Μεταγωγή του Σήµατος από τον TGF-β: Μελέτη του Συµπλόκου της Πρωτεΐνης SARA ΣΦΛΩΜΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ Μεταγωγή του Σήµατος από τον TGF-β: Μελέτη του Συµπλόκου της Πρωτεΐνης SARA ΣΦΛΩΜΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2005

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Μεταγωγή του Σήµατος από τον TGF-β: Μελέτη του Συµπλόκου της Πρωτεΐνης SARA ΣΦΛΩΜΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΕΣ: CAROL MURPHY Ερευνήτρια Β, Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών (ΙΒΕ) ΘΕΟ ΩΡΟΣ ΦΩΤΣΗΣ Καθηγητής Βιολογικής Χηµείας

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην εργασία που εκπόνησα σε προπτυχιακό επίπεδο στα πλαίσια του τµήµατος της Βιοχηµείας µε τίτλο ``Μελέτη της αλληλεπίδρασης µεταξύ της ογκοπρωτεϊνης SET και του συνενεργοποιητή της µεταγραφής CBP (CREB binding protein)``, στον πρόλογο είχα γράψει ότι Θεωρώ ότι όπως οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των ατόµων που απαρτίζουν ένα κοινωνικό σύνολο είναι σηµαντικότατο αντικείµενο µελέτης για άλλες επιστήµες, µε αυτόν τον τρόπο και οι προσπάθειες που πραγµατοποιούνται για την εύρεση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων αποτελούν ίσως το βασικό-πρωταρχικό, µε γνώµονα τα σηµερινά δεδοµένα, αλλά και πραγµατικά σηµαντικό ερευνητικό πεδίο για την επιστήµη της Βιοχηµείας και των συναφών µε αυτήν επιστηµών. Όπως η κοινωνική ζωή εξαρτάται και χαρακτηρίζεται από αλληλεπιδράσεις, είναι σηµαντικές και οι αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα βιοµόρια που βρίσκονται µέσα στο κύτταρο.. Το είδος της αλληλεπίδρασης, ο προσδιορισµός των υποπρωτεϊνικών περιοχών µέσω των οποίων επιτυγχάνεται η σύνδεση, ο δοµικός και λειτουργικός ρόλος των υπολοίπων υποπρωτεϊνικών περιοχών οι οποίες εµπλέκονται έµµεσα στην ευόδωση της αλληλεπίδρασης είναι ωραία και ουσιώδη ερωτήµατα. Ύστερα από περισσότερη ερευνητική και προσωπική εµπειρία θα ήθελα να προσθέσω στα παραπάνω ότι οι αλληλεπιδράσεις και η µελέτη τους είναι κάτι που πραγµατικά αξίζει κάποιος να ασχοληθεί προκείµενου να θέσει ένα εµπόδιο στην απέραντη άγνοια που µας περιβάλλει. Το ταξίδι είναι ωραίο! Η παρούσα µεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο του κ Θεόδωρου Φώτση και ασχολήθηκε µε την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών του συµπλόκου της πρωτεΐνης SMAD Anchor for Receptor Activation στο πρώιµο ενδόσωµα χρησιµοποιώντας δυο διαφορετικές προσεγγίσεις. Αρχικά θέλω να ευχαριστήσω τόσο την Carol Murphy όσο και τον Θεόδωρο Φώτση για την πραγµατικά αδιάλειπτη ερευνητική αγρύπνηση, συνεργασία και εποικοδοµητική συνεισφορά τους καθώς και για την εµπιστοσύνη τους όσον αφορά την ανάθεση της µελέτης αυτής.. Παράλληλα θέλω να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στα υπόλοιπα µέλη του εργαστηρίου για τη συνεργασία τους, στην Λαµπρινή Κύρκου για τη σηµαντική τεχνική υποστήριξή της, στην Σοφία Μπέλλου για την ουσιαστική της συµβολή στα στάδια της παρούσας εργασίας, στην Κατερίνα Πανοπούλου για την επιστηµονική της συνεισφορά ενώ η µελέτη αυτή εµβαθύνει σε ένα κοµµάτι της έρευνας που αυτή άρχισε στην διδακτορική της διατριβής, στην Παναγιώτα Χήρα, στην Αθηνά Κύρκου, στην Ελισάβετ Χατζή, στην Εύη Κάραλη και στη Γεωργία Γιώτη για την αµέριστη συνεργασία τους. Καθώς και στον Peter Gajecki για την ωραία παρέα και συνεργασία που είχαµε το διάστηµα που ήταν στο εργαστήριο.

4 Επιπλέον θέλω να ευχαριστήσω την Αναστασία Πολίτου, τον Σάββα Χριστοφορίδη και την Θωµαΐς Παπαµαρκάκη για την επιστηµονική τους συνεισφορά στην εργασία αυτή καθώς και τα µέλη.ε.π του µεταπτυχιακού και ειδικότερα του εργαστηρίου Βιολογικής Χηµείας για τη συνεργασία τους. Τελειώνοντας θέλω να ευχαριστήσω την Βασιλική µε λόγους καρδιάς για την υποµονή και κατανόηση που επέδειξε κατά την διάρκεια αυτής της µελέτης. Πραγµατικά σε ευχαριστώ! Και βέβαια, ευχαριστώ τη µητέρα µου και τον πατέρα µου για όλη τους την αγάπη.

5 Σκοπός της επιστήµης δεν είναι να ανοίξει τις πόρτες προς την απέραντη γνώση, όσο να θέσει ένα εµπόδιο στην απέραντη άγνοια Mρεχτ

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΟΨΗ...I 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΝ TGF-β Ο αυξητικός παράγων µετασχηµατισµού-β (TGF-β) Ισοµορφές του TGF-β Η µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β πραγµατοποιείται µέσω µεµβρανικών υποδοχέων µε ενεργότητα σερίνης/θρεονίνης Ενδοκυττάρια µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Κυτταροκαλλιέργειες Αποµόνωση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων προερχόµενα από φλέβα οµφάλιου λώρου Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από E.coli σε µικρή και µεσαία κλίµακα (mini, midipreparation) Μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνών Ανοσοαποτύπωση κατά Western Αναπαραγωγή ανασυνδυασµένων αδενοϊών Τιτλοποίηση των αδενοϊών Μεγάλης κλίµακας πολλαπλασιασµός αδενοϊων Κατασκευές ανασυνδυασµένου DNA οκιµασία για τον έλεγχο αυτοενεργοποίησης (β-galactosidase Filter Lift Assay) Ανοσοκατακρήµνιση της πρωτεΐνης SARA και αλίευση αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών Χρώση νιτρικού αργύρου Έκφραση και αποµόνωση χιµαιρικών GST πρωτεϊνών µε τη χρήση σφαιριδίων γλουταθείονης-αγαρόζης Χρωµατογραφία αγχιστείας (σφαιρίδια αγαρόζης- γλουταθειόνης) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ: Το σύστηµα των δύο υβριδίων σε κύτταρα ζύµης Αρχή της προσέγγισης Το σύστηµα Gal To σύστηµα LexA ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ: Ανοσοκατακρήµνιση και πρωτεοµική Γενικά-Στρατηγική της προσέγγισης Κατασκευές-Αδενοϊοί ιερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της FLAG-SARA σε ενδοθηλιακά κύτταρα ιερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών κυτταρικής λύσης και πρόσδεσης στα ανοσοσφαιρίδια ιερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών έκλουσης...35

7 3.2.6 Έλεγχος της διαδικασίας χρησιµοποιώντας τη γνωστή από την βιβλιογραφία αλληλεπίδραση της SARA µε την SMAD2 πρωτεΐνη Μεγάλης κλίµακας συνκατακρήµνιση πρωτεϊνών, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε FLAG- SARA 1-664, και ταυτοποίηση τους µε φασµατοµετρία µάζας ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ Οι καταλυτικές περιοχές των φωσφατασών PP-1 (α, β, και γ ισοµορφές) Η κυτταροπλασµατική 5 -νουκλεοτιδάση (Cytosolic 5 -nucleotidase) Η β-κατενίνη (β-catenin) ΣΥΖΗΤΗΣΗ Συγκριτική συζήτηση των προσεγγίσεων SARA και PP1 φωσφατάσες SARA και κυτταροπλασµατική 5 -νουκλεοτιδάση SARA και β-κατενίνη SARA και RNF SARA και ERBIN SARA και Ets SARA και HSP SARA και Nup Συµπεράσµατα-µελλοντικές κατευθύνσεις ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ...53 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1: Πρωτεΐνες που ανιχνεύθηκαν στην παρούσα εργασία και αλληλεπιδρούν µε την SARA: µε κόκκινο χρώµα τονίζονται αυτές που βρέθηκαν µε τη βιοχηµική µέθοδο και αυτές που ανήκουν στην Α κατηγορία του συστήµατος των δυο υβριδίων...53 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 2: Επιλογή χρήσιµων ιστοσελίδων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα ερευνητική εργασία ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...55

8 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ActR Υποδοχέας της ακτιβίνης ALK Υποδοχέας της ακτιβίνης µε ενεργότητα κινάσης (Activin receptor-like Kinase) BBCE Eνδοθηλιακά κύτταρα τριχοειδών εγκεφάλου βοός (Bovine Brain Capillary Endothelial Cells) BMP Bone Morphogenetic Protein CCP Πρωτεΐνη ελέγχου του συµπληρώµατος (complement control protein) CHAPS 3-[(3-χολαµίδοπρόπυλο-διµεθυλαµµώνιο]-1-προπανοσουλφονικό οξύ CTD Καρβοξυτελικός τοµέας (carboxy-terminal domain) DTT ιθειοθρεϊτόλη (Dithithreitol) EC Ενδοθηλιακό κύτταρο (Endothelial Cell) ECM Εξωκυττάρια ουσία (Extracellular matrix) EE Πρώιµο ενδόσωµα (Early Endosome) EGF Επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (Εpidermal Growth Factor) FCS Ορός εµβρύου βοός (Fetal Calf Serum) Flag Oκταπεπτίδιο. Aποτελείται από τα αµινοξέα N-Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C GFP Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein) GST Τρανσφεράση-µεταφοράση της γλουταθειόνης (Glutathione-S-Transferase) HRP Ραφανιδική υπεροξειδάση (Horse Raddish Peroxidase) HUVEC Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα οµφαλίου λώρου (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) I-SMAD Ανασταλτική SMAD (Inhibitory SMAD) kb Χίλιες βάσεις (Kilobase) LAP Latency-Associated Peptide LRR Eπαναλήψεις πλούσιες σε λευκίνη (leucine-rich repeats) LTBP Latent transforming growth factor-beta (TGF-beta)-binding protein MEP50 Πρωτεΐνη του µεθυλοσώµατος (Methylosome protein) MIRO-2 Μιτοχονδριακή πρωτεΐνη Rho (Mitochondrial Rho 2) MOI Πολλαπλότητα µόλυνσης (Multiplicity Of Infection) Mowiol Πολυβινυλική αλκοόλη NI Μη µολυσµένα (Non infected) NTD Αµινοτελικός τοµέας (amino-terminal domain)

9 PBD Τοµέας σύνδεσης µε φωσφατάση (phosphatase-binding domain) PBS Φυσιολογικό ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (Phosphate-Βuffered Saline) PDZ Τα αρχικά των πρωτεϊνών PSD-95/Discs-large/ZO-1 PKC Πρωτεϊνική κινάση C (Protein Kinase C) PP2A Πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α Ptdlns(3)P 3-φωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (Phosphatidyl inositole 3-Phosphate) R-SMAD SMAD πρωτεΐνη, η οποία ρυθµίζεται από τον υποδοχέα (Receptor-regulated SMAD) SARA Πρωτεΐνη αγκυροβόλησης των SMADs στη µεµβράνη για ενεργοποίηση από τους υποδοχείς SDS Θεϊικό δωδεκυλικό νάτριο (Sodium Dodecyl Sulfate) SMAD Drosophila mothers against dpp (Mad) και C.elegans Sma STAT Μεταγωγέας σήµατος και ενεργοποιητής της µεταγραφής (Signal Transducer and Activator of Transcription) TGF-β Αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού-β (Transforming Growth Factor-β) Trap Πρωτεΐνη που συνδέεται µε το σύµπλοκο του υποδοχέα (Thyroid receptor-associated protein complex component) VEGF Eνδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (Vascular Endothelial Growth Factor) WD40 Trp-Asp (W-D) WNT Wingless

10

11 ΣΥΝΟΨΗ Τα µέλη της οικογένειας και οι διαµεσολαβητές της µεταγωγής του σήµατος από τον TGF-β εµπλέκονται σε πολλές και διαφορετικές διεργασίες του ευκαρυωτικού κυττάρου όπως η αναστολή του πολλαπλασιασµού, η διαφοροποίηση, η απόπτωση και η ανοσοεπίβλεψη. Η πρωτεΐνη SARA κατέχει κύριο ρόλο στο µονοπάτι στρατολογώντας τις µη-φωσφορυλιωµένες SMAD πρωτεΐνες στο σύµπλοκο του υποδοχέα του TGF-β και ελέγχοντας την ενδοκυτταρική εντόπιση των R-SMAD. Πράγµατι, η SARA εντοπίζεται στο πρώιµο ενδόσωµα λόγω της αλληλεπίδρασης του τοµέα FYVE µε PΙ(3)P λιπίδια. Φαίνεται λοιπόν ότι το σύµπλοκο SARA/SMAD2/SMAD3 βρίσκεται στο πρώιµο ενδόσωµα και ότι η φωσφορυλίωση των SMAD2/3 προϋποθέτει ενδοκυττάρωση του συµπλόκου TGF-β/ΤβRII/ALK5 στο οργανίδιο αυτό. Εκεί, η µικρή GTPάση Rab5 επηρεάζει το µονοπάτι του TGFβ, αφού η κυρίαρχα-αρνητική µορφή της οδηγεί σε συνεχή µεταγραφική ενεργοποίηση ενός υποκινητή εξαρτώµενου από τις SMAD και σε αναστολή του πολλαπλασιασµού ενδοθηλιακών κυττάρων. Από τα στοιχεία αυτά είναι πρόδηλη η διασύνδεση ανάµεσα στην ενδοκυτταρική µεµβρανική κυκλοφορία και στη µεταγωγή του σήµατος από τον ΤGF-β. Λόγω της καίριας θέσης της, ερευνήσαµε περαιτέρω τον ρόλο της SARA ταυτοποιώντας τις υπόλοιπες πρωτεΐνες του συµπλόκου της στο πρώιµο ενδόσωµα χρησιµοποιώντας δυο διαφορετικές προσεγγίσεις. Με το σύστηµα των δύο υβριδίων (µοριακή βιολογική προσέγγιση) ταυτοποιήσαµε 32 πρωτεΐνες, εκ των οποίων 8 είχαν υψηλό δείκτη αξιοπιστίας. Παράλληλα, εκφράσαµε την SARA µέσω αδενοϊών σε ενδοθηλιακά κύτταρα, αλιεύσαµε το σύµπλοκο της SARA µε ανοσοκατακρήµνιση και ταυτοποιήσαµε τις πρωτεΐνες του µε φασµατοµετρία µάζας (βιοχηµική προσέγγιση). Ταυτοποιήθηκαν 8 πρωτεΐνες, εκ των οποίων τρείς (οι ισοµορφές α, β και γ της φωσφατάσης PP1) είχαν ταυτοποιηθεί και µε το σύστηµα των δύο υβριδίων. Ήδη, επιβεβαιώσαµε την αλληλεπίδραση 5 πρωτεϊνών (τις τρεις ισοµορφές της φωσφατάσης PP1, την β-κατενίνη και την κυτταροπλασµατική 5 - νουκλεοτιδάση) µε την SARA χρησιµοποιώντας ανεξάρτητες τεχνικές. Στην εργασία αυτή συζητάµε τους πιθανούς ρόλους των καινούργιων αυτών αλληλεπιδράσεων στην i

12 µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β. Πράγµατι, από τις πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν και µε τις δύο προσεγγίσεις 9 έχουν γνωστό ρόλο σε άλλα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος όπως του EGF, WNT, TGF-β και του JAK/STAT, στοιχείο που µπορεί να συνδέει λειτουργικά την SARA µε αλλά µονοπάτια σηµατοδότησης. Αξιοσηµείωτο είναι επίσης, ότι 3 από τις πρωτεΐνες έχουν δράσεις µεταγραφικων παραγόντων και 4 εντοπίζονται κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων, ενώ 3 ανήκουν στο σύµπλοκο του πυρηνικού πόρου. ii

13 Εισαγωγή 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΝ TGF-β Ο αυξητικός παράγων µετασχηµατισµού-β (TGF-β) Ο αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού-β είναι µια εκκρινόµενη οµοδιµερής πρωτεΐνη που ανακαλύφθηκε δυο δεκαετίες πριν, ως ο παράγοντας o οποίος επάγει την αύξηση του ποντικίσιου νεφρού (Roberts AB, 1981; ten Dijke and Hill, 2004). Από τότε µέχρι σήµερα, ο TGF-β βρέθηκε ότι είναι αρνητικός ρυθµιστής του πολλαπλασιασµού σε ευρύ φάσµα κυτταρικών σειρών. Τελευταίες µελέτες ανέδειξαν τον TGF-β ως ένα πολυδύναµο αναπτυξιακό παράγοντα, ο οποίος δρα σε όλο το σώµα ενώ επηρεάζει τους περισσοτέρους κυτταρικούς τύπους. Ο ρόλος του TGF-β έχει εµπλακεί στην ρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού, της διαφοροποίησης, της µετανάστευσης, της εναπόθεσης της εξωκυτταρικής ουσίας και της απόπτωσης (Massague, 1990; Roberts and Sporn, 1989) Ισοµορφές του TGF-β Η υπεροικογένεια του TGF-β απαρτίζεται από παρόµοιες δοµικά πρωτεΐνες που έχουν µοριακό βάρος γύρω στα 25KDa. Στα θηλαστικά έχουν προσδιοριστεί τα τρία γονίδια που κωδικοποιούν για τις ισοµορφές του TGF-β: TGF-β1 (Derynck et al., 1985), TGF-β2 (de Martin et al., 1987), TGF-β3 (Derynck R, 1988). Οι ισοµορφές παρουσιάζουν 70-80% οµοιότητα στην αµινοξική αλληλουχία των πρωτεϊνών. Οι ισοµορφές έχουν διαφορετική βιοδραστικότητα: σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ΕΚ), η TGF-β1 και η TGF-β3 ισοµορφή αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό ενώ η TGF-β2 δεν έχει επίδραση στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό (Jennings JC, 1988). O TGF-β παράγεται σε λανθάνουσα µορφή που δεν είναι ικανή να δεσµευτεί στον υποδοχέα. Αυτή η µορφή απαρτίζεται από διµερές TGF-β, το πεπτίδιο LAP, και την πρωτεΐνη LTBP (Miyazono et al., 1988). Το σύµπλοκο αυτό είναι ικανό να συνδέεται µε την εξωκυττάρια ουσία (ECM). Η ενεργοποίησή του πραγµατοποιείται µε την αποµάκρυνση του LAP µε την βοήθεια πρωτεασών (Sato and Rifkin, 1989) ή µε την σύνδεση του µε την θροµβοσπονδίνη και την ιντεργκρίνη avβ6 (Crawford SE, 1998; Munger JS, 1999). 1

