ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΕΜΠΤΗ

Transcript

1 16/10/2014 Celia Koutrafouri ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΕΜΠΤΗ 11:00-14:00 2 ο ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΣΤΟΧΟΣ: Ποσοτικοποίιηση και Επιβεβαίωση Παρουσίας της Ουσίας Oπτικές Μέθοδοι: Διακρίνονται σε Α.Φασματοσκοπικές: Απορρόφηση ΗΜΑ Β.Μη Φασματοσκοπικές: Διέλευση ΗΜΑ Ελέγχω εάν παθαίνει κάποια Μεταβολή η ΗΜΑ Διερχόμενη από την ουσία. Α.Φασματοσκοπικές: Απορρόφηση ΗΜΑ Φασματοφωτομετρία UV-Vis: Πειραματικός Σχεδιασμός για Αναλύσεις Συστατικών Τροφίμων, με Φασματοφωτομετρία UV-Vis 1

2 1. Έλεγχος Προϋποθέσεων, ώστε η προς Προσδιορισμό ουσία να Απορροφά σε UV-Vis Hλεκτρονικές Μεταπτώσεις- Διεγέρσεις: n π* π π* 2. Για να κάνουμε Ποσοτικοποίηση, θα πρέπει να επιλέξουμε 1 Συγκεκριμένο λ, στο οποίο η ουσία θα Απορροφά με Συγκεκριμένη Ικανότητα. Επιλογή Περιοχής ΗΜ Φάσματος, που θα γίνει η Ανάλυση. UV ( ) nm Άχρωμες ουσίες Vis ( ) nm Έγχρωμες ουσίες Σε ποιο λ έχει την Μέγιστη Απορρόφηση ή Α max η ουσία μου? 3. Γίνεται Προσδιορισμός του λ βέλτιστου, όπου η ουσία έχει Α max. Αυτό Επιτυγχάνεται από την λήψη του Φάσματος Απορρόφησης ή Φ.Α. ΔΜ ουσίας γνωστής C: Πρότυπο ΔΜ Το βάζουμε σε 1 Φασματοφωτόμετρο και το Ακτινοβολούμε σε όλα τα λ : από nm. 2

3 To Ακτινοβολούμε Σαρώνοντας από τα nm. Όταν Γίνεται αυτό, το Μηχάνημα λαμβάνει τιμές Απορρόφησης. Φάσμα Απορρόφησης: Eίναι η Γραφική Παράσταση της ΔΑ: Μεταβολής της Απορρόφησης, συναρτήσει του λ. Για να Λάβουμε το Φ.Α- Ακτινοβολούμε το ΔΜ της ουσίας που Αναλύουμε, Σαρώνοντας όλα τα λ της Περιοχής που η ουσία Πιθανών Απορροφά. 4. Προσδιορισμός της Γλυκόζης σε κάποιο Τρόφιμο. Θα πρέπει Αρχικά να Προηγηθεί κάποια Διαδικασία- Προκατεργασία του Τροφίμου όπως είναι: - Eκχύλιση του Τροφίμου, με κάποιο Οργανικό Διαλύτη - Φυσικό ή Χημικό Καθαρισμό Ώστε να Παραληφθεί το ΔΜ της προς Προσδιορισμό ουσίας. Όπου και Ακολουθούνται κάποια Έτοιμα Πρωτόκολλα ή Γίνεται Δημιουργία Νέων Πρωτοκόλλων. 3

4 5. Γίνεται Παράλληλη Προετοιμασία Προτύπων ΔΜ της ουσίας που Παρασκευάζονται με το ίδιο Πρωτόκολλο, ώστε να τηρούν ίδιες Πειραματικές Συνθήκες με τα Δείγματα. Τα Πρότυπα ΔΜ Διαθέτουν γνωστή C Προσδιοριζόμενης ουσίας. 6. Πειραματική Διαδικασία και Παραλαβή Μετρήσεων (Απορροφήσεων) 7. Εξαγωγή Αποτελεσμάτων και Εύρεση Συστάσεως της ουσίας στο Συνολικό Τρόφιμο. 8. Εκτίμηση Αποτελεσμάτων και Πόρισμα Σχηματική Παράσταση και Λειτουργία του Φασματοφωτομέτρου Α. Τύπος του Φασματοφωτομέτρου- Απλής Δέσμης 1. Έχει 1 Λάμπα που Παράγει UV(Βολφραμίου)- Vis(Δευτερίου) HΜΑ Ή 1 Λάμπα Αερίου- Ηλίου, η οποία Παράγει όλες τις ΗΜΑ. 4

