ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΕΝΑ ΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ, PhD. ιπλωµατική εργασία µε τίτλο:

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΚΒΑΝΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Μ Ε ΣΤΗΝ ΚΒΑΝΤΙΚΗ ΚΑΙ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΕΝΑ ΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ, PhD ιπλωµατική εργασία µε τίτλο: ΘΕΩΡΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΕΣΜΕΥΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ ΑΠΟ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΕΣ ΑΟΥΡΟΝΕΣ Υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή κ. Μιχάλη Σιγάλα ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σκοπός της παρούσας διπλωµατικής εργασίας ήταν η θεωρητική µελέτη της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών από επιλεγµένες αουρόνες. Η µελέτη αυτή πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Εφαρµοσµένης Κβαντικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ. στα πλαίσια απόκτησης Μ Ε στη Χηµεία µε έµφαση στην Κβαντική Χηµεία. Εκφράζω τις θερµές µου ευχαριστίες στον Αναπλ. Καθηγητή κ. Μ. Σιγάλα που ήταν και ο επιβλέπων καθηγητής για τον ενθουσιασµό του να δεχτεί την πρόταση µου να συνεργαστούµε σε ένα θέµα που αφορούσε τη µελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης. Ένα θέµα που συνδέονταν άµεσα µε τα προσωπικά µου ερευνητικά ενδιαφέροντα καθώς η όλη µου ερευνητική δραστηριότητα εντοπίζεται στο πεδίο των αντιοξειδωτικών από την εκπόνηση της διδακτορικής µου διατριβής που ολοκληρώθηκε το 2004 έως και σήµερα. Τον ευχαριστώ επίσης για την πρόσθετη εκπαίδευση που µε βοήθησε να αποκτήσω σε θέµατα υπολογισµών για τα οποία δεν είχα προηγούµενη εµπειρία, για το ευχάριστο κλίµα συνεργασίας, αλλά και τη διάθεσή του για τη συζήτηση και επίλυση όλων των τυχόν αποριών και προβληµάτων που προέκυψαν κατά την προεία της µελέτης. Ευχαριστώ τον Αναπλ. Καθηγητή κ. Π. Καραφίλογλου και τον Επικ. Καθηγητή κ. Γ. Μπλέκα µέλη της Τριµελούς Επιτροπής για τις υποδείξεις στη διόρθωση του δοκιµίου. Ευχαριστώ την Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Μαρία Τσιµίδου που στήριξε την απόφασή µου να συµµετάσχω στο ΜΠΣ του Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ. για την απόκτηση Μ Ε στην Κβαντική Χηµεία. Την ευχαριστώ επίσης µαζί µε τον Αναπλ. Καθηγητή κ. Ε. Μπακάλµπαση, αλλά και τον µακρινό µας συνεργάτη Καθηγητή κ. ong-yu Zhang από το Πανεπιστήµιο του Zibo στην Κίνα καθώς συνέβαλλαν στο να i

3 έρθω σε επαφή µε την Κβαντική Χηµεία και να αντιληφθώ τη χρησιµότητά της στη µελέτη των αντιοξειδωτικών. Ευχαριστώ τους µεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες του Εργαστηρίου Κβαντικής Χηµείας καθώς και το ιδάκτορα κ. Νικόλαο Χαριστό µόνιµο πλέον µέλος του Εργαστηρίου να για το ευχάριστο κλίµα σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης του Μ Ε. Ιδιαίτερες ευχαριστίες εκφράζω στη συµφοιτήτριά µου Ιωάννα Ζώη, αλλά και στον Υποψήφιο ιδάκτορα Ιωάννη επάστα για τη φιλία τους και τη συνεργασία ευχόµενος καλή επιτυχία στη µεν Ιωάννα στην εκπόνηση ιδακτορικού ιπλώµατος που πρόκειται να ξεκινήσει σύντοµα, στο δε Γιάννη στην επιτυχή ολοκλήρωση της διδακτορικής του διατριβής. Τέλος θερµές ευχαριστίες απευθύνω στην οικογένεια µου που παρά τις δύσκολες στιγµές του τελευταίου χρόνου στήριξαν την απόφασή µου. Νικόλαος Νενάδης Θεσσαλονίκη, Απρίλιος 2008 ii

4 Στον αδελφό µου Πασχάλη και στο µικρό ήρωα που έκρυβε και αποκάλυψε στην άνιση µάχη που δίνει iii

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ενεργές µορφές οξυγόνου (RS), γενικές έννοιες Αντιµετώπιση της δράσης των RS Φυσικές φαινολικές ενώσεις και πηγές τους Ικανότητα φυσικών φαινολικών ενώσεων να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών Πειραµατικές µέθοδοι Υπολογιστικές µέθοδοι Υπολογισµός τιµών φυσικοχηµικών παραµέτρων για το χαρακτηρισµό της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες Θεωρητική προσέγγιση της επιδιαλύτωσης Σχέση δοµής-ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών Φλαβονοειδή Φαινολικά οξέα Αουρόνες 24 2 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 28 3 ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υπολογισµοί DFT στην αέρια φάση Υπολογισµοί DFT παρουσία διαλύτη Λογισµικό και υπολογιστικά συστήµατα 31 iv

6 Σελ. 4 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Έλεγχος αξιοπιστίας του υπολογιστικού µοντέλου Μελέτη σε αέρια φάση ιερεύνηση του χώρου των διαµορφωµερών Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών µε απόδοση ατόµου υδρογόνου Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών µε απόδοση µονήρους ηλεκτρονίου Μελέτη παρουσία διαλύτη Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών µε απόδοση ατόµου υδρογόνου Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών µε απόδοση µονήρους ηλεκτρονίου Σύγκριση υπολογιστικών και πειραµατικών αποτελεσµάτων Η περίπτωση της ρίζας DPP Η περίπτωση της ρίζας ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 64 6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 66 v

7 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Σελ. Πίνακας 1.1 Κύριες τάξεις φυσικών φαινολικών ενώσεων 6 Πίνακας 1.2 Ενδεικτικές πηγές φυσικών φαινολών 7 Πίνακας 4.1 Πειραµατικές και θεωρητικά υπολογιζόµενες (Β3LYP/6-31G) τιµές µήκους και γωνιών δεσµών της Ζ-2-π-µεθοξυαουρόνης 35 Πίνακας 4.2 Πλήθος και ενεργειακά δεδοµένα των διαµορφωµερών για τις υπό εξέταση αουρόνες στο επίπεδο B3LYP/6-31G 37 Πίνακας 4.3 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - των απλών φαινολών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 40 Πίνακας 4.4 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - στο δακτύλιο Β επιλεγµένων αουρονών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 44 Πίνακας 4.5 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - της κατεχολικής οµάδας του δακτυλίου Α επιλεγµένων αουρονών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 47 Πίνακας 4.6 Τιµές αδιαβατικού δυναµικού ιοντισµού ΙΡ απλών φαινολών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 49 Πίνακας 4.7 Τιµές αδιαβατικού δυναµικού ιοντισµού ΙΡ επιλεγµένων αουρονών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 50 Πίνακας 4.8 Τιµές ενθαλπίας απόσπασης πρωτονίου ΡDE της κατιονικής ρίζας απλών φαινολών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 51 vi

8 Σελ. Πίνακας 4.9 Τιµές ενθαλπίας απόσπασης πρωτονίου ΡDE της κατιονικής ρίζας επιλεγµένων αουρονών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 52 Πίνακας 4.10 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - των απλών φαινολών παρουσία διαλύτη στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 55 Πίνακας 4.11 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - στο δακτύλιο Β επιλεγµένων αουρονών παρουσία διαλύτη στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 56 Πίνακας 4.12 Τιµές αδιαβατικού δυναµικού ιοντισµού ΙΡ και ενθαλπίας απόσπασης πρωτονίου κατιονικής ρίζας απλών φαινολών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 58 Πίνακας 4.13 Τιµές δυναµικού αδιαβατικού ιοντισµού ΙΡ και ενθαλπίας απόσπασης πρωτονίου κατιονικής ρίζας επιλεγµένων αουρονών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G, T= K 59 vii

9 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σελ. Σχήµα 1.1 Ενεργές µορφές οξυγόνου (RS) που σχηµατίζονται in vivo και στα τρόφιµα 2 Σχήµα 1.2 Μακροµόρια που µπορεί να οξειδωθούν in vivo από τις RS 3 Σχήµα 1.3 Ασθένειες που συνδέονται µε την επιβλαβή δράση των RS in vivo 4 Σχήµα 1.4 Σχηµατική απεικόνιση του δικτύου αντιοξειδωτικής προστασίας των αερόβιων οργανισµών από την επιβλαβή δράση των RS 5 Σχήµα 1.5 Σταθεροποίηση φαινοξυ-ρίζας λόγω δοµών συντονισµού 9 Σχήµα 1.6 οµές συνθετικών ριζών που χρησιµοποιούνται σε δοκιµές εκτίµησης της αντιοξειδωτικής δράσης ΑΗ 11 Σχήµα 1.7 Βασική δοµή φλαβονοειδών (α) και δοµή κερκετίνης (β) 22 Σχήµα 1.8 οµή φλαβονών (α) και αουρονών (β) 24 Σχήµα 1.9 Αντιπροσωπευτικά φυτικά είδη στα οποία συναντώνται αουρόνες 25 Σχήµα 1.10 Προτεινόµενη βιοσυνθετική οδός αουρονών 26 Σχήµα 4.1 οµή των υπό µελέτη αουρονών (α) και επιλεγµένων απλών φαινολών (β) 33 Σχήµα 4.2 οµή Ζ-2-π-µεθοξυαουρόνης 34 Σχήµα 4.3 ίεδρες γωνίες για τη διερεύνηση του χώρου των διαµορφωµερών των υπο µελέτη αουρονών 37 Σχήµα 4.4 Ενεργειακό φάσµα διαµορφωµερών και δοµή των διαµορφωµερών µε την ελάχιστη και µέγιστη ενέργεια των υπό µελέτη αουρονών 38 Σχήµα 4.5 Βελτιστοποιηµένες δοµές επιλεγµένων αουρονών µε τη χαµηλότερη ενέργεια στο επίπεδο B3LYP/6-31G 39 viii

10 Σελ. Σχήµα 4.6 Πιθανές φαινοξυ- ρίζες και τιµές BDE των επιµέρους δεσµών - για το µόριο της πυρογαλλόλης στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G 41 Σχήµα 4.7 Τιµές σταθεράς ammett (σ) ενός φαινολικού υδροξυλίου 42 Σχήµα 4.8 Πιθανός µηχανισµός αντίδρασης γουαϊακόλης µε ελεύθερες ρίζες 43 Σχήµα 4.9 Φαινοξυ- ρίζες και τιµές BDE των αντίστοιχων δεσµών - στο δακτύλιο Β για το µόριο της αουρόνης E στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G 45 Σχήµα 4.10 Το τροχιακό SΟΜΟ της φαινοξυ ρίζας της αουρόνης Ε 45 Σχήµα 4.11 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου στις φαινοξυ- ρίζες απλών φαινολών και επιλεγµένων αουρονών στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G 46 Σχήµα 4.12 Φαινοξυ- ρίζες στο δακτύλιο Α των υπό εξέταση αουρονών 47 Σχήµα 4.13 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου σε επιλεγµένες φαινοξυ- ρίζες του δακτυλίου Α για την αουρόνη Γ στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G 48 Σχήµα 4.14 Υπέρθεση των βελτιστοποιηµένων δοµών σε αέρια φάση και παρουσία διαλύτη της αουρόνης Α (α) και της αντίστοιχης φαινοξυ- ρίζας (β) 54 Σχήµα 4.15 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου στη φαινοξυ- ρίζα της γουαϊακόλης σε αέρια φάση (α) και σε µεθανόλη (β), στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G 55 ix

11 Σελ. Σχήµα 4.16 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου στη φαινοξυ- ρίζα της αουρόνης Β α) σε αέρια φάση και β) σε µεθανόλη, στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G 57 Σχήµα 4.17 Συσχέτιση µεταξύ των τιµών log (1/ΙC 50 ) της δοκιµής DPP και των τιµών Ο- BDE του φαινολικού υδροξυλίου στο δακτύλιο Β σε αέρια φάση (α) και σε µεθανόλη (β). 60 Σχήµα 4.18 Αντίδραση ο-διφαινολών µε τη ρίζα DPP 61 Σχήµα 4.19 Συσχέτιση µεταξύ των τιµών log (1/ΙC 50 ) της δοκιµής 2 - και των τιµών ΙΡ (α) και Ο- BDE (β), του φαινολικού υδροξυλίου στο δακτύλιο Β παρουσία νερού 63 x

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ενεργές µορφές οξυγόνου (RS), γενικές έννοιες Ελεύθερες ρίζες χαρακτηρίζονται άτοµα ή µόρια που διαθέτουν ένα ή περισσότερα µονήρη (ασύζευκτα) ηλεκτρόνια στο υψηλότερο κατειληµµένο ατοµικό ή µοριακό τους τροχιακό (Single ccupied Atomic/Molecular rbital, SA/M) αντίστοιχα [1]. Οι ελεύθερες ρίζες, που µπορεί να είναι θετικά ή αρνητικά φορτισµένες ή ηλεκτρικώς ουδέτερες, σχηµατίζονται γενικώς µε τρεις τρόπους [2]: Με απόδοση ενός ηλεκτρονίου από ένα µόριο Υ Υ + + e Με πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου από ένα µόριο (κοινή αντίδραση σε βιολογικά συστήµατα) X + e X Με οµολυτική σχάση ενός δεσµού και σχηµατισµό δυο µοριακών θραυσµάτων που διαθέτουν από ένα µονήρες ηλεκτρόνιο (απαιτεί υψηλή ενέργεια και συνήθως συµβαίνει υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας) X-Y X + Y Καθώς τα ηλεκτρόνια όταν είναι συζευγµένα στα επιµέρους τροχιακά είναι πιο σταθερά, οι ελεύθερες ρίζες είναι εξαιρετικά ασταθείς και κατά συνέπεια πολύ δραστικές [1]. Από τις διάφορες ελεύθερες ρίζες, εκείνες που παρουσιάζουν το µεγαλύτερο ενδιαφέρον για το πεδίο των επιστηµών της υγείας και της χηµείας των τροφίµων είναι οι οξυγονούχες (π.χ. 2,, R, RΟΟ ), που είναι γνωστές µε τη συλλογική ονοµασία «ενεργές µορφές οξυγόνου» (Reactive xygen Species, RS). Οι RS, που µπορούν να σχηµατιστούν in vivo, αλλά και στα τρόφιµα ενζυµικώς, χηµικώς ή ακόµα και φωτοχηµικώς (Σχήµα 1.1), αφενός µε την παρουσία τους στον οργανισµό µπορούν 1

13 να βλάψουν τα φυσιολογικά κύτταρα, αφετέρου όταν σχηµατίζονται στα τρόφιµα µπορούν να οδηγήσουν στην υποβάθµιση της διατροφικής τους αξίας [3,4]. 2L καρβονυλικές ενώσεις 3 Ο 2 + φωτοευαισθητοποιητής 1 2 φωτοευαισθητοποιητής + 2 +, φωτοευαισθητοποιητής 3 2 +e aq Ο 2 + φωτοευαισθητοποιητής 1 2, Fe 2+ Fe ένζυµο + 3 Ο 2 L 2 ακτινοβόληση 2 2 L Σχήµα 1.1 Ενεργές µορφές οξυγόνου (RS) που σχηµατίζονται in vivo και στα τρόφιµα [4,5] Η αιτία των παραπάνω ανεπιθύµητων επιδράσεων, τόσο στον ανθρώπινο οργανισµό, όσο και στα τρόφιµα είναι η οξείδωση που µπορούν να προκαλέσουν οι RS σε διάφορα µακροµόρια λόγω της δραστικότητάς τους. Χαρακτηριστική είναι η περίπτωση της οξείδωσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων που αποτελούν συστατικά των λιπιδίων των κυτταρικών µεµβρανών, αλλά και των τροφίµων [3]. Η οξείδωση αυτή (γνωστή ως αυτοξείδωση) είναι µια αυτοκαταλυόµενη αλυσιδωτή αντίδραση που λαµβάνει χώρα µε το µηχανισµό των ελευθέρων ριζών και περιλαµβάνει τρία στάδια: την έναρξη (initiation, R. 1), τη διάδοση (propagation, R. 2-3) και τον τερµατισµό (termination, R. 4-6). L- + R L + R- (R. 1) L + 2 L (R. 2) L + L- L + L (R. 3) L + L LL (R. 4) 2 L LL + 2 (R. 5) L + L L-L (R. 6) 2