14 Εισαγωγή Η µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β πραγµατοποιείται µέσω µεµβρανικών υποδοχέων µε ενεργότητα σερίνης/θρεονίνης Η µεταγωγή του σήµατος από τα µέλη της οικογένειας του TGF-β πραγµατοποιείται µέσω των τύπων Ι και ΙΙ διαµεµβρανικών υποδοχέων. Στα σπονδυλωτά έχουν βρεθεί πέντε τύπου ΙΙ και επτά τύπου Ι υποδοχείς (εικόνα 1). Εικόνα 1. O συνδυασµός των αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στους δυο τύπους υποδοχέων καθορίζει την µεταγωγή του σήµατος. Στην εικόνα αυτή περιγράφονται, οι πιο µελετηµένοι συνδυασµοί που µπορούν να συµβούν µεταξύ των υποδοχέων και των πρωτεϊνών R- SMAD (Derynck and Zhang, 2003) Οι τύπου Ι υποδοχείς ονοµάζονται επίσης και ALKs. οµικά είναι παρόµοιες διαµεµβρανικές γλυκοπρωτεΐνες µε µοριακά βάρη για τον τύπου Ι στα kda και για τον τύπου ΙΙ στα kda. Απαρτίζονται από την εξωκυτταρική άµινο τελική περιοχή που περιέχει περισσότερες από 10 κυστεϊνες, και η οποία είναι υπεύθυνη για την σύνδεση του προσδέµατος και τον διµερισµό, τη διαµεµβρανική περιοχή και την καρβόξυτελική περιοχή στην οποία οφείλεται και η ενεργότητα σερίνης-θρεονίνης (Εικόνα 1). Επίσης οι τύπου ΙΙΙ υποδοχείς είναι βοηθητικοί υποδοχείς, οι οποίοι έχουν µικρή ενδοκυτταρική περιοχή και διαδραµατίζουν έµµεσο ρόλο στην µεταγωγή του σήµατος. Η β-γλυκάνη (betaglycan), η ενδογλίνη (endoglin) και ο κρύπτο (crypto) είναι τρία παραδείγµατα υποδοχέων τύπου ΙΙΙ. 2

15 Εισαγωγή Οι υποδοχείς αυτοί ρυθµίζουν την πρόσβαση του TGF-β στους υποδοχείς που είναι υπεύθυνοι για την µετάδοση του σήµατος και διευκολύνουν την πρόσδεση του στο σύµπλοκο TβR-I/ TβR-II (Massague et al., 1991). Κάθε µέλος της οικογένειας του TGF-β δεσµεύεται σε χαρακτηριστικό συνδυασµό των δυο υποδοχέων. Η δέσµευση του συνδέτη στον υποδοχέα τύπου ΙΙ επάγει την συνάθροιση των υποδοχέων σε σύµπλοκα και την άµεση φωσφορυλίωση του τύπου Ι υποδοχέα στην περιοχή GS από τον υποδοχέα τύπου ΙΙ (Εικόνα 1). Ο ενεργοποιηµένος υποδοχέας Ι στη συνέχεια µπορεί να φωσφορυλιώσει και να ενεργοποιήσει άλλα µόρια, γνωστά ως SMAD πρωτεΐνες που εµπλέκονται στην καθοδική µεταγωγή του σήµατος (Massague and Wotton, 2000; ten Dijke and Hill, 2004) Ενδοκυττάρια µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β Οι SMAD πρωτεΐνες Τα γεγονότα που ακολουθούν την ενεργοποίηση του υποδοχέα τύπου Ι διερευνήθηκαν περαιτέρω µε την ανακάλυψη των SMAD πρωτεϊνών ως διαµεσολαβητών της µεταγωγής του σήµατος από τον TGF-β (Raftery et al., 1995). Η ανακάλυψη της οικογένειας των SMAD πρωτεϊνών, στα σπονδυλωτά, βασίστηκε στo ήδη αναγνωρισµένo γονίδιο της δροσόφιλας Mad (Mothers against decapentaplegic) που χαρακτηρίστηκε ως απαραίτητο για την µεταγωγή του σήµατος από την πρωτεΐνη Dpp (Decapentaplegic protein) (Gaullier et al., 1998b; Sekelsky et al., 1995). Με βάση τη δοµή και τη λειτουργία τους, οι SMAD πρωτεΐνες διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες (Εικόνα 2). Στην πρώτη οµάδα ανήκουν εκείνες οι SMAD που είναι άµεσα υποστρώµατα για τους υποδοχείς της οικογένειας TGF-β (R-SMAD). Η δεύτερη υποοµάδα αποτελείται από πρωτεΐνες SMAD οι οποίες συνεργάζονται µε τις ενεργοποιηµένες από τους υποδοχείς SMAD (Co-SMAD), ενώ στην τρίτη κατηγορία ανήκουν οι SMAD που δρουν ανασταλτικά και αναφέρονται ως αντί-smads (I-SMAD). Ανάµεσα στις SMAD που ενεργοποιούνται από τους υποδοχείς, οι SMADs 1, 5 και 8 είναι υπεύθυνες για την µετάδοση σηµάτων που προέρχονται από µια πλειάδα προσδεµάτων µε κύριο εκπρόσωπο τις BMP πρωτεΐνες (Bone Morphogenetic Proteins) (Hoodless et al., 1996; Kretzschmar et al., 1997), ενώ η SMAD2 και η SMAD 3 µετάγουν σήµατα προερχόµενα από την ακτιβίνη και τον παράγοντα TGF-β (Baker and Harland, 1996; Macias-Silva et al., 1996). οµικά, οι SMAD πρωτεΐνες αποτελούνται από τρεις διακριτές περιοχές: το αµινοτελικό (MH1) και καρβοξυτελικό άκρο (MH2), τα οποία είναι καλά συντηρηµένα, καθώς και µία ενδιάµεση συνδετική περιοχή (linker region), η οποία µπορεί να έχει 3

16 Εισαγωγή διαφορετικό µέγεθος και αλληλουχία. Η µεταγωγή του σήµατος από τις SMAD πρωτεΐνες, οι οποίες ενεργοποιούνται από τους υποδοχείς, εξαρτάται από την συνεργασία τους µε την SMAD4, το µοναδικό µέλος της δεύτερης κατηγορίας. Σχηµατικά, η ροή πληροφορίας από τη µεµβράνη ως τον πυρήνα έχει ως εξής: η σύνδεση συνδέτη-υποδοχέα τύπου ΙΙ ενεργοποιεί τον υποδοχέα τύπου Ι, ο οποίος µε τη σειρά του φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί το C-τελικό άκρο των SMAD πρωτεϊνών. Ακολουθεί αποσύνδεση των ενεργοποιηµένων SMAD από τον υποδοχέα που εν συνεχεία σχηµατίζουν ενδοκυττάρια σύµπλοκα µε την SMAD4 (π χ. SMAD2/4, SMAD3/4) και µετατοπίζονται στον πυρήνα, όπου και ασκούν τον µεταγραφικό τους ρόλο (Εικόνα 3). Εικόνα 2: οµική οργάνωση των SMAD πρωτεϊνών: Οι SMADs πρωτεΐνες αποτελούνται από τρεις τοµείς: οι τοµείς MH1 και MH2 είναι υψηλά συντηρηµένοι και ενώνονται από µια µη συντηρηµένη συνδετική περιοχή (linker region) Για κάθε έναν από τους τρεις τοµείς έχει περιγραφεί ένας µεγάλος αριθµός διακριτών λειτουργιών (Wrana, 2000). οµική ανάλυση των R-SMAD έδειξε ότι η θηλειά 3 (L3) και η α έλικα 1 (Η1) στην περιοχή MH2 παίζουν καθοριστικό ρόλο στην σύνδεση των R-SMAD µε τους υποδοχείς τύπου Ι (Chen and Massague, 1999; Lo et al., 1998). Κρυσταλλογραφική ανάλυση για την περιοχή ΜΗ2 της SMAD2 έδειξε ότι υπάρχει µια θετικά φορτισµένη περιοχή που βρίσκεται δίπλα στην L3, η οποία παρατηρείται σε όλες τις R-SMAD και στην SMAD4 (Wu et al., 2000). Σε παρόµοιες µελέτες, η θηλειά 45 (L45) στην περιοχή κινάσης των υποδοχέων τύπου Ι προσδιορίζει την ειδικότητα σύνδεσης µε τις R-SMADs (Chen et al., 1998; Feng and Derynck, 1997). Έτσι, η σύνδεση υποδοχέα-smad γίνεται µεταξύ της θηλειάς L3 στην SMAD και της L45 στον υποδοχέα, ενώ η βασική περιοχή κοντά στην θηλειά L3 προάγει την σύνδεση µε την πρόσδεσή της στη φωσφορυλιωµένη περιοχή GS του υποδοχέα (Wu et al., 2000). Η σύνδεση µεταξύ υποδοχέων και R-SMAD πρωτεϊνών είναι καθοριστικό βήµα 4

17 Εισαγωγή για την έναρξη του ενδοκυττάριου σηµατοδοτικού µονοπατιού. Για το λόγο αυτό η αναγνώριση των R-SMAD από τους υποδοχείς διευκολύνεται από την παρουσία άλλων βοηθητικών πρωτεϊνών Η σηµασία της πρωτεΐνης SARA (SMAD Anchor for Receptor Activation) Το πρώτο ενδοκυττάριο βήµα στην µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β, δηλαδή η στρατολόγηση των SMAD πρωτεϊνών στο σύµπλοκο των υποδοχέων, ελέγχεται από την πρωτεΐνη SARA (Εικόνα 2). H ανακάλυψη της πρωτεΐνης SARA (SMAD Anchor for Receptor Activation) δείχνει την πολυπλοκότητα της µεταγωγής του σήµατος από την υπεροικογένεια TGF-β. H SARA ανακαλύφθηκε για την ικανότητά της να συνδέεται µε τις µη φωσφορυλιωµένες µορφές των SMAD2 και SMAD3 πρωτεϊνών (Tsukazaki et al., 1998) και ένας από τους ρόλους της είναι η παρουσίαση των SMAD2 και SMAD3 πρωτεϊνών στον ενεργοποιηµένο τύπου Ι υποδοχέα. οµικά περιέχει µία περιοχή από οκτώ συντηρηµένες κυστεΐνες οι οποίες περιβάλλουν δύο ιόντα ψευδαργύρου (Stenmark et al., 1996). H περιοχή αυτή ονοµάζεται περιοχή δακτύλου FYVE (FYVE finger domain) και βρέθηκε ότι δένεται ειδικά σε PI(3)P (Gaullier et al., 1998b). Η ονοµασία FYVE που προέρχεται από τα αρχικά των τεσσάρων πρωτεϊνών που αρχικά βρέθηκε να περιέχουν αυτό το µοτίβο (Fab1, YOTB, Vac1, and EEA1), είναι µια αλληλουχία ~70 αµινοξέων και περιέχει τέσσερις συντηρηµένες κυστεΐνες που συντονίζουν δυο άτοµα ψευδαργύρου. Ο τοµέας FYVE προσδιορίστηκε από τον Stenmark, ως µέρος της αλληλουχίας µιας ενδοσωµικής πρωτεΐνης, της EEA1 (Simonsen et al., 1998; Stenmark et al., 1996). Τα πρώτα δοµικά χαρακτηριστικά του τοµέα FYVE έγιναν γνωστά από την κρυσταλλοποίηση του τοµέα αυτού της πρωτεΐνης της ζύµης vps27 (Kutateladze et al., 1999). Επίσης, έχει γίνει γνωστή µια δεύτερη κρυσταλλική δοµή, αυτή την φορά της περιοχής FYVE της πρωτεΐνης Hrs (d-hrs) από την δροσόφιλα (Mao et al., 2000). Τέλος, έχει αναφερθεί η δοµή του κανονικού τοµέα FYVE (canonical FYVE domain) της EEA1 (Kutateladze et al., 1999). Η αλληλεπίδραση του τοµέα FYVE µε το λιπίδιο PI3P έγινε γνωστή από την παρατήρηση ότι η αλληλεπίδραση της EEA1 µε τις µεµβράνες ήταν ευαίσθητη στον αναστολέα της κινάσης της 3-φωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (PI3K), wortmannin (Patki et al., 1997) και του ευρήµατος ότι η FYVE της EEA1 είχε υψηλή συγγένεια για το λιπίδιο PI3P (Burd and Emr, 1998; Gaullier et al., 1998a). Ο τοµέας FYVE υπάρχει σε ένα περιορισµένο αριθµό πρωτεϊνών, πολλές από τις οποίες εµφανίζονται να έχουν ρόλο στην µεταγωγή του σήµατος, ή στην µεµβρανική µετακίνηση ή και στα δυο (Komada and Soriano, 1999; Otto et al., 2000; Zhao et al., 2000) (Εικόνα 2). 5

18 Εισαγωγή Εικόνα 3. ιάγραµµα που απεικονίζει την µεταγωγή σήµατος από την κυτταρική µεµβράνη προς τον πυρήνα. Η µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β πραγµατοποιείται µέσω µεµβρανικών υποδοχέων µε ενεργότητα σερίνης/θρεονίνης. Οι Ι-SMADs αναστέλλουν την µεταγωγή σήµατος από το σύµπλοκο R-SMAD-Co-SMAD. Τα βέλη δείχνουν την ροή του σήµατος και ανάλογα µε το χρώµα που έχουν αντιστοιχούν: πορτοκαλί, πρόσδεση του συνδέτη και ενεργοποίηση του υποδοχέα, γκρι, απενεργοποίηση της SMAD και του υποδοχέα, πράσινο, ενεργοποίηση της SMAD και δηµιουργία του µεταγραφικού συµπλόκου, µπλε, µετακίνηση της SMAD από και προς τον πυρήνα. Οι φωσφορικές οµάδες και η ουβικιτινίωση παρουσιάζονται µε πράσινους και κόκκινους κύκλους αντίστοιχα (Shi and Massague, 2003) H SARA εκτός από την περιοχή FYVE περιέχει και µια ειδική περιοχή SBD (SMAD Binding Domain), η οποία συνδέεται µε τις µη φωσφορυλιωµένες SMAD2 και SMAD3 πρωτεΐνες και όχι µε άλλα µέλη της οικογένειας των SMAD (Tsukazaki et al., 1998). H περιοχή SBD βρίσκεται καθοδικά της περιοχής FYVE και προς το καρβόξυτελικό άκρο της SARA και συνδέεται µε το καρβόξυτελικό άκρο (MH2 domain) των πρωτεϊνών SMAD2 ή SMAD3. Η σύνδεση αυτή οφείλεται σε ένα µοτίβο πλούσιο σε προλίνες στην περιοχή SBD, το οποίο συνδέεται µε την περιοχή ΜΗ2 των SMAD (Wu et al., 2000). Επιπλέον, το κατάλοιπο ασπαραγίνης (Ν381) στη SMAD2 (συντηρηµένο και στη SMAD3) παίζει 6

19 Εισαγωγή καθοριστικό ρόλο στη σύνδεση µε την SARA (Wu et al., 2000). Tο σύµπλοκο SARA-SMAD στη συνέχεια συνδέεται µε τον υποδοχέα τύπου I µέσω του αµινοτελικού άκρου της SARA (Tsukazaki et al., 1998). O ρόλος λοιπόν της SARA είναι να προσελκύσει τις SMAD πρωτεΐνες και να τις φέρει σε επαφή µε τον υποδοχέα, ώστε να φωσφορυλιωθούν και να δηµιουργήσουν σύµπλοκα µε την κοινή SMAD4 για την επιτυχή µεταγωγή του σήµατος. Η µετέπειτα φωσφορυλίωση των SMAD2 ή SMAD3 επάγει την αποσύνδεσή τους από την SARA και τα σύµπλοκα SMAD2/SMAD3-SMAD4 µε τα σύµπλοκα SMAD2/SMAD3-SARA δεν σχηµατίζονται ποτέ ταυτόχρονα. H SARA εποµένως είναι απαραίτητος διαµεσολαβητής για την µεταγωγή του σήµατος από τον παράγοντα TGF-β γιατί προσελκύει τις SMAD πρωτεΐνες στις µεµβράνες που περιέχουν τον υποδοχέα ελέγχοντας µε τον τρόπο αυτό την ενεργοποίησή τους Μεταγωγή του σήµατος από TGF-β και πρώιµα ενδοσώµατα Η ενδοκυττάρωση για χρόνια είχε θεωρηθεί, κυρίως, ως το µέσο για τον τερµατισµό της µεταγωγής σήµατος µέσω αποικοδόµησης των συµπλόκων των ενεργοποιηµένων υποδοχέων, µετά την εσωτερικοποίησή τους. Εξαιτίας της µονοµερής αυτής θεώρησης, η προσοχή των ερευνητών είχε επικεντρωθεί µόνο στον προσδιορισµό των συστατικών που είναι απαραίτητα για την σηµατοδότηση. Εντούτοις, µε τον καιρό γινόταν όλο και πιο ξεκάθαρο ότι η σηµατοδότηση δεν εξαρτάται µόνο από την ενεργοποίηση µιας σειράς πρωτεϊνών, αλλά επίσης στο πού και για πόσο χρονικό διάστηµα το σήµα είναι ενεργό µέσα στο κύτταρο. Εξαιρετικά ενδιαφέροντα καινούργια δεδοµένα προτείνουν ότι η σηµατοδοτική µηχανή µπορεί να πετύχει υψηλής οργάνωσης αυτορρύθµιση αξιοποιώντας τη διαµερισµατοποίηση και την λειτουργική ειδικότητα του µονοπατιού της ενδοκυττάρωσης, µελέτες που ανοίγουν δρόµους πέρα από την συµβατική θεώρησή της στην αποικοδόµηση του φορτίου (cargo). Τα ενδοσώµατα είναι ιδανικά για µια τέτοια ρύθµιση καθώς οργανώνονται σε δίκτυα διακριτών µεµβρανών, οι οποίες διασυνδέονται µε ένα αυστηρά ελεγχόµενο σύστηµα µεταφοράς κυστιδίων (Gruenberg, 2001; Zerial and McBride, 2001). Η πρόσφατη βιβλιογραφία υποστηρίζει λοιπόν την πρόταση ότι τα ενδοσώµατα µπορούν να διαδραµατίσουν άµεσο ρόλο στη µετάδοση και τον πολλαπλασιασµό του σήµατος. Πράγµατι, αµέσως µετά την προσθήκη του συνδέτη το µεγαλύτερο µέρος των ενεργοποιηµένων υποδοχέων του επιδερµικού παράγοντα αύξησης (EGFRs) καθώς και των πρωτεϊνών που δρουν καθοδικά του µονοπατιού (Shc, η Grb2 και η msos), δεν εντοπίστηκαν στην κυτταρική µεµβράνη, αλλά στα πρώιµα ενδοσώµατα (Di Guglielmo et al., 7