5 2. Εξέρχεται Πολυχρωματική ΗΜΑ: Oνομάζεται η ΗΜΑ που αντιστοιχεί σε πολλές τιμές λ. Έστω ότι θέλουμε να Μετρήσουμε την Απορρόφηση ΗΜΑ σε 1 ΔΜ ουσίας στα 500nm. Δηλαδή Απορροφά η ουσία μας στο Vis από [ ] nm τότε Χρησιμοοποιούμε 1 Μονοχρωμάτορα. 3. Μονοχρωμάτορες: Είναι Υλικά, Πολυφίλτρα που μπορούν να τροποποιήσουν τι Απορροφούν: Δηλαδή όλα τα λ, που δεν μας ενδιαφέρουν και Επιτρέπει την Διέλευση του λ= 500nm που μας Ενδιαφέρει μόνο. Ονομάζεται αλλιώς Επιλογέας βέλτιστου λ 4. Προϋποθέσεις Κυψελίδας: a) Το Υλικό της δεν πρέπει να Απορροφά ΗΜΑ UV- Xαλαζία Vis- Ύαλος b) b: Το Πάχος των Εσωτερικών τοιχωμάτων της κυψελίδας Είναι η Απόσταση που Διανύει η ΗΜΑ εντός του ΔΜ ουσίας b = 1,000 cm 5

6 ή P<Po Δεδομένου ότι 1 Μέρος Απορροφήθηκε P aπορροφούμενη = Po P Το P Εξερχόμενο, μπορώ να το Μετρήσω. 5.Φωτοανιχνευτής Συνδέεται με 1 Ενισχυτή, και αυτός με την σειρά του με 1 Καταγραφικό: Μας Δίνει τα Αποτελέσματα. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΙ ΝΟΜΟΙ: 1 ος Νόμος του Lambert: A ~ b(cm) πάχος της κυψελίδας Iσχύει Πάντα A= log Kλάσμα Μεταβολής για την Ισχύ Ο log: Μειώνει το Νούμερο 2 ος Νόμος του Beer: A ~ CΔΜ ουσίας (g/l ή mole/l) Iσχύει Μόνο για πολύ Αραιά ΔΜ. 6

7 3 ος Συνδυαστικός Νόμος L-B: Α = a b C a = A: καθαρός αριθμός a=? Eιδική Απορροφητικότητα b: cm C: g/l ή mol/l Α = ε b C ε = A: καθαρός αριθμός ε=? Μοριακή Απορροφητικότητα b: cm C: g/l ή mol/l Aλλάζουν οι Μονάδες μόνο. Οι 2 Σταθερές Απορροφητικότητας εκφράζουν: Tην Ικανότητα της ουσίας να Απορροφά ΗΜΑ σε ορισμένο λ, θ, εντός Συγκεκριμένου Οργανικού Διαλύτη. Ορίζεται για b, C: Μοναδιαία 7

8 ΠΕΙΡΑΜΑ: Προσδιορισμού Γλυκόζης σε 1 Δείγμα άγνωστης C Σε Κάθε Ποσοτική Ανάλυση Παρασκευάζεται: Για όλα Ακολουθούμε τα ίδια Πρωτόκολλα με τα Δείγματα, για να έχουμε Παντού τις ίδιες Πειραματικές Συνθήκες. 1. Σε 1 Κυψελίδα τοποθετείται η Γλυκόζη Α Μέτρηση b Γνωστό α=? Δεν Γνωρίζω C=? Θα πρέπει να βρω 2. Σε 1 Άλλη Κυψελίδα τοποθετείται το Τυφλό ΔΜ δεν περιέχει την Προσδιοριζόμενη ουσία P εξερχόμενου τυφλού = Po 3. 4 Πρότυπα ΔΜ- περιέχουν την Προσδιοριζόμενη ουσία σε Γνωστή C. H a, ε Απορροφητικότητα- Υπολογίζεται από τα Πρότυπα ΔΜ. b Γνωστό C Γνωστό Α=? Μέτρηση α=? Άγνωστο το βρίσκω και το Αντικαθιστώ στο Δείγμα μου. 8