14 Η οξείδωση των ακόρεστων λιπαρών οξέων και ο σχηµατισµός των διαφόρων προϊόντων της οξείδωσής τους, µπορεί να διαταράξει τις κυτταρικές λειτουργίες [2] και στην περίπτωση των τροφίµων, να οδηγήσει στην οξειδωτική τάγγισή τους και την απώλεια των οργανοληπτικών τους χαρακτηριστικών [5]. Η κατανάλωση µάλιστα τροφίµων που έχουν υποστεί οξείδωση έχει δυσµενείς συνέπειες για την υγεία, καθώς µπορεί να συµβάλλει στην οξείδωση in vivo [6]. Επίσης, η οξείδωση και άλλων µακροµορίων in vivo όπως των πρωτεϊνών, των υδατανθράκων και των νουκλεϊκών οξέων (Σχήµα 1.2) µπορεί να επιδράσει π.χ. στη µεταφορά και ερµηνεία νευρικών σηµάτων, στο µηχανισµό αντιγραφής του γενετικού υλικού, στη δοµή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών κ.α. [7-9]. Σχήµα 1.2 Μακροµόρια που µπορεί να οξειδωθούν in vivo από τις RS Τo αποτέλεσµα της δράσης των RS είναι η εξασθένηση του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήµατος και η µη οµαλή επιτέλεση των κυτταρικών λειτουργιών, που τελικώς µπορούν να οδηγήσουν στην εµφάνιση σειράς σοβαρών παθήσεων [10-12] (Σχήµα 1.3). 3

15 Σχήµα 1.3 Ασθένειες που συνδέονται µε την επιβλαβή δράση των RS in vivo Όπως είναι λογικό, η κατανόηση της χηµείας των RS, αλλά και η παρεµπόδιση της επιβλαβούς δράσης τους, αποτελεί σκοπό υψίστης σηµασίας, τόσο για την παρεµπόδιση της εµφάνισης διαφόρων ασθενειών, όσο και για τη διατήρηση της ποιότητας των τροφίµων για µεγαλύτερο διάστηµα. 1.2 Αντιµετώπιση της δράσης των RS Η αντιµετώπιση των ελευθέρων ριζών είναι δυνατή µε τη δράση των λεγόµενων αντιοξειδωτικών [4,13]. Το περιεχόµενο του όρου είναι ευρύ και καθορίζεται από το ενδιαφέρον του κάθε επιστηµονικού πεδίου. Σε γενικές γραµµές, ως αντιοξειδωτικό µπορεί να χαρακτηριστεί κάθε ένωση που όταν υπάρχει σε χαµηλή συγκέντρωση σε σχέση µε εκείνη ενός ευοξείδωτου υποστρώµατος, µπορεί να καθυστερήσει ή και να παρεµποδίσει την οξείδωσή του [14]. Τα αντιοξειδωτικά διακρίνονται σε δυο γενικά κατηγορίες. Σ αυτά που παρεµποδίζουν τον σχηµατισµό ενεργών µορφών οξυγόνου (preventive antioxidants) και σ αυτά που δεσµεύουν τις ελεύθερες ρίζες µε σχηµατισµό σταθερών προϊόντων (chain-breaking antioxidants) [13]. 4

16 Οι αερόβιοι οργανισµοί έχουν αναπτύξει για την αντιµετώπιση των τοξικών δράσεων των RS ένα πολύπλοκο ενδογενές δίκτυο αντιοξειδωτικής προστασίας. Το δίκτυο αυτό, που πρέπει να αναπτύχθηκε από τότε που δηµιουργήθηκαν οι πρώτοι αερόβιοι οργανισµοί και εξελίχθηκε µε την πάροδο των αιώνων, περιλαµβάνει σειρά ενζυµικών συστηµάτων και άλλων ενώσεων που µπορούν να δεσµεύουν τις RS ή να παρεµποδίζουν τον σχηµατισµό τους (Σχήµα 1.4). Σε περίπτωση που η αποφυγή της οξείδωσης δεν είναι εφικτή, κατάλληλα ένζυµα που µπορούν να επιδιορθώνουν τις βλάβες των κυττάρων ή να οδηγήσουν στην αποµάκρυνσή τους από τον οργανισµό (απόπτωση κυττάρων) συµπληρώνουν το ενδογενές σύστηµα προστασίας [2,15]. Σχήµα 1.4 Σχηµατική απεικόνιση του δικτύου αντιοξειδωτικής προστασίας των αερόβιων οργανισµών από την επιβλαβή δράση των RS (SD: δισµουτάση σουπεροξειδίου, CAT: καταλάση, GR: ρεδουκτάση της γλουταθειόνης, GS-Px: υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, DA-red: ρεδουκτάση του δεϋδροασκορβικού οξέος, L: υπεροξείδιο λιπαρού οξέος, TC: α-τοκοφερόλη, ASC: ασκορβικό οξύ) Υπό φυσιολογικές συνθήκες το σύνθετο αυτό δίκτυο εξασφαλίζει µια σχετική ισορροπία στη δράση οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών παραγόντων στον οργανισµό. Ωστόσο, ένα ποσοστό των ηλεκτρονίων που παράγονται π.χ. στα µιτοχόνδρια µπορεί να διαρρεύσουν από την µεµβράνη τους, και συνεπώς να αλληλεπιδράσουν µε το οξυγόνο µε σχηµατισµό των τοξικών για τα κύτταρα RS [16]. Το γεγονός αυτό, σε 5

17 συνδυασµό µε µια σειρά από άλλους παράγοντες, όπως η έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία, ραδιενέργεια και ατµοσφαιρικούς ρύπους, η υψηλή πίεση οξυγόνου, οι συνήθειες όπως το κάπνισµα και η χρόνια κατανάλωση αλκοόλ, αλλά και σε περιπτώσεις τραυµατισµού των ιστών, η παραπάνω ισορροπία διαταράσσεται σε µεγάλο βαθµό οδηγώντας σε υπερπαραγωγή των RS (συνθήκες οξειδωτικού στρες). Έτσι, για παράδειγµα αναφέρεται ότι η επιβλαβής δράση των RS στο DNA ενός φυσιολογικού ανθρώπου εκτιµάται καθηµερινά σε επιθέσεις ανά κύτταρο [17]. Για την αντιµετώπιση του οξειδωτικού στρες, είναι συχνά απαραίτητη η ενίσχυση της ενδογενούς αντιοξειδωτικής άµυνας. Καθοριστικό ρόλο για την αποκατάσταση της ισορροπίας παίζει η διατροφή µε την πρόσληψη, µεταξύ άλλων, και διαφόρων ενώσεων µε αντιοξειδωτική δράση (dietary antioxidants) Φυσικές φαινολικές ενώσεις και πηγές τους Ξεχωριστή θέση µεταξύ των φυσικών αντιοξειδωτικών έχουν οι φαινολικές ενώσεις (ΑΗ). Πρόκειται για ενώσεις φυτικής προέλευσης που έχουν ως κοινό δοµικό χαρακτηριστικό την παρουσία στο µόριό τους τουλάχιστον ενός αρωµατικού δακτυλίου µε υποκαταστάτη µια τουλάχιστον υδροξυ- οµάδα [18]. Οι κύριες τάξεις των ΑΗ δίνονται στον Πίνακας 1.1. Πίνακας 1.1 Κύριες τάξεις φυσικών φαινολικών ενώσεων Βασική δοµή Τάξη C 6 Απλές φαινόλες, βενζοκινόνες C 6 -C 1 Υδροξυβενζοϊκά οξέα C 6 -C 2 Ακετοφαινόνες, υδροξυφαινυλοξικά οξέα C 6 -C 3 Υδροξυκινναµωµικά οξέα, φαινυλπροπένια, κουµαρίνες, ισοκουµαρίνες, χρωµόνες C 6 -C 4 Ναφθοκινόνες C 6 -C 1 -C 6 Ξανθόνες C 6 -C 2 -C 6 Στιλβένια, ανθρακινόνες C 6 -C 3 -C 6 Φλαβονοειδή, ισοφλαβονοειδή (C 6 -C 3 ) 2 Λιγνάνες, νεολιγνάνες (C 6 -C 3 -C 6 ) 2 ιµερή φλαβονοειδή (C 6 -C 3 ) n, n>2 (C 6 ) 6 (C 6 -C 3 -C 6 ) n, n=2-5 Λιγνίνες Μελανίνες Συµπυκνωµένες ταννίνες 6

18 Οι φαινολικές ενώσεις αποτελούν συνήθη συστατικά µιας δίαιτας που περιλαµβάνει την κατανάλωση προϊόντων φυτικής προέλευσης και η µέση ηµερήσια πρόσληψή τους µπορεί να φτάσει το 1 g [19], καθώς στα διάφορα τρόφιµα απαντώνται από µικροποσότητες έως και 3000 mg/kg [20]. Πλούσιες πηγές σε A θεωρούνται τρόφιµα ευρείας κατανάλωσης µεταξύ των οποίων πολλά φρούτα και οι χυµοί τους, λαχανικά, δηµητριακά, όσπρια, ελαιούχοι σπόροι και καρποί, αρτυµατικές ύλες, αρωµατικά βότανα, ροφήµατα, κόκκινα κρασιά και παρθένο ελαιόλαδο [21-24]. Ενδεικτικές πηγές και κατηγορίες φυσικών φαινολικών ενώσεων που απαντούν σε αυτές δίνονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 1.2. Ενδεικτικές πηγές φυσικών φαινολών [24] Κατηγορία ΑΗ Πηγή Φαινολικά οξέα Υδροξυκιναµµωµικά Αχλάδια, βατόµουρα, βερύκοκα, δαµάσκηνα, δηµητριακά, ελαιούχοι σπόροι, καρότα, κεράσια, κίτρο, µελιτζάνες, ροδάκινα, σπανάκι, τοµάτες Βενζοϊκά Βατόµουρα, δηµητριακά, ελαιούχοι σπόροι Φλαβονοειδή Ανθοκυανίνες Βατόµουρα, κεράσια, µαύρη και κόκκινη σταφίδα, σταφύλια, φράουλες Χαλκόνες Μήλα Φλαβανόλες Μήλα, µούρα, σταφύλια, κρεµύδια, µαρούλια Φλαβανονόλες Σταφύλια Φλαβονόλες Κίτρο Φλαβόνες Αντίδια, βατόµουρα, ελιές, µήλα, κρεµύδια, πιπέρι, φασόλια, µαρούλια, πράσα, τοµάτες, φαγόπυρα Ισοφλαβόνες Σόγια Ξανθόνες Μάνγκο Ταννίνες (συµπυκνωµένες) (υδρολυµένες) Αχλάδια, δαµάσκηνα, µήλα, ροδάκινα, σταφύλια Ρόδια, µούρα Το ενδιαφέρον για τις ΑΗ ξεκίνησε κυρίως µε σκοπό τη χρησιµοποίησή τους ως πρόσθετα σε λιπαρές ύλες για την αποφυγή της οξείδωσης [25-27]. Στην πορεία του 7

19 χρόνου και κυρίως την τελευταία εικοσαετία αυξήθηκε σηµαντικά, καθώς, επιδηµιολογικές µελέτες αλλά και in vitro δοκιµές µε µεµονωµένες ενώσεις έδειξαν ότι οι ΑΗ µπορούν να συµβάλλουν στην in vivo πρόσληψη και προστασία από διάφορα νοσήµατα, όταν λαµβάνονται καθηµερινώς µε την τροφή [28,29]. Σήµερα, το µεγάλο ενδιαφέρον για τις φυσικές φαινόλες φαίνεται από την αυξηµένη ζήτηση που παρατηρείται µεταξύ των καταναλωτών για φυσικά συστατικά που ενισχύουν τον ανθρώπινο οργανισµό [30], αλλά και για τρόφιµα που περιέχουν όσο το δυνατό λιγότερα συνθετικά πρόσθετα που µπορεί να είναι υπεύθυνα ακόµα και για την εµφάνιση καρκίνου [31] Ικανότητα φυσικών φαινολικών ενώσεων να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες Οι ΑΗ µπορούν να δράσουν ως αντιοξειδωτικά µε διάφορους τρόπους, όπως παρεµποδίζοντας τη δράση ενζύµων υπεύθυνων για αντιδράσεις οξείδωσης, δεσµεύοντας ιόντα µεταβατικών µετάλλων µε προοξειδωτική δράση ή ακόµα, δεσµεύοντας ελεύθερες ρίζες. Η ικανότητά τους να δεσµεύουν τις τελευταίες αναφέρεται ως ο κυριότερος τύπος δράσης, τόσο in vitro όσο και in vivo [3]. Για τη δέσµευση των ελευθέρων ριζών από τις ΑΗ τρεις µηχανισµοί έχουν προταθεί µέχρι σήµερα, από τους οποίους ο τρίτος προτάθηκε σχετικά πρόσφατα από τους Litwinienko and Ingold [32,33]. Ο πρώτος, (ΗΑΤ, Ηydrogen atom transfer), περιλαµβάνει την απευθείας απόδοση ατόµου υδρογόνου από το φαινολικό υδροξύλιο προς π.χ. τις υπεροξυ- (L ) ή τις αλκοξυ- (L ) ρίζες και την αντίστοιχη µετατροπή τους σε υδροϋπεροξείδια (L) ή υδροξυ- παράγωγα (L) (αντίδραση R. 7). Ο δεύτερος, (SET, Single electron transfer coupled with proton transfer), περιλαµβάνει δύο στάδια και συγκεκριµένα την αναγωγή της υπεροξυρίζας (L ) προς το αντίστοιχο ανιόν µε απόδοση µονήρους ηλεκτρονίου και στη συνέχεια τη µετατροπή του ανιόντος σε υδροϋπεροξείδιο µε απόδοση κατιόντος υδρογόνου (αντίδραση R. 8). Ο τρίτος, (SPLET, sequential proton loss electron transfer) προϋποθέτει το σχηµατισµό ανιόντος από την ΑΗ και στη συνέχεια την απόδοση ηλεκτρονίου για τη δέσµευση της ελεύθερης ρίζας (αντίδραση R. 9). Α+L /L Α + L/L (R. 7) Α+L /L L /L ---Α + L/L + Α (R. 8) Α+L /L Α - + L /L + + L /L +Α + + L/L +Α (R. 9) 8

20 Τόσο η απόδοση ατόµου υδρογόνου, όσο και εκείνη µονήρους ηλεκτρονίου αναφέρεται ότι συµβαίνουν παράλληλα σε ένα σύστηµα, αλλά µε διαφορετική ταχύτητα [34]. Η δέσµευση ελευθέρων ριζών µέσω της απόδοσης ατόµου υδρογόνου χαρακτηρίζει συνήθως τη δραστικότητα των ΑΗ σε περιπτώσεις όπως η αυτοξείδωση των λιπαρών υλών [35]. Στην περίπτωση των βιολογικών συστηµάτων, όπου το περιβάλλον είναι υδατικό, η απόδοση του µονήρους ηλεκτρονίου µπορεί να ευνοηθεί µιας και το νερό µπορεί αφενός να παρεµποδίζει ως ένα βαθµό την απευθείας απόδοση ατόµου υδρογόνου λόγω σχηµατισµού δεσµών υδρογόνου µε τις ενώσεις, αφετέρου να σταθεροποιεί ιονισµένες ενώσεις [36]. Στην περίπτωση που οι συνθήκες ευνοούν τον εξαρχής ιονισµό του φαινολικού υδροξυλίου, τότε ο SPLET είναι ο µηχανισµός που προτάθηκε ως ο πιο πιθανός [32,33]. Οι φαινοξυ-ρίζες (Α ) που παράγονται τελικά ανεξάρτητα από το µηχανισµό δράσης των ΑΗ, είναι λιγότερο δραστικές από τις LΟ και R καθώς σταθεροποιούνται λόγω δοµών συντονισµού (Σχήµα 1.5). Σχήµα 1.5 Σταθεροποίηση φαινοξυ-ρίζας λόγω δοµών συντονισµού Επίσης οι Α αντιδρούν µε οµοειδείς ή άλλου τύπου ελεύθερες ρίζες (π.χ. L ) µε σχηµατισµό σταθερών προϊόντων (Αντιδράσεις R ) [3]. Α + Α Α-Α (R. 10) Α + LΟΟ LΟΟΑ (R. 11) Α + L LΑ (R. 12) Όλες οι Α των ΑΗ µε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση δεσµεύονται µε τον παραπάνω τρόπο (R ). Αντίθετα, στην περίπτωση ΑΗ µε ασθενή δράση είναι δυνατόν να λάβουν χώρα και άλλες παράπλευρες αντιδράσεις που είναι όµως πιο βραδείες σε σχέση µε την R. 7. Έτσι, για παράδειγµα, η Α µπορεί να αντιδράσει µε το 9