20 Εισαγωγή 1994) προτείνοντας έναν ρόλο στη µεταγωγή σήµατος από αυτό το κυτταρικό διαµέρισµα (Baass et al., 1995). Ένας προφανής ρόλος για τον ρόλο της ενδοκυττάρωσης στη µεταγωγή του σήµατος είναι η χρονική ρύθµιση, δεδοµένου ότι η διάρκεια της σηµατοδότησης είναι µια σηµαντική παράµετρος (Miaczynska et al., 2004). Η διάρκεια ζωής των σηµατοδοτικών συµπλοκών τα οποία σχηµατίζονται από την στιγµή της ενεργοποίησης των υποδοχέων εξαρτάται από διάφορες παραµέτρους, συµπεριλαµβανοµένων της κινητικής της εσωτερικοποίησης των υποδοχέων και του επόµενου προορισµού τους από τη στιγµή που µεταφέρονται στο ενδόσωµα. Η διάρκεια εξαρτάται από το ποσοστό των υποδοχέων που οδηγούνται σε αποικοδόµηση έναντι εκείνων που ανακυκλώνονται στη µεµβράνη. Ακόµη και µέσα σε µια οικογένεια υποδοχέων αυτές οι παράµετροι µπορούν να διαφέρουν σηµαντικά.(wiley, 2003; Wiley and Burke, 2001). Ειδικότερα οι υποδοχείς του TGF-β εισέρχονται στο εσωτερικό του κυττάρου µε δυο ξεχωριστά µονοπάτια, α) το µονοπάτι της διαµεσολαβούµενης από την κλαθρίνη ενδοκυττάρωσης (Zwaagstra et al., 1999) και β) το µονοπάτι της διαµεσολαβούµενης από καβεοσώµατα (caveolae) (Di Guglielmo et al., 2003). Το µονοπάτι της ενδοκυττάρωσης διαµέσου καβεοσωµάτων έχει δειχθεί ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στην αποικοδόµηση των υποδoχέων από το πρωτεόσωµα και κατ επέκταση στην αρνητική ρύθµιση της σηµατοδότησης από τον TGF-β. Αντίθετα, σειρά παρατηρήσεων τονίζει ότι η διαµεσολαβούµενη από κλαθρίνη ενδοκυττάρωση παίζει ενισχυτικό ρόλο στη σηµατοδότηση από τον TGF-β. Πράγµατι, µετά την εσωτερικοποίηση σε καλυµµένα µε κλαθρίνη κυστίδια, οι υποδοχείς εντοπίζονται για µεγάλο χρονικό διάστηµα κυρίως στα πρώιµα ενδοσώµατα, ενώ επίσης έχουν βρεθεί και σε ανακυκλούµενα ενδοσώµατα (Di Guglielmo et al., 2003). Εξάλλου αναστολή της διαµεσολαβούµενης από κλαθρίνη ενδοκυττάρωσης, είτε µε κυρίαρχα αρνητικές µορφές της δυναµίνης (dynamin) ή της EPS15 είτε µε µείωση του Κ +, οδηγούν σε αναστολή της µεταγωγής του σήµατος από τον TGF-β (Hayes et al., 2002b). Από την άλλη πλευρά τα πρώιµα ενδοσώµατα, είναι πλούσια στην πρωτεΐνη SARA (Itoh et al., 2002; Panopoulou et al., 2002) γεγονός που δείχνει ότι το διαµέρισµα αυτό του κυττάρου είναι κοµβικό σηµείο για τη δηµιουργία των αποδοτικών συµπλόκων υποδοχέων/sara/smad2-3. Ειδικότερα τώρα στη µεταγωγή του σήµατος από τον TGF-β, η πρωτεΐνη SARA στρατολογείται ειδικά στα πρώιµα ενδοσώµατα στην υποπεριοχή που περιέχει την πρωτεΐνη Rab-5. Η περιοχή αυτή είναι επίσης πλούσια στο λιπίδιο PI(3)P. Είναι επίσης σηµαντικό ότι η SARA εµφανίζεται να παίζει διπλό ρόλο στα ενδοσώµατα, ρυθµίζοντας τόσο την µεταγωγή σήµατος όσο και τη µετακίνηση φορτίου µέσω του Rab5 8

21 Εισαγωγή κυτταρικού διαµερίσµατος (Hu et al., 2002; Panopoulou, 2002). Ο συνεντοπισµός του υποδοχέα του TGF-β µε την πρωτεΐνη SARA είναι απαραίτητος για την φωσφορυλίωση της Εικόνα 4. Κυτταρική εντόπιση και λειτουργία των πρωτεϊνών που περιέχουν FYVE τοµέα, σε κύτταρα θηλαστικών (Corvera, 2000) SMAD2 και τη µετάδοση του σήµατος, γεγονός που εξηγεί γιατί η εσωτερικοποίηση του υποδοχέα του TGF-β στα πρώιµα ενδοσώµατα είναι αναγκαία για τη σωστή µεταγωγή του σήµατος. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση που έγινε πρόσφατα στο εργαστήριο του κ. Φώτση, είναι ότι η υπερέκφραση της συνεχούς ανενεργής Rab5 (Rab5S34N) προάγει την µεταγωγή του σήµατος από τον TGF-β, ενώ η έκφραση της συνεχούς ενεργής µορφής Rab5 (Rab5Q79L) δεν έχει καµία επίδραση (Panopoulou et al., 2002). Μια εξήγηση για αυτήν την παρατήρηση είναι ότι η αναστολή της Rab5 µπορεί να τροποποιήσει τη µεταφορά των υποδοχέων διαµέσου των πρώιµων ενδοσωµάτων, υπογραµµίζοντας την επίδραση της ενδοκυτταρικής κυκλοφορίας στη µεταγωγή του σήµατος. Επίσης, η ουσία wortmannin, η οποία αναστέλλει την PI3K και µειώνει την ενδοσωµική δεξαµενή των PtdIns3P, όπως και η υπερέκφραση της SARA στην οποία έχει αφαιρεθεί η FYVE περιοχή που είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση µε τις µεµβράνες, έχουν ως αποτέλεσµα την αναστολή της σηµατοδότησης από τον TGF-β (Panopoulou et al., 2002). 9

22 Εισαγωγή Εποµένως, το µονοπάτι της διαµεσολαβούµενης από κλαθρίνη ενδοκυττάρωσης προάγει τον συνεντοπισµό των υποδοχέων µε καθοδικά µόρια του σήµατος όπως την SARA και την SMAD2 πρωτεΐνη στα πρώιµα ενδοσώµατα. 10

23 Εισαγωγή 1.2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Με βάση όσα αναφέρθηκαν στην εισαγωγή και ειδικότερα στα κεφάλαια και 1.4.3, η παρούσα εργασία είχε ως στόχο την ανεύρεση πρωτεϊνών οι οποίες αλληλεπιδρούν µε τη SARA στο πρώιµο ενδόσωµα και πιθανά συµµετέχουν στη ρύθµιση του συµπλέγµατος υποδοχέων TGF-β/SARA/SMAD2/SMAD3. Η ταυτοποίηση όλων των επιµέρους συστατικών του συµπλέγµατος της SARA στο πρώιµο ενδόσωµα µπορεί επίσης να επιτρέψει την µηχανιστική διασύνδεση της µεµβρανικής κυκλοφορίας των υποδοχέων µε την χρονική διάρκεια και ένταση της σηµατοδότησης των υποδοχέων TGF-β. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν δύο προσεγγίσεις 1. η µοριακή βιολογική προσέγγιση χρησιµοποιώντας το σύστηµα των δύο υβριδίων και 2. η βιοχηµική προσέγγιση χρησιµοποιώντας ανοσοκατακρήµνιση και πρωτεοµική. 11

24 Υλικά και Μέθοδοι 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Κυτταροκαλλιέργειες Eνδοθηλιακά κύτταρα τριχοειδών εγκεφάλου βοός (Bovine Brain Capillary Endothelial, BBCE) καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό DMEM µε περιεκτικότητα D-γλυκόζης 1 g/l και 10% ορό νεογέννητου βοός (Newborn Calf Serum, NCS). Προσθήκη του ινοβλαστικού αυξητικού παράγοντα FGF-2 σε συγκέντρωση 2,5ng/ml γίνονταν κάθε δεύτερη ηµέρα µέχρι τα κύτταρα καλύψουν όλη την επιφάνεια των τρυβλίων. Στην εργασία αυτή χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα γενιάς Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα προερχόµενα από φλέβα οµφάλιου λώρου (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία τα οποία είχαν πριν υποστεί επεξεργασία µε κολλαγόνο αρουραίου τύπου Ι για 30 λεπτά στους 37 C και είχαν εκπλυθεί µε διάλυµα φωσφορικών (Phosphate Buffer Saline, PBS). Η ανάπτυξη των HUVEC έγινε σε θρεπτικό υλικό Μ199 µε περιεκτικότητα D-γλυκόζης 1 g/l, εµπλουτισµένο µε 20% ορό εµβρύου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) θερµικά απενεργοποιηµένο, 0,05 mg/ml εκχύλισµα ενδοθηλιακής ανάπτυξης (Endothelial Cell Growth Supplement, ECGS) και 0,05/ml IU ηπαρίνης. Για τις ανάγκες των πειραµάτων της εργασίας αυτής χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα γενιάς Εµβρυονικά κύτταρα από νεφρό ανθρώπου 293 καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό RPMI 1640 εµπλουτισµένο µε 10% FBS θερµικά απενεργοποιηµένο. Όλα τα θρεπτικά υλικά ήταν εµπλουτισµένα µε 100 U/ml πενικιλίνη, 100 µg/ml στρεπτοµυκίνη και 2 mm γλουταµίνη (4 mm για τα κύτταρα COS-1). Όλα τα κύτταρα συντηρήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο των 37 C και 5% CO 2 εκτός των ενδοθηλιακών κυττάρων BBCE που διατηρήθηκαν σε 10% CO 2. Όλα τα θρεπτικά µέσα και υλικά προήλθαν από την εταιρεία Invitrogen (ECGS από την εταιρία Sigma) και ήταν ελεύθερα ενδοτοξινών. Ο χειρισµός των κυττάρων γινόταν σε εστία κάθετης νηµατικής ροής και τα κύτταρα αναπτύσσονταν σε επωαστικό κλίβανο στο οποίο η θερµοκρασία διατηρούταν σταθερή στους 37C, επικρατούσαν συνθήκες υγρασίας και η ατµόσφαιρα ήταν εµπλουτισµένη µε 5% CO Αποµόνωση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων προερχόµενα από φλέβα οµφάλιου λώρου Σε φρέσκο ανθρώπινο οµφάλιο λώρο µε τη βοήθεια µιας σύριγγας εντοπίστηκε µε ψηλάφηση η φλέβα του λώρου και πλύθηκε µε 20 ml PBS. Στη συνεχεία κρατήθηκε κλειστό, 12

25 Υλικά και Μέθοδοι µε την βοήθεια αποστειρωµένων αιµοστατών, το κάτω άκρο του λώρου και διαποτίστηκε η φλέβα µε 0.1% κολλαγενάση διαλυµένη σε θρεπτικό µέσο Μ199. Ακολούθησε επώαση του λώρου µε PBS σε υδατόλουτρο στους 37 ο C για 12 λεπτά. Πλύσιµο µε 10 ml θρεπτικό υλικό Μ199 εµπλουτισµένο µε 5% FCS και ακολούθησε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 1500g. Τέλος αφαιρέθηκε το υπερκείµενο και επαναιωρήθηκε το κυτταρικό ίζηµα σε πλήρες θρεπτικό υλικό Μ199 (αναλυτικότερα για την αποµόνωση των Ε.Κ βλέπε δικτυακό τόπο, Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από E.coli σε µικρή και µεσαία κλίµακα (mini, midi-preparation) Μετά τον µετασχηµατισµό των επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων µε τους ανασυνδυασµένους φορείς, 5-10 αποικίες από την επιφάνεια των τρυβλίων επιλογής ενοφθαλµίστηκαν, κάθε µια ξεχωριστά, σε 5 ml L.B το οποίο περιείχε το αντιβιοτικό αµπικιλλίνη σε τελική συγκέντρωση 100 µg/µl. Ακολούθησε ολονύχτια επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C. Την επόµενη µέρα 1.5 ml από κάθε καλλιέργεια µεταφέρθηκε σε σωληνάριο και τα δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν ( g για 5 λεπτά, σε φυγόκεντρο eppendorf, centrifuge 5415D). Το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 100 µl διαλύµατος P 1 (P 1: 50 mm Tris-HCI ph 8, 10 mm ΕDTA, 100 µg/µl Rnase A) και στο εναιώρηµα προστέθηκαν διαδοχικά τα διαλύµατα P 2 (P 2 : 200 mm ΝαΟΗ, 1% SDS) και P 3 (P3: 3 M oξικό κάλιο, ph 5.5). Μετά από ήπια ανάδευση τα δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν ( g, για 5 λεπτά). Το ίζηµα που αποτελείται από το χρωµοσωµικό DNA και τα κυτταρικά υπολείµµατα αποµακρύνθηκε. Το υπερκείµενο µεταφέρθηκε σε καινούργιο σωληνάριο. Το πλασµιδιακό DNA καταβυθίστηκε µε την προσθήκη στο υπερκείµενο, 1 ml παγωµένης αιθανόλης (-20 ο C) και φυγοκέντρηση ( g για 10 λεπτά, φυγόκεντρος eppendorf, centrifuge 5415D). Ακολούθησε πλύση του DNA µε 500 µl 70% v/v αιθανόλης, φυγοκέντρηση ( g, για 10 λεπτά) και επαναιώρηση του ιζήµατος σε 50 µl ddh 2 0. Για την παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε µεσαία κλίµακα έγινε χρήση του πακέτου υλικών (midi-preparation, QIAGEN R Plasmid Purification kit). Χρησιµοποιήθηκε 1 ml από την εξακριβωµένα θετική καλλιέργεια µικρής κλίµακας. To αποµονωµένο DNA επαναδιαλύθηκε σε 150 µl ddh 2 0. Η καθαρότητα και η συγκέντρωσή του υπολογίσθηκαν φωτοµετρικά, λαµβάνοντας δύο µετρήσεις, στα 260 nm και στα 280 nm. Η συγκέντρωση του DNA υπολογίσθηκε µε βάση τη σχέση: οπτική πυκνότητα (OD 260 = 1) αντιστοιχεί σε 50 µg δίκλωνου DNA /mi διαλύµατος. Η καθαρότητα του διαλύµατος του DNA προσδιορίστηκε µε βάση το λόγο OD 260 /ΟD 280 και θεωρήθηκε καθαρό για OD 260 /ΟD 280 =1,8. 13

26 Υλικά και Μέθοδοι 2.4 Μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνών Στις περιπτώσεις όπου τα κυτταρικά εκχυλίσµατα περιείχαν SDS, TritonΧ-100 ή και CHAPS χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος BCA (Bicinchromic acid, βικινχρωµικό οξύ) σύµφωνα µε το αντιδραστήριο εµπορίου BCA Protein Assay Kit της εταιρίας Pierce. Για την πρότυπη καµπύλη χρησιµοποιήθηκαν διαδοχικά αυξανόµενες συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης BSA (Bovine Serum Albumin), 2 µg/ml, ενώ προστέθηκε ποσότητα διαλύµατος λύσης µε απορρυπαντικό ίση µε την ποσότητα των δειγµάτων προς µέτρηση. Τα δείγµατα επωάστηκαν στους 37 C για 30 λεπτά ενώ η απορρόφηση µετρήθηκε στα 562 nm. Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος Bradford (Biorad) που βασίζεται στην παρατήρηση ότι κατά την σύνδεση της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 στις πρωτεΐνες σε όξινο ph, το διάλυµά της παρουσιάζει µετατόπιση του µέγιστου της απορρόφησής του από τα 465 nm στα 595 nm. H πρότυπη καµπύλη έγινε όπως αναφέρεται πιο πάνω, ενώ τα δείγµατα επωάστηκαν σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά πριν την µέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm. 2.5 Ανοσοαποτύπωση κατά Western Κυτταρικά εκχυλίσµατα ελήφθησαν µε διάλυµα φωσφορικών ph 7,0 (PBS) που περιείχε 0,1 % SDS, 100 µμ PMSF, 1 µμ leupeptin, 1µΜ pepstatin και 0,3 µμ aprotinin. Εν συνεχεία τα δείγµατα υπερηχήθηκαν (Branson Digital Sonifier) τρεις φορές από 10 δευτερόλεπτα και βράστηκαν για 10 λεπτά. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα g για 20 λεπτά απ όπου συλλέχτηκε το υπερκείµενο. Κυτταρικά εκχυλίσµατα ή πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-πολυακρυλαµιδίου 8%-13% και µεταφερθήκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης Scheicher and Schuell, σύµφωνα µε τις πρότυπες διαδικασίες που αναφέρονται στο Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Maniatis et.al., 1989). Για τον έλεγχο της αποτελεσµατικότητας της αποτύπωσης οι πρωτεΐνες που βρίσκονται στην µεµβράνη νιτροκυτταρίνης χρωµατίστηκαν µε Ponceau S (0,1% σε οξικό οξύ 1%) για 1 λεπτό και ξεβάφτηκαν µε νερό. Οι µεµβράνες επωάστηκαν σε 5% άπαχο γάλα σκόνη σε διάλυµα Western (1 Μ Tris ph 7,2, 0,1% Tween 20, και 150 mm NaCl) είτε σε θερµοκρασία δωµατίου για µια ώρα είτε στους 4 C ολονυχτίως υπό ανακίνηση για τη δέσµευση των µη ειδικών θέσεων. Οι µεµβράνες επωάστηκαν µε τα αντισώµατα για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου σε 5% άπαχο γάλα σκόνη σε διάλυµα Western. Στην συνέχεια ακολούθησαν δύο σύντοµες πλύσεις σε διάλυµα Western, µια πλύση για 7 λεπτά και τέλος δύο πλύσεις των 5 λεπτών στο ίδιο διάλυµα. Τέλος, οι µεµβράνες 14

27 Υλικά και Μέθοδοι επωάστηκαν µε αντισώµατα συζευγµένα µε την ραφανιδική υπεροξειδάση (Horse Raddish Peroxidase, HRP) για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου και σε 5% άπαχο γάλα σκόνη σε διάλυµα Western και ακολούθησαν ίδιες ακριβώς πλύσεις όπως αναφέρεται παραπάνω. Η εµφάνιση του σήµατος έγινε µε το αντιδραστήριο ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας (Enhanced Chemiluminescence, ECL) της εταιρίας Amersham. Τα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτή την δοκιµασία ήταν το µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικού Flag-M2 που προήλθε από την εταιρία Sigma, το πολυκλωνικό αντίσωµα κόνικλου φώσφο-smad2, που ήταν µια ευγενική προσφορά του κ. Αριστείδη Μουστάκα (Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Sweden), το αντίσωµα έναντι της πρωτεΐνης β-catenin ήταν µια ευγενική προσφορά του κ. Παναγιώτη Κούκλη (BD Transduction Laboratories) και το αντίσωµα έναντι της PP1α από την εταιρία Cell Signaling. Όλα τα δευτερογενή αντισώµατα συζευγµένα µε τη ραφανιδική υπεροξειδάση προήλθαν από την εταιρία DIANOVA. 2.6 Αναπαραγωγή ανασυνδυασµένων αδενοϊών Ανασυνδυασµένοι αδενοϊοί κατασκευάστηκαν σύµφωνα µε την αναφορά (He et al., 1998) και η διαδικασία περιγράφεται αναλυτικά στην ιστοσελίδα ( org/adeasy.htm). Όλοι οι φορείς και τα στελέχη βακτηρίων για την δηµιουργία των αδενοϊών ήταν ευγενική προσφορά του Bert Vogelstein (The John Hopkins Medical Institutions, Bartimore, MD). Για την αναπαραγωγή ανασυνδυασµένων αδενοϊών χρησιµοποιήθηκε η ανθρώπινη κυτταρική σειρά πακεταρίσµατος 293 (packaging line) η οποία επιτρέπει τον πολλαπλασιασµό των παραγόµενων αδενοϊών προµηθεύοντας τους µε τα προϊόντα των γονιδίων που τους λείπουν Ε1 και Ε Τιτλοποίηση των αδενοϊών Η γνώση του τίτλου των ιών, αφού γνωρίζουµε και τον αριθµό των κυττάρων, είναι χρήσιµη στον υπολογισµό του ΜΟΙ (Multiplicity Of Infection, πολλαπλότητα της µόλυνσης), που εκφράζει τον αριθµό των ιών που αντιστοιχούν σε κάθε κύτταρο. Η τιτλοποίηση των αδενοϊών έγινε µε την δοκιµασία των πλακών (plaque assay). Κύτταρα 293 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλίο 6 φρεατίων (5χ10 5 κύτταρα ανά φρεάτιο) µέχρι το 80-90% της πληρότητας τους. Την επόµενη µέρα, µολύνθηκαν µε 5µl από διαφορετικές αραιώσεις του ιού (10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ). Μετά από 4 ώρες µόλυνσης τα κύτταρα επικαλύφθηκαν µε 4ml άγαρ επικάλυψης που περιέχει 20mM Hepes, 12,5mm MgCl 2, 1% αγαρόζη (Gibco BRL), σε πλήρες θρεπτικό υλικό RPMI Για την αποφυγή του στεγνώµατος της αγαρόζης πριν από το σχηµατισµό των 15

28 Υλικά και Μέθοδοι πλακών, προστέθηκε PBS µεταξύ των φρεατίων και το τρυβλίο τυλίχθηκε µε πάραφιλµ. Η εµφάνιση των πλακών έγινε µετά από 7 µέρες ενώ έγιναν συνεχείς µετρήσεις ως την πλήρη εµφάνιση των πλακών. 2.8 Μεγάλης κλίµακας πολλαπλασιασµός αδενοϊων Tόσο ο πολλαπλασιασµός, όσο και η µέτρηση του τίτλου των ιών πραγµατοποιούνται στις λεγόµενες κυτταρικές σειρές πακεταρίσµατος (packaging lines). Έτσι για τους αδενοϊούς χρησιµοποιείται η κυτταρική σειρά 293 που παρέχει τα γονίδια του αδενοϊού Ε1 και Ε3. Κύτταρα 293 καλλιεργήθηκαν σε φλάσκες Τ-175 σε πληρότητα 80-90%. Για την µόλυνση χρησιµοποιήθηκε αδενοϊός µε ΜΟΙ 5 από προηγούµενο πολλαπλασιασµό του ιού σε φλάσκα Τ75. Όταν το 50% των κυττάρων αποκολλήθηκε, τα κύτταρα συλλέχθηκαν µαζί µε το θρεπτικό υλικό. Τα δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν σε 5000g, για 5 λεπτά, στους 4 ο C και το ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 5 ml PBS. Ακολούθησε λύση των κυττάρων µε την διαδικασία ψύξης-τήξης σε 4 κύκλους. Τέλος πραγµατοποιήθηκε φυγοκέντρηση (5000g, για 5 λεπτά, στους 4 ο C) και το υπερκείµενο κλασµατοποιήθηκε. 2.9 Κατασκευές ανασυνδυασµένου DNA Η κατασκευή που περιέχει το αµινοτελικό άκρο της SARA (N-SARA, αµινοξέα 1-587) στον εµπορικό φορέα PAS1-CYH2 (Clontech Laboratories), κατασκευάστηκε ως εξής: O φορέας κλωνοποίησης PAS1-CYH2 υπέστη περιοριστική πέψη µε τα ένζυµα SalI και XhoI. Παράλληλα το αµινοτελικό άκρο της SARA εξάχθηκε από τον φορέα pfastbac-gst µε τα ίδια περιοριστικά ένζυµα. Ακολούθησε ανασύνδεση των τµηµάτων µε την χρήση της T4 DNA λιγάσης (T4 DNA ligase). Για την αντίδραση της ανασύνδεσης χρησιµοποιήθηκαν 10ng ενθέµατος και 20 ng από τον φορέα. Η αντίδραση πραγµατοποιήθηκε σε συνολικό όγκο 10 µl µε την προσθήκη 1µl (1u/µl), λιγάσης στους 16 ο C επί 18 ώρες. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε εισαγωγή του ανασυνδυασµένου φορέα στα επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα X-L1Blue της E.coli µε την ακόλουθη διαδικασία: Τα βακτήρια αφού ανασύρθηκαν από την βαθιά κατάψυξη, παρέµειναν είκοσι λεπτά στον πάγο προκειµένου να ξεπαγώσουν οµαλά. Ακολούθησε προσθήκη του ανασυνδυασµένου φορέα (10-20ng) σε όγκο κυττάρων 80µl, ανάµιξη και επώαση για τριάντα λεπτά στον πάγο. Έπειτα τα βακτήρια υποβλήθηκαν σε θερµικό σοκ για 4 λεπτά στους 42 ο C και το κυτταρικό εναιώρηµα εµβολιάστηκε σε 250µl θρεπτικό υλικό L.B (Luria Bertani). Aκολούθησε επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C για µία ώρα. Τα βακτηριακά κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία επιλογής για το αντιβιοτικό αµπικιλλίνη 100µg/µl, από όπου και επιλέχθηκαν οι αποικίες. Όλες οι 16

29 Υλικά και Μέθοδοι περιοριστικές ενδονουκλεάσες καθώς και η T4 DNA λιγάση προήλθαν από την εταιρία Fermentas οκιµασία για τον έλεγχο αυτοενεργοποίησης (β-galactosidase Filter Lift Assay) Χρησιµοποιήθηκε πρόσφατα αποµονωµένη αποικία (ανάπτυξη στους 30 ο C για 2 µε 4 µέρες, 1-3mm σε διάµετρο). Για κάθε τρυβλίο µε µετασχηµατισµένα κύτταρα ζύµης χρησιµοποιήθηκε χαρτί Whatman αποστειρωµένο και διαποτισµένο µε το διάλυµα Ζ. Το διάλυµα Ζ περιέχει 16,1gr Na2HPO4 7H2O, 5,5gr NaH2PO4 H2O, 0,75gr KCl και 0,246gr MgSO4 7H2O σε τελικό όγκο 1L, ph 7.0. Αρχικά ένα στεγνό φίλτρο τοποθετήθηκε στο τρυβλίο και οριοθετήθηκε το φίλτρο στο τρυβλίο µε την δηµιουργία ασσυµετρικών οπών από το φίλτρο στο τρυβλίο (3 ή και περισσότερες). Στη συνεχεία µε ιδιαίτερη προσοχή µεταφέρθηκε το φίλτρο σε δεξαµενή υγρού αζώτου όπου και εµβαπτίστηκε για δέκα δευτερόλεπτα και αµέσως µετα, για να πραγµατοποιηθεί η λύση των κυττάρων, µεταφέρθηκε σε θερµοκρασία δωµατίου. Τέλος το φίλτρο τοποθετήθηκε στην διαποτισµένη µεµβράνη µε το διάλυµα Ζ 2.11 Ανοσοκατακρήµνιση της πρωτεΐνης SARA και αλίευση αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών Για την ανίχνευση πιθανών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε την SARA χρησιµοποιήθηκε η γενική αρχή του συστήµατος της συν-ανοσοκατακρήµνισης (co-immunoprecipitation) ακολουθούµενη από ανάλυση φασµατοµετρίας µαζών. Στην εργασία αυτή χρησιµοποιήσαµε τους ανασυνδιασµένους αδενοϊούς της SARA (Ad-SARA) και του καρβοξυτελικού της άκρου (Ad-SARA 1-664). Kαι οι δύο πρωτεΐνες έχουν τον επίτοπο (οκταπεπτίδιο) flag (flag-tagged) στο αµινοτελικό τους άκρο, ενώ µαζί µε τη SARA παράγεται και η GFP µε, σχεδόν πάντα, ίση έκφραση. Tα ενδοθηλιακά κύτταρα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν γενεάς p2-p10 και προέρχονταν από τριχοειδή εγκεφάλου βοός (BBCE cells) ή από φλέβα οµφαλίου λώρου (HUVEC cells). Τα κύτταρα µολύνθηκαν µε την κατάλληλη ποσότητα ιού ώρες πριν τη λήψη του κυτταρικού εκχυλίσµατος. Tο διάλυµα λύσης, χωρίς απορρυπαντικό, περιείχε 50mM Tris-HCl ph7,5, 150Mm NaCl, 1mM EDTA, 2mM Pefablock (Roche), 1µM leupeptin, 1µM pepstatin και 0.3µM aprotinin ή µια ταµπλέτα αναστολέων πρωτεασών της εταιρίας Roche (Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets). Tο διάλυµα λύσης που περιείχε απορρυπαντικό είχε την ίδια σύσταση µε το παραπάνω και ακόµη περιείχε CHAPS (0.1%-0.05%) ή TRITON X-100 (0.5%-1%).Tα κύτταρα λύθηκαν µε διαδοχικές αναρροφήσεις µε τη βελόνα ERSTA 27G (276 x 1/2, 0,4x12 mm, 1ml, 17

30 Υλικά και Μέθοδοι ELVER) ή στην περίπτωση της µη χρήσης απορρυπαντικού µε τον κυτταροθραύστη (cell craker) και φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 g, για 10 λεπτά. To υπερκείµενο φυγοκεντρήθηκε, στα g, για 60 λεπτά ενώ συλλέχθηκε το µεµβρανικό (ίζηµα) και το κυτταροπλασµατικό (υπερκείµενο) µέρος. Το υπερκείµενο εφαρµόσθηκε στα σφαιρίδια της εταιρίας SIGMA (ANTI-FLAG M2 Affinity) τα οποία είχαν προεπωαστεί µε διάλυµα 0.1M, ph 3,5 γλυκίνης, σε αναλογία 1 όγκος σφαιριδίων προς 6-40 όγκους κυτταρικού εκχυλίσµατος. Tο µείγµα δείγµατος-σφαιριδίων υπεβλήθηκε σε περιστροφική κίνηση, στους 4 ο C, για 2-6 ώρες. Mετά από σύντοµη φυγοκέντρηση το υπερκείµενο-έκπλυµα (flowthrough) φυλάχτηκε ενώ έγιναν 3 εκπλύσεις των σφαιριδίων µε προσθήκη διαλύµατος λύσης ίσου όγκου µε αυτόν του µείγµατος. Tο υπερκείµενο των εκπλύσεων φυλάχθηκε και τα σφαιρίδια αναλύθηκαν µε ανοσοαποτύπωση κατά Western. Σε περίπτωση που ισχύει κάτι διαφορετικό αναφέρεται στο κεφάλαιο των αποτελεσµάτων Χρώση νιτρικού αργύρου Για την χρώση µε το νιτρικό άργυρο το πήγµα της ηλεκτροφόρησης επωάστηκε για µια ώρα, µε διάλυµα 50% µεθανόλη/10% οξικό οξύ. Στη συνέχεια ξεπλύθηκε πολλές φορές, 10-20, για διάστηµα µιας ώρας µε διπλά απεσταγµένο νερό και ακολούθησε η µεταφορά του σε γυάλινο δοχείο που περιείχε διάλυµα διθειοθρεϊτόλης σε συγκέντρωση 5µg/ml για 30 λεπτά. Έπειτα αφαιρέθηκε το διάλυµα της διθειοθρεϊτόλης και προστέθηκε χωρίς ξέπλυµα διάλυµα 0,1% (w/v) σε νιτρικό άργυρο. Τέλος έγινε απόρριψη του διαλύµατος του νιτρικού αργύρου και αφού το πήγµα ξεπλύθηκε δυο φορές µε νερό, επωάστηκε µε το διάλυµα εµφάνισης 3% (w/v) Να 2 CO 3 και 0,0185 (v/v) HCHO. H αντίδραση έλαβε τέλος µε την προσθήκη διαλύµατος 2.3Μ κιτρικού οξέος. Το πήγµα ξεπλύθηκε και διατηρήθηκε σε νερό στους 4 ο C. Όλα τα σταδία πραγµατοποιήθηκαν υπό συνεχή ανάδευση Έκφραση και αποµόνωση χιµαιρικών GST πρωτεϊνών µε τη χρήση σφαιριδίων γλουταθείονης-αγαρόζης Μια αποδοτική µέθοδος για την υπερέκφραση µιας πρωτεΐνης και τον µετέπειτα καθαρισµό της, είναι η σύντηξη της επιθυµητής πρωτεΐνης µε την (GST) τρανσφεράση-s-της γλουταθειόνης. Η γενική στρατηγική για τον καθαρισµό που ακολουθείται είναι η δέσµευση της GST χιµαιρικής πρωτεΐνης σε στήλη ακινητοποιηµένης γλουταθειόνης, η αποµάκρυνση µε έκπλυση της στήλης του µη δεσµευµένου εκχυλίσµατος, και τελικά έκλουση της πρωτεΐνης από την στήλη. Οι χιµαιρικές GST πρωτεΐνες υπερεκφράστηκαν στο βακτήριο E.coli BL21(DE) ή BL21, το οποίο ύστερα από µετασχηµατισµό, έφερε ένα 18

31 Υλικά και Μέθοδοι ανασυνδυασµένο pgex πλασµίδιο. Η πρωτεϊνική έκφραση από αυτό το πλασµίδιο υπόκειται του ελέγχου του υποκινητή tac (tac promoter), o οποίος επάγεται χρησιµοποιώντας το ανάλογο της λακτόζης, το IPTG (isopropyl-β-d-thiogalactoside). Οι επαγώµενες από το IPTG βακτηριακές καλλιέργειες διευκολύνουν την υπερέκφραση των GST χιµαιρικών πρωτεϊνών. Στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν ύστερα από κατεργασία είτε µε υπερήχους, (Branson Digital Sonifier R 250-D, USA), είτε µε µηχανικά µέσα µε την χρήση του French pressure cell (SIM-AMINCO, PSI) Χρωµατογραφία αγχιστείας (σφαιρίδια αγαρόζης- γλουταθειόνης) Οι πρωτεΐνες αυτές εκφράστηκαν στα επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα BL21 (protease free) και BL21(DE) του βακτηρίου E.coli. Ακολουθήθηκε η εξής πορεία: Ύστερα από µετασχηµατισµό του βακτηρίου E.coli µε τα αντίστοιχα pgex πλασµίδια, ακολούθησε επώαση της καλλιέργειας στους 37 ο C. Όταν η οπτική απορρόφηση έφτασε την τιµή 0,6 (OD 600nm =0,6), δηλαδή στην λογαριθµική φάση ανάπτυξης των κυττάρων, προστέθηκε IPTG σε τελική συγκέντρωση 300 µm. Aκολούθησε περαιτέρω επώαση στους 37 ο C για ακόµη δύο ώρες (υπερέκφραση των GST χιµαιρικών πρωτεϊνών). Μετά το πέρας των 2 ωρών τα κύτταρα συλλέχθηκαν µε φυγοκέντρηση, 6.000g Sorvall RC-5B, Refrigerated Superspeed Centrifuge, Germany, κεφαλή GSA, για 15 λεπτά. Το ίζηµα των κυττάρων επαναδιαλύθηκε, στον πάγο, σε συνολικό όγκο 20 ml διαλύµατος (50 mm Tris ph 8, 1 mm EDTA, 150 mm NaCl, 0.5% NP-40, protease inhibitors). Aκολούθησε λύση των κυττάρων µε µηχανικά µέσα (french press). Το εκχύλισµα συλλέχθηκε και αµέσως φυγοκεντρήθηκε, g Sorvall, κεφαλή SS-34, για 30 λεπτά, στους 4 ο C. Το υπερκείµενο υπέστη διαπίδυση σε διάλυµα: 150 mm NaCl, 20 mm Ηepes ph 7.9, 0.1% Nonidet P40, 1 mm DTT, 0.2mM EDTA, 0.5mM PMSF, στους 4 ο C. Οι χιµαιρικές GST-CBP πρωτεΐνες επωάστηκαν µε σφαιρίδια γλουταθειόνης και η έκφραση τους ελέγχθηκε µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή 10%, SDSπολυακρυλαµιδίου. 19

32 Αποτελέσµατα 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ: Το σύστηµα των δύο υβριδίων σε κύτταρα ζύµης Αρχή της προσέγγισης Το σύστηµα των δύο υβριδίων είναι µια δυναµική µοριακή γενετική µέθοδος, η οποία αξιοποιεί την ευελιξία που παρατηρείται στις δοµές των ενεργοποιητών προκειµένου να προσδιορίσει γονίδια των οποίων τα προϊόντα αλληλεπιδρούν µε την πρωτεΐνη που ενδιαφέρει τον εκάστοτε ερευνητή (Fields and Song, 1989). Στηρίζεται στην δυνατότητα λειτουργικής συµπλήρωσης (functional complementation) µεταξύ δυο διακριτών πρωτεϊνικών περιοχών εφόσον έρθουν σε άµεση ή έµµεση αλληλεπίδραση µέσα στον πυρήνα κυττάρων ζύµης. Στο σύστηµα των δύο υβριδίων, η πρωτεΐνη, της οποίας τις αλληλεπιδράσεις θέλουµε να µελετήσουµε (δόλωµα-bait domain), κλωνοποιείται, σε φορέα ζύµης, συντηγµένη µε την περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA-binding domain) ενός ενεργοποιητή της µεταγραφής διαµέσου µιας ευέλικτης συνδετικής περιοχής (linker region). Η υβριδική αυτή πρωτεΐνη αποκαλείται υβρίδιο-δόλωµα (bait hybrid). Από την άλλη πλευρά τα cdna µιας βιβλιοθήκης κλωνοποιούνται σε ένα δεύτερο φορέα ζύµης. Ο φορέας αυτός εκφράζει τις πρωτεΐνες, οι οποίες κωδικοποιούνται από τα cdna της βιβλιοθήκης (θηράµατα-preys), συντηγµένες µε την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής του ίδιου µε το δόλωµα ενεργοποιητή διαµέσου µιας συνδετικής περιοχής (αλιευτικό υβρίδιο-fish domain). Στη συνέχεια ο φορέας που φέρει το δόλωµα και οι φορείς της βιβλιοθήκης που περιέχουν τα θηράµατα µετασχηµατίζονται σε γενετικά τροποποιηµένα κύτταρα ζύµης, στα οποία το µόνο αντίγραφο ενός γονιδίου που απαιτείται για τη σύνθεση της ιστιδίνης υπόκειται στον έλεγχο ενός UAS (Upstream Αctivating Sequence) µε θέσεις δέσµευσης για την περιοχή πρόσδεσης στο DNA του υβριδίουδολώµατος. Έτσι, η ενεργοποίηση του γονιδίου της ιστιδίνης πραγµατοποιείται στα µετασχηµατισµένα κύτταρα που εκφράζεται το δόλωµα και η αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη θήραµα (Εικόνα 5). Η ανίχνευση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων γίνεται διαµέσου επιλογής δύο σταδίων. Ο φορέας δόλωµα εκτός από την πρωτεΐνη που µας ενδιαφέρει εκφράζει επίσης το γονίδιο TRP (θρυπτοφάνη), ενώ ο φορέας θήραµα εκφράζει το γονίδιο LEU (λευκίνη). Τα µετασχηµατισµένα κύτταρα αναπτύσσονται αρχικά σε θρεπτικό υλικό το οποίο δεν έχει θρυπτοφάνη και λευκίνη, αλλά περιέχει ιστιδίνη. Στο θρεπτικό µέσο επιβιώνουν µόνο τα 20

33 Αποτελέσµατα κύτταρα που έχουν τον φορέα δόλωµα καθώς και ένα από τα πλασµίδια θήραµα. Στην συνέχεια τα κύτταρα που έχουν επιβιώσει επιστρώνονται σε τρυβλία που δεν περιέχουν ιστιδίνη. Αυτά τα κύτταρα στα οποία εκφράζεται µια πρωτεΐνη θήραµα που δεν αλληλεπιδρά µε το δόλωµα δεν παράγουν ιστιδίνη και εποµένως δεν σχηµατίζουν αποικία σε αυτό το θρεπτικό υλικό. Αντιθέτως τα κύτταρα στα οποία πραγµατοποιείται η αλληλεπίδραση αναπτύσσονται και σχηµατίζουν αποικίες στο θρεπτικό µέσο χωρίς ιστιδίνη. Το τελευταίο βήµα είναι η ανάκτηση του φορέα θηράµατος από αυτές τις αποικίες και η εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του cdna. Εικόνα 5: Σχηµατική απεικόνιση της αρχής του συστήµατος των δύο υβριδίων α) Το υβρίδιο-δόλωµα (bait hybrid) (αριστερό σχήµα) περιλαµβάνει την περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA-binding domain) ενός µεταγραφικού παράγοντα συντηγµένη µε την αλληλουχία που εκφράζει την πρωτεΐνη που µας ενδιαφέρει (τοµέας δόλωµα-bait domain). Το αλιευτικό υβρίδιο (fish domain) (δεξί σχήµα) περιλαβάνει την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής (αctivation domain) συντηγµένη µε την πρωτεΐνη θήραµα (prey ή fish domain). β) Στα κύτταρα ζύµης, τα οποία έχουν µετασχηµατιστεί µε τους δυο φορείς, όταν οι πρωτεΐνες δόλωµα και θήραµα αλληλεπιδρούν παρατηρείται το φαινόµενο της λειτουργικής συµπλήρωσης µε αποτέλεσµα την έκφραση γονιδίων επιλογής ( 21

34 Αποτελέσµατα Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν σαν υβρίδια-δολώµατα περιοχές της SARA συντηγµένες µε την περιοχή σύνδεσης στο DNA των µεταγραφικών παραγόντων GAL4 (GAL4-BD) και LEXA (LEXA-BD), ενώ σαν αλιευτικά υβρίδια οι πρωτεΐνεςθηράµατα συντηγµένες µε τις περιοχές ενεργοποίησης της µεταγραφής των ιδίων µεταγραφικών παραγόντων (GAL4-AD και LEXA-AD) (εικόνα 6). Εικόνα 6: Σχηµατική απεικόνιση της πειραµατικής διαδικασίας του συστήµατος των δύο υβριδίων σε κύτταρα ζύµης. Στο σύστηµα των δυο υβριδίων η πρωτεΐνη δόλωµα που χρησιµοποιήθηκε (SARΑ) ήταν συντηγµένη µε την περιοχή σύνδεσης στο DNA των µεταγραφικών παραγόντων GAL4 ή LEXA (GAL4-BD ή LEXA-BD). Από την άλλη πλευρά, οι υποψήφιες για αλληλεπίδραση πρωτεΐνες της βιβλιοθήκης ήταν συντηγµένες µε την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής των ιδίων παραγόντων (GAL4-AD ή LEXA-AD). Όταν το δόλωµα και οι πρωτεΐνες της βιβλιοθήκης αλληλεπιδρούν, τότε η περιοχή σύνδεσης στο DNA και η περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής έρχονται πολύ κοντά στο χώρο και έτσι ενεργοποιείται η µεταγραφή των γονίδιων αναφοράς Το σύστηµα Gal4 Για να ανιχνεύσουµε πιθανές αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης SARA εφαρµόσαµε το σύστηµα των δυο υβριδίων σε κύτταρα ζύµης. Επειδή η πρωτεΐνη αυτή έχει µεγάλο µοριακό βάρος (1323 αµινοξέα) και δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί στο σύστηµα των δυο υβριδίων αποτελεσµατικά δηµιουργήσαµε τµήµατα της. Κλωνοποιήσαµε το αµινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης SARA συµπεριλαµβανοµένου όχι του τοµέα SBD (Εικόνα 7, 22

35 Αποτελέσµατα κατασκευές 1 και 2, αντίστοιχα) στον πλασµιδιακό φορέα PAS1-CYH2 (Clontech Laboratories), καθοδικά της περιοχής που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Gal4. Ο φορέας PAS1- CYH2 περιέχει επίσης το γονίδιο για την έκφραση της θρυπτοφάνης και εποµένως το στέλεχος ζύµης που µετασχηµατίζεται είναι αυξότροφο για το αµινοξύ αυτό. Επίσης όπως φαίνεται στην ίδια εικόνα δηµιουργήθηκαν οι κατασκευές του καρβόξυ τελικού τµήµατος της πρωτεΐνης περιλαµβανοµένου ή µη του τοµέα πρόσδεσης µε τις SMADs (Εικόνα 7, κατασκευή 3 και 4 αντίστοιχα). Εικόνα 7: Κατασκευές που χρησιµοποιήθηκαν για ανεύρεση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε την SARA µε το σύστηµα των δύο υβριδίων. Στην απεικόνιση µε το νούµερο 1 παρουσιάζεται το άµινο-τελικό άκρο της SARA (αµινοξέα 1-719) το οποίο είναι συντηγµένο µε τον τοµέα της GAL4 που είναι υπεύθυνος για την πρόσδεση το DNA. Στο νούµερο 2 απεικονίζεται η κατασκευή όπου το άµινο-τελικό άκρο της SARA χωρίς την SBD είναι συντηγµένο µε τον τοµέα Gal4. Οι κατασκευές του καρβόξυ τελικού τµήµατος της περιλαµβανοµένου ή µη του τοµέα πρόσδεσης µε τις SMADs (SBD) παρουσιάζονται αντίστοιχα µε το νούµερο 3 και 4. Η πλήρους µήκους SΑRA απεικονίζεται µε τον κωδικό FL. 23

36 Αποτελέσµατα Κύτταρα ζύµης µετασχηµατίστηκαν µε το πλασµίδιο Gal4-N-SARA (Εικόνα 7, κατασκευή 1) και µε ανοσοαποτύπωση ελέγχθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης την οποία εκφράζει (Εικόνα 8, διαδροµή 3). Αφού ελέγξαµε την έκφραση της χιµαιρικής πρωτεΐνης µέσα σε κύτταρα ζύµης το επόµενο βήµα πριν προχωρήσουµε στο µετασχηµατισµό µε την βιβλιοθήκη ήταν η δοκιµασία για τον έλεγχο της αυτενεργοποιήσης του γονιδίου αναφοράς της (βλέπε υλικά και µέθοδοι 2.10). Το φαινόµενο της αυτενεργοποιήσης έχει παρατηρηθεί στην βιβλιογραφία και είναι ένα αδύνατο σηµείο του συστήµατος (Beranger et al., 1997). Χρησιµοποιώντας λοιπόν την παραπάνω πλασµιδιακή κατασκευή, παρατηρήσαµε ότι αυτή από µόνη της ενεργοποιούσε το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης και εποµένως δεν µπορούσε να χρησιµοποιηθεί αυτή η κατασκευή που είναι συντηγµένη µε την Gal4 για περαιτέρω συν-µετασχηµατισµό µε την βιβλιοθήκη (Εικόνα 9, σχήµα Β). Επίσης, και οι άλλες κατασκευές της SARA που εξέφραζαν είτε το αµινοτελικό άκρο της χωρίς τον τοµέα SBD (Εικόνα 7, κατασκευή 2) είτε το καρβοξυτελικό-άκρο της µε (Εικόνα 7, κατασκευή 3) ή χωρίς τον τοµέα SBD (Εικόνα 7, κατασκευή 4) και χρησιµοποιήθηκαν µε την ίδια πειραµατική διαδικασία από την κ.α.πανοπούλου, επίσης αυτοενεργοποιούσαν το γονίδιο αναφοράς Εικόνα 8: Έλεγχος για την έκφραση της χιµαιρικής GAL4-N-SARΑ πρωτεΐνης σε κύτταρα ζύµης. Η χιµαιρική GAL4-N-SARΑ µετασχηµατίστηκε και εκφράστηκε σε κύτταρα ζύµης. Τα κύτταρα λύθηκαν µε διάλυµα λύσης 0,1 % SDS, 100 µμ PMSF σε PBS, ενώ ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων και ανοσοαποτύπωση. 24

37 Αποτελέσµατα Εικόνα 9. οκιµασία για τον έλεγχο της αυτοενεργοποίησης (β-galactosidase Filter Lift Assay. Στο σχήµα Α παρουσιάζεται η θετική περίπτωση αυτενεργοποίησης της κατασκευής Gal4-C-SARA, ενώ στο σχήµα Β η κατασκευή Gal4-Ν-SARA. Η δοκιµασία β-galactosidase Filter Lift Assay περιγράφεται (υλικά και µέθοδοι 2.10) To σύστηµα LexA Με το δεδοµένο λοιπόν ότι οι κατασκευές GAL4 αυτενεργοποιούσαν το γονίδιο αναφοράς της β-γαλακτοσιδάσης οδηγηθήκαµε στο δεύτερο διαδεδοµένο σύστηµα που εφαρµόζεται στο σύστηµα των δύο υβριδίων (LEXA σύστηµα). Χρησιµοποιώντας το καρβοξυτελικό τµήµα της πρωτεΐνης SARA συνεργαστήκαµε µε την εταιρία Hybrigenics, που εδρεύει στη Γαλλία (Hybrigenics Headquarters 3-5 impasse Reille 75014, Paris France) και εξειδικεύεται στο σύστηµα δύο υβριδίων. Για την ανεύρεση αλληλεπιδράσεων µε το σύστηµα αυτό, ανατέθηκε στην εταιρία Hybrigenics να κάνει το πείραµα στα εργαστήρια της χρησιµοποιώντας την κατασκευή του καρβόξυτελικού άκρου της SARA, το ίδιο ακριβώς µέρος της πρωτεΐνης που χρησιµοποιήσαµε και στην βιοχηµική προσέγγιση (αποτελέσµατα 3.2.1). Λεπτοµέρειες για τον τρόπο της πειραµατικής πορείας που ακολουθήθηκε από την εταιρεία δεν περιγράφονται στην παρούσα πτυχιακή εργασία, αλλά είναι διαθέσιµες στον δικτυακό τόπο της Hybrigenics. Με το LexA σύστηµα των δύο υβριδίων ταυτοποιήθηκαν 21 πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε την SARA (Εικόνα 10). Η αξία και η βεβαιότητα των αλληλεπιδράσεων ταξινοµείται από την Hybrigenics µε ένα προβλεπόµενο βιολογικό στατιστικό σκορ PBS (Predictive Biological Score). Το PBS στηρίζεται στα πειραµατικά δεδοµένα και λαµβάνει υπόψη ξεχωριστά κάθε αλληλεπίδραση (Rain et al., 2001). Ειδικότερα η τιµή PBS ποσοτικοποιεί την αξιοπιστία κάθε αλληλεπίδρασης και βασίζεται σε ένα στατιστικό µοντέλο που λαµβάνει υπόψη τον ανταγωνισµό για την δέσµευση στο δόλωµα (bait) ανάµεσα στα διάφορα τµήµατα των 25

38 Αποτελέσµατα πρωτεϊνών θηραµάτων (preys) και διακυµαίνεται από την τιµή 0 (ειδική αλληλεπίδραση) µέχρι και 1 (πιθανό τεχνικό λάθος). Για πρακτικούς λόγους οι τιµές αυτές διαιρούνται σε τέσσερις κατηγορίες, από το A (τιµή πλησιέστερα στο 0) στο D (πλησιέστερα του 1). Στους παρακάτω πίνακες (Πίνακας 1 και 2) περιγράφονται οι πρωτεΐνες (και το όνοµα του γονιδίου) που ανιχνεύθηκαν µε το σύστηµα αυτό ενώ έχουν ταξινοµηθεί σε σχέση µε την κατηγορία της τιµής PBS. Ακόµη στους ίδιους πίνακες υπάρχει ο αριθµός των κλώνων, για κάθε πρωτεΐνη, που αποµονώθηκαν για αλληλούχιση καθώς επίσης και ορισµένα βιολογικά χαρακτηριστικά και στοιχεία µοριακής λειτουργίας. Εικόνα 10: Σχηµατική απεικόνιση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του καρβόξυτελικού άκρου της SARA ( ) µε βάση την µοριακή βιολογική προσέγγιση, χρησιµοποιώντας το LexA σύστηµα των δύο υβριδίων. Στην εικόνα αυτή παρουσιάζονται οι πρωτεΐνες που µε βάση το σύστηµα των δυο υβριδίων αλληλεπιδρούν µε την πρωτεΐνη C-SARA και ανήκουν στην κατηγορία Α (βλέπε και πίνακα 1). 26

39 Αποτελέσµατα Πίνακας 1: Γονίδια που ανιχνεύθηκαν µε βάση το σύστηµα των δυο υβριδίων σε κύτταρα ζύµης (LexA σύστηµα) και ανήκουν στην Α κατηγορία. Πίνακας 2: Γονίδια που ανιχνεύθηκαν µε βάση το σύστηµα των δυο υβριδίων σε κύτταρα ζύµης (LexA σύστηµα) και ανήκουν στις κατηγορίες B ως και D. 27

40 Αποτελέσµατα Μια πρώτη προσέγγιση των αποτελεσµάτων του συστήµατος των δύο υβριδίων έγινε µε βιοπληροφορική επεξεργασία των αλληλοεπιδράσεων που ανιχνεύθηκαν. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω (βλέπε 3.1.4) τα θηράµατα πρωτεΐνες συνήθως δεν είναι ολόκληρες πρωτεΐνες, αλλά τµήµατα αυτών. Έτσι, για κάθε αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη µπορούν να βρεθούν αρκετοί κλώνοι, οι οποίοι αλληλεπιδρούν µε την SARA (Πίνακας 1 και 2) και οι οποίοι αντιπροσωπεύουν ένα τµήµα της πρωτεΐνης αυτής. Τα τµήµατα αυτά µπορεί να αλληλεπικαλύπτονται ή να είναι ξεχωριστά. Συγκρίνοντας τα τµήµατα αυτά καταλήξαµε στην ανεύρεση των ελάχιστων τµηµάτων της πρωτοταγούς αλληλουχίας, τα οποία είναι πρέπει να είναι υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση. Στην Εικόνα 11 παρουσιάζεται η δοµική οργάνωση έξι πρωτεϊνών που ανήκουν στην Α κατηγορία σε σχέση µε την ελάχιστη περιοχή που βρέθηκε να αλληλεπιδρά µε την SARA (πράσινες διακεκοµµένες γραµµές) και οι οποίες θα αποτελέσουν την βάση λεπτοµερέστερης δοµικής ανάλυσης της αλληλεπίδρασης µε την SARA. Για την ανεύρεση της δοµικής ανάλυσης των πρωτεϊνών χρησιµοποιήθηκε ο δικτυακός τόπος ενώ για τον χαρακτηρισµό και την αλληλουχία των αµινοξέων ο δικτυακός τόπος 28

41 Αποτελέσµατα Εικόνα 11: Σχηµατική απεικόνιση της δοµικής οργάνωσης ορισµένων πρωτεϊνών που ανιχνεύτηκαν µε το σύστηµα των δύο υβριδίων και της ελάχιστης περιοχής, η οποία αλληλεπιδρά µε την SARA. Συγκρίνοντας τις αλληλουχίες των κλώνων, οι οποίοι αλληλεπιδρούν µε την SARA (Πίνακας 1), καταλήξαµε στην ανεύρεση των ελάχιστων τµηµάτων της πρωτοταγούς αλληλουχίας, τα οποία είναι υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση (περιοχή µε πράσινο χρωµατισµό). 29

42 Αποτελέσµατα 3.2 ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ: Ανοσοκατακρήµνιση και πρωτεοµική Γενικά-Στρατηγική της προσέγγισης Για την ανεύρεση πιθανών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε την SARA, η δεύτερη προσέγγιση που χρησιµοποιήσαµε ήταν η βιοχηµική. Κατά την προσέγγιση αυτή, ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα µολύνονται µε ανασυνδυασµένους αδενοΐους που εκφράζουν την πρωτεΐνη SARA συντηγµένη µε το οκταπεπτίδιο FLAG. Η FLAG-SARA εκφράζεται µέσα στο κύτταρο και οι αλληλεπιδράσεις της µε άλλες πρωτεΐνες συµβαίνουν εντός του κυττάρου. Εικόνα 12: Πειραµατική προσέγγιση για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών οι οποίες αλληλεπιδρούν µε την SARA χρησιµοποιώντας χρωµατογραφία συγγένειας και πρωτεοµική.1. µόλυνση ενδοθηλιακών κυττάρων µε αδενοϊο που εκφράζει την πρωτεΐνη SARA ή την C-SARA συντηγµένη µε το οκταπεπτίδιο FLAG, 2. λύση των ενδοθηλιακών κυττάρων, 3. επώαση του κυτταρικού εκχυλίσµατος µε σφαιρίδια τα οποία φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το αντίσωµα που αναγνωρίζει τον επίτοπο FLAG, 4. έκλουση από τα σφαιρίδια, 5. ανάλυση του εκλουσµάτων µε ηλεκτροφόρηση SDS- PAGE, 6.χρώση του πήγµατος µε νιτρικό άργυρο, και 7. αποκοπή των ζωνών και ταυτοποίηση των πρωτεϊνών µε φασµατοµετρία µάζας. 30

43 Αποτελέσµατα Στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέγονται, λύονται και το κυτταρικό εκχύλισµα επωάζεται µε σφαιρίδια, τα οποία φέρουν οµοιοπολικά συνδεδεµένο ένα µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι του επιτόπου FLAG. Σε αυτό το στάδιο, η αλληλεπίδραση του οκταπεπτιδίου FLAG µε το αντίσωµά επιτρέπει στη FLAG-SARA να συνδεθεί µε τα σφαιρίδια και µαζί της όλες οι αλληλεπιδρώσες µε αυτή πρωτεΐνες. Μετά από εκτεταµένες πλύσεις των σφαιριδίων, εκλούεται η FLAG-SARA (µαζί µε τις αλληλεπιδρώσες πρωτεΐνες) από τα σφαιρίδια και το έκλουσµα ηλεκτροφορείται µε SDS-PAGE. Οι ζώνες, οι οποίες προκύπτουν, συγκρίνονται µε της ζώνες του πειράµατος-µάρτυρα, όπου τα ενδοθηλιακά µολύνονται µε αδενοϊό, ο οποίος εκφράζει µόνο την GFP πρωτεΐνη. Τελικά από τη σύγκριση των δυο δειγµάτων στην ηλεκτροφόρηση επιλέγονται πολύ προσεκτικά οι πρωτεϊνικές ζώνες, οι οποίες εµφανίζονται διαφορικά στην ανοσοκατακρήµνιση της SARA. Οι ζώνες αυτές αποκόπτονται από το πήγµα και στέλνονται για ταυτοποίηση µε τη µέθοδο της φασµατοµετρία µάζας (Εικόνα 12) Κατασκευές-Αδενοϊοί Οι αδενοϊοί που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία εκφράζουν το οκταπεπτίδιο FLAG συντηγµένο στο αµινοτελικό άκρο είτε της πλήρους µήκους πρωτεΐνης SARA (Αd- FLAG-SARA) είτε στο καρβοξυτελικό άκρο της SARA (αµινοξέα ) (Αd-FLAG- SARA 1-665) (Εικόνα 13). Η FLAG-SARA δεν περιέχει την περιοχή FYVE, ενώ περιλαµβάνει τις περιοχές SBD (SMAD Binding Domain) και PBD (Phosphatase Binding Domain). Η περιοχή FYVE είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση της πρωτεΐνης µε 3- φωσφορικές φωσφατιδυλοϊνοσιτόλες των µεµβρανικών λιπιδίων. Η αποκοπή του τοµέα FYVE πραγµατοποιήθηκε για να έχει η πρωτεΐνη κυρίως κυτταροπλασµατική εντόπιση, και εποµένως να εκχυλίζεται µε ήπια µέσα (Driscoll, 2001; Panopoulou et al., 2002) 31

44 Αποτελέσµατα Eικόνα 13: Σχηµατική απεικόνιση των κατασκευών της πρωτεΐνης SARA, οι οποίες χρησιµοποιήθηκαν στην βιοχηµική προσέγγιση. 1. FLAG-SARA 2. FLAG- SARA φυσικού τύπου SARA για σύγκριση. SBD: SMAD-Binding Domain, περιοχή σύνδεσης µε SMAD, PBD: Phosphatase-Binding Domain, περιοχή σύνδεσης µε τη φωσφατάση PP1, FYVE: Fab1p, YOTB, Vac1p και EEA1, περιοχή σύνδεση της πρωτεΐνης µε 3-φωσφορικές φωσφατιδυλοϊνοσιτόλες των µεµβρανικών λιπιδίων ιερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της FLAG-SARA σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο αδενοϊός ο οποίος εκφράζει την SARA (Ad-SARA 1-664) πολλαπλασιάσθηκε σε µεγάλη κλίµακα σε κύτταρα HEK293T και µε τη δοκιµασία πλακών (plaque assay) υπολογίσθηκε ο τίτλος του (5x10 7 σωµάτια/ml). Προκειµένου να προσδιορισθεί ο βέλτιστος τίτλος µόλυνσης των ενδοθηλιακών κύτταρων, µολύναµε κύτταρα BBCE µε τον Ad-FLAG- SARA για 24 ώρες µε διαφορετικούς τίτλους (100 έως 300) πολλαπλότητας µόλυνσης (ΜΟΙ). Σε µια πειραµατική σειρά αφού µολύναµε τα κύτταρα έγινε αλλαγή του θρεπτικού µέσου µετά από δυο ώρες (Εικόνα 14, µαύρη γραµµή), ενώ σε µια άλλη έγινε η µόλυνση µε τον αδενοϊο χωρίς να αλλαχθεί το θρεπτικό υλικό (Εικόνα 14, κόκκινη γραµµή). Τέλος µε κυτταρική λύση και µε ανοσοαποτύπωση κατά Western έγινε εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης. Από την εικόνα 14 είναι σαφές ότι µόλυνση µε ΜΟΙ 300 για 24 ώρες 32