9 Αρχή Μεθόδου Πειραματική Πορεία: 1 ο Πείραμα: Σειρά Προτεραιότητας Φασματοφωτομετρίας 1. Tυφλό ΔΜ 2. 4 Πρότυπα ΔΜ 3. Δείγμα Ενώ γίνονται όλα ταυτόχρονα!! Αρχή Μεθόδου Πειραματική Πορεία: 1 ο Πείραμα: (p.31) Α Τόμου Εργαστηριακών Σημειώσεων Φασματοφωτομετρικός Προσδιορισμός Γλυκόζης στο Ορατό Φάσμα Vis: ( ) nm 1. Mας Δίνεται Έτοιμο ΔΜ Γλυκόζης Άγνωστης C 2. Έμμεση Μέθοδος: Δεν Μετράω Απευθείας Γλυκόζη 9

10 3. Αρχή Μεθόδου: Aντίδραση: D-Γλυκόζη + 2,4-Δι-ΝιτροΦαινόλη + 2 Η 2 Ο + 2,4-Δι-Αμινο φαινόλη Η D- Γλυκόζη: Ανάγων Σάκχαρο Έχει Μη Δεσμικά e στο Ο Απορροφά Οριακά στο UV: 220 nm H 2,4-Δι-Νιτροφαινόλη: Oξειδωτική Ουσία Κίτρινου Χρώματος Σε Περίσσεια Αραιό ΔΜ Η 2,4-Δι-Αμινοφαινόλη: Kέραμέρυθρου Χρώματος Απορροφά στα 550 nm Πυκνό ΔΜ Η Αντίδραση αυτή γίνεται Εν θερμώ. Οι Νιτρο- Ομάδες Ανάγονται σε Αμινο-Ομάδες Σε τι Ποσότητα πρέπει να Βάζω την Δι-Νιτροφαινόλη στα Δείγματα? Όσο δεν αντιδρά η Δι-Νιτροφαινόλη, δεν με πειράζει να μείνει κίτρινη, γιατί δεν Απορροφάει. Μας ενδιαφέρει μόνο το P της 10

11 Αντίδρασης. Άρα για να είμαι Σίγουρος ότι όλη η Γλυκόζη, θα έχει Αντιδράσει, θα πρέπει να μπαίνει ΠΑΝΤΑ σε Περίσσεια η Δι-Νιτροφαινόλη. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ: (p.33 κάτω) Α ,00 ml ΔΜ Γλυκόζης Άγνωστης C: Περιεκτικότητας Δ1 1 η Αραίωση 2. Σε Ογκομετρική Φιάλη των 100,00 ml Δ2 3. Παραλαβή 1,00 ml από το Δ2 4. Και Μεταφορά σε Δοκιμαστικό Σωλήνα ,0 ml ΔΜ 2,4-Δινιτροφαινόλης 6. Θέρμανση για 5 min, σε Ζέων= που Βράζει Υδρόλουτρο 7. Ψύξη σε Παγόλουτρο 8. Ποσοτική Μεταφορά σε Ογκομετρική Φιάλη 2 η Αραίωση 9. 25,00 ml Δ3 11

12 10. Ακολουθεί Φωτομέτρηση στα 550 nm Γίνεται χρήση Οκομετρικής Φιάλης και Σιφωνίων. SOSΤο Δ2 μόλις έχει ψυχθεί μπορούμε να το Φασματοφωτομετρήσουμε? Όχι δεν θα πρέπει να το Φασματοφωτομετρήσω, διότι θα έχει εξατμιστεί Νερό. Για να μπορέσω να το Επαναφέρω και να είναι κατάλληλο για να Μετρηθεί, θα πρέπει να κάνω Αραίωση 3 η σε 1 Ογκομετρική φιάλη. Β. Πρότυπα ΔΜ: Πα: 2,00 ml Πβ: 5,00 ml Πγ: 10,00 ml Πδ: 15,00 ml Aπό Πρότυπο-Πυκνό ΔΜ Γλυκόζης 1,00 % w/v 1. 1 η Αραίωση 2. 50,00 ml 3. Παραλαβή 1,00 ml από κάθε Πρότυπο ΔΜ σε 1 Δοκιμαστικό Σωλήνα ,0 ml ΔΜ Δινιτροφαινόλης 12

13 5. Θέρμανση για 5 min και Ψύξη 6. Ποσοτική Μεταφορά 7. 2 η Αραίωση στα 25,00 ml 8. Φασματοφωτομετρία Γ. Τυφλό ΔΜ 1,00 ml Aπεσταγμένο Νερό + 3,00 ml Δινιτροφαινόλη Θέρμανση για 5 min, έπειτα ψύξη Ποσοτική Μεταφορά 1 η Αραίωση στα 25,00 ml Φωτομέτρηση ΣΥΝΟΛΟ: 6 ΔΜ - 1 Τυφλό ΔΜ - 4 Πρότυπα ΔΜ - 1 Δείγμα ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ: 1. Σαν Cmin: πρέπει να είναι εκείνη που μπορεί να μου δώσει, το Φασματοφωτόμετρο, Μέτρηση Απορρόφησης, χωρίς να ακούγεται Θόρυβος. 2. Θόρυβος τι Σημαίνει? 13

14 Κάνω 1 Πείραμα και το Επαναλαμβάνω ΠΑΝΤΑ 3 φορές και βγάζω τον Μ.Ο. Πάμε μετά στα 25 Δείγματα και Εφαρμόζουμε τον τύπο της Απόκλισης. H Tυπική Απόκλιση: s Εκφράζει Την Διαφορά μεταξύ των Αποτελεσμάτων, μεταξύ τους. Είναι ο Μ.Ο + S Απορρόφησης Εάν η τιμή της Απορρόφησης που έχω, δω ότι μετρήσει είναι μεχρι το 3χ= 3πλάσιο της S: Tυπικής Απόκλισης που έχω, τότε είναι Θόρυβος. Όταν η τιμή της Απορρόφησης που μετράω είναι > από το 3χ, τότε είναι εντάξει και μετράω Σωστά. Εκεί βρίσκω τα όρια Ανιχνεύσεως του Μηχανήματος μου. Άρα λοιπόν πάω σε οποιαδήποτε Αραιό Πρότυπο ΔΜ 1. Το Μετράω 2.Ελέγχω εάν η Απορρόφηση του, σε σχέση με τις Τυπικές Αποκλίσεις είναι > από το 3πλάσιο. Εάν είναι τότε Σημαίνει πως είναι Ανιχνεύσιμη η Απορρόφηση. Εκεί παίρνω το κατω όριο. 3. Στο κατω όριο π.χ Εχω ανοιχτό τον Απαγωγό και μου δίνει 1 Σήμα το Φασματοφωτόμετρο. Αυτό είναι Θόρυβος. 14

15 Ποια Τιμή Μέτρησης και > είανι Πραγματική Απορρόφηση. Αυτή η Χρήσιμη Περιοχή C πρέπει να οριστεί, είτε βάση Επισήμων Πρωτοκόλλων για κάθε Μέθοδο, είτε εάν δεν Υπάρχουν τα ορίζουμε εμείς. 4. Σε όλα τα Πρότυπα ΔΜ Το b: θα πρέπει να είναι Σταθερό Όσο Αλλάζει η C, Aλλάζει η Απορρόφηση. Όταν λοιπόν βλέπω στα Πρότυπα ΔΜ, ότι υπάρχει Αναλογία C + Aπορρόφησης. Είναι μέσα στην Χρήσιμη Περιοχή C και Ισχύει ο Νόμος του Beer. Mε το που βλέπω στο 1 ο Πυκνό Πρότυπο ