και αποτελούν στόχους του μεταγραφικού παράγοντα ΗΥ5, της ακετυλοτρανφεράσης της ιστόνης H3, GCN5 και ρυθμίζεται η έκφρασή τους από το φως. 28

30 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Οικότυποι και μεταλλάγματα Χρησιμοποιήθηκαν ο οικότυπος Columbia (Col) και το μετάλλαγμα ada2a-3 και ο οικότυπος Wassilewskija-2 (Ws-2) και τα μεταλλάγματα gcn5-1, ada2b-1, ada2a-2 και hda19-2 του φυτού Arabidopsis thaliana Συνθήκες ανάπτυξης των φυτών Μέτρηση της επιμήκυνσης του υποκοτυλίου. Τα σπέρματα των φυτών απολυμάνθηκαν με χλωρίνη (30%), ξεπλύθηκαν πέντε φορές με αποσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα Gamborg s B5 (Duchefa, Haarlem, Netherlands) με 1% σουκρόζη, σε θερμοκρασία 4 ο C απουσία φωτός. Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν περίπου 400 σπέρματα από κάθε ομοζύγωτο μετάλλαγμα gcn5-1, ada2a-2, ada2a-3 και των αντίστοιχων οικοτύπων, τα οποία κατανεμήθηκαν σε τριβλία (από 30 έως 50 σπέρματα από κάθε μετάλλαγμα και άγριο τύπο/τριβλίο) και 2400 σπέρματα από ετεροζύγωτα μεταλλάγματα ada2b-1 (150/τριβλίο). Στη συνέχεια, όλα τα φυτά τοποθετήθηκαν για 6 ώρες σε λευκό φως, έντασης 500 μmol m -2 s -1 και έπειτα, χωρίστηκαν σε τέσσερεις ομάδες. Η πρώτη ομάδα παρέμεινε σε λευκό φως έντασης 500 μmol m -2 s -1. Η δεύτερη ομάδα μεταφέρθηκε σε συνθήκες ερυθρού φωτός έντασης 47 μmol m -2 s -1, χρησιμοποιώντας το φίλτρο, Roscolux 27 (Rosco, Stamford, CT, USA) (Lercari and Bertram, 2004). Η τρίτη ομάδα τοποθετήθηκε σε συνθήκες κυανού φωτός έντασης 42 μmol m -2 s -1, χρησιμοποιώντας δύο ειδικά φίλτρα Roscolux 69 (Rosco, Stamford, CT, USA) (Purcell et al., 1995; Eskins, 1992). Η τέταρτη ομάδα μεταφέρθηκε στο σκοτάδι. Τα νεαρά φυτά αναπτύχθηκαν σε συνθήκες μεγάλων ημερών (16 ώρες φως/8 ώρες σκοτάδι) ή 24 ώρες σκοτάδι και σταθερή θερμοκρασία 21 ο C. Το μήκος του υποκοτυλίου μετρήθηκε μετά από 7 ημέρες σε φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία φωτός ή μετά από 5 ημέρες σε φυτά που αναπτύχθηκαν στο σκοτάδι χρησιμοποιώντας το λογισμικό πρόγραμμα ImageJ (ΝΙΗ, Μaryland, USA). Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα SPSS (Chicago, IL, USA,). 29