45 Αποτελέσµατα χωρίς αλλαγή του θρεπτικού υλικού έδωσε την µεγαλύτερη έκφραση της FLAG-SARA Εικόνα 14: Έλεγχος για τις βέλτιστες συνθήκες έκφρασης-κυτταρικής λύσης της πρωτεΐνης FLAG-SARA σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Ενδοθηλιακά BBCE κύτταρα µολύνθηκαν για 24 ώρες µε διαφορετικούς τίτλους ΜΟΙ του αδενοϊού Αd-FLAG- SARA και κατόπιν µε ανοσοαποτύπωση κατά Western τα επίπεδα έκφρασης της FLAG-SARA Η µαύρη γραµµή αντιστοιχεί στα δείγµατα στα οποία έγινε αλλαγή του θρεπτικού µέσου ύστερα από δυο ώρες, ενώ η κόκκινη γραµµή σε αυτά στα οποία δεν έγινε αλλαγή του θρεπτικού υλικού. ΜΟΙ: πολλαπλότητα µόλυνσης (Multiplicity Of Infection), NI: µη µολυσµένα (Non Infected) ιερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών κυτταρικής λύσης και πρόσδεσης στα ανοσοσφαιρίδια Από την στιγµή την οποία βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες έκφρασης των πρωτεϊνών FLAG-SARA και FLAG-SARA στα ενδοθηλιακά κύτταρα, το επόµενο βήµα ήταν η διερεύνηση των συνθηκών ανάκτησης του πρωτεϊνικού συµπλέγµατος της SARA. Η ποσοτική ανάκτηση εξαρτάται από τις συνθήκες λύσης των κυττάρων, οι οποίες πρέπει να είναι τέτοιες ώστε και η αρτιότητα του συµπλέγµατος να µην διαταράσσεται αλλά και να είναι συµβατές µε ποσοτική σύνδεση στα ανοσοσφαιρίδια. Επίσης, ο χρόνος επώασης του κυτταρικού λύµατος µε τα ανοσοσφαιρίδια πρέπει να είναι µεν επαρκής για ποσοτική σύνδεση αλλά όχι υπερβολικά παρατεταµένος προς αποφυγή πρωτεϊνικής αποικοδόµησης. Βέβαια και η έκλουση από τα σφαιρίδια επηρεάζει την τελική ανάκτηση, αλλά για αυτή γίνεται ειδική µνεία στο παρακάτω κεφάλαιο (3.2.5). Για το λόγο αυτό, στα πειράµατα βελτιστοποίησης των συνθηκών κυτταρικής λύσης και πρόσδεσης στα σφαιρίδια δεν χρησιµοποιήθηκε κάποιος τρόπος έκλουσης, αλλά η ολική προσδεθείσα στα σφαιρίδια SARA εκτιµήθηκε µε ηλεκτροφόρηση µετά από προσθήκη διαλύµατος Laemmli. Αναφορικά µε τις συνθήκες δηµιουργίας του κυτταρικού λύµατος, χρησιµοποιήθηκαν δύο προσεγγίσεις α) χρησιµοποίηση µόνο µηχανικών µέσων και β) 33

46 Αποτελέσµατα χρησιµοποίηση απορρυπαντικού στο διάλυµα λύσης. Η χρησιµοποίηση µόνο µηχανικών µέσων, παρά τη µεµβρανική εντόπιση της SARA, έγινε διότι η FLAG-SARA δεν περιελάµβανε την περιοχή FYVE, µε συνέπεια να αναµένεται να έχει κυτταροπλασµατική εντόπιση. Η χρήση απορρυπαντικού έδωσε συστηµατικά καλύτερα αποτελέσµατα σε σύγκριση µε τη χρήση κυτταροθραύστη (cell cracker) είτε χρησιµοποιήθηκε µη ιονικό (ΤΡΙΤΟΝ-Χ100, 0.1%-1%) είτε αµφοτεριονικό (CHAPS, 0.05%-0.1%) απορρυπαντικό, αναφορικά µε την ανάκτηση της FLAG-SARA (τα δεδοµένα δεν παρατίθενται). Πράγµατι, στην εικόνα 15Α (διαδροµή 2), όπου χρησιµοποιήθηκε 1% TRITON-X100, φαίνεται ότι η ανάκτηση της SARA είναι σαφώς καλύτερη από την ανάκτηση µετά από χρήση κυτταροθραύστη (cell cracker) (Εικόνα 15Β, διαδροµή 2). Η υπεροχή της χρήσης απορρυπαντικού στην κυτταρική λύση είναι συµβατή µε προηγούµενες παρατηρήσεις από το εργαστήριό µας ότι παρά την απάλειψη της περιοχής FYVE από την SARΑ αυτή κατανέµεται περίπου εξίσου µεταξύ κυτταροπλάσµατος και µεµβρανών (διπλωµατική εργασία Π. Ντζιαχρήστου). Έτσι, στα παραπέρα πειράµατα υιοθετήθηκε η χρησιµοποίηση ΤΡΙΤΟΝ-Χ100 σε 0.5% συγκέντρωση επειδή έδωσε την ίδια καλή ανάκτηση µε την συγκέντρωση 1% (τα δεδοµένα δεν παρατίθενται). Χρησιµοποιώντας τις συνθήκες αυτές σαν άξονα έγινε προσπάθεια βελτιστοποίησης του χρόνου επώασης του λύµατος µε τα ανοσοσφαιρίδια. Στα πειράµατα αυτά, ο χρόνος των 5 ωρών αποδείχθηκε ο καλύτερος αναφορικά µε την ποσοτική ανάκτηση µη αποικοδοµηµένης πρωτεΐνης (τα δεδοµένα δεν παρατίθενται). 34

47 Αποτελέσµατα Εικόνα 15: Σύγκριση της ανάκτησης της FLAG-SARA µετά από κυτταρική λύση µε απορρυπαντικό σε σχέση µε αυτή µετά από λύση µε κυτταροθραύστη. Α). Ενδοθηλιακά HUVE κύτταρα µολύνθηκαν µε τον Ad-FLAG-SARA Ύστερα από την λύση των κυττάρων µε τη χρήση του απορρυπαντικού TRITON-X100 σε τελική συγκέντρωση 1% ακολούθησε υπερφυγοκέντρηση (100,000g) και το υπερκείµενο εφαρµόστηκε σε σφαιρίδια που φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το αντι-flag αντίσωµα. Tελικά πραγµατοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των εκπλυµάτων και των σφαιριδίων (µετά από προσθήκη διαλύµατος Laemmli) και ανοσοαποτύπωση µε το αντι-flag αντίσωµα. Β) Σαν την εικόνα Α εκτός από την λύση των κυττάρων, η οποία έγινε µε κυτταροθραύστη Α. ΝΙ: κύτταρα µη µολυσµένα µε αδενοϊό (not infected) ιερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών έκλουσης Για την εύρεση των κατάλληλων συνθηκών έκλουσης του συµπλέγµατος της FLAG- SARA από τα σφαιρίδια, τα οποία φέρουν οµοιοπολικά συνδεδεµένο το αντι-flag αντίσωµα, χρησιµοποιήθηκαν ειδικοί και µη ειδικοί τρόποι έκλουσης. Σαν µη ειδικός τρόπος έκλουσης χρησιµοποιήθηκε υψηλή συγκέντρωση αλατιού (1 M NaCl). Με την έκλουση αυτή η FLAG-SARA ανιχνεύτηκε στο έκλουσµα και όχι στα σφαιρίδια (Εικόνα 16Α). Για περισσότερο ειδική έκλουση χρησιµοποιήθηκε το πεπτίδιο 3ΧFLAG. Το ειδικό αυτό πεπτίδιο απαρτίζεται από τρείς συνεχόµενες αλληλουχίες του οκταπεπτίδιου FLAG, µε το οποίο είναι συντηγµένη η SARA, και ανταγωνίζεται ειδικά την FLAG- SARA αναφορικά µε την πρόσδεση στα ανοσοσφαιρίδια. Ελέγχθηκαν δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του 3XFLAG (0,2µg/µl και 1µg/µl). Η συγκέντρωση 0,2µg/µl δεν οδήγησε σε έκλουση της FLAG-SARA καθώς αυτή παρέµεινε αποκλειστικά 35

48 Αποτελέσµατα συνδεµένη µε τα σφαιρίδια (Εικόνα 16Β). Αντίθετα, η συγκέντρωση 1µg/µl προκάλεσε την ολοκληρωτική ανακατανοµή της FLAG-SARA στο έκλουσµα (Εικόνα 16Γ). Από την σειρά αυτήν των πειραµάτων καταλήξαµε στο συµπέρασµα ότι η έκλουση από τα σφαιρίδια µπορεί να γίνει αποτελεσµατικά µε µη ειδικούς και ειδικούς τρόπους, αλλά σαφώς οι τελευταίοι αναµένονται να δίνουν έκλουσµα µεγαλύτερης καθαρότητας. Έτσι, επιλέξαµε τη χρήση του 3XFLAG 1µg/µl συγκέντρωση για την έκλουση της FLAG- SARA από τα σφαιρίδια. Εικόνα 16: Μελέτη των συνθηκών έκλουσης της FLAG-SARA από τα σφαιρίδια. Ύστερα από την λύση των κυττάρων µε τη χρήση του απορρυπαντικού TRITON X-100 σε τελική συγκέντρωση 1% ακολούθησε υπερφυγοκέντρηση (100,000g) και στο υπερκείµενο προστέθηκαν σφαιρίδια που φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το αντι-flag αντίσωµα. Tελικά, µετά από επανειληµµένες πλύσεις, πραγµατοποιήθηκε έκλουση από την στήλη µε τέσσερις διαφορετικές προσεγγίσεις, Α) Για την έκλουση από την στήλη χρησιµοποιήθηκε διάλυµα έκλουσης µε συγκέντρωση 1M NaCl, Β) το πεπτίδιο 3XFLAG σε συγκέντρωση 0,2µg/µl, Γ) το πεπτίδιο 3XFLAG σε συγκέντρωση 1µg/µl. Στις εικόνες φαίνονται τα ηλεκτροφορήµατα των εκπλυµάτων (διαδροµή 2) και των σφαιριδίων (διαδροµή 1) που έχουν υποστεί ανοσοαποτύπωση µε το FLAG αντίσωµα. Οι βέλτιστες συνθήκες για την FLAG-SARA χρησιµοποιήθηκαν για την ανάκτηση της FLAG-SARA µετά από µόλυνση ενδοθηλιακών κυττάρων µε τον αντίστοιχο αδενοϊό. Ενώ, η ανάκτηση της FLAG-SARA ήταν πολύ καλή, ωστόσο η πρωτεΐνη παρουσίαζε έντονη αποικοδόµηση (Εικόνα 17). Για αυτόν τον λόγο αυτό συνεχίσαµε τα παραπέρα πειράµατα για την ταυτοποίηση αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών µε την FLAG- SARA

49 Αποτελέσµατα Εικόνα 17: Ανάκτηση της πλήρους µήκους πρωτεΐνης SARA. Ενδοθηλιακά HUVE κύτταρα µολύνθηκαν µε τον Ad-FLAG-SARA. Ύστερα από την λύση των κυττάρων µε τη χρήση του απορρυπαντικού TRITON-X100 σε τελική συγκέντρωση 1% ακολούθησε υπερφυγοκέντρηση (100,000g) και το υπερκείµενο εφαρµόστηκε σε σφαιρίδια που φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το αντι-flag αντίσωµα. Tελικά πραγµατοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των εκπλυµάτων και των σφαιριδίων και ανοσοαποτύπωση µε το αντι-flag αντίσωµα. Α: Σφαιρίδια και µεµβρανικό κλάσµα Β; Έκλουσµα; ΝΙ: κύτταρα µη µολυσµένα µε αδενοϊό (not infected), Ι: κύτταρα µολυσµένα µε αδενοϊο (infected) Έλεγχος της διαδικασίας χρησιµοποιώντας τη γνωστή από την βιβλιογραφία αλληλεπίδραση της SARA µε την SMAD2 πρωτεΐνη. Η παρουσία της περιοχής SBD (SMAD Binding Domain), η οποία είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση της SARA µε τις πρωτεΐνες SMAD, στην FLAG-SARA αποτελεί σηµαντικό εργαλείο ελέγχου της αναπτυχθείσας διαδικασίας αλίευσης αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών µε την SARA. Έτσι, µετά από µόλυνση µε τον αδενοϊό Ad-FLAG-SARA κύτταρα HEK293T λύθηκαν µε διάλυµα το οποίο περιείχε 0.5% (v/v) Triton X-100, 150mM ΝαCl, 20mM Tris-HCl, ph7.4, 1mM EDTA και τους κατάλληλους αναστολείς πρωτεασών. Το κυτταρικό λύµα επωάστηκε µε τα ανοσοσφαιρίδια για 5 ώρες, ενώ για την έκλουση χρησιµοποιήθηκε το πεπτίδιο 3ΧFLAG σε τελική συγκέντρωση 1µg/µl Πράγµατι, η SMAD2 βρέθηκε στο έκλουσµα των σφαιριδίων όταν τα κύτταρα είχαν µολυνθεί µε τον αδενοϊό Ad-FLAG-SARA (Εικόνα 18, 2) και όχι µε τον αδενοϊό Ad-control 37

50 Αποτελέσµατα (Εικόνα 18, 3). Το ίδιο παρατηρήθηκε και σε κύτταρα ΒΒCE (τα δεδοµένα δεν παρατίθενται). Εποµένως, η µεθοδολογία της συν-ανοσοκατακρήµνισης, την οποία αναπτύξαµε, ανιχνεύει τη γνωστή αλληλεπίδραση της SARA µε τη SMAD2 πρωτεΐνη. Αυτό σηµαίνει ότι οι συνθήκες αυτές, αφού επιτρέπουν την πραγµατοποίηση της προαναφερθείσας αλληλεπίδρασης, είναι πιθανότατα κατάλληλες για την εύρεση και των υπόλοιπων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της SARA στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εικόνα 18: Έλεγχος του συστήµατος για την ανοσοκατακρήµνιση της πρωτεΐνης SMAD2. Λύµα κυττάρων HEK293T µολυσµένων µε τον αδενοϊό Ad-FLAG- SARA επωάσθηκε µε σφαιρίδια που φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το άντι- FLAG αντίσωµα. Μετά από επανειληµµένες πλύσεις, πραγµατοποιήθηκε έκλουση µε 3ΧFLAG, 1µg/µl και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση µε πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της SMAD2 πρωτεΐνης Μεγάλης κλίµακας συνκατακρήµνιση πρωτεϊνών, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε FLAG-SARA 1-664, και ταυτοποίηση τους µε φασµατοµετρία µάζας Σε µια πρώτη προσπάθεια ταυτοποίησης πρωτεϊνών, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε την SARA, εφαρµόσαµε την αναπτυχθείσα διαδικασία ανοσοκατακρήµνισης ξεκινώντας από 1.5 Χ 10 7 ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. υστυχώς, στις ζώνες, οι οποίες αποκόπηκαν δεν κατέστη δυνατό να ανιχνευτούν πεπτίδια µε φασµατογραφία µάζας, γιατί η συγκέντρωση τους ήταν κάτω από την ευαισθησία του συστήµατος. Ήταν φανερό ότι έπρεπε να αυξηθεί ο αριθµός των ενδοθηλιακών κυττάρων, ο οποίος χρησιµοποιείται για την συνκατακρήµνιση, προκειµένου να αυξηθεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε την FLAG-SARA 1-664, µε συνέπεια να αυξηθεί η πιθανότητα ανίχνευσης τους. Για το λόγο αυτό κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία διαστάσεων 500cm 2 µέχρι του αριθµού των 1,6Χ10 8, δηλ. αριθµού δεκαπλάσιου από την πρώτη προσπάθεια συνκατακρήµνισης. Μετά την εφαρµογή της αναπτυχθείσας µεθοδολογίας ανοσοκατακρήµνισης, στο έκλουσµα των σφαιριδίων, τα οποία είχαν επωαστεί µε το λύµα κυττάρων µολυσµένων µε τον αδενοϊό Ad-FLAG- SARA 1-664, εµφανίστηκαν επτά ζώνες µε χρώση νιτρικού αργύρου (Εικόνα 19, διαδροµή 38

51 Αποτελέσµατα Β), οι οποίες δεν ήταν ορατές στο δείγµα-µάρτυρα µε τον Ad-control (Εικόνα 19, διαδροµή Α). Οι ζώνες αυτές αποκόπηκαν από το πήγµα και οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν µε φασµατοµετρία µάζας (Dr. Jol Vandekerckhove, Department of Medical Protein Research (VIB09), Medical School of Ghent University). Σε κάθε ζώνη δόθηκε ένας κωδικός (p1-7) από το αρχικό της λέξης πρωτεΐνης (protein, p) και αύξοντα αριθµό αρχίζοντας από την ζώνη µε το µεγαλύτερο µοριακό βάρος. Εικόνα 19: Μεγάλης κλίµακας συνκατακρήµνιση πρωτεϊνών, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε FLAG-SARA Λύµατα από 1Χ10 8 ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC µολυσµένα µε τον αδενοϊό Ad-FLAG-SARA ή τον αδενοϊό Ad-control επωάσθηκαν µε σφαιρίδια σφαιρίδια που φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το αντι-flag αντίσωµα. Μετά από επανειληµµένες πλύσεις, πραγµατοποιήθηκε έκλουση µε 3ΧFLAG, 1µg/µl. Τα 9/10 του εκλούσµατος υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και χρώση νιτρικού αργύρου (Α), ενώ το 1/10 του εκλούσµατος χρησιµοποιήθηκε για ανοσοαποτύπωση µε αντι-flag αντίσωµα. S: HUVEC µολυσµένα µε τον αδενοϊο Ad-FLAG-SARA 1-664, C: HUVEC µολυσµένα µε τον αδενοϊο- µάρτυρα, Ad-Control. Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται οι αλληλουχίες των πεπτιδίων, όπως ακριβώς ταυτοποιήθηκαν από το φασµατογράφο µάζας. Όλα τα πεπτίδια, τα οποία ταυτοποιήθηκαν, αντιστοιχούσαν σε πρωτεΐνες, οι οποίες είναι κατατεθειµένες σε πρωτεϊνικές βάσεις 39

52 Αποτελέσµατα δεδοµένων. Σε ορισµένες περιπτώσεις ταυτοποιήθηκαν πεπτίδια, τα οποία αντιστοιχούσαν σε περισσότερες από µια πρωτεΐνες. Επίσης, σε πολλές περιπτώσεις ανευρέθηκαν πεπτίδια, τα οποία αντιστοιχούσαν σε εξωγενείς κερατίνες, οι οποίες εισήχθηκαν στα δείγµατα κατά την διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας. Πίνακας 3: Τα πεπτίδια και οι αντιστοιχούσες πρωτεΐνες, οι οποίες ταυτοποιήθηκαν µε φασµατοµετρία µάζας στη συνκατακρήµνιση µε τον Ad-FLAG-SARA

53 Αποτελέσµατα 3.3 ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ Η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε την SARA, χρησιµοποιώντας τεχνικές σάρωσης, όπως το σύστηµα των δύο υβριδίων (κεφάλαιο 3.1) και πρωτεοµική (κεφάλαιο 3.2) χρήζει επιβεβαίωσης χρησιµοποιώντας εξειδικευµένα αντιδραστήρια για την πρωτεΐνη αυτή. υστυχώς, τα αντιδραστήρια αυτά, κυρίως αντισώµατα, δεν είναι πάντα διαθέσιµα είτε στο εµπόριο είτε από άλλες οµάδες. Στην παρούσα εργασία για την περαιτέρω επιβεβαίωση ορισµένων αλληλεπιδράσεων χρησιµοποιήθηκαν οι τεχνικές της καταβύθισης (pull down) και ανοσοκατακρήµνισης Οι καταλυτικές περιοχές των φωσφατασών PP-1 (α, β, και γ ισοµορφές) Τόσο µε το σύστηµα των δυο υβριδίων όσο και µε την βιοχηµική προσέγγιση βρέθηκε η φωσφατάση PP1 και ειδικότερα και οι τρεις ισοµορφές της καταλυτικής υποµονάδας. Το σηµαντικό είναι ότι µε την βιοχηµική προσέγγιση τα πεπτίδια τα οποία ταυτοποιήθηκαν µε τον φασµατογράφο µάζας βρέθηκαν να είναι από περιοχές διαφορετικές για κάθε ισοµορφή. Εικόνα 20: Επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης µεταξύ της SARA και της PP-1α µε τη µέθοδο της ανοσοκατακρήµνισης. Κύτταρα 293 µολύνθηκαν µε τον αδενοϊο που εκφράζει την πρωτεΐνη FLAG-SARA και το κυτταρικό λύµα επωάστηκε µε σφαιρίδια που φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το αντίσωµα έναντι του flag επιτόπου. Τα σφαιρίδια αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση και η ανοσοαποτύπωση έγινε µε το αντίσωµα έναντι της PP-1α. ιαδροµή 1: 40µg κυτταρικού λύµατος, διαδροµή 2: τα εκλουσµένα σφαιρίδια του πειράµατος µε τον αδενοϊό Αd-FLAG-SARA 1-664, διαδροµή 3: τα εκλουσµένα σφαιρίδια πειράµατος µε τον αδενοϊο µάρτυρα, διαδροµή 4: έκλουµα σφαιριδίων του πειράµατος µε τον αδενοϊό Αd-FLAG-SARA 1-664, διαδροµή 5: έκλουσµα σφαιριδίων του πειράµατος µε τον αδενοϊό µάρτυρα. Από τα παραπάνω είναι σαφές ότι η αλληλεπίδραση των τριών ισοµορφών των φωσφατασών PP-1 είναι περισσότερο από βέβαιη. Άλλωστε η αλληλεπίδραση της PP-1γ µε 41

54 Αποτελέσµατα την SARA είναι ήδη γνωστή (Shi et al., 2004). Παρόλα αυτά θελήσαµε να επιβεβαιώσουµε και µε ένα τρίτο τρόπο την αλληλεπίδραση και των άλλων δύο ισοµορφών µε την SARA. Ευτυχώς, υπήρχε διαθέσιµο ένα αντίσωµα έναντι της PP1α, το οποίο και χρησιµοποιήθηκε για την ταυτοποίηση της στο ανοσοκατακρήµνισµα της SARA (εικόνα 20). Για την έκφραση της SARA σε κύτταρα 293 χρησιµοποιήθηκε ο Ad-FLAG-SARA Στην διαδροµή 4, σε αντίθεση µε την διαδροµή 5, το αντίσωµα αναγνώρισε την ενδογενή φωσφατάση PP1α ύστερα από ανοσοκατακρήµνιση της SARA µε το αντι-flag αντίσωµα από λύµα κυττάρων 293 στα οποία υπερεκφράστηκε η FLAG-SARA Η κυτταροπλασµατική 5 -νουκλεοτιδάση (Cytosolic 5 -nucleotidase) Με την βιοχηµική προσέγγιση και την ανάλυση µε φασµατοµετρία µαζών βρέθηκε ότι µια πιθανή αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη είναι η κυτταροπλασµατική 5 -νουκλεοτιδάση. Εικόνα 21: Επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης µεταξύ της SARA και της Cytosolic 5 - nucleotidase µε τη µέθοδο της καταβύθισης (pull down). Κύτταρα 293 µολύνθηκαν µε τον αδενοϊο που εκφράζει την SARA πρωτεΐνη και το κυτταρικό λύµα επωάστηκε µε GST (διαδροµή 2), ή GST-Cytosolic 5 -nucleotidase (διαδροµή 3), ή GST-SMAD2 πρωτεΐνη (διαδροµή 4). ιαδροµή 1: 40 µg κυτταρικού λύµατος. Η ανοσοαποτύπωση έγινε µε το αντίσωµα α-flag. Για την επιβεβαίωση αυτής της αλληλεπίδρασης χρησιµοποιήθηκε η τεχνική της καταβύθισης. H 5 -νουκλεοτιδάση συντηγµένη µε το ένζυµο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST πρωτεΐνη) υπερεκφράστηκε στο βακτηριακό στέλεχος BL21 και o καθαρισµός της έγινε µέσω σφαιριδίων της γλουταθειόνης (GST beads). Η καθαρισµένη GST-Cytosolic 5 -nucleotidase πρώτα επωάστηκε µε σφαιρίδια της γλουταθειόνης και στη 42

55 Αποτελέσµατα συνεχεία τα σφαιρίδια επωάστηκαν µε κυτταρικό λύµα κυττάρων 293 τα οποία είχαν µολυνθεί µε τον αδενοϊο που εκφράζει την FLAG-SARA πρωτεΐνη. Τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν µε φυγοκέντρηση, εκπλύθηκαν, ηλεκτροφορήθηκαν, και η FLAG-SARA ανιχνεύτηκε µε αντι-flag αντίσωµα (εικόνα 21, διαδροµή 3). Ως θετικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε η πρωτεΐνη GST-SMAD2 (εικονα21, διαδροµή 4), ενώ ως αρνητικός η GST πρωτεΐνη (εικόνα 21, διαδροµή 2) Η β-κατενίνη (β-catenin) Για την επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης µεταξύ της πρωτεΐνης SARA και της β-κατενίνης χρησιµοποιήθηκε η τεχνική της ανοσοκατακρήµνισης. Κύτταρα 293 µολύνθηκαν µε τον αδενοϊό της FLAG-SARA 1-664, παρασκευάστηκαν κυτταρικά λύµατα, και εν συνεχεία η FLAG-SARA ανοσοκατακρηµνίστηκε µε σφαιρίδια στα οποία ήταν συνδεδεµένο αντι-flag αντίσωµα. (M2 agarose beads, Sigma). Τα σφαιρίδια εκλούστηκαν, τα εκλούσµατα και τα εκλουσµένα σφαιρίδια ηλεκτροφορήθηκαν και ακολούθησε ανίχνευση της ενδογενούς β-κατενίνης µε ανοσοαποτύπωση χρησιµοποιώντας ειδικό αντίσωµα (εικόνα 22). Στην διαδροµή 4 το αντίσωµα αναγνώρισε την ενδογενή β-κατενίνη στο έκλουσµα των σφαιριδίων του πειράµατος µε τον αδενοϊό Αd-FLAG-SARA Αντίθετα στο έκλουσµα των σφαιριδίων του πειράµατος µε τον αδενοϊό µάρτυρα (Εικόνα 22, διαδροµή 5) το αντίσωµα δεν αναγνώρισε την ενδογενή β-κατενίνη. Εικόνα 22: Επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης µεταξύ της SARA και της β-catenin µε τη µέθοδο της ανοσοκατακρήµνισης. Κύτταρα 293 µολύνθηκαν µε τον αδενοϊο που εκφράζει την πρωτεΐνη FLAG-SARA και το κυτταρικό λύµα επωάστηκε µε σφαιρίδια που φέρουν οµοιοπολικά προσδεδεµένο το αντίσωµα έναντι του flag επιτόπου. Τα σφαιρίδια αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση και η ανοσοαποτύπωση έγινε µε το αντίσωµα έναντι της ενδογενούς β-catenin. ιαδροµή 1: 40µg κυτταρικού λύµατος, διαδροµή 2: τα εκλουσµένα σφαιρίδια του πειράµατος µε τον αδενοϊό Αd-FLAG- SARA 1-664, διαδροµή 3: τα εκλουσµένα σφαιρίδια πειράµατος µε τον αδενοϊο µάρτυρα, διαδροµή 4: έκλουµα σφαιριδίων του πειράµατος µε τον αδενοϊό Αd-FLAG- SARA 1-664, διαδροµή 5: έκλουσµα σφαιριδίων του πειράµατος µε τον αδενοϊό µάρτυρα. 43

56 Συζήτηση 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Συγκριτική συζήτηση των προσεγγίσεων Ένα σηµαντικό µειονέκτηµα για την ανεύρεση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων σε οποιοδήποτε ετερόλογο σύστηµα είναι ότι µερικές αλληλεπιδράσεις εξαρτώνται από τις µετά-µεταγραφικές τροποποιήσεις. Oι τροποποιήσεις αυτές δεν συµβαίνουν ή συνήθως δεν γίνονται σωστά στα κύτταρα ζύµης. Τέτοιες τροποποιήσεις είναι συχνές και περιλαµβάνουν το σχηµατισµό δισουλφιδικών δεσµών, τη γλυκοζυλίωση και συνηθέστερα τη φωσφορυλίωση. εδοµένου ότι στο σύστηµα των δύο υβριδίων οι συντηγµένες πρωτεΐνες στοχεύονται στον πυρήνα των κυττάρων ζύµης, αυτό είναι ένα µειονέκτηµα για τις εξωκυτταρικές πρωτεΐνες ή τις πρωτεΐνες που περιέχουν ισχυρά σήµατα στόχευσης. Εκτός, όµως, από τα προαναφερθέντα µειονεκτήµατα, το σύστηµα των δύο υβριδίων έχει µερικά σαφή πλεονεκτήµατα πέρα από τις κλασσικές βιοχηµικές και γενετικές προσεγγίσεις. Καταρχήν ενσωµατώνει µια in vivo διάσταση χρησιµοποιώντας τα κύτταρα ζύµης ως ζωντανό δοκιµαστικό σωλήνα. To σύστηµα αντιπροσωπεύει την υψηλότερη ευκαρυωτική πραγµατικότητα σε σχέση µε τις περισσότερες in vitro προσεγγίσεις ή τεχνικές βασισµένες στη βακτηριακή έκφραση. Τo ιδιαίτερο χαρακτηριστικό γνώρισµα του συστήµατος είναι οι ελάχιστες απαιτήσεις για να αρχίσει µια διαλογή (screening). Μόνο το cdna, ολόκληρο ή ακόµα και µέρoς του γονιδίου που µας ενδιαφέρει απαιτείται, σε αντίθεση µε τις, µερικές φορές, υψηλές ποσότητες καθαρισµένων πρωτεϊνών ή καλής ποιότητας αντισωµάτων που απαιτούνται στις κλασσικές βιοχηµικές προσεγγίσεις. H τεχνική της ανοσοκατακρήµνισης, από την άλλη πλευρά, είναι µια κλασσική µέθοδος για την ανίχνευση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (protein-protein interactions) και έχει χρησιµοποιηθεί κυριολεκτικά σε χιλιάδες πειράµατα στη βιβλιογραφία. Το βασικό πείραµα είναι απλό στην σύλληψη του. ηµιουργούνται κυτταρικά εκχυλίσµατα στα οποία έχει υπερεκφραστεί η πρωτεΐνη-δόλωµα, προστίθεται ειδικό αντίσωµα έναντι της πρωτεΐνης-δόλωµα, το αντιγόνο καταβυθίζεται µε σφαιρίδια, και ύστερα από πλύσεις ακολουθεί η έκλουση των δεσµευµένων στη πρωτεΐνη-δόλωµα πρωτεϊνών. Έπεται η ανάλυση τους µε SDS-PAGE, η χρώση του πηκτώµατος της ηλεκτροφόρησης, η αποκοπή των ζωνών και τελευταία η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών µε φασµατοµετρία µάζας. Εναλλακτικά, η πρωτεΐνη-δόλωµα µπορεί είναι σηµασµένη µε ειδικό επίτοπο για τον οποίο είναι διαθέσιµα εµπορικά αντισώµατα (π.χ flag και c-myc), το οποίο και χρησιµοποιείται για την ανοσοκατακρήµνιση. Βασικό σηµείο ελέγχου είναι η εξασφάλιση της ειδικής 44

57 Συζήτηση ανοσοκατακρήµνισης από το αντίσωµα και για το λόγο αυτό χρησιµοποιούνται µονοκλωνικά αντισώµατα υψηλής ποιότητας. Κύριο πλεονέκτηµα της ανοσοκατακρήµνισης όταν εφαρµόζεται σε κυτταρικά λύµατα στα οποία έχει υπερεκφραστεί η πρωτεΐνη-δόλωµα είναι ότι οι αλληλεπιδράσεις λαµβάνουν χώρα στο φυσικό τους περιβάλλον µε αποτέλεσµα να έχουν µεγαλύτερες πιθανότητες να συµβούν. Τέλος µειονέκτηµα είναι ότι οι ανοσοκατακρηµνιζόµενες πρωτεΐνες µπορεί να µην αλληλεπιδρούν άµεσα µε την πρωτεΐνηδόλωµα, αλλά να είναι µέρος µεγαλύτερων πρωτεϊνικών συµπλοκών. 4.2 SARA και PP1 φωσφατάσες Οι καταλυτικές υποµονάδες των τριών ισοµορφών (PP1α, PP1β/δ και PP1γ) των φωσφατασών σερίνης/θρεονίνης της υποοικογένειας PP1 βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν µε την SARA στα πειράµατα µας. Ιδιαίτερα σηµαντικό είναι το γεγονός ότι η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύτηκε και µε το σύστηµα των δυο υβριδίων αλλά και µε την βιοχηµική προσέγγιση. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση της PP1α µε την SARA επιβεβαιώθηκε και µε ειδικό αντίσωµα. Είναι λοιπόν αδιαµφισβήτητο ότι οι καταλυτικές υποµονάδες των PP1α, PP1β/δ και PP1γ αλληλεπιδρούν µε την SARA. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώνουν, αλλά και επεκτείνουν, την ήδη γνωστή αλληλεπίδραση της SARA µε την PP1δ της δροσόφιλας (Bennett and Alphey, 2002). Πράγµατι, η SARA φέρει ένα RVXF µοτίβο, κοντά στην περιοχή πρόσδεσης µε τις πρωτεΐνες SMAD, µέσω του οποίου στρατολογεί την PP1β/δ. Έτσι, η PP1β/δ προσελκύεται στο σύµπλοκο των υποδοχέων του TGF-β (τύπου ΙΙ και τύπου Ι) µε την SARA και τις SMAD2/3 πρωτεΐνες αποφωσφορυλιώνοντας τον υποδοχέα τύπου Ι και µε τον τρόπο αυτό ρυθµίζοντας τη φωσφορυλίωση των δεύτερων µεταβιβαστών SMAD2 και 3 (Massague and Chen, 2000; Wrana et al., 1994). Ακόµη πιο πρόσφατα υπάρχει µια βιβλιογραφική αναφορά η οποία αναφέρει ότι η SARA αυξάνει τον βαθµό προσέλκυσης της PP1γ στο σύµπλοκο SMAD7-GADD34 ελέγχοντας την ειδική υποκυτταρική εντόπιση της PP1γ (Shi et al., 2004). Αν λάβουµε υπόψη µας τις δυο παραπάνω µελέτες διαπιστώνουµε ότι οι φωσφατάσες PP1 προσελκύονται από την SARA και παίζουν σηµαντικό ρόλο στην µεταγωγή του σήµατος από τον TGF-β/ακτιβίνη. Η δική µας µελέτη επιβεβαιώνει την αλληλεπίδραση των PP1β/δ και PP1γ µε την SARA προσθέτοντας σε αυτές την αλληλεπίδραση µε την PP1α. Παραπέρα µελέτες πρέπει να εστιαστούν στη διερεύνηση του πιθανού ρόλου κάθε µιας από τις τρεις ισοµορφές στην µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β εστιάζοντας στο διαφορετικό ρόλο που ενδέχεται να έχει η καθεµία (Okada et al., 2004). Επίσης, επειδή η SARA βρίσκεται στα πρώιµα ενδοσώµατα (Hayes et al., 2002a; Panopoulou et al., 2002; Penheiter et al., 2002) πιθανά οι φωσφατάσες 45

58 Συζήτηση αυτές να έχουν και άλλα υποστρώµατα και επιπρόσθετους ρόλους στα ενδοκυτταρικά αυτά οργανίδια. 4.3 SARA και κυτταροπλασµατική 5 -νουκλεοτιδάση. Μια άλλη πρωτεΐνη που βρέθηκε µε την βιοχηµική προσέγγιση (βλέπε αποτελέσµατα 3.2) και επιβεβαιώθηκε µε ανεξάρτητη διαδικασία (βλέπε αποτελέσµατα 3.3.2) είναι η πρωτεΐνη 5 -νουκλεοτιδάση. Η πρωτεΐνη αυτή εµπλέκεται στην διαδικασία της ωρίµανσης του RNA και είναι επίσης µέρος ενός συµπλόκου που ονοµάζεται µεθυλόσωµα. Το µεθυλόσωµα αποτελείται συνολικά από τρεις πρωτεΐνες, JBP1, picin και την MEP50. Η JBP1 και η MEP50 επίσης ταυτοποιήθηκαν µε φασµατοµετρία µάζας και πιθανόν αλληλεπιδρούν µε την SARA (βλέπε αποτελέσµατα 3.2). Ο γνωστός µέχρι σήµερα ρόλος του µεθυλοσώµατος είναι η µεθυλίωση των Sm πρωτεϊνών (Friesen et al., 2001; Friesen et al., 2002). Ο συνδετικός κρίκος του συµπλόκου είναι η νουκλεοτιδάση picin η οποία συνδέεται τόσο µε την JBP1 όσο και µε την MEP50. Ελλείψει αντιδραστηρίων επιβεβαιώσαµε µόνο την αλληλεπίδραση της SARA µε τη νουκλεοτιδάση. Παραµένει η επιβεβαίωση και των αλληλεπιδράσεων της SARA µε τα άλλα συστατικά του µεθυλοσώµατος. Ωστόσο και µε αυτό µόνο το δεδοµένο µπορούµε να συµπεράνουµε ότι είναι πιθανό η SARA να φέρνει το σύµπλοκο του µεθυλοσώµατος µέσω της αλληλεπίδρασης µε τη νουκλεοτιδάση πάνω στο ενδόσωµα. Από την άλλη πλευρά η πρωτεΐνη JBP1, ονοµάζεται επίσης PRMT5, είναι µέλος της οικογένειας των µεθυλοτρανσφερασών και εποµένως έχει δραστικότητα µεθυλοτρανσφεράσης. Η µεθυλίωση του αµινοξέος αργινίνη (Αrginine methylation) είναι µια οµοιοπολική τροποποίηση που καταλήγει στην προσθήκη µεθυλικής οµάδας στο άτοµο του αζώτου της πλευρικής αλυσίδας της αργινίνης (Boisvert et al., 2005). Ο πιθανός ρόλος της µεθυλίωσης της αργινίνης στη µεταγωγή του σήµατος αναδείχθηκε µε τον προσδιορισµό νέων µεθυλιωµένων πρωτεϊνών. Εντούτοις, η λειτουργική σηµασία και ο τρόπος που η µεθυλίωση της αργινίνης ρυθµίζεται παραµένουν άγνωστοι. Ο προσδιορισµός της οικογένειας των µεθυλοτρανσφερασών και η ανάπτυξη αντισωµάτων ειδικών για τη µεθυλιωµένη αργινίνη προκάλεσε το ενδιαφέρον για την τροποποίηση αυτή κατά την διάρκεια της προηγούµενης δεκαετίας. H µεθυλίωση της αργινίνης παρατηρείται κυρίως σε άφθονες ποσοτικά πρωτεΐνες όπως οι πρωτεΐνες που δεσµεύονται στο RNA και στις ιστόνες, ωστόσο πρόσφατες µελέτες αποκάλυψαν πληθώρα πρωτεϊνών που µεθυλιώνονται σε κατάλοιπα αργινίνης και οι οποίες έχουν εµπλακεί σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες περιλαµβανοµένου και της µεταγωγής του σήµατος από τις ιντερφερόνες και τις κυτοκίνες καθώς επίσης και της σηµατοδότησης σε T λεµφοκύτταρα. Περαιτέρω µελέτες χρειάζεται να 46