21 οξυγόνο ( 3 Ο 2 ) της ατµόσφαιρας και στη συνέχεια µε το λιπαρό υπόστρωµα (L), (R ) ή απευθείας µε το λιπαρό υπόστρωµα (L) και τα υδροϋπεροξείδια όταν δεν είναι σταθερή (R ). Επίσης, η ίδια η ΑΗ µπορεί να οξειδωθεί απευθείας από το οξυγόνο ή και να αντιδράσει µε υπάρχοντα υδροϋπεροξείδια (R ) εµφανίζοντας τελικά προοξειδωτική δράση. Α +Ο 2 ΑΟΟ (R. 13) ΑΟΟ +LΗ ΑΟΟΗ+L (R. 14) Α +LΗ ΑΗ+L (R. 15) Α + LΟΟΗ ΑΗ+LΟΟ (R. 16) ΑΗ+ Ο 2 Α + ΗΟΟ (R. 17) ΑΗ+LΟΟΗ Α +Η 2 Ο+LΟ (R. 18) Αντιοξειδωτική δράση παρουσιάζεται πάνω από µια συγκέντρωση, διαφορετική για κάθε ΑΗ, που ονοµάζεται κρίσιµη συγκέντρωση. Όταν όµως το επίπεδο προσθήκης είναι εξαιρετικά υψηλό αντί της αντιοξειδωτικής µπορεί να παρατηρηθεί και προοξειδωτική δράση (R ). Όταν η ΑΗ απαντάται σε υψηλές συγκεντρώσεις η ταχύτητα των αντιδράσεων R. 7 και R. 8 είναι σταθερή, καθώς το περιεχόµενο σε LΟΟ και LΟ είναι περιορισµένο. Υπό αυτές τις συνθήκες αντιδράσεις όπως οι R. 13, R. 17 και R. 18, στις οποίες δε συµµετέχουν οι παραπάνω ρίζες, γίνονται πιο σηµαντικές µε αποτέλεσµα την παραγωγή L (R ). Χαρακτηριστικό παράδειγµα ΑΗ που µπορεί να εµφανίσει προοξειδωτική δράση µε αύξηση της συγκέντρωσης είναι η α-τοκοφερόλη [37]. Όπως είναι φανερό η αποτελεσµατικότητα των ΑΗ εξαρτάται αφενός από την ευκολία απόδοσης ατόµου υδρογόνου/µονήρους ηλεκτρονίου προς τις ελεύθερες ρίζες και αφετέρου από τη σταθερότητα της φαινοξυ-ρίζας Α. Καθοριστικό ρόλο και στις δύο περιπτώσεις παίζουν τα δοµικά χαρακτηριστικά της ΑΗ, όπως το είδος και ο αριθµός των υποκαταστατών στον αρωµατικό δακτύλιο. Ο ρόλος των υποκαταστατών στην ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών θα αναπτυχθεί σε επόµενη παράγραφο. 10

22 1.3. Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών Πειραµατικές µέθοδοι Όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, οι ΑΗ δρουν κυρίως δεσµεύοντας ελεύθερες ρίζες. Έτσι, έχουν αναπτυχθεί ποικίλες δοκιµές και έχουν εφαρµοστεί πολλά διαφορετικά αναλυτικά πρωτόκολλα για τον in vitro προσδιορισµό αυτής της ικανότητας. Ως καταλληλότερη µεθοδολογία αναφέρεται η περίπτωση κατά την οποία γίνεται µελέτη της οξειδωτικής κατάστασης ενός λιπαρού υποστρώµατος παρουσία π.χ. υπεροξυ- ριζών, καθώς τα λιπίδια αποτελούν κύριο στόχο της οξείδωσης, τόσο σε κυτταρικό επίπεδο, όσο και στα τρόφιµα [38]. Εκτός όµως από την παραπάνω µεθοδολογία, τα τελευταία χρόνια παρατηρείται η χρησιµοποίηση σηµαντικού αριθµού δοκιµών µε ρίζες, συχνά συνθετικές, διαφορετικές από τις υπεροξυ- ρίζες. Αιτία είναι η απλότητα αυτού του είδους των πρωτοκόλλων και η δυνατότητα για την απόκτηση αποτελεσµάτων σε σύντοµο χρονικό διάστηµα για µεγάλο εύρος ενώσεων λιπόφιλων, αλλά και υδρόφιλων. Από τις πλέον χρησιµοποιούµενες δοκιµές είναι εκείνες που περιλαµβάνουν τις συνθετικές ρίζες DPP [39], ABTS + [40] και DMPD + [41] (Σχήµα 1.6). 2 N N N 2 N N 2 Ρίζα 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζυλίου (DPP ) - 3 S S N C 3 N C 3 Κατιοντική ρίζα Ν, Ν-διφαινυλο-π-φαινυλενδιαµίνης (DMPD + ) S S 3 - N N N + N + + N N 4 4 C 2 5 C 2 5 Κατιοντική ρίζα του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος) (ABTS + ) Σχήµα 1.6 οµές συνθετικών ριζών που χρησιµοποιούνται σε δοκιµές εκτίµησης της αντιοξειδωτικής δράσης ΑΗ οκιµές που εστιάζουν στην εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης υπεροξυ- ριζών (RΟΟ ) είναι η δοκιµή αποχρωµατισµού της κροκίνης (Crocin Bleaching Assay) 11

23 [42], η δοκιµή RAC (xygen Radical Absorbance Capacity) [43], και η δοκιµή TSC (Total xyradical Scavenging Capacity) [44]. Τα παραπάνω πρωτόκολλα ωστόσο δεν περιλαµβάνουν µελέτη της οξείδωσης λιπαρού υποστρώµατος, ενώ οι χρησιµοποιούµενες ρίζες είναι συνθετικές (παράγονται µε θέρµανση αζω- εκκινητών) και δεν έχουν σχέση µε τις αντίστοιχες που προκύπτουν κατά την οξείδωση των ακόρεστων λιπαρών οξέων. Μεταξύ άλλων υπάρχουν και δοκιµές που εξετάζουν την ικανότητα δέσµευσης ριζών βιολογικής φύσης. Χαρακτηριστικά παραδείγµατα αποτελούν οι δοκιµές δέσµευσης της ρίζας του σουπεροξειδίου (Ο - 2 ) [45] και της υδροξυ- ρίζας (ΟΗ ) [46]. Η πρώτη αποτελεί προϊόν αναγωγής του µοριακού οξυγόνου από την οξειδάση της ξανθίνης (ΧAD) και ενώ δεν παρουσιάζει ισχυρό οξειδωτικό χαρακτήρα (Ο 2 / Ο - 2 :-330 mv) [47], µπορεί να αποτελέσει πρόδροµη ένωση για την παραγωγή της ΟΗ µε σειρά αντιδράσεων οξειδοαναγωγής [2]. Η τελευταία είναι πολύ δραστική (ΗΟ, Η + /Η 2 Ο:+2310 mv) [47] και κατά συνέπεια πολύ τοξική, καθώς αντιδρά µε όλα σχεδόν τα βιοµόρια [2]. Για την αντιµετώπιση της δράσης της υδροξυρίζας δεν υπάρχει κατάλληλο ένζυµο, έτσι η προστασία επιτυγχάνεται εµµέσως µε παρεµπόδιση του σχηµατισµού πρόδροµων ενώσεών ή µε δέσµευση ιόντων µεταβατικών µετάλλων (βλ. Σχήµα 1.1). Καθώς οι ΑΗ µπορούν να δράσουν αποδίδοντας και ηλεκτρόνια προς τις ελεύθερες ρίζες, αναπτύχθηκαν διάφορες µεθοδολογίες που εκτιµούν πειραµατικά τη συγκεκριµένη ικανότητα. Τα αντίστοιχα πρωτόκολλα παρόλα αυτά περιλαµβάνουν αντιδράσεις οξειδοαναγωγής µε ιόντα µεταβατικών µετάλλων όπως του σιδήρου ή του χαλκού και όχι µε ελεύθερες ρίζες. Γνωστές είναι οι δοκιµές FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) [48], CUPRAC (Copper Reduction Assay) [49], αλλά και η δοκιµή που περιλαµβάνει χρήση του αντιδραστηρίου Folin Ciocalteu και συνήθως χρησιµοποιείται για την εκτίµηση των επιπέδων των ολικών φαινολών σε εκχυλίσµατα [50]. Η ανάγκη για την παραγωγή αποτελεσµάτων που σχετίζονται µε τη δραστικότητα των ΑΗ σε πραγµατικά συστήµατα οδήγησε και στην ανάπτυξη δοκιµών σε διάφορα µοντέλα. οκιµές σε µοντέλα ελαίων, λιποσώµατα, γαλακτώµατα ή σε υποστρώµατα βιολογικής σηµασίας (π.χ. λιποπρωτεΐνες, κύτταρα) συναντώνται συχνά στη βιβλιογραφία [51]. Η χρησιµοποίηση τέτοιων συστηµάτων αναµένεται να οδηγήσει σε πιο ασφαλή συµπεράσµατα. Η ερµηνεία όµως των αποτελεσµάτων είναι σχετικά δυσκολότερη καθώς παράγοντες όπως η θερµοκρασία, η συγκέντρωση των ΑΗ, το περιβάλλον της αντίδρασης, η πολικότητα και η δράση των ΑΗ µε 12

24 περισσότερους από έναν µηχανισµούς δείχνει ότι η εξέταση της αποτελεσµατικότητας και η κατανόηση της συµβολής των δοµικών χαρακτηριστικών είναι µια δύσκολη υπόθεση. Για το λόγο αυτό είναι αναγκαίο η µελέτη των ΑΗ να γίνεται µε πολλές µεθόδους και σε διαφορετικές συνθήκες Υπολογιστικές µέθοδοι Πέρα από τις πειραµατικές µεθόδους, τα τελευταία χρόνια εξαιτίας της µεγάλης ανάπτυξης στο πεδίο της Κβαντικής Χηµείας και των υπολογιστών, δόθηκε η δυνατότητα εφαρµογής θεωρητικών µεθόδων στη µελέτη της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ΑΗ [51]. Αντίθετα µε το παρελθόν, όπου απαιτούνταν εξαιρετικά µεγάλοι χρόνοι υπολογισµού, η συστηµατική βελτίωση τόσο των υπολογιστικών συστηµάτων όσο και των εξειδικευµένων λογισµικών έχει κάνει εφικτή τη χρήση των κβαντοχηµικών υπολογισµών και σε συστήµατα του µεγέθους των ΑΗ. Με τον τρόπο αυτό προστέθηκε ένα ακόµα εργαλείο στη µελέτη της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών από τις ΑΗ. Αντίθετα µε τις πειραµατικές µεθόδους, όπου η εκτίµηση της αποτελεσµατικότητας των ΑΗ γίνεται συνήθως έµµεσα, µέσω για παράδειγµα της µελέτης των µεταβολών ενός λιπαρού υποστρώµατος, της ελάττωσης της συγκέντρωσης ελεύθερων ριζών κ.α., οι υπολογιστικές µέθοδοι εστιάζουν στο ίδιο το µόριο. Συγκεκριµένα, στόχος τους είναι ο υπολογισµός της συνολικής ενέργειας του µορίου και της µοριακής πολυηλεκτρονικής κυµατοσυνάρτησης που περιγράφει τη βασική ή µια από τις διηγερµένες καταστάσεις του, συνάρτηση της οποίας είναι όλες οι ιδιότητές του. Απαραίτητη προϋπόθεση για την επίτευξη του παραπάνω υπολογισµού είναι η εύρεση της κατάλληλης γεωµετρίας του υπό εξέταση µορίου, που θα έχει τη χαµηλότερη δυνατή ενέργεια και εποµένως θα είναι η ενεργειακώς σταθερότερη διαµόρφωση [52]. Βάση των υπολογιστικών µεθόδων αποτελεί ο υπολογισµός της ενέργειας και της µοριακής πολυηλεκτρονικής κυµατοσυνάρτησης της υπό µελέτη ένωσης, που προκύπτει από την επίλυση της ανεξάρτητης του χρόνου εξίσωσης του Schrödinger ΗΨ=ΕΨ. Το όλο σύστηµα περιγράφεται από την µοριακή πολυηλεκτρονική κυµατοσυνάρτηση Ψ, που αποτελεί συνάρτηση των συντεταγµένων όλων των ηλεκτρονίων και των πυρήνων του συστήµατος. Ο τελεστής Η (Χαµιλτώνειος τελεστής) είναι ένας ενεργειακός τελεστής, που περιλαµβάνει την κινητική ενέργεια 13

25 των ηλεκτρονίων, την κινητική ενέργεια των πυρήνων και τις δυναµικές ενέργειες, ελκτικές και απωστικές µεταξύ των ηλεκτρονίων και των πυρήνων του συστήµατος. Όταν ο τελεστής Η εφαρµοστεί στην κυµατοσυνάρτηση Ψ δίνει ως αποτέλεσµα το γινόµενο της ολικής ενέργειας του συστήµατος Ε, µε την κυµατοσυνάρτηση Ψ. Η συγκεκριµένη εξίσωση µπορεί να λυθεί επακριβώς µόνο για µονοηλεκτρονιακά συστήµατα (π.χ. Η, Ηe +, Η + 2 ) καθώς είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη για να επιλυθεί αναλυτικά. Για να γίνει αυτό εφικτό και ιδιαίτερα για τις µοριακές ενώσεις έχουν γίνει διάφορες προσεγγίσεις [53,54]. Οι κυριότερες είναι: Η προσέγγιση Born-ppenheimer: Σύµφωνα µε τους Born-ppenheimer εξαιτίας της µεγάλης διαφοράς στη µάζα µεταξύ ηλεκτρονίων και πρωτονίων τα τελευταία κινούνται πολύ αργά, εποµένως µπορούν να θεωρηθούν σταθερά στο χώρο και η εξίσωση Schrödinger να επιλυθεί µόνο για τα ηλεκτρόνια. Έτσι η µορφή της εξίσωσης Schrödinger γίνεται απλούστερη. Η προσέγγιση της θεωρίας των Μοριακών Τροχιακών (Molecular orbital, ΜΟ): Στη συγκεκριµένη περίπτωση η ολική κυµατοσυνάρτηση Ψ µπορεί να εκφραστεί ως γινόµενο των µοριακών τροχιακών που είναι κατειληµµένα από τα ηλεκτρόνια για µια δεδοµένη ενεργειακή κατάσταση. Τα µοριακά τροχιακά στη συνέχεια θεωρείται ότι µπορούν να εκφραστούν ως γραµµικός συνδυασµός των επιµέρους ατοµικών τροχιακών (Linear Combination of Atomic rbitals, LCA). Το σύνολο των κυµατοσυναρτήσεων των ατοµικών τροχιακών που χρησιµοποιούνται για την περιγραφή των µοριακών τροχιακών αποτελεί το λεγόµενο σύνολο βάσης. Με βάση τις παραπάνω προσεγγίσεις η επίλυση της εξίσωσης Schrödinger είναι δυνατή και γίνεται µε τη µέθοδο των διαδοχικών επαναλήψεων που ονοµάζεται και µέθοδος αυτοσυνεπούς πεδίου (Self Consistent Field, SCF). Η µέθοδος προτάθηκε από το artree και συµπληρώθηκε από τον Fock µε την εισαγωγή της αρχής της αντισυµµετρίας (Θεωρία artree-fock, F). Έτσι αρχικά γίνεται µια επιλογή των αρχικών ΜΟ, βάσει των οποίων θα υπολογιστούν νέα ΜΟ που στη συνέχεια θα αποτελέσουν εκ νέου τη βάση για την επανάληψη του υπολογισµού. Η διαδικασία επαναλαµβάνεται µέχρι τα ΜΟ που υπολογίζονται να µη διαφέρουν από εκείνα που χρησιµοποιήθηκαν στην αρχή του υπολογιστικού κύκλου. Το γεγονός αυτό συµβαίνει όταν η ενέργεια του συστήµατος µεταξύ δύο διαδοχικών κύκλων δε µεταβάλλεται ουσιαστικά, σύµφωνα πάντα µε ένα όριο που έχει τεθεί εξ αρχής. Αν και οι υπολογισµοί F µπορούν να δώσουν ικανοποιητικά αποτελέσµατα έχουν αναπτυχθεί διάφορες προσεγγίσεις για τη συντόµευση της υπολογιστικής 14