31 Έλεγχος της έκφρασης φωτοεπαγώμενων γονιδίων. Για τον έλεγχο της έκφρασης των φωτοεπαγώμενων γονιδίων χρησιμοποιήθηκαν 120 ομοζύγωτα μεταλλάγματα gcn5-1, ada2a-2, ada2a-3 και φυτά αγρίου τύπου (Ws ή Col), (περίπου 30 φυτά από κάθε μετάλλαγμα και άγριο τύπο/τριβλίο) και 600 ετεροζύγωτα μεταλλάγματα ada2b-1 (150/τριβλίο). Τα φυτά αναπτύχθηκαν για 5 ημέρες σε μεγάλες ημέρες (16 ώρες φως / 8 ώρες σκοτάδι) με θερμοκρασία 21 ο, σε λευκό, ερυθρό ή κυανό φάσμα φωτός. Από 10 φυτά απομονώθηκε RNA. Για τον έλεγχο της πρώιμης έκφρασης των φωτοεπαγώμενων γονιδίων ομοζύγωτα μεταλλάγματα gcn5-1, ada2a-2 και hda19-2 και φυτά αγρίου τύπου Ws αναπτύχθηκαν για 10 ημέρες σε λευκό φως. Τα ομοζύγωτα ada2b-1 μεταλλάγματα επιλέχτηκαν την έκτη ημέρα, και μεταφυτεύθηκαν σε νέα τριβλία, όπου παρέμειναν στις ίδιες συνθήκες για τέσσερεις ημέρες. Έπειτα, όλα τα φυτά μεταφέρθηκαν στο σκοτάδι για 3 ημέρες. Στη συνέχεια, έγινε επαναφορά των φυτών για 0, 0.5, 1 και 3 ώρες στο λευκό φως. Ως χρονική στιγμή 0 ώρες ορίζεται η στιγμή πριν την επαναφορά των φυτών στο φως. Απομονώθηκε RNA από 15 φυτά Απομόνωση RNA και RT-PCR ανάλυση Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Nucleospin Plant RNA kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την RT-PCR, το Reverse Transcription System kit (Promega, Madison, USA), χρησιμοποιήθηκε για την σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του cdna με oligo (dt20) εκκινητές από 0.2μg ολικού RNA. Το cdna αραιώνεται 2 φορές με αποσταγμένο νερό και 2μl χρησιμοποιούνται για την PCR. Για την PCR χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο ExTaq DNA πολυμεράση (TaKaRa Shiga, Japan), και ειδικά ζεύγη εκκινητών για το κάθε γονίδιο (Πίνακας 3). Οι συνθήκες του PCR ήταν 94 ο C για 5, 94 ο C για 15, θερμοκρασία πρόσδεσης των εκκινητών για 30, 72 ο C για 2, σε κατάλληλο αριθμό κύκλων και 72 ο C για 7. Τα προϊόντα της PCR ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0.8%. Η ποσοτικοποίηση των προϊόντων της PCR πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα Gel-Pro v.3.0 (Media Cybernetics, Silverspring, MD, USA.). 30

32 Πίνακας 3: Αλληλουχίες νουκλεοτιδίων ειδικών γονιδιακών εκκινητών Κωδικός γονιδίου Όνομα εκκινητών Αλληλουχία εκκινητών 5 3 Θερμοκρασία πρόσδεσης At1g67090 CAB2_F CAB2_R GGAACGGAGTCAAGTTTGGA AACGGCTCCCATCAAATAA 51 O C At1g67090 RBCS-1A_F RBCS-1A_R TGATGGACGGTACTGGACAA TGGGGTACTCCTTCTTGCAC 51 O C At3g27690 LHCB2_F LHCB2_R CCACTTCAGCAATCCAACACT GGTAGTCAAGCCCTCCTTCTG 55 O C At2g40100 LHCB4.3_F LHCB4.3_R CCAAAGAAATCAAGGCAGGT CCATAGCGAGACGAGAGTG 55 O C At5g15960 COR6.6_F COR6.6_R GCTGGCAAAGCTGAGGAGAA TTCCCGCCTGTTGTGCTC 51 O C At1g13320 PDF2_F PDF2_R TAACGTGGCCAAAATGATGC GTTCTCCACAAC^CGCTTGGT 62 O C 31

33 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Η φωτομορφογένεση των φυτών εξαρτάται από τη δράση των γονιδίων GCN5, ADA2a και ADA2b. Στο λευκό φως, το μήκος του υποκοτυλίου των ada2b-1 μεταλλαγμάτων αυξήθηκε κατά 37% σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Αντίθετα, το μήκος του υποκοτυλίου των ada2a-3 μεταλλαγμάτων ήταν κατά 12% μικρότερο από τα αντίστοιχα φυτά αγρίου τύπου. Παράλληλα, δεν παρατηρήθηκε διαφοροποίηση στο μήκος του υποκοτυλίου στα gcn5-1 και ada2a-2 μεταλλάγματα σε σύγκριση με τα φυτά αγρίου τύπου, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 8. A Μήκος υποκοτυλίου (mm) Ws gcn5-1 ada2b-1 ada2a-2 Col ada2a-3 B Εικόνα 8: Επιμήκυνση υποκοτυλίου των μεταλλαγμάτων gcn5-1, ada2b-1, ada2a-2 και ada2a-3 μετά από 7 ημέρες ανάπτυξης στο λευκό φως. A) Ποσιτικοποίηση τoυ μήκους υποκοτυλίου. Τα δεδομένα απεικονίζουν το μέσο όρο, το τυπικό σφάλμα και αναλύθηκαν με το Student s t test, a = 0.05, (n= ). B) Φαινότυποι υποκοτυλίου για κάθε γενότυπο. 32

34 Σε νεαρά φυτά επτά ημερών που αναπτύχθηκαν στο κυανό φως, το μήκος του υποκοτυλίου των gcn5-1, ada2b-1 και ada2a-2 μεταλλαγμάτων ήταν μικρότερο κατά 16%, 23% και 13% αντίστοιχα σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Αντίθετα, το μήκος του υποκοτυλίου των ada2a-3 μεταλλαγμάτων δε διέφερε σημαντικά σε σύγκριση με τα φυτά αγρίου τύπου, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 9. A Μήκος υποκοτυλίου (mm) Ws gcn5-1 ada2b-1 ada2a-2 Col ada2a-3 B Εικόνα 9: Επιμήκυνση υποκοτυλίου των μεταλλαγμάτων gcn5-1, ada2b-1, ada2a-2 και ada2a-3 μετά από 7 ημέρες ανάπτυξης στο κυανό φως. A) Ποσιτικοποίηση τoυ μήκους υποκοτυλίου. Τα δεδομένα απεικονίζουν το μέσο όρο, το τυπικό σφάλμα και αναλύθηκαν με το Student s t test, a = 0.05, (n= ). B) Φαινότυποι υποκοτυλίου για κάθε γενότυπο 33

35 Σε νεαρά φυτά επτά ημερών που αναπτύχθηκαν στο ερυθρό φως το μήκος του υποκοτυλίου των gcn5-1, ada2b-1, ada2a-2 και ada2a-3 μεταλλαγμάτων ήταν μικρότερο κατά 22%, 32%, 12% και 12% αντίστοιχα από τα φυτά αγρίου τύπου, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 10. Α A Μήκος υποκοτυλίου (mm) Ws gcn5-1 ada2b-1 ada2a-2 Col ada2a-3 B Εικόνα 10: Επιμήκυνση υποκοτυλίου των μεταλλαγμάτων gcn5-1, ada2b-1, ada2a-2 και ada2a-3 μετά από 7 ημέρες ανάπτυξης στο ερυθρό φως. A) Ποσιτικοποίηση τoυ μήκους υποκοτυλίου. Τα δεδομένα απεικονίζουν το μέσο όρο, το τυπικό σφάλμα και αναλύθηκαν με το Student s t test, a = 0.05, (n= ). B) Φαινότυποι υποκοτυλίου για κάθε γενότυπο. 34

36 Σε νεαρά φυτά που αναπτύχθηκαν στο σκοτάδι για πέντε ημέρες, το μήκος του υποκοτυλίου των gcn5-1, ada2b-1 και ada2a-2 μεταλλαγμάτων ήταν μικρότερο κατά 8%, 25% και 4% αντίστοιχα από τα φυτά αγρίου τύπου. Αντίθετα, το μήκος του υποκοτυλίου των ada2a-3 μεταλλαγμάτων δε διέφερε σημαντικά από τα φυτά αγρίου τύπου, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 11. A Μήκος υποκοτυλίου (mm) Ws gcn5-1 ada2b-1 ada2a-2 Col ada2a-3 B Εικόνα 11: Επιμήκυνση υποκοτυλίου των μεταλλαγμάτων gcn5-1, ada2b-1, ada2a-2 και ada2a-3 μετά από 5 ημέρες ανάπτυξης στο σκοτάδι. A)Ποσιτικοποίηση τoυ μήκους υποκοτυλίου φυτών. Τα δεδομένα απεικονίζουν το μέσο όρο, το τυπικό σφάλμα και αναλύθηκαν με το Student s t test, a = 0.05, (n= ). B) Φαινότυποι υποκοτυλίου για κάθε γενότυπο. 35