59 Συζήτηση πραγµατοποιηθούν προκειµένου να ελέγξουµε αν αυτή η αλληλεπίδραση έχει επίδραση στην ωρίµανση του RNA και τον ρόλο του ενδοσώµατος σε αυτή την διαδικασία. 4.4 SARA και β-κατενίνη Mια καινούργια αλληλεπίδραση που βρέθηκε µε το σύστηµα των δυο υβριδίων (βλέπε αποτελέσµατα 3.1 και πίνακας 2) είναι η πρωτεΐνη β-κατενίνη (β-catenin). H πρωτεΐνη αυτή βρέθηκε αρχικά στην δροσόφιλα (segment polarity protein) και ονοµάστηκε αρµαδίλο (Perrimon and Mahowald, 1987). Περιέχει 13 τοµείς που ονοµάζονται επαναλήψεις αρµαδίλο. Η β-κατενίνη είναι ικανή να συνδέεται µε διάφορες πρωτεΐνες όπως τις APC, Axin, Tcf/Lefs και τις καδερίνες (cadherins) (Cadigan and Nusse, 1997). Πρόσφατα βρέθηκε να αλληλεπιδρά µε την SMAD7, συστατικό του TGF-β σήµατος, ρυθµίζοντας την διαµεσολαβούµενη από τον TGFβ απόπτωση (Edlund et al., 2005). Η β-κατενίνη µαζί µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες (π.χ LEF1/TCF) είναι τελεστής του Wnt σήµατος στον πυρήνα (Barker et al., 2000). Η ενεργοποίηση του Wnt σήµατος έχει αναφερθεί να είναι σηµαντική στον καρκίνο του παχέος εντέρου, όπου µεταλλάξεις στο γονίδιο της έχουν ως αποτέλεσµα στην συνάθροιση της στο κυτταρόπλασµα και στον πυρήνα. Είναι σηµαντικό ότι το ογκογονίδιο c-myc και η κυκλίνη D1 έχουν προσδιοριστεί ως γονίδια στόχοι για το ενεργοποιηµένο σύµπλοκο β-κατενίνη-tcf (Barker and Clevers, 2000; Barker et al., 2000; Tetsu and McCormick, 1999). Η αλληλεπίδραση µε την πρωτεΐνη SARA µπορεί να είναι σηµαντική λοιπόν στην ρύθµιση και στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασµού. 4.5 SARA και RNF11 Tα σύµπλοκα των πρωτεολυτικών ενζύµων, γνωστά ως πρωτεoσώµατα, είναι επιφορτισµένα µέσα στο ευκαρυωτικό κύτταρο µε τον ρόλο της αποικοδόµησης των πρωτεϊνών. Το σύστηµα που σχηµατίζουν τα σύµπλοκα αυτά δρα κυρίως σε πρωτεΐνες που έχουν σηµανθεί για αποικοδόµηση από την οµοιοπολική πρόσδεση µιας µικρής πρωτεΐνης γνωστής ως ουβικουϊτίνη. Συγκεκριµένες SMAD πρωτεΐνες καθώς και ο υποδοχέας τύπου Ι υφίστανται ουβικουϊτινίωση. Η SMAD7 και πιθανώς η SMAD6 αλληλεπιδρούν µε τις Smurfs, οι οποίες είναι ουβικουϊτινες και στοχεύουν τον υποδοχέα τύπου Ι για αποικοδόµηση (Ebisawa et al., 2001; Kavsak et al., 2000; Zhang et al., 2001; Zhu et al., 1999) Μέσω του PY τοµέα, η RNF11 πρωτεΐνη µπορεί και δεσµεύεται στην Smurf2 και θεωρείται µε αυτόν τον τρόπο δυνητικός ρυθµιστής του σήµατος από τον TGF-β. Η RNF11 µπορεί ακόµη να ανταγωνίζεται µε την SMAD7 για την πρόσδεση στην Smurf2 και κατά συνέπεια διασπάει το σύµπλοκο Smurf2/SMAD7 (Hayashi et al., 1997; Kavsak et al., 2000). 47

60 Συζήτηση Αυτός ο µηχανισµός αποτρέπει τις αρνητικές επιδράσεις των πρωτεϊνών Smurf2 και SMAD7 στην µεταγωγή του σήµατος από τον TGF-β και αποκαθιστά την ευαισθησία των κυττάρων που δεν ανταποκρίνονται στον TGF-β. Όταν η RNF11 υπερεκφράζεται σε 293Τ κύτταρα υπάρχει µια διαβάθµιση στην ανταπόκριση στον TGF-β, δείχνοντας την σχέση της RNF11 µε τη µεταγωγή του σήµατος από τον TGF-β (Subramaniam et al., 2003). Η πιθανή αλληλεπίδραση µε την πρωτεΐνη SARA ενδέχεται να δρα ως ρυθµιστής των δυο αυτών γεγονότων δηλαδή της θετικής µετάδοσης του σήµατος και της αποικοδόµησης των υποδοχέων (βλέπε εικόνα 22). 4.6 SARA και ERBIN Η πρωτεΐνη ERBIN προσδιορίστηκε αρχικά ως ο παράγοντας που δεσµεύεται στον ErBB2 υποδοχέα. Ο ErBB2 υποδοχέας εντοπίζεται στην βασοπλευρική µεµβράνη των επιθηλιακών κυττάρων γεγονός πολύ σηµαντικό για την λειτουργία του. Με την ανακάλυψή της ορίστηκε ουσιαστικά η οικογένεια των πρωτεϊνών (LAP οικογένεια) που αποτελούνται από περιοχές πλούσιες σε λευκίνη και PDZ τοµέα. Ειδικότερα χαρακτηρίζονται από 16 περιοχές πλούσιες σε λευκίνη (LRRs) στο άµινο-τελικό άκρο και από µια µέχρι τέσσερις PDZ τοµείς στο καρβόξυ-τελικό άκρο (Borg et al., 2000). O PDZ τοµέας αποτελείται από αµινοξέα και συνδέεται µε αλληλουχίες που συνήθως βρίσκονται στο καρβοξυτελικό άκρο των πρωτεϊνών (Sheng and Sala, 2001). Τα αλλά µέλη της οικογένειας (densin-180, LET-413, και Scribble) εµπλέκονται στον καθορισµό της κυτταρικής πολικότητας. Η κυτταρική πολικότητα είναι ουσιώδης για την δράση των κυττάρων που εντοπίζονται σε λειτουργικές διεπιφάνειες (physical functional interfaces). Για παράδειγµα τα επιθηλιακά κύτταρα στον πεπτικό σωλήνα (digestive track) έχουν µια κορυφαία µεµβράνη που τα προσανατολίζει προς τον αυλό του στοµάχου και απορροφάει τα θρεπτικά συστατικά µέσω µεγάλου αριθµού µικρολαχνών. Από την άλλη πλευρά η βασοπλευρική µεµβράνη µεσολαβεί για τις επαφές µε τα γειτονικά επιθηλιακά κύτταρα πλευρικά των κυττάρων και στην βάση της βασοπλευρικής µεµβράνης. Η κορυφαία µε τη βασοπλευρική µεµβράνη διαχωρίζονται µεταξύ τους από εξειδικευµένες µεµβρανικές περιοχές που ονοµάζονται σφικτοί σύνδεσµοι (tight junctions) και προσκολλητικοί σύνδεσµοι (adherens junction), οι οποίοι σφραγίζουν τον χώρο ανάµεσα στα κύτταρα και βοηθούν στην στερέωση των γειτονικών κύτταρων µεταξύ τους. Η ανακάλυψη τώρα, ότι οι LAP πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για την κυτταρική πολικότητα των επιθηλιακών κυττάρων έδωσε το έναυσµα για την µελέτη των µοριακών µηχανισµών που εµπλέκονται σε αυτήν την διαδικασία. Ποικίλες πιθανότητες µπορούν να εξηγήσουν αυτόν τον ρόλο: 48

61 Συζήτηση 1) Μπορεί να σχηµατίζουν ένα φραγµό για τον διαχωρισµό των συστατικών της βασοπλευρικής από την κορυφαία µεµβράνη 2) Συµµετέχουν στην διαλογή των κυστιδίων µεταφοράς τα οποία συνεχώς µετακινούνται κυκλικά ανάµεσα σε διαφορετικά κυτταρικά διαµερίσµατα και µεταφέρουν τις πρωτεΐνες στον κατάλληλο προορισµό 3) Τέλος µπορούν να αγκυροβολούν πρωτεΐνες σε συγκεκριµένες περιοχές στη σωστή κυτταρική µεµβράνη Η οµόλογη let-23 πρωτεΐνη, συγκρατείται στην βασοπλευρική µεµβράνη από ένα σύµπλοκο τριών πρωτεϊνών µε PDZ τοµέα και παρέχει ένα παράδειγµα για την τελευταία πιθανότητα. Ο Borg και οι συνάδελφοι του έχουν προτείνει ότι η ERBIN πρωτεΐνη διαδραµατίζει ένα παρεµφερές ρόλο για τον ErBB2 υποδοχέα (Borg et al., 2000). Πρόσφατη εργασία παρουσιάζει ότι η SMAD3 συνδέεται µε τρεις πρωτεΐνες (Erbin, Par-3, or Dvl-1), µεταξύ των οποίων και η ERBIN, οι οποίες έχουν πολύ καλά τεκµηριωµένο ρόλο στην κυτταρική πολικότητα, προτείνοντας ότι οι ενεργοποιηµένες από τον TGF-β SMAD πρωτεΐνες εµπλέκονται στην δηµιουργία της πολικότητας (Warner et al., 2003). Αν και ο TGF-β δεν είχε προηγουµένως αποδειχθεί ότι να συνδέεται άµεσα µε την κυτταρική πολικότητα, έχει δειχθεί ότι συνδέεται µε την προαγωγή της EMT, µια διαδικασία που χαρακτηρίζεται από την απώλεια της κυτταρικής πολικότητας, της κυτταρικής εντόπισης της E-cadherin από τις συνδέσεις (cell junctions), και την απόκτηση ατρακτοειδούς µορφολογίας (Bhowmick et al., 2001; Miettinen et al., 1994). Το σηµαντικό από αυτή τη µελέτη για µας είναι το γεγονός ότι µε βάση το σύστηµα των δυο υβριδίων η περιοχή που είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της SARA µε την ERBIN εντοπίζεται στο καρβόξυ-τελικό άκρο της πρωτεΐνης ERBIN (αµινοξέα ). Η ίδια περιοχή επίσης (αµινοξέα ), είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση µε αλληλεπίδραση µε τις SMADs (1, 2, 3, 4, 7) γεγονός που µπορεί να σηµαίνει ανταγωνισµό για την πρόσδεση στην ERBIN (Warner et al., 2003). 4.7 SARA και Ets2 Ακόµη ένα άλλο πειραµατικό δεδοµένο, όπως προέκυψε από το σύστηµα των δυο υβριδίων, είναι ότι η SARA συνδέεται µε διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες όπως για παράδειγµα µε τον Ets2 (Πίνακας 1, Αριθµός 2). Τα µέλη της οικογένειας στα οποία ανήκει ο Ets2 σε µια πρόσφατη µελέτη δείχθηκε ότι επηρεάζουν τον υποκινητή του υποδοχέα τύπου ΙΙ του TGF-β µε µοναδικό τρόπο εξαιτίας σηµαντικών διαφορών στις βιοχηµικές ιδιότητες καθώς και στην κυτταρική τους έκφραση (Kopp et al., 2004). 49

62 Συζήτηση 4.8 SARA και HSP70 Τόσο στην µεσαία όσο και στην µεγάλη κλίµακα ανοσοκατακρήµνισης που πραγµατοποιήσαµε (εικόνες 5, 6 και πίνακες 4, 5) ταυτοποιήσαµε και στις δυο περιπτώσεις µε φασµατοµετρία µάζας την πρωτεΐνη HSP70 (85.6% οµολογία ανάµεσα στις δυο ισοµορφές). Αναζητώντας στη βιβλιογραφία για στοιχεία που να συνδέουν την πρωτεΐνη αυτή µε το µονοπάτι τουtgfβ εντοπίσαµε µια ιδιαίτερα σηµαντική πρόσφατη µελέτη που δείχνει ότι HSP70 είναι η πρωτεΐνη που ειδικά συνδέεται µε την SMAD3 (Knuesel et al., 2003). Στην µελέτη αυτή η οµάδα από το Πανεπιστήµιο του Κολοράντο χρησιµοποίησε την µέθοδο συγγένειας διπλού καθαρισµού TAP (Tandem Affinity Purification) που επιτρέπει τον γρήγορο καθαρισµό πρωτεϊνικών συµπλόκων τα οποία εκφράζονται στα φυσιολογικά τους επίπεδα σε γενετικά τροποποιηµένα κύτταρα ζύµης (Knuesel et al., 2003; Rigaut, 1999) και επιβεβαίωσαν την αλληλεπίδραση µε πειράµατα συνδιαµόλυνσης. Γενετικές αναλύσεις σε κύτταρα ζύµης υποστηρίζουν έντονα τη σηµασία της διασύνδεσης. Η πρωτεΐνη HSP70 εµφανίζεται να εµπλέκεται στην σωστή στερεοδιαµόρφωση πολλών κινασών όπως η pp60src, Raf, η ακόµη και στεροειδών ορµονών τόσο κατά τη διάρκεια της σύνθεσης τους, όσο και της µεταφοράς τους (Pratt and Toft, 1997). Λαµβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η SMAD3 προϋπάρχει στο κυτταρόπλασµα απουσία σήµατος από τον TGF-β και χρειάζεται να παρουσιαστεί στον υποδοχέα τύπου Ι από την στιγµή που θα αρχίσει η µεταγωγή του σήµατος, καθώς επίσης και το γεγονός ότι η SMAD3 µεταφέρεται στον πυρήνα όπου αλληλεπιδρά µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες, δεν είναι τελείως αναπάντεχο το γεγονός ότι αλληλεπιδρά επίσης µε την HSP70 (Bukau et al., 2000). Εξάλλου είναι πολύ καλά τεκµηριωµένο ότι η HSP70 έχει λειτουργικό ρόλο όσον αφορά πρωτεΐνες που παλινδροµούν ανάµεσα στο κυτταρόπλασµα και στον πυρήνα (Pratt and Toft, 1997). Η ακριβής λειτουργία των συµπλόκων βοηθών (chaperone complexes) στο TGF-β µονοπάτι χρειάζεται να διερευνηθεί περαιτέρω. Το αξιοσηµείωτο από την εργασία αυτή είναι η ειδικότητα της αλληλεπίδρασης ανάµεσα στην HSP70 και την SMAD3, αφού η οµόλογη της SMAD3, η SMAD1 δεν βρέθηκε να αλληλεπιδρά µε την HSP70. Ωστόσο είναι πιθανό η SMAD1 να αλληλεπιδρά άµεσα µε άλλες πρωτεΐνες του ετερογενούς συµπλόκου των HSP70 πρωτεϊνών (Bukau and Horwich, 1998). Επιπρόσθετα σε µια µελέτη παρατηρήθηκε ότι ο TGF-β1 διαµεσολαβεί την επαγωγή της 70Kda πρωτεΐνη θερµικού σοκ εξαιτίας υπεριώδης ακτινοβολίας σε ανθρώπινα ινοβλαστικά κύτταρα του δέρµατος (Cao et al., 1999). Τα παραπάνω δεδοµένα στοιχειοθετούν την πιθανή διασύνδεση των πρωτεϊνών θερµικού σοκ στην µεταγωγή του σήµατος µέσω της αλληλεπίδρασης µε την SARA. 50

63 Συζήτηση 4.9 SARA και Nup155 Τέλος ένα άλλο ενδιαφέρον αποτέλεσµα είναι ότι µε το σύστηµα των δυο υβριδίων στην κατηγορία Β (βλέπε αποτελέσµατα 3.1) µια ακόµη αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη είναι η Nup155. Η πρωτεΐνη αυτή είναι µέρος του συµπλόκου του πυρηνικού πόρου (Radu et al., 1993), ενώ πρόσφατα βρέθηκε ότι ρυθµίζει τόσο τη λειτουργία του τελευταίου όσο και του πυρηνικού φακέλου (Franz et al., 2005; Radu et al., 1993) Συµπεράσµατα-µελλοντικές κατευθύνσεις Αναµφισβήτητα η πρωτεΐνη SARA κατέχει σηµαντικό ρόλο στο µονοπάτι µεταγωγής σήµατος από τον TGF-β, στρατολογώντας τις SMAD πρωτεΐνες στο σύµπλοκο του υποδοχέα του και ελέγχοντας την ενδοκυτταρική εντόπιση των R-SMAD. Για να εντοπίσουµε πρωτεΐνες που πιθανά αλληλεπιδρούν µε την SARA χρησιµοποιήσαµε δυο διαφορετικές προσεγγίσεις, το σύστηµα των δυο υβριδίων και πρωτεοµική ανάλυση. Οι δύο αυτές προσεγγίσεις οδήγησαν στην ταυτοποίηση πολλών πρωτεϊνών. Αρκετές από αυτές συµµετέχουν σε αλλά µονοπάτια µεταγωγής σήµατος, όπως του EGF, WNT, και JAK/STAT, άλλες είναι µεταγραφικοί παράγοντες ή πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου. Βρέθηκαν επίσης και αρκετές υποθετικές πρωτεΐνες (βλέπε εικόνα 22). Η εργασία αυτή ανοίγει νέες προοπτικές για µελλοντική έρευνα αναφορικά µε την σηµασία που µπορεί να έχουν οι πρωτεΐνες αυτές που αλληλεπιδρούν µε την SARA στο µονοπάτι µεταγωγής σήµατος του TGF-β αλλά και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες. Θα ήταν ενδιαφέρον να µελετηθεί ο ρόλος της επιβεβαιωµένης αλληλεπίδρασης της SARA µε τη νουκλεοτιδάση και τις άλλες πρωτεΐνες του µεθυλοσώµατος στη ωρίµανση και µάτισµα του RNA και το ρόλο που µπορεί να έχει η µεταγωγή του σήµατος από τον ΤGF-β στις λειτουργίες αυτές. Εξίσου σηµαντική θα είναι η µελέτη του ρόλου της αλληλεπίδρασης της SARA µε την β-κατενίνη στην ρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και της σηµασίας της παράπλευρης επικοινωνίας των µονοπατιών σηµατοδότησης του TGF-β και του WNT στη ρύθµιση αυτή. Επίσης, σηµαντικό θα ήταν να µελετηθεί ο ρόλος της αλληλεπίδρασης της SARA µε κάθε µιας από τις τρεις ισοµορφές (α, β και γ) της φωσφατάσης PP1 στη µεταγωγή σήµατος από τον TGF-β. Αυτά εάν εστιαστεί κανείς στις ήδη επιβεβαιωµένες αλληλεπιδράσεις. Φυσικά η επιβεβαίωση και των άλλων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων µε την SARA πρέπει να συνεχιστεί και στη συνέχεια να ερευνηθεί ο λειτουργικός τους ρόλος. Ιδιαίτερα σηµαντική θα είναι η µελέτη των υποθετικών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε την SARA, εάν και αυτό θα είναι ιδιαίτερα δύσκολο λόγω έλλειψης βιβλιογραφικών 51

64 Συζήτηση δεδοµένων για το ρόλο τους και ακόµη περισσότερο λόγω έλλειψης αντιδραστηρίων για αυτές (cdνα κλώνοι, αντισώµατα, µεταλλαγµένες µορφές κτλ). Εικόνα 22: Ολοκληρωµένη απεικόνιση της µεταγωγής σήµατος από τον TGF-β σε συνδυασµό µε τα πειραµατικά αποτελέσµατα που απορρέουν από τις δυο διαφορετικές µεθοδολογικές προσεγγίσεις που χρησιµοποιήθηκαν στην εργασία αυτή. 52

65 Παραρτήµατα 5. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1: Πρωτεΐνες που ανιχνεύθηκαν στην παρούσα εργασία και αλληλεπιδρούν µε την SARA: µε κόκκινο χρώµα τονίζονται αυτές που βρέθηκαν µε τη βιοχηµική µέθοδο και αυτές που ανήκουν στην Α κατηγορία του συστήµατος των δυο υβριδίων 53