26 διαδικασίας (ηµιεµπειρικές µέθοδοι) ή την αύξηση της ακρίβειας των παραγόµενων αποτελεσµάτων (π.χ. υπολογισµοί τύπου CI, Configuration Interaction), µε τους οποίους µπορεί να προσεγγισθεί η µοριακή κυµατοσυνάρτηση µε ακρίβεια. Ab initio υπολογισµοί: Ο όρος ab initio που σηµαίνει «από την αρχή» αναφέρεται σε υπολογισµούς που στηρίζονται καθαρά σε θεωρητικές αρχές χωρίς τη χρήση πειραµατικών δεδοµένων. Οι πιο χαρακτηριστική κατηγορία αυτών των υπολογισµών είναι οι υπολογισµοί artree-fock, (F). Αποτελούν ακριβείς υπολογισµούς και συνήθως κατά τη µελέτη των οργανικών µορίων στην υπολογιστική διαδικασία συµπεριλαµβάνονται όλα τα ηλεκτρόνια, δηλαδή τόσο αυτά που ανήκουν στις στιβάδες σθένους όσο και αυτά που ανήκουν στις εσωτερικές στιβάδες των ατόµων που αποτελούν το µόριο. Εξαιτίας ωστόσο κάποιων προσεγγίσεων, όπως η LCA, η τιµή της ενέργειας που υπολογίζεται είναι πάντοτε µεγαλύτερη από την πραγµατική και τείνει προς ένα όριο, γνωστό ως όριο artree-fock, που µικραίνει όσο το χρησιµοποιούµενο σύνολο βάσης γίνεται µεγαλύτερο και αρτιότερο. Ένα από τα µειονεκτήµατα των υπολογισµών F είναι ότι δεν περιλαµβάνoυν τη συσχέτιση των ηλεκτρονίων και πιο συγκεκριµένα εκείνη που αναφέρεται στα ηλεκτρόνια µε αντίθετο spin. Μέθοδοι όπως αυτή των διαταραχών Møller-Plesset, της αλληλεπίδρασης διαµόρφωσης (Configuration Ιnteraction, CI), των συζευγµένων συµπλεγµάτων (Coupled Cluster, CC), του αυτοσυνεπούς πεδίου πολλαπλών διαµορφώσεων (Multi Configurational Self Consistent Field, MCSCF) έχουν αναπτυχθεί για τον υπολογισµό της συσχέτισης ηλεκτρονίων. Οι υπολογισµοί που λαµβάνουν υπόψη τη συγκεκριµένη συσχέτιση, δίνουν πιο ακριβή αποτελέσµατα όσον αφορά την τιµή της ενέργειας κα της µοριακής γεωµετρίας. Ορισµένοι από αυτούς χρειάζονται πιο εξειδικευµένη γνώση για την εφαρµογή τους και είναι περισσότερο χρονοβόροι [52]. Ηµιεµπειρικοί υπολογισµοί: Οι ηµιεµπειρικοί υπολογισµοί έχουν δοµή ανάλογη µε εκείνη των F. Ωστόσο χρησιµοποιούνται διάφορες προσεγγίσεις κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να επιτυγχάνεται η µεγαλύτερη δυνατή απλοποίηση της υπολογιστικής διαδικασίας. Συγκεκριµένα, πολλά στοιχεία της µήτρας τους αγνοούνται ή προσεγγίζονται µε απλοποιηµένες εκφράσεις και συναρτήσεις που αντικαθίστανται από εµπειρικές παραµέτρους µε αποτέλεσµα τον περιορισµό του αριθµού των ολοκληρωµάτων που πρέπει τελικά να επιλυθούν. Επιπλέον, σε αυτούς τους υπολογισµούς λαµβάνονται υπόψη µόνο τα ηλεκτρόνια των στιβάδων σθένους των ατόµων που αποτελούν το µόριο ή για µια συγκεκριµένη τάξη ενώσεων τα π- ηλεκτρόνια της στιβάδας σθένους [55]. Με τον τρόπο αυτό το χρονικό διάστηµα που 15

27 απαιτείται για την εκτέλεση ενός υπολογισµού συντοµεύεται. Οι ηµιεµπειρικές µέθοδοι (π.χ. Modified Neglect of Differential verlap, MND [56], Parametric Model 3, PM 3 [57], Austin Model 1, AM1, [58]) χρησιµοποιούνται σήµερα ευρύτατα και από τους χηµικούς, ως εργαλείο ρουτίνας. Οι ηµιεµπειρικοί υπολογισµοί αποτέλεσαν σηµαντικό εργαλείο για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης στο παρελθόν [59,60], καθώς οι υπολογιστικές απαιτήσεις για την εκτέλεση τους είναι µικρές. DFT υπολογισµοί: Πρόκειται για υπολογισµούς που στηρίζονται στην εφαρµογή της θεωρίας συναρτησιακής πυκνότητας (Density Functional Theory). Η συγκεκριµένη κατηγορία υπολογισµών αναπτύχθηκε πιο πρόσφατα σε σχέση µε εκείνη των ab initio και σήµερα είναι αρκετά δηµοφιλής, καθώς η χρήση DFT υπολογισµών δεν φαίνεται να είναι τόσο χρονοβόρα όσο αυτή άλλων µεθόδων και µπορεί να οδηγήσει σε αποτελέσµατα µε ανάλογη ακρίβεια [52]. Σύµφωνα µε την DFT η ενέργεια και όλες οι άλλες ηλεκτρονιακές ιδιότητες της βασικής κατάστασης µιας ένωσης καθορίζονται κατά τρόπο µοναδικό από την ηλεκτρονική πυκνότητα πιθανότητας ρ. Έτσι η ενέργεια µιας ένωσης αποτελεί συνάρτηση του ρ. Η αρχή αυτή αποτελεί το θεώρηµα των oenburg και Kohn που αποτέλεσε την αφετηρία για την παραγωγή αργότερα των εξισώσεων Khon και Sham. Οι εξισώσεις Khon και Sham είναι ανάλογες µε εκείνες των F, υπερτερούν ωστόσο, καθώς περιλαµβάνουν τη συσχέτιση των ηλεκτρονίων. Ακόµα και στην περίπτωση των DFT υπολογισµών προτάθηκαν προσεγγίσεις που η καταλληλότητά τους ελέγχθηκε µε βάση την ακρίβεια των τιµών µοριακών ιδιοτήτων µε πειραµατικά δεδοµένα. Χαρακτηριστική είναι η προσέγγιση τοπικής πυκνότητας (Local Density Approximation, LDA) και η προσέγγιση τοπικής πυκνότητας spin (Local Spin Density Approximation, LSDA) [52]. Πρόσφατη εξέλιξη στον τοµέα των DFΤ υπολογισµών είναι η χρήση συναρτησιακών παραγόντων διορθωµένης κλίσης (gradient corrected functionals) και υβριδικών συναρτησιακών παραγόντων (hybrid functionals). Οι τελευταίοι είναι µικτοί συναρτησιακοί παράγοντες που περιλαµβάνουν τους όρους ανταλλαγής των F και της DFT, αλλά και τους όρους συσχέτισης της DFT. Χαρακτηριστική είναι η περίπτωση της Β3LYP, που αποτελεί συνδυασµό του υβριδικού συναρτησιακού παράγοντα τριών παραµέτρων του Becke Β3, και του συναρτησιακού παράγοντα συσχέτισης LYP και έχει γίνει η πιο διαδεδοµένη σε χρήση συνάρτηση της DFT [52]. 16

28 Υπολογισµός τιµών φυσικοχηµικών παραµέτρων για το χαρακτηρισµό της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες Μέχρι σήµερα, η υπολογιστική εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης έχει επικεντρωθεί στον υπολογισµό των τιµών µοριακών δεικτών που µπορούν να χαρακτηρίσουν την ικανότητα των ΑΗ να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες [34,60-68]. Καθώς η ικανότητα αυτή σχετίζεται µε την ισχύ του δεσµού Ο-Η του φαινολικού υδροξυλίου (όσο πιο ασθενής ο δεσµός τόσο πιο ισχυρό το αντιοξειδωτικό), ή µε την τάση απόδοσης ηλεκτρονίου, ο υπολογισµός τιµών που τις χαρακτηρίζουν µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την πρόβλεψη της δραστικότητας των ΑΗ. Παράµετροι που έχουν διερευνηθεί στο παρελθόν για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης είναι το µήκος και η τάξη του δεσµού µεταξύ υδρογόνου και οξυγόνου στο φαινολικό υδροξύλιο, η ενθαλπία σχηµατισµού της ελεύθερης ρίζας (Difference in eat of Formation, F) που συναντάται και ως ενθαλπία διάσπασης δεσµού (Bond Dissociation Enthalpy, BDE) του φαινολικού υδροξυλίου, η ιδιοτιµή του υψηλότερου κατεχόµενου µοριακού τροχιακού (ighest ccupied Molecular rbital, ΗΟΜΟ), το δυναµικό ιοντισµού (Ionization Potential, ΙΡ) και η διπολική ροπή [34,59,63,66,67,69,70]. Από τις διάφορες παραµέτρους που έχουν µελετηθεί δύο είναι οι πλέον χρησιµοποιούµενες. Η µία είναι η τιµή της BDE που προκύπτει από τον υπολογισµό της διαφοράς της ενθαλπίας Η µεταξύ αντιδρώντων και προϊόντων και δίνεται από τη σχέση: BDE = Η ο = Η ο (Α ) + Η ο (Η ) Η ο (ΑΗ) Όπου Η ο (Α ), Η ο (Η ), και Η ο (ΑΗ) οι τιµές της ενθαλπίας της φαινοξυ- ρίζας, της ρίζας του υδρογόνου και της µητρικής φαινολικής ένωσης. Η τιµή της BDE για την κάθε ΑΗ µπορεί να αποτελέσει µέτρο της αποτελεσµατικότητας µιας υπό εξέταση ένωσης όσον αφορά τη δράση µε απόδοση ατόµου υδρογόνου. Άλλη φυσικοχηµική παράµετρος είναι το δυναµικό ιοντισµού η τιµή του οποίου χαρακτηρίζει την ικανότητα απόδοσης µονήρους ηλεκτρονίου και ορίζεται ως η διαφορά στην ενέργεια µεταξύ µητρικής ένωσης (ΑΗ) και της αντίστοιχης κατιονικής ρίζας (Α + ): ΙΡ= Ε (ΑΗ + ) Ε (ΑΗ) 17

29 Στις υπολογιστικές προσεγγίσεις, απαραίτητη προϋπόθεση για την αξιολόγηση της σηµασίας του υπολογισµού των συγκεκριµένων ιδιοτήτων στην εκτίµηση της δραστικότητας είναι η πειραµατική επαλήθευση των αποτελεσµάτων. Σύµφωνα πάντα µε πειραµατικά δεδοµένα, η τιµή της BDE και σε µικρότερο βαθµό η τιµή του ΙΡ είναι οι καταλληλότερες παράµετροι για την εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών, καθώς φαίνεται ότι υπάρχει σηµαντική συσχέτιση των µεγεθών αυτών µε τις τιµές logk s της ταχύτητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών [59,70-72]. Στο σηµείο αυτό αξίζει να σηµειωθεί ότι χαµηλή τιµή ΙΡ δεν είναι απαραίτητα επιθυµητή, καθώς µια ένωση που µπορεί να ιονιστεί εύκολα µε απόδοση ηλεκτρονίου µπορεί να έχει προοξειδωτική δράση όταν έρθει σε επαφή µε το µοριακό οξυγόνο [34]. Τελευταία, για την πλήρη µελέτη του µηχανισµού SET έχει αρχίσει η µελέτη της ικανότητας αποπρωτονίωσης των κατιονικών ριζών [73,74]. Η φυσικοχηµική παράµετρος που περιγράφει αυτήν την ικανότητα προσφοράς πρωτονίου έχει µελετηθεί λιγότερο απ όλους και καλείται ενθαλπία απόσπασης πρωτονίου (Proton Dissociation Enthalpy, PDE). Η PDE ορίζεται ως: ΡDE = Η ο = Η ο (Α ) + Η ο (Η + ) Η ο (Α + ) Όπου Η ο (Α ), Η ο (Η + ), και Η ο (Α + ) οι τιµές της ενθαλπίας της φαινοξυ ρίζας, του κατιόντος υδρογόνου και της κατιονικής ρίζας. Είναι φανερό ότι όσο µεγαλύτερη η τιµή της PDE τόσο δυσκολότερα γίνεται η αποπρωτονίωση της ελεύθερης ρίζας. Τέλος, µετά την πρόταση του µηχανισµού δράσης των ΑΗ και µέσω του µηχανισµού SPLET έγιναν µελέτες σχετικά µε τη συµβολή στην ερµηνεία πειραµατικών αποτελεσµάτων και άλλων φυσικοχηµικών παραµέτρων όπως η ενθαλπία αποπρωτονίωσης των ΑΗ µε σχηµατισµό ανιόντος (Proton Affinity, ΡΑ) και της ενθαλπίας για την απόδοση ηλεκτρονίου από το ανιόν (Electron Transfer Enthalpy, ETE) [75-77] Θεωρητική προσέγγιση της επιδιαλύτωσης Οι υπολογιστικές µελέτες εκτίµησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας που αναφέρθηκαν παραπάνω αφορούν τη µελέτη µορίων στην αέρια φάση όπου, όπως είναι λογικό, δε υφίσταται κάποια αλληλεπίδραση µε άλλα µόρια. Στην πραγµατικότητα, οι 18

30 πειραµατικές µελέτες της αντιοξειδωτικής ικανότητας, όπως και οι δράσεις σε βιολογικό επίπεδο ή στα τρόφιµα, πραγµατοποιούνται σε κάποιο περιβάλλον η αλληλεπίδραση του οποίου µε τις υπό µελέτη ΑΗ δεν µπορεί να θεωρηθεί αµελητέα. Η παρουσία ενός διαλύτη εισάγει σε ένα σύστηµα κάποια ενέργεια αλληλεπίδρασης µε τη διαλυµένη ουσία. Εξαιτίας αυτής της αλληλεπίδρασης, επηρεάζεται η ενέργεια της διαλυµένης ένωσης και κατά συνέπεια οι ιδιότητές της. Το φαινόµενο είναι πιο χαρακτηριστικό κατά την παρουσία ιδιαίτερα ενός πολικού µέσου καθώς τότε είναι δυνατό να προκληθεί διάκριση φορτίων στο µόριο. Αυτό έχει ως άµεση συνέπεια αλλαγές στην ενέργεια, εποµένως µεταβολές στην ηλεκτρονιακή πυκνότητα και στις σχετικές ιδιότητες [52]. Κατά τη διάλυση µιας ένωσης τρεις διαφορετικές δράσεις λαµβάνουν χώρα µε το διαλύτη. Αρχικά, το µόριο για να διαλυθεί, πρέπει να αποµακρύνει µόρια διαλύτη, ώστε να σχηµατίσει µια κοιλότητα µέσα στην οποία θα τοποθετηθεί. Η ενέργεια που χρειάζεται για να γίνει αυτό, ονοµάζεται ενέργεια επιδιαλύτωσης. Η δεύτερη, περιλαµβάνει το σύνολο των αλληλεπιδράσεων µεταξύ διαλύτη-ένωσης όπως είναι οι δυνάµεις Van der Waals, διασποράς και δεσµού υδρογόνου. Τέλος, στην εγγύτατη περιοχή µεταξύ διαλύτη και ένωσης (στιβάδα επιδιαλύτωσης), τα µόρια του διαλύτη αναδιατάσσονται µε σκοπό τη µέγιστη δυνατή αλληλεπίδραση των µορίων του µε το µόριο της ένωσης. Η ενέργεια σχηµατισµού δεσµών υδρογόνου προκύπτει σε µεγάλο βαθµό από αυτή την αναδιάταξη των µορίων του διαλύτη [52]. Όπως προκύπτει από τα παραπάνω η επίδραση του διαλύτη είναι σηµαντική. Για το λόγο αυτό έγιναν προσπάθειες για την ανάπτυξη υπολογιστικών µοντέλων που µπορούν να προσοµοιάσουν τη διαλυτοποίηση. Οι σχετικές µέθοδοι που αναπτύχθηκαν αναφέρονται ως µέθοδοι αυτοσυνέπειας του πεδίου της αντίδρασης, SCRF (Self Consistent Reaction Field). Στις µεθόδους αυτές ο διαλύτης θεωρείται ως ένα συνεχές µέσο µε οµοιόµορφη τιµή διηλεκτρικής σταθεράς ε (πεδίο της αντίδρασης). Το µόριο της υπό µελέτη ένωσης τοποθετείται σε µια κοιλότητα εντός του διαλύτη, ανάλογα µε τον τρόπο που ορίζεται η συγκεκριµένη κοιλότητα, αλλά και το πεδίο της αντίδρασης έχουν αναπτυχθεί διάφορες µέθοδοι [52]. Η πιο απλή από αυτές είναι η µέθοδος του πεδίου αντίδρασης nsager, (nasager Reaction Field Method). Σύµφωνα µε αυτήν η κοιλότητα στην οποία τοποθετείται το µόριο θεωρείται σφαιρική. Το µόριο που υφίσταται πόλωση αλληλεπιδρά µε το ηλεκτρικό πεδίο του διαλύτη µε σκοπό την τελική σταθεροποίηση 19

31 του συστήµατος [78]. Μειονέκτηµα της µεθόδου είναι η περίπτωση κατά την οποία η υπό µελέτη ένωση έχει µηδενική διπολική ροπή [52]. Από τις πιο γνωστές και πλέον χρησιµοποιούµενες µεθόδους είναι αυτή του µοντέλου του πολωµένου συνεχούς (PCM, Polarized Continuum Model) που προτάθηκε από τους Miertus et al. [79]. Το προτεινόµενο µοντέλο ορίζει την κοιλότητα ως ένα σύνολο ατοµικών αλληλεπικαλυπτόµενων σφαιρών. Το αποτέλεσµα της πόλωσης του συνεχούς του διαλύτη αναπαρίσταται µέσω µιας αριθµητικής ολοκλήρωσης και όχι µέσω µιας προσέγγισης στον αναλυτικό τύπο που χρησιµοποιείται στο µοντέλο του nsager. Τροποποιηµένες µορφές της µεθόδου PCM είναι η ισόπυκνη του πολωµένου συνεχούς, γνωστής ως IPCM (Isodensity Polarized Continuum Model), η αυτοσυνεπής ισόπυκνη του πολωµένου συνεχούς SCI-PCM (Self Consistent Isodensity Polarized Continuum Model) και η IEF-PCM (Intergral Equation Formulation -PCM). Στην πρώτη η κοιλότητα ορίζεται ως µια ισόπυκνη επιφάνεια που προκύπτει µέσα από µια διαδικασία αυτοσυνέπειας. Η δεύτερη αποτελεί βελτιωµένη έκδοση καθώς λαµβάνει υπόψη τη σύζευξη µεταξύ της κοιλότητας του διαλύτη και της ηλεκτρονιακής πυκνότητας [52], ενώ η τρίτη αποτελεί γενίκευση του PCM, που επιτρέπει το χειρισµό µέσων διαφορετικής φύσης, όπως είναι τα οµογενή ισότροπα διηλεκτρικά µέσα (µε σταθερή τιµή διηλεκτρικής σταθεράς, ε) ή τα οµογενή ανισότροπα διηλεκτρικά µέσα (µε σταθερή ανυσµατική τιµή διηλεκτρικής σταθεράς, ε) ή ακόµη και ανοµοιογενή µέσα, όπως οι υγροί κρύσταλλοι, στερεά υλικά, αλλά και τα ιοντικά διαλύµατα [80]. Μια άλλη προσέγγιση της κοιλότητας επιδιαλύτωσης είναι αυτή των Barone, et al. [81], γνωστή ως µέθοδος συνδεµένων ατόµων για υπολογισµούς F (UAF, United Αtom model for artree-fock). Για τον ορισµό της κοιλότητας λαµβάνονται υπόψη κυρίως ο υβριδισµός, το συµβατικό φορτίο, και το επαγωγικό φαινόµενο λόγω άµεσης γειτνίασης, σε µια προσπαθεια για την παραγωγή ακριβέστερων τιµών της ενέργειας διαλυτοποίησης. Στην περίπτωση της µεθόδου UAF διατηρούνται τα βασικά χαρακτηριστικά του PCM, µε µόνη διαφορά τη βελτιστοποίηση των ακτίνων Van der Waals των ατόµων και των ατοµικών οµάδων. Η χρησιµοποίηση των παραπάνω προσεγγίσεων της επιδιαλύτωσης τα τελευταία χρόνια λαµβάνεται όλο και πιο συχνά υπόψη στις µελέτες της αντιοξειδωτικής ικανότητας φαινολικών ενώσεων [82-87]. 20

32 1.4 Σχέση δοµής-ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών Λαµβάνοντας υπόψη την προστατευτική δράση των φυσικών φαινολικών ενώσεων έναντι αυτής των RS, τις τελευταίες δυο δεκαετίες έχει σηµειωθεί σηµαντική αύξηση του ενδιαφέροντος για την αναζήτηση νέων και µη τοξικών αντιοξειδωτικών. Ο σκοπός αυτής της αναζήτησης είναι η χρησιµοποίηση των παραπάνω ενώσεων, τόσο από τη βιοµηχανία φαρµάκων, όσο και από τη βιοµηχανία τροφίµων [51]. Για την επίσπευση της όλης διαδικασίας εφαρµόζονται διάφορες πειραµατικές µέθοδοι (βλ. παρ ) µε στόχο τη διερεύνηση των σχέσεων δοµήςδραστικότητας (Structure-Activity Relationships, SARs) µε σκοπό τόσο τον εντοπισµό κριτηρίων SAR που θα διευκολύνουν στον προσδιορισµό συστατικών µε υψηλή δραστικότητα, αλλά και το σχεδιασµό νέων και πιθανώς περισσότερο αποτελεσµατικών ενώσεων για θεραπευτικούς σκοπούς [88-90]. Στην κατεύθυνση αυτή χρήσιµο πλέον εργαλείο αποτελούν οι υπολογιστικές µέθοδοι. Οι µέθοδοι αυτοί µπορούν να συνεισφέρουν στην καλύτερη κατανόηση των πειραµατικών αποτελεσµάτων όσον αφορά τη συµβολή των δοµικών χαρακτηριστικών στην αποτελεσµατικότητα των αντιοξειδωτικών. Σηµαντική αναµένεται η βοήθειά τους στην πρόβλεψη της δραστικότητας ενώσεων, που αν και η δοµή τους έχει ταυτοποιηθεί επακριβώς, η αποµόνωσή τους σε ποσότητες που να καλύπτουν τις πειραµατικές ανάγκες για την εκτίµηση της δραστικότητας αποτελεί επίπονη και χρονοβόρα διαδικασία ή είναι ακόµα και αδύνατη λόγω του ευοξείδωτου χαρακτήρα τους. Η ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών από τις ΑΗ εξαρτάται σε γενικές γραµµές από το είδος των υποκαταστατών, φαινόµενα στερεοχηµείας, την ικανότητα σχηµατισµού δεσµού υδρογόνου, τη σταθερότητα της φαινοξυ- ρίζας και φυσικά τα ηλεκτρονικά φαινόµενα (επαγωγικό, Ι, συζυγιακό R) που εισάγουν οι υποκαταστάτες και µπορεί να επηρεάζουν την ευκολία απόδοσης ατόµου υδρογόνου ή ηλεκτρονίου προς τις ελεύθερες ρίζες [51]. Πέρα ωστόσο από αυτά, σε πραγµατικές συνθήκες, η τελική δράση αποτελεί συνάρτηση και άλλων παραµέτρων (βλ. παρ ), γεγονός που κάνει τη διερεύνηση των SAR και πολύ περισσότερο την πρόβλεψή τους, µια δύσκολη και επίπονη διαδικασία. Τα σηµαντικότερα κριτήρια SAR που έχουν διατυπωθεί έως σήµερα και είναι προϊόν τόσο πειραµατικών, όσο και θεωρητικών µελετών παρουσιάζονται συνοπτικά στη συνέχεια για τα φλαβονοειδή και τα φαινολικά οξέα, τις κυριότερες δηλαδή κατηγορίες φυσικών φαινολών. 21

33 1.4.1 Φλαβονοειδή Τα φλαβονοειδή είναι η πολυπληθέστερη κατηγορία φυσικών φαινολικών ενώσεων που περιλαµβάνει διάφορες επιµέρους τάξεις. Η βασική τους δοµή δίνεται στο σχήµα 1.7 α. Η διερεύνηση της δράσης ενώσεων που ανήκουν σε διαφορετικές τάξεις φλαβονοειδών ανέδειξε τη σηµασία των ακόλουθων δοµικών χαρακτηριστικών που επισηµαίνονται µε διαφορετικό χρωµατισµό και συγκεντρωτικά υπάρχουν στη δοµή του φλαβονοειδούς που είναι γνωστό ως κερκετίνη (Σχ. 1.7 β): 7 6 A 5 1 C ' B 4' 5' 1 7 A C ' B 2 3 4' 5' (α) (β) Σχήµα 1.7 Βασική δοµή φλαβονοειδών (α) και δοµή κερκετίνης (β) ακτύλιος Β: Αποτελεί το ενεργό κέντρο των φλαβονοειδών για τη δέσµευση των ελευθέρων ριζών [91]. Ο αριθµός και η θέση υδροξυ- οµάδων στο δακτύλιο παίζουν καθοριστικό ρόλο στην αποτελεσµατικότητά τους. Η παρουσία δύο υδροξυοµάδων σε ορθο- θέση (δοµή κατεχόλης) συµβάλλει καθοριστικά στη δραστικότητα [21,84,92]. Η παρουσία και τρίτης υδροξυ- οµάδας (δοµή πυρογαλλόλης) δεν ευνοεί πάντα µια αύξηση της δραστικότητας [93]. Η παρουσία δυο υδροξυ- οµάδων σε µεταθέσεις του δακτυλίου (C-2 και C-4 ) έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της δραστικότητας σε σχέση µε το αντίστοιχο 3,4 - διυδροξυ- παράγωγο [84,94] καθώς η σχηµατιζόµενη φαινοξυ ρίζα δε µπορεί να σταθεροποιηθεί µε ενδοµοριακό δεσµό υδρογόνου. Η παρουσία µεθοξυ- οµάδων στις θέσεις C-3 ή C-5 δεν φαίνεται να ενισχύει την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών [95]. Παρόλα αυτά, η παρουσία δυο διµεθοξυ- οµάδων σε ορθο- θέση στο δακτύλιο Β πιθανώς να είναι πιο σηµαντική απ όσο αυτή µιας υδροξυ- οµάδας στη θέση C-4 [44]. 22

34 ακτύλιος C: Η παρουσία υδροξυ- οµάδας στη θέση C-3 του δακτυλίου C επηρεάζει σηµαντικά τη συνολική δράση της ένωσης [93,94,96]. Η οµάδα αυτή συµβάλλει στην επιπεδότητα του µορίου, αλλά και στην αντιοξειδωτική δράση καθώς µπορεί να δράσει και ως δότης πρωτονίου ή/και ηλεκτρονίου [61]. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει η συνήθως µεγαλύτερη δραστικότητα των ενώσεων που έχουν ελεύθερο το συγκεκριµένο υδροξύλιο σε σχέση µε τους αντίστοιχους γλυκοζίτες [51]. Η παρουσία διπλού δεσµού (C-2, C-3) και η παρουσία οξο- οµάδας (C-4) θεωρούνται επίσης σηµαντικά χαρακτηριστικά όσον αφορά τη σταθεροποίηση της ρίζας του φλαβονοειδούς [92,97]. Απαραίτητη προϋπόθεση για τη συµβολή των συγκεκριµένων δοµικών χαρακτηριστικών στην ενίσχυση της δραστικότητας, είναι η παρουσία της κατεχολικής οµάδας στο δακτύλιο Β. ακτύλιος Α: Ο αριθµός και το είδος των υποκαταστατών στο συγκεκριµένο δακτύλιο παίζει µικρότερο ρόλο στη δραστικότητα των φλαβονοειδών. Η συνεισφορά των υδροξυ οµάδων στην αντιοξειδωτική δράση παρατηρείται µόνο σε περίπτωση που δεν υπάρχουν υδροξυ- οµάδες στο δακτύλιο Β. Ωστόσο, η παρουσία υδροξυ- οµάδας στη θέση 5, εφόσον υπάρχουν και τα υπόλοιπα επιθυµητά δοµικά χαρακτηριστικά στους άλλους δυο δακτυλίους, συνεισφέρει στην καλύτερη σταθεροποίηση της φαινοξυ- ρίζας [51,98] Φαινολικά οξέα Τα κριτήρια SAR που αφορούν τα φαινολικά οξέα είναι πιο απλά από εκείνα των φλαβονοειδών καθώς πιο απλή είναι και η δοµή τους [51]. Οι κύριες δοµικές διαφορές µεταξύ αυτών των ενώσεων αφορούν στον αριθµό και τη θέση των υδροξυ- ή/και µεθοξυ- υποκαταστατών καθώς και στα χαρακτηριστικά της πλευρικής αλυσίδας. Τρεις είναι οι κατηγορίες των φαινολικών οξέων: α) Τα υδροξυβενζοϊκά (C 6 -C 1 ), β) τα υδροξυφαινυλοξικά (C 6 -C 2 ), γ) τα υδροξυκινναµωµικά (φαινυλπροπενοϊκά) (C 6 -C 3 ). Σε συµφωνία µε τα φλαβονοειδή ο αριθµός και η θέση των υδροξυλίων καθορίζουν τη δράση των φαινολικών οξέων. Έτσι για παράδειγµα, στην περίπτωση των υδροξυβενζοϊκών το πιο αποτελεσµατικό είναι το γαλλικό οξύ (3,4,5-τριυδροξυ-) και ακολουθεί το πρωτοκατεχικό (3,4-διυδροξυ-), ενώ λιγότερο δραστικό είναι το βανιλλικό οξύ (4-υδροξυ, 3-µεθοξυ). Ανάλογες παρατηρήσεις ισχύουν και για την περίπτωση των υδροξυφαινυλοξικών οξέων τα οποία ωστόσο δεν έχουν µελετηθεί σε µεγάλο βαθµό, αλλά και των υδροξυκινναµωµικών οξέων. 23

35 Ρόλος του ελεύθερου καρβοξυλίου: Ο ρόλος του ελεύθερου καρβοξυλίου έχει µελετηθεί µε δοκιµές που περιελάµβαναν µέλη κυρίως των υδροξυβενζοϊκών και των υδροξυκινναµωµικών οξέων και σε µικρότερο βαθµό των υδροξυφαινυλοξικών [93,99-104]. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα τα υδροξυβενζοϊκά οξέα βρέθηκαν ασθενέστερα από τα αντίστοιχα υδροξυκινναµωµικά οξέα. Η ερµηνεία των αποτελεσµάτων στηρίχθηκε στο ρόλο του καρβοξυλίου και στην απόστασή του από τον αρωµατικό δακτύλιο. Η αποτελεσµατικότητα των υδροξυκινναµωµικών οξέων οφείλεται στο γεγονός ότι το καρβοξύλιο που δρα ως δέκτης ηλεκτρονίων βρίσκεται σε απόσταση από τον αρωµατικό δακτύλιο, εποµένως η συµβολή του στη δραστικότητα περιορίζεται. Επίσης, η επέκταση της συζυγίας στην πλευρική αλυσίδα στην περίπτωση των υδροξυκινναµωµικών οξέων συµβάλλει στην καλύτερη σταθεροποίηση της φαινοξυ- ρίζας µε δοµές συντονισµού. Τα αποτελέσµατα για τη δραστικότητα των φαινυλοξικών οξέων είναι λίγα στη βιβλιογραφία. Aνάλογα µε τη µεθοδολογία που ακολουθείται και τον τρόπο εκτίµησης της δραστικότητας τα αποτελέσµατα είναι αντικρουόµενα [102,104,105]. 1.5 Αουρόνες Οι αουρόνες, [2-βενζυλιδενοβενζοφουραν-3(2Η)-όνες], ανήκουν στην κατηγορία των φλαβονοειδών και δοµικώς χαρακτηρίζονται ως ισοµερείς των γνωστών φλαβονών (Σχήµα 1.8) [106] ' A C (α) B 4' 6 A C 3 (β) 1' B 4' Σχήµα 1.8 οµή φλαβονών (α) και αουρονών (β) Τα συγκεκριµένα φλαβονοειδή, που έχουν πάρει την ονοµασία τους από την λατινική λέξη aurum που σηµαίνει χρυσός, απαντώνται στα λαχανικά, αλλά κυρίως στα φρούτα και στα άνθη διαφόρων φυτών στα οποία και συνεισφέρουν στον έντονο κίτρινο χρωµατισµό τους (λ max = nm). Χαρακτηριστικά παραδείγµατα αποτελούν οι περιπτώσεις των άνθεων των καλλωπιστικών φυτών Antirrhinum majus (Οικ. 24

36 Scrophulariaceae), και Coreopsis, Cosmos, Dahlia (Οικ. Compositae) (Σχήµα 1.9) [107]. Ωστόσο σε ορισµένα άλλα φυτικά είδη η παρουσία τους έχει αναφερθεί στο φλοιό, στον κορµό, στα φύλα, στους σπόρους ακόµα και στο νέκταρ [106], ενώ τελευταία έχουν εντοπιστεί και σε θαλάσσιους οργανισµούς [108]. (α) (β) (γ) (δ) Σχήµα 1.9 Αντιπροσωπευτικάφυτικά είδη στα οποία συναντώνται αουρόνες: α) Antirrhinum majus, β) Coreopsis, γ) Cosmos και δ) Dahlia Εκτός από τη συνεισφορά τους στο χρωµατισµό των φυτών οι αουρόνες αναφέρεται ότι µπορούν να δράσουν και ως φυτο-αλεξίνες, για την προστασία των φυτών έναντι πιθανών επιµολύνσεων [109]. Σε σχέση µε τις ισοµερείς τους φλαβόνες που απαντώνται ευρέως στο φυτικό βασίλειο, η παρουσία των αουρονών είναι σχετικά περιορισµένη και δεν έχει διερευνηθεί συστηµατικά. Η πιο γνωστή ένωση που απαντάται στη φύση είναι η αουρεσιδίνη που έχει αποµονωθεί από αρκετά είδη του γένους Cyperus µε τη µορφή του 6- ή 4- γλυκοζίτη της, γνωστών και ως αουρεσίνη (aureusin) και κερνουοζίτης (cernuoside) αντίστοιχα [106]. Όπως όλες οι υποκατηγορίες των φλαβονοειδών, οι αουρόνες συναντώνται µε τη µορφή υδροξυ- και µεθοξυ- παραγώγων, συνήθως γλυκοζιτικώς ενωµένες, και σπανιότερα µε τη µορφή άλλων παραγώγων [ ]. Βιοσυνθετικώς οι αουρόνες προκύπτουν από τις χαλκόνες. Οι τελευταίες παρουσία του ενζύµου συνθετάση της αουρεσιδίνης µπορούν να υποστούν υδροξυλίωση και στη συνέχεια οξείδωση προς κινόνη [107]. Η κινόνη στη συνέχεια 25

37 κυκλοποιείται και τέλος µε µια αναδιάταξη των δεσµών προκύπτουν οι αουρόνες (Σχήµα 1.10). 2' 3 4 υδροξυλίωση στη θέση 3 και οξείδωση στις θέσεις 3 & οξείδωση στις θέσεις 3 & 4 κυκλοποίηση αναδιάταξη δεσµών Σχήµα 1.10 Προτεινόµενη βιοσυνθετική οδός αουρονών Από τις φυσικές χαλκόνες, µόνο εκείνες που διαθέτουν υδροξυ οµάδα οπωσδήποτε στις θέσεις 2 και 4 µπορούν να µετατραπούν σε αουρόνες. Το ένζυµο παρουσιάζει εκλεκτική δράση καθώς παραµένει αδρανές παρουσία φλαβανονών. Η συνθετάση όπως απεικονίζεται στο παραπάνω σχήµα µπορεί να δράσει και ως οξυγονάση καθώς αµέσως µετά την κυκλοποίηση των χαλκονών µε υδροξυ οµάδα σε θέση 4 είναι δυνατή η οξυγόνωση στη θέση 3 [106]. Καθώς οι αουρόνες δεν απαντώνται ευρύτατα στη φύση όπως άλλα µέλη της κατηγορίας των φλαβονοειδών, η µελέτη της βιολογικής δράσης τους βρίσκεται σε πρώιµο σχετικά στάδιο. Η έρευνα µέχρι σήµερα δείχνει ότι οι αουρόνες µπορεί να χρησιµοποιηθούν για την αντιµετώπιση σειράς παθήσεων όπως ο καρκίνος, οι µολύνσεις από παράσιτα και µικρόβια. Άλλες δράσεις που αναφέρονται για κάποια από τα µέλη των αουρονών είναι η αντιορµονική και η αντιδιαβητική, ωστόσο τα δεδοµένα που υπάρχουν στη βιβλιογραφία είναι σχετικά περιορισµένα [106, ]. Η βιολογική δράση των αουρονών αποδίδεται στην παρεµπόδιση της δράσης διαφόρων ενζύµων και πρωτεϊνών η λειτουργία των οποίων εξαρτάται από το ΑΤΡ 26

38 [106]. Οι αουρόνες, λόγω της δοµής τους, και κυρίως του βενζοπυρανικού δακτυλίου σε συνδυασµό µε την παρουσία υδροξυ οµάδας στη θέση 4, µιµούνται τη δοµή της αδενίνης του ΑΤΡ. Έτσι λοιπόν, δρουν ανταγωνιστικά µε το ΑΤΡ για τους κατάλληλους υποδοχείς των ενζύµων και των πρωτεϊνών, παρεµποδίζοντας την επιτέλεση των βιολογικών λειτουργιών των τελευταίων. Εικάζεται ότι η δοµή των αουρονών παρουσιάζει µεγαλύτερη οµοιότητα µε εκείνη της αδενίνης του ΑΤΡ σε σύγκριση µε τις αντίστοιχες φλαβόνες που αναφέρονται να δρούν µε παρόµοιο τρόπο [106]. Έτσι µπορεί πιθανώς να εξηγηθεί γιατί συχνά οι αουρόνες αναφέρονται ως πιο δραστικές. Για την καλύτερη αποµίµηση της δοµής της αδενίνης και πιθανώς τη µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα in vivo, ενδιαφέρον έχουν οι συνθετικές αζαουρόνες, ενώσεις στις οποίες το οξυγόνο έχει αντικατασταθεί µε άζωτο στη θέση 1 [117,118].114 Σε γενικές γραµµές οι αουρόνες έχουν µεγάλο ενδιαφέρον ως ενώσεις που µπορεί να χρησιµοποιηθούν στην αντιµετώπιση διαφόρων παθήσεων. Παρόλα αυτά η διερεύνηση των σχέσεων δοµής-δραστικότητας δεν έχει πραγµατοποιηθεί σε βάθος για σειρά ιδιοτήτων που µπορεί να εµφανίζουν. Παράδειγµα αποτελεί η αντιοξειδωτική δράση των παραπάνω ενώσεων, που πιθανώς να συµβάλλει στην ευρύτερη βιολογική τους δράση. Οι αναφορές στη βιβλιογραφία είναι περιορισµένες και περιλαµβάνουν συνήθως τη µελέτη της ικανότητας δέσµευσης της ελεύθερης ρίζας DPP [112,119]115 Οι δοκιµές αυτές έχουν δείξει ότι ορισµένα µέλη των αουρονών παρουσιάζουν εξαιρετική δραστικότητα, καθώς έχει αναφερθεί δραστικότητα ακόµα και τρεις φορές πιο µεγάλη από αυτή γνωστών αντιοξειδωτικών όπως για παράδειγµα το ασκορβικό οξύ και η ρεσβερατρόλη. Σύµφωνα µε τα παραπάνω είναι φανερό ότι οι αουρόνες αποτελούν ενώσεις µε εξαιρετικό βιολογικό ενδιαφέρον. Για το λόγο αυτό αξίζει µια περαιτέρω διερεύνηση των βιολογικών ιδιοτήτων τους, µεταξύ άλλων της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας και των πιθανών µηχανισµών δράσης τους. 27

39 2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στην παρούσα εργασία επιχειρείται να µελετηθεί θεωρητικά η ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών σειράς φαινολικών ενώσεων που ανήκουν στην τάξη των φλαβονοειδών και πιο συγκεκριµένα στην κατηγορία των αουρονών. Πρόκειται για την ένωση µαριτιµετίνη που έχει αποµονωθεί στο παρελθόν από φυτικά είδη όπως το bidens frondosa και σειράς συγγενών ενώσεων που διαφέρουν στον αριθµό ή και τη θέση των υδροξυ- οµάδων στο δακτύλιο Β. Οι συγκεκριµένες ενώσεις πέρα από το γεγονός ότι έχουν µελετηθεί πειραµατικά µόνο ως προς την ικανότητά τους να δεσµεύουν τις ρίζες DPP και Ο - 2 διαθέτουν δακτύλιο Α µε κατεχολική δοµή. Το συγκεκριµένο δοµικό χαρακτηριστικό δε συναντάται συνήθως στα φλαβονοειδή και η συµβολή του στην ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών παρουσία διαφόρων υποκαταστατών στο δακτύλιο Β δεν έχει ως τώρα διερευνηθεί. Η θεωρητική µελέτη περιλαµβάνει τον υπολογισµό τιµών κατάλληλων φυσικοχηµικών παραµέτρων, που χρησιµοποιούνται για το χαρακτηρισµό της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών. Η µελέτη πραγµατοποιήθηκε στην αέρια φάση αλλά και παρουσία διαλύτη. Ως διαλύτες επιλέχθηκαν η µεθανόλη και το νερό, που αποτελούν το περιβάλλον της αντίδρασης µε τη DPP - (συνήθως) και τη Ο 2 αντίστοιχα. Για λόγους σύγκρισης στη µελέτη συµπεριλήφθηκαν και η απλή φαινόλη µαζί µε τις γουαϊακόλη, κατεχόλη, ρεσορκινόλη και πυρογαλλόλη, καθώς ο τύπος της υποκατάστασης στις απλές φαινόλες είναι ανάλογος µε εκείνο στο δακτύλιο Β των υπό εξέταση ενώσεων. Τα αποτελέσµατα αναµένεται να συνεισφέρουν στη διερεύνηση των σχέσεων δοµής-αντιοξειδωτικής δράσης των αουρονών και στην ενίσχυση του ενδιαφέροντος για τις συγκεκριµένες ενώσεις µε σκοπό την αναζήτηση και εκµετάλλευση νέων πηγών πλούσιων σε αουρόνες. 28

40 3.ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1 Υπολογισµοί DFT στην αέρια φάση Για τη βελτιστοποίηση της γεωµετρίας κάθε υπό εξέταση ένωσης χρησιµοποιήθηκε η θεωρία του συναρτησιακού παράγοντα πυκνότητας DFT. Πιο συγκεκριµένα, έγινε χρήση της υβριδικής µεθόδου DFT µε τη χρήση του συναρτησιακού παράγοντα B3LYP [120], που προκύπτει από το συνδυασµό του υβριδικού συναρτησιακού παράγοντα τριών παραµέτρων του Becke Β3 [121], και του συναρτησιακού παράγοντα συσχέτισης LYP [122]116 Για τις αντίστοιχες φαινοξυ ή κατιονικές ρίζες, όπως και για το άτοµο του υδρογόνου, οι υπολογισµοί πραγµατοποιήθηκαν στο επίπεδο UB3LYP (Unrestricted). Η βελτιστοποίηση της γεωµετρίας πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση του συνόλου βάσης 6-31G [123, 124]117 και έγινε µε αυστηρά κριτήρια σύγκλισης (tight convergence criteria) για όλα τα µόρια. Τα κριτήρια αυτά είναι απαραίτητα για να εξασφαλιστεί ικανοποιητική σύγκλιση και αξιοπιστία των συχνοτήτων που πρόκειται να υπολογιστούν. Οι υπολογισµοί εκτελέστηκαν χωρίς να επιβληθούν περιορισµοί στη συµµετρία των µορίων. Παράλληλα, για το χαρακτηρισµό των βελτιστοποιούµενων δοµών ως ενεργειακών ελαχίστων ή µεταβατικών καταστάσεων στην υπερεπιφάνεια δυναµικής ενέργειας των µορίων, αλλά και για τον υπολογισµό της τιµής της ενέργειας µηδενικού σηµείου, έγινε αναλυτικός υπολογισµός συχνοτήτων δόνησης στο ίδιο σύνολο βάσης. Κατ αρχήν µελετήθηκε διεξοδικά ο χώρος των διαµορφώσεων των µητρικών ενώσεων και εντοπίστηκαν όλα τα πιθανά διαµορφωµερή. Στη συνέχεια, σε ότι αφορά τις φαινοξυ και τις κατιονικές ρίζες, µελετήθηκαν αυτές που προκύπτουν από το διαµορφωµερές της µητρικής ένωσης µε τη χαµηλότερη ενέργεια. Για την ακριβέστερη εκτίµηση των ενεργειών των διαφόρων µορίων µετά τη βελτιστοποίηση της γεωµετρίας τους ακολούθησε υπολογισµός απλού σηµείου στη βελτιστοποιηµένη γεωµετρία µε τη χρήση του εκτενέστερου συνόλου βάσης G(2d,2p). Λόγω του µικρού σχετικά µεγέθους των BDE των υπο µελέτη ενώσεων κατά τον υπολογισµό τους κρίθηκε σκόπιµο να συνυπολογισθεί το µέγεθος του σφάλµατος υπέρθεσης του συνόλου βάσης (BSSE) [a-e]. To σφάλµα αυτό έχει ως αποτέλεσµα µια 29

41 τεχνητή ενεργειακή σταθεροποίηση ενός µορίου που αποτελείται από δύο θραύσµατα (εδώ Α- και Η ) και συνεπώς σε σφάλµατα στην ενέργεια διάσπασης του δεσµού. Οφείλεται στη χρήση συνόλων βάσης περιορισµένης έκτασης και στο γεγονός ότι η ενέργεια των ηλεκτρονίων που ανήκουν σε ένα από τα θραύσµατα κατά τον υπολογισµό του υπερµορίου εµφανίζεται χαµηλότερη λόγω της χρήσης συναρτήσεων βάσης που ανήκουν στο άλλο θραύσµα [ ]. Οι υπολογισµοί του BSSE έγιναν µε τη µέθοδο Countepoise σύµφωνα µε την οποίαν οι ενέργειες των δύο θραυσµάτων που λαµβάνονται υπόψη κατά τον υπολογισµό της BDE είναι αυτές που υπολογίζονται για κάθε θραύσµα µε σύνολο βάσης όχι αυτό των ατόµων του αλλά επαυξηµένο µε τις συναρτήσεις βάσης των ατόµων του άλλου θραύσµατος τοποθετηµένες στις θέσεις των ατόµων του αλλά απουσία τους, δηλαδή ουσιαστικά µε το σύνολο βάσης του υπερµορίου Α-ΟΗ. Έτσι, η διορθωµένη λόγω BSSE ενέργεια αλληλεπίδρασης δύο θραυσµάτων Α-Β υπολογίζεται ως: όπου { AB E } ( AB ) είναι η ενέργεια του βελτιστοποιηµένου υπερµορίου, AB { A E } ( A ) και A { B E } ( B ) οι ενέργειες των θραυσµάτων Α και Β αντίστοιχα στις βελτιστοποιηµένες B γεωµετρίες τους υπολογιζόµενες µε τα σύνολα βάσης των ατόµων τους {Α} και {Β}, { A E } ( A ) και AB { B E } ( B ) οι ενέργειες των θραυσµάτων Α και Β αντίστοιχα στις AB γεωµετρίες που υιοθετούν στο υπερµόριο υπολογιζόµενες µε τα σύνολα βάσης των ατόµων τους {Α} και {Β}, και { AB E } ( A ) και AB { AB E } ( B ) οι ενέργειες των θραυσµάτων Α και Β αντίστοιχα στις γεωµετρίες που υιοθετούν στο υπερµόριο υπολογιζόµενες µε το σύνολο βάσης του υπερµορίου {ΑΒ} [129]. 3.2 Υπολογισµοί DFT παρουσία διαλύτη Για τη µελέτη σε διάλυµα χρησιµοποιήθηκε ένα µοντέλο αυτοσυνέπειας του πεδίου της αντίδρασης SCRF και πιο συγκεκριµένα το µοντέλο πολώσιµης συνέχειας IEF-PCM [80]. Η κατασκευή της κοιλότητας που θα περιελάµβανε την υπό εξέταση ένωση και τις αντίστοιχες ρίζες, έγινε µε βάση το µοντέλο συνδεµένων ατόµων για AB 30

42 υπολογισµούς F, το UAF (United atom model for artree-fock) [81]. Οι υπολογισµοί εκτελέστηκαν σε διαλύτες µεθανόλη (ε =32,63) και νερό (ε =78,39), που αποτελούν αντιστοίχως το περιβάλλον της αντίδρασης µε τις ελεύθερες ρίζες, στις δυο πειραµατικές δοκιµές που εφαρµόστηκαν για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των υπό µελέτη ενώσεων. Η βελτιστοποίηση της γεωµετρίας πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση του συνόλου βάσης 6-31G, όπως και στην αέρια φάση. Εξαιτίας του µεγέθους των επιλεγµένων µορίων, αλλά και των σχετικών προβληµάτων που αναδείχθηκαν κατά την επιτέλεση υπολογισµών παρουσία διαλύτη δεν ήταν δυνατόν να γίνει µελέτη του χώρου των διαµορφώσεων ανάλογη µε εκείνη σε αέρια φάση. Έτσι σε κάθε περίπτωση, ως αρχική γεωµετρία που στη συνέχεια βελτιστοποιήθηκε παρουσία διαλύτη χρησιµοποιήθηκε αυτή του σταθερότερου διαµορφωµερούς στην αέρια φάση. Η βελτιστοποίηση της δοµής συνοδεύτηκε και από αριθµητικό υπολογισµό συχνοτήτων µε αυστηρά κριτήρια σύγκλισης. Παρουσία διαλύτη παρατηρήθηκε σε αρκετές περιπτώσεις η αδυναµία επίτευξης αυτοσυνέπειας στο πλαίσιο των κύκλων ενός τυπικού υπολογισµού SCF. Το πρόβληµα αυτό αντιµετωπίστηκε µε την αύξηση του αριθµού των κύκλων προκειµένου να επιτευχθεί τελικά αυτοσυνέπεια. Κάτι άλλο που παρατηρήθηκε ήταν η συχνή εµφάνιση µιας αρνητικής συχνότητας. Το πρόβληµα αυτό επιλύθηκε στις περισσότερες περιπτώσεις µε µικρή τροποποίηση της δοµής της ένωσης σύµφωνα µε το ιδιοδιάνυσµα που αντιστοιχεί στην αρνητική συχνότητα δόνησης, ενώ σε άλλες µε την εκτέλεση βελτιστοποίησης όπου οι δεύτερες παράγωγοι της ενέργειας (essian matrix) υπολογίζονται αριθµητικά σε κάθε βήµα. Για την ακριβέστερη εκτίµηση των ενεργειών των διαφόρων µορίων µετά τη βελτιστοποίηση της γεωµετρίας τους ακολούθησε υπολογισµός απλού σηµείου στη βελτιστοποιηµένη γεωµετρία µε τη χρήση του εκτενέστερου συνόλου βάσης G(2d,2p). 3.3 Λογισµικό και υπολογιστικά συστήµατα Το υπολογιστικό πακέτο των προγραµµάτων, που χρησιµοποιήθηκε για την εκτέλεση των υπολογισµών τόσο σε αέρια φάση, όσο και παρουσία διαλύτη στην υγρή φάση, µέσω των µοντέλων πολώσιµης συνέχειας PCM, ήταν το GAUSSSIAN 03W ver. 6.0 στο λειτουργικό περιβάλλον των Windows ΧΡ [130]. Οι υπολογισµοί εκτελέστηκαν σε υπολογιστές µε επεξεργαστή Intel/Pentium IV στα 3,2 Gz µε 1 GΒ RΑΜ. Πέρα από την εκτέλεση των υπολογισµών, ο σχεδιασµός των συντακτικών τους 31

43 τύπων, η στερεοχηµική απεικόνιση των τύπων των ενώσεων και η επεξεργασία των αποτελεσµάτων έγινε µε τα προγράµµατα Chem Draw Ultra 6.0, Chem 3D Ultra 6.0 (Chemffice Ultra 6.0, Cambridge Scientific Computing, Inc., 2000) και GaussView 3.07 (GaussView, 3.07, G aussian Inc., Pittsburgh PA, 2003). 32

44 4. ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Οι αουρόνες που επιλέχθηκαν να µελετηθούν στην παρούσα εργασία ήταν η µαριτιµετίνη, που έχει αποµονωθεί στο παρελθόν από φυτικά είδη όπως το Βidens frondosa [131] και σειρά συνθετικών της παραγώγων. Τα συγκεκριµένα παράγωγα συντέθηκαν από τους Venkateswarlu et al. [119] σε µια προσπάθεια αναζήτησης βιοδραστικών ενώσεων. Οι συντακτικοί τύποι των υπό εξέταση µορίων δίνονται στο σχήµα 4.1 (α). R 4 R 3 R 2 R 4 R 3 R 2 R 1 (α) Α) R 1 =R 2 =R 4 =, R 3 = Β) R 1 =R 4 =, R 2 =C 3, R 3 = Γ) R 1 =R 4 =, R 2 =R 3 = (µαριτιµετίνη) ) R 1 =R 3 =, R 2 =R 4 = Ε) R 2 =R 3 =R 4 =, R 1 = R 1 (β) Α) R 1 =R 2 =R 4 =, R 3 = (φαινόλη) Β) R 1 =R 4 =, R 2 =C 3, R 3 = (γουαϊακόλη) Γ) R 1 =R 4 =, R 2 =R 3 = (κατεχόλη) ) R 1 =R 3 =, R 2 =R 4 = (ρεσορκινόλη) Ε) R 2 =R 3 =R 4 =, R 1 = (πυρογαλλόλη) Σχήµα 4.1 οµή των υπό µελέτη αουρονών (α) και επιλεγµένων απλών φαινολών (β) Οι υπό µελέτη ενώσεις διαφέρουν στον τύπο της υποκατάστασης µόνο στο δακτύλιο Β, ενώ στο δακτύλιο Α κοινό δοµικό χαρακτηριστικό αποτελεί η παρουσία κατεχολικής οµάδας. Προσεκτική παρατήρηση της δοµής του δακτυλίου Β δείχνει ότι ουσιαστικά οι παραπάνω αουρόνες θα µπορούσαν να θεωρηθούν παράγωγα αντίστοιχων απλών φαινολών (Σχήµα 4.1 β). Λαµβάνοντας υπόψη την παρατήρηση αυτή, επιλέχθηκε να συµπεριληφθούν στην παρούσα µελέτη και οι απλές φαινόλες. Η 33

45 παράλληλη µελέτη της δραστικότητας των απλών φαινολών κρίθηκε αναγκαία, καθώς εκτιµήθηκε ότι µπορεί να συνεισφέρει στην καλύτερη διερεύνηση του ρόλου των δοµικών χαρακτηριστικών των επιλεγµένων αουρονών στην ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών και στην καλύτερη κατανόηση των περιορισµένων πειραµατικών δεδοµένων που υπάρχουν για αυτές [119] Έλεγχος αξιοπιστίας του υπολογιστικού µοντέλου Πριν από τη µελέτη των διαµορφωµερών των παραπάνω αουρονών πραγµατοποιήθηκε βελτιστοποίηση της δοµής της Ζ-2-π-µεθοξυαουρόνης (σχήµα 4.2) για την οποία υπάρχουν κρυσταλλογραφικά δεδοµένα [132]. Ο στόχος ήταν να αξιολογηθεί η ακρίβεια του υπολογιστικού µοντέλου που χρησιµοποιήθηκε για τις βελτιστοποιήσεις της γεωµετρίας (B3LYP/6-31G) των υπό εξέταση ενώσεων. Αν και η σύγκριση κρυσταλλογραφικών και υπολογιστικών γεωµετρικών παραµέτρων δεν είναι απόλυτα δόκιµη, καθώς οι υπολογισµοί γίνονται στην αέρια φάση, ενώ τα πειραµατικά δεδοµένα αφορούν τη στερεά κατάσταση, τα δεδοµένα αυτά είναι το µοναδικό λεπτοµερές στοιχείο για τη δοµή κάποιας αουρόνης. Οι τιµές των πειραµατικών και θεωρητικά υπολογιζόµενων γεωµετρικών παραµέτρων δίνονται στον πίνακα C Σχήµα 4.2 οµή Ζ-2-π-µεθοξυαουρόνης 34

46 Πίνακας 4.1 Πειραµατικές [132] και θεωρητικά υπολογιζόµενες (Β3LYP/6-31G) τιµές µήκους και γωνιών δεσµών της Ζ-2-π-µεθοξυαουρόνης* C C C 15 -C 14 C 14 -C 13 C 13 -C 12 C 12 -C 17 C 17 -C 16 C 16 -C 15 C 11 -C 12 C 10 -C 11 C C 8 C 8 -C 3 C 3 -C 2 C 2 -C 10 C 2-1 C 3 -C 4 C 4 -C 5 C 5 -C 6 C 6 -C 7 C 7 -C 8 Μήκη δεσµού (Å) Γωνίες (deg ο ) Πειραµατική τιµή 1,43 1,36 1,39 1,38 1,40 1,40 1,37 1,39 1,45 1,33 1,40 1,38 1,39 1,46 1,48 1,23 1,39 1,38 1,40 1,38 1,38 Θεωρητική τιµή 1,454 1,385 1,403 1,395 1,412 1,420 1,387 1,407 1,450 1,350 1,425 1,407 1,400 1,472 1,484 1,251 1,398 1,398 1,409 1,402 1,388 * Η αρίθµηση ατόµων δίνεται στο σχήµα 4.2 C C 15 C 15 C 14 C 13 C 14 C 13 C 12 C 13 C 12 C 17 C 12 C 17 C 16 C 17 C 16 C 15 C 16 C 15 C 14 C 12 C 11 C 10 C 11 C 10 C 2 C 3 C 2 1 C 10 9 C 8 9 C 8 C 3 C 8 C 3 C 2 C 3 C 2 C 10 C 2 C 10 9 C 7 C 8 C 3 C 8 C 3 C 4 C 3 C 4 C 5 C 4 C 5 C 6 C 5 C 6 C 7 C 6 C 7 C 8 Πειραµατική τιµή 115,5 118,7 122,7 117,3 120,4 120,9 119,9 131,8 125,7 130,0 107,0 112,9 106,7 104,5 109,0 122,9 120,2 117,8 120,7 122,3 116,1 Θεωρητική τιµή 115,6 119,2 121,8 117,8 120,8 120,3 120,1 130,5 126,8 129,0 106,9 111,7 107,6 104,7 109,1 123,0 120,0 118,2 120,6 121,7 116,4 Η σύγκριση των πειραµατικών δεδοµένων µε εκείνα που προέκυψαν από το θεωρητικό υπολογισµό για τη Ζ-2-π-µεθοξυαουρόνη, έδειξαν, ότι στην περίπτωση του µήκους του δεσµού υπήρχε µια απόκλιση της τάξης του 0,016 Å, ενώ η διαφορά στις τιµές των γωνιών ήταν της τάξης των 0,5 ο. Τα αποτελέσµατα κρίθηκαν ικανοποιητικά, καθώς είναι γνωστό ότι το προτεινόµενο σφάλµα στον υπολογισµό του µήκους δεσµού πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 0,01-0,02 Å, ενώ για την περίπτωση των τιµών των γωνιών να είναι µικρότερο από 2 ο. Εποµένως το υπολογιστικό µοντέλο B3LYP/6-31G κρίθηκε κατάλληλο και χρησιµοποιήθηκε στη συνέχεια της µελέτης. 4.2 Μελέτη σε αέρια φάση Αρχικά η µελέτη όλων των παραπάνω ενώσεων έγινε σε αέρια φάση που αποτελεί και την συνηθέστερη προσέγγιση στις θεωρητικές µελέτες της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών. Πριν τον υπολογισµό των τιµών κατάλληλων φυσικοχηµικών παραµέτρων που χρησιµοποιούνται για το χαρακτηρισµό της 35

47 αποτελεσµατικότητας των φαινολικών ενώσεων ως προς τη δέσµευση ελευθέρων ριζών, πραγµατοποιήθηκε µια συστηµατική διερεύνηση του χώρου των διαµορφωµερών κάθε ένωσης, ώστε να εντοπιστεί το διαµορφωµερές µε τη χαµηλότερη ενέργεια ιερεύνηση του χώρου των διαµορφωµερών Κατά τη διερεύνηση του χώρου των διαµορφωµερών αναζητήθηκαν όλα τα πιθανά διαµορφωµερή που προκύπτουν από τη σχετική διευθέτηση των υδρογόνων των υδροξυλίων στους δακτυλίους Α και Β. Οι σχετικές αυτές διευθετήσεις καθορίζουν την ύπαρξη ή µη ενδοµοριακών δεσµών υδρογόνου. Επίσης αναζητήθηκαν και διαµορφωµερή που προκύπτουν από τη γεωµετρία του διπλού δεσµού (Ε/Ζ) µεταξύ του πενταµελούς δακτυλίου και του δακτυλίου Β. Η µελέτη τόσο της Ε, όσο και της Ζ διαµόρφωσης έγινε παρά το γεγονός ότι οι αουρόνες γενικά [132], καθώς και εκείνες που επελέγησαν να µελετηθούν αναφέρεται ότι απαντούν µε τη Ζ διαµόρφωση [119]. Ο λόγος είναι ότι αφενός έχει αναφερθεί η παρουσία Ε ισοµερών στη φύση [133], αφετέρου η διακρίβωση της ακριβούς διαµόρφωσης µέσω φασµατοσκοπίας είναι επισφαλής, καθώς τα φάσµατα UV είναι σε µεγάλο βαθµό όµοια, στα δε φάσµατα NMR οι χηµικές µετατοπίσεις για το υδρογόνο του διπλού δεσµού και στις δυο περιπτώσεις βρίσκονται στην ίδια περιοχή (τ ) [133]. Οι δίεδρες γωνίες που καθορίζουν τις πιθανές διαµορφώσεις δίνονται για όλες τις υπό µελέτη ενώσεις στο σχήµα 4.3. Κατά τη δόµηση των αρχικών γεωµετριών σε κάθε δίεδρη γωνία δόθηκε τιµή ίση µε 0 ο ή 180 ο. Από τη βελτιστοποίηση των αρχικών γεωµετριών, από τις οποίες εξαιρέθησαν αυτές για τις οποίες υπάρχει προφανής στερεοχηµική παρεµπόδιση, προέκυψαν µια σειρά από σταθερά διαµορφωµερή για κάθε ένωση. Το πλήθος των αρχικών γεωµετριών και διαµορφώσεων που εντοπίστηκαν δίνεται στον πίνακα 4.2. Επίσης δίνονται το εύρος του ενεργειακού φάσµατος διαµορφωµερών και η διαφορά ενέργειας των πιο σταθερών Ζ και Ε διαµορφωµερών. Στο σχήµα 4.4 δίνεται το ενεργειακό φάσµα διαµορφωµερών και τη δοµή των διαµορφωµερών µε την ελάχιστη και µέγιστη ενέργεια για όλες τις υπό µελέτη αουρόνες. 36

48 C 3 Α Β Γ Ε Σχήµα 4.3 ίεδρες γωνίες για τη διερεύνηση του χώρου των διαµορφωµερών των υπο µελέτη αουρονών Πίνακας 4.2 Πλήθος και ενεργειακά δεδοµένα των διαµορφωµερών για τις υπό εξέταση αουρόνες στο επίπεδο B3LYP/6-31G Ένωση Αριθµός αρχικών γεωµετριών Αριθµός διαµορφωµερών * Ε συν. (kcal/mol) ** Ε (Ζ-Ε) (kcal/mol) Α ,5 1,25 Β ,4 0,51 Γ ,0 0, ,5 0,69 Ε ,4 0,09 * ιαφορά ενέργειας µεταξύ της διαµόρφωσης µε τη χαµηλότερη και την υψηλότερη ενέργεια, ** ιαφορά ενέργειας µεταξύ της σταθερότερης Ε και Ζ διαµόρφωσης 37

49 Σχήµα 4.4 Ενεργειακό φάσµα διαµορφωµερών και δοµή των διαµορφωµερών µε την ελάχιστη και µέγιστη ενέργεια των υπό µελέτη αουρονών.

50 Από τις τιµές του πίνακα 4.2 προκύπτει ότι οι διάφορες σχετικές θέσεις των υποκαταστατών σε κάθε µόριο µπορούν να διαφοροποιήσουν την ενέργεια σε σηµαντικό βαθµό, αν λάβουµε υπόψη όλα τα δυνατά διαµορφωµερή (7,5-16,5 kcal). Σε πολλές περιπτώσεις, και ιδιαίτερα στις αουρόνες µε τις περισσότερες υδροξυοµάδες, οι επιµέρους διαφορές στην ενέργεια των διαµορφωµερών (σε kcal/mol) ήταν ασήµαντες ή πολύ µικρές. Η διαφορά στην ενέργεια µεταξύ των πέντε διαµορφωµερών µε τη χαµηλότερη ενέργεια βρέθηκε να είναι µικρότερη των 3 kcal/mol. Επίσης, όσον αφορά τη διαφορά ενέργειας µεταξύ του Ζ και του Ε διαµορφωµερούς, µε εξαίρεση την περίπτωση της ένωσης Α (1,25 kcal/mol), σε εκείνες των άλλων ενώσεων οι διαφορές ήταν µικρότερες από 1 kcal/mol. Στο σχήµα 4.5, δίνονται οι βελτιστοποιηµένες δοµές των γενικών ελαχίστων των υπό µελέτη αουρονών. Με εξαίρεση την ένωση Α, για τις υπόλοιπες ενώσεις η Ε διαµόρφωση βρέθηκε να είναι η σταθερότερη. Α Β Γ Ε Σχήµα 4.5 Βελτιστοποιηµένες δοµές επιλεγµένων αουρονών µε τη χαµηλότερη ενέργεια στο επίπεδο B3LYP/6-31G 39

51 Αξίζει να σηµειωθεί ότι οι ενώσεις Α, Β, Γ και Ε είναι επίπεδες. Ειδική είναι η περίπτωση της ένωσης. Στην τελευταία, λόγω στερεοχηµικών παρεµποδίσεων που προκαλούνται από την εγγύτητα της υδροξυ- οµάδας του δακτυλίου Β µε το οξυγόνο του καρβονυλίου του πενταµελούς δακτυλίου προκαλείται µια ελάχιστη στρέψη του επιπέδου του διπλού δεσµού ( 9 -C 10 -C 11 -C 12 =2,8 ο ) και µια µεγαλύτερη του δακτυλίου Β (C 10 -C 11 -C 12 -C 13 =18,1 ο ) (Σχήµα 4.5) Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών µε απόδοση ατόµου υδρογόνου Πριν από τη µελέτη των επιλεγµένων αουρονών προηγήθηκε διερεύνηση της ικανότητας απόδοσης ατόµου υδρογόνου προς τις ελεύθερες ρίζες των απλών φαινολών του σχήµατος 4.1 (β). Οι δοµές που χρησιµοποιήθηκαν για τις µητρικές ενώσεις είχαν την ίδια διαµόρφωση µε εκείνη του δακτυλίου Β των αντίστοιχων βέλτιστων δοµών των αουρονών. Η µελέτη αυτή όπως αναφέρθηκε και προηγουµένως κρίθηκε απαραίτητη για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου των δοµικών χαρακτηριστικών των αουρονών, ειδικά αν λάβουµε υπόψη ότι ο δακτύλιος Β αποτελεί το ενεργό κέντρο των φλαβονοειδών, ενώ η συνεισφορά των δοµικών χαρακτηριστικών των άλλων δακτυλίων δε φαίνεται να είναι τόσο καθοριστική [91]. Τα αποτελέσµατα παρατίθενται στον πίνακα 4.3. Πίνακας 4.3 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - των απλών φαινολών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p)//B3LYP/6-31G, T= K ΑΗ p α r b,c BDE d BDE e Φαινόλη -307, , ,3 84,1 Γουαϊακόλη -421, , ,5 83,2 Κατεχόλη -382, , ,2 75,0 Ρεσορκινόλη -382, , ,8 83,6 Πυρογαλλόλη -457, , ,4 69,2 a Ενθαλπία µητρικής ένωσης σε artree, b Ενθαλπία φαινοξυ-ρίζα σε artree c Η Ενθαλπία του ατόµου υδρογόνου είναι artree, d BDE σε kcal/mol για την πιο δραστική υδροξυ οµάδα e BDE σε kcal/mol διορθωµένη λόγω BSSE. Στον πίνακα 4.3 δίνονται επίσης οι τιµές της BDE διορθωµένες λόγω BSSE, από όπου προκύπτει ότι το σφάλµα είναι της τάξης των 0,2 0,3 kcal/mol. Το γεγονός αυτό είναι µια ακόµη επιβεβαίωση ότι το σύνολο βάσης που χρησιµοποιήθηκε είναι ικανοποιητικά πλήρες για τον ακριβή υπολογισµό των BDE. 40

52 Η σειρά δραστικότητας των απλών φαινολών σύµφωνα µε τις τιµές BDE είναι αναµενόµενη σε γενικές γραµµές [84,94,103,134,135]118119Η πιο δραστική από τις παραπάνω φαινόλες προκύπτει ότι είναι η πυρογαλλόλη, καθώς διαθέτει και το µεγαλύτερο αριθµό υδροξυ- οµάδων που µπορούν να αντιδράσουν µε τις ελεύθερες ρίζες. Καθοριστικό ρόλο στη δραστικότητά της παίζει η δυνατότητα σχηµατισµού ενδοµοριακού/κών δεσµού/ών υδρογόνου (ΙΗΒ), που µπορούν να συµβάλλουν στην περαιτέρω σταθερότητα της φαινοξυ- ρίζας [136]. Πραγµατικά όπως φαίνεται στο ακόλουθο σχήµα (Σχήµα 4.6) η τιµή της BDE µειώνεται αισθητά χάρις στο σχηµατισµό ΙΗΒ. BDE=76,2 kcal/mol BDE=79,6 kcal/mol BDE=76,4 kcal/mol BDE=69,4 kcal/mol BDE=84,6 kcal/mol Σχήµα 4.6 Πιθανές φαινοξυ- ρίζες και τιµές BDE των επιµέρους δεσµών - για το µόριο της πυρογαλλόλης στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p) // B3LYP/6-31G εύτερη σε σειρά δραστικότητας είναι η κατεχόλη (BDE= 75,2 kcal/mol), όπου επίσης η συµβολή ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου είναι καθοριστική για την αποτελεσµατικότητά της [73], καθώς απουσία ΙΗΒ η τιµή της BDE είναι παρόµοια µε εκείνη της απλής φαινόλης (BDE= 83,9 kcal/mol). Εκτός από τη συµβολή του ΙΗΒ, στην ευκολία απόδοσης ατόµου υδρογόνου από τις παραπάνω δυο φαινόλες 41

53 συνεισφέρουν και τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που εισάγουν οι επιπλέον υδροξυοµάδες, όπως περιγράφεται από την τιµή της σταθεράς ammett (σ) (Σχήµα 4.7). 0,12-0,37-0,37 0,12-0,37 Σχήµα 4.7 Τιµές σταθεράς ammett (σ) ενός φαινολικού υδροξυλίου Η παρουσία υδροξυ- οµάδων µε πυρηνόφιλο χαρακτήρα ευνοούν την απόδοση ατόµου υδρογόνου σε αντίθεση µε την παρουσία ηλεκτρονιόφιλων οµάδων [51]. Πραγµατικά, αυτό επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι η ρεσορκινόλη, αν και διφαινόλη, αναµένεται να είναι πολύ λιγότερο δραστική από την κατεχόλη και ίσης δραστικότητας µε τη φαινόλη (παρόµοιες τιµές BDE) που στερείται την παρουσία δεύτερης υδροξυ- οµάδας στο δακτύλιο. Η παραπάνω παρατήρηση για την κατεχόλη και τη ρεσορκινόλη επιβεβαιώνεται και από πειραµατικά δεδοµένα µε δοκιµές δέσµευσης της DPP και ABTS + [84], αλλά και του αποχρωµατισµού της κροκίνης [103]. Χαµηλή αναµένεται να είναι η δραστικότητα της γουαϊακόλης καθώς η τιµή της BDE είναι παραπλήσια µε εκείνη της φαινόλης. Πειραµατικά ωστόσο κάτι τέτοιο δεν επαληθεύεται. Η γουαϊακόλη για παράδειγµα αναφέρεται ότι µπορεί να δεσµεύσει δυο µόρια DPP, ενώ η φαινόλη παραµένει σχεδόν αδρανής [134,135]. Η εξήγηση του παραπάνω αποτελέσµατος έχει να κάνει ασφαλώς µε την παρουσία σε όρθο θέση της µεθοξυ- οµάδας. Οι Kozlowski et al. [135]119 µελετώντας θεωρητικά σειρά χαλκονών µε ανάλογη υποκατάσταση, πρότειναν ότι είναι δυνατό να γίνει απόδοση και δεύτερου ατόµου υδρογόνου από τη µεθοξυ- οµάδα µε τελικό αποτέλεσµα ένα προϊόν κυκλοποίησης. Η απόδοση αυτή σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα των παραπάνω ερευνητών αναµένεται να ευνοείται θερµοδυναµικώς παρουσία ελεύθερων ριζών. Κατόπιν αυτής της παρατηρήσεως έγινε µελέτη του προτεινόµενου µηχανισµού, για την περίπτωση της απλής γουαϊακόλης. Βελτιστοποιήθηκε η κυκλοποιηµένη δοµή που προκύπτει και η BDE που υπολογίστηκε για τη δεύτερη αντίδραση (Σχήµα 4.8) 42

54 προέκυψε σηµαντικά µικρότερη. Συνεπώς, η αυξηµένη δραστικότητα της γουαϊακόλης πρέπει να οφείλεται στην απόδοση και δεύτερου ατόµου υδρογόνου. 3 C L L 3 C L L C2 BDE = 83,5 kcal/mol BDE = 44,0 kcal/mol Σχήµα 4.8 Πιθανός µηχανισµός αντίδρασης γουαϊακόλης µε ελεύθερες ρίζες Σύµφωνα µε τα παραπάνω φάνηκε ότι η θεωρητική προσέγγιση που ακολουθήθηκε µπορούσε να εξηγήσει τη σειρά δραστικότητας απλών φαινολών ως προς την ικανότητά τους να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες µε απόδοση ατόµου υδρογόνου. Έτσι, εφαρµόστηκε στη συνέχεια και για τη µελέτη της δραστικότητας των επιλεγµένων αουρονών. Η µελέτη της ικανότητας απόδοσης ατόµου υδρογόνου περιγράφεται αρχικώς αποσπασµατικά, δηλαδή όσον αφορά τους δακτυλίους Β, C και Α χωριστά και τέλος συζητείται ενιαία. Στη συζήτηση προηγείται η µελέτη που αφορά το δακτύλιο Β, καθώς αποτελεί το τµήµα του µορίου στο οποίο διαφοροποιείται η υποκατάσταση και αναµένεται να καθορίζει τη διαφορά στη δραστικότητα των ενώσεων που παρατηρήθηκε πειραµατικά. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στον πίνακα 4.4. Στον ίδιο πίνακα γίνεται παράθεση και των πειραµατικών τιµών (IC 50 σε µμ) για τις επιλεγµένες ενώσεις µε τις δοκιµές DPP και Ο - 2 [119]. Στον πίνακα 4.4 δίνονται επίσης οι τιµές της BDE διορθωµένες λόγω BSSE, από όπου προκύπτει ότι το σφάλµα είναι της τάξης των 0,2 0,3 kcal/mol. Το γεγονός αυτό είναι µια ακόµη επιβεβαίωση ότι το σύνολο βάσης που χρησιµοποιήθηκε είναι ικανοποιητικά πλήρες για τον ακριβή υπολογισµό των BDE. 43

55 Πίνακας 4.4 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - στο δακτύλιο Β επιλεγµένων αουρονών στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p)//B3LYP/6-31G, T= K ΑΗ p α r b,c BDE d BDE e DPP - Ο 2 f IC 50 f IC 50 Α -953, , ,9 80,7 10,4 10,0 Β -1068, , ,3 81,1 8,7 9,0 Γ -1029, , ,0 74,7 8,3 6,5-1029, , ,6 84,4 10,1 12,3 Ε -1104, , ,7 69,4 7,9 4,3 a Ενθαλπία µητρικής ένωσης, b Ενθαλπία φαινοξυ-ρίζας σε artree, c Η Ενθαλπία του ατόµου υδρογόνου είναι artree, d BDE σε kcal/mol για την πιο δραστική υδροξυ- οµάδα, e BDE σε kcal/mol διορθωµένη λόγω BSSE, f συγκέντρωση του αντιοξειδωτικού σε µμ που απαιτείται για τη δέσµευση της ελεύθερης ρίζας κατά 50% όπως εκτιµήθηκαν από τους [119] Σύµφωνα µε τις τιµές BDE του παραπάνω πίνακα η σειρά δραστικότητας που προκύπτει είναι σχετικά ανάλογη µε εκείνη των απλών φαινολών. Έτσι, η αουρόνη µε την πυρογαλλολική οµάδα στο Β δακτύλιο (αουρόνη Ε) αναµένεται να είναι η πιο δραστική, ακολουθεί εκείνη που διαθέτει κατεχολική οµάδα (αουρόνη Γ) και τέλος οι υπόλοιπες τρεις. Ανάλογες παρατηρήσεις έχουν γίνει και για άλλες κατηγορίες φλαβονοειδών µε όµοια υποκατάσταση στον Β δακτύλιο. Χαρακτηριστική είναι η περίπτωση των φλαβονολών µυρικετίνης (3,4,5 - τριυδροξυ-), κερκετίνης (3,4 διυδροξυ-), ισοραµνετίνης (3 - µεθοξυ-, 4 - υδροξυ-) και της κεµπφερόλης (4 υδροξυ-) [51]. Όπως και στην περίπτωση της πυρογαλλόλης και της κατεχόλης, ο σχηµατισµός ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου επηρεάζει την αποτελεσµατικότητα της αουρόνης Ε (σχήµα 4.9) και της αουρόνης Γ (BDE= 81,7 kcal/mol, χωρίς σχηµατισµό ΙΗΒ). Για την περίπτωση της 4 υδροξυ- αουρόνης (αουρόνη Α) και της 4 - υδροξυ-, 3 -µεθοξυ- αουρόνης (αουρόνη Β) όπου εκ πρώτης όψεως δε φαίνεται κάποια διαφορά στη δραστικότητα, πραγµατοποιήθηκε ανάλογη διερεύνηση µε εκείνη που έγινε για το ζεύγος φαινόλη-γουαϊακόλη. Οµοίως, για την αουρόνη Β η απόδοση δευτέρου ατόµου υδρογόνου και τελικό σχηµατισµό κυκλικού προϊόντος αναµένεται να είναι εφικτή (BDE=48,1 kcal/mol) παρουσία ελευθέρων ριζών. Η σειρά δραστικότητας που προέκυψε για τις συγκεκριµένες αουρόνες κατά τη θεωρητική µελέτη, βρίσκεται σε συµφωνία µε τα πειραµατικά δεδοµένα, κυρίως όµως µε εκείνα της δοκιµής δέσµευσης της ρίζας Ο - 2 [119]115 44

56 BDE=79,9 kcal/mol BDE=80,2 kcal/mol BDE=74,5 kcal/mol BDE=69,7 kcal/mol BDE=84,9 kcal/mol Σχήµα 4.9 Φαινοξυ- ρίζες και τιµές BDE των αντίστοιχων δεσµών - στο δακτύλιο Β για το µόριο της αουρόνης Ε στο επίπεδο B3LYP/ G(2d,2p)//B3LYP/6-31G Προσεκτική εξέταση της δοµής των αουρονών δείχνει ότι στις συγκεκριµένες ενώσεις παρατηρείται επέκταση της συζυγίας στην πλευρική αλυσίδα που συνδέει το δακτύλιο Β µε το δακτύλιο C. Όπως φαίνεται ενδεικτικά από την τρισδιάστατη απεικόνιση του SΟΜΟ για την περίπτωση της φαινοξυ- ρίζας της αουρόνης Ε, πρόκειται για ένα διάχυτο τροχιακό πέραν του δακτυλίου Β (Σχήµα 4.10). Η επέκταση της συζυγίας είναι ένα επιθυµητό δοµικό χαρακτηριστικό για τη σταθεροποίηση της σχηµατιζόµενης φαινοξυ- ρίζας. Σχήµα 4.10 Το τροχιακό SΟΜΟ της φαινοξυ ρίζας αουρόνης Ε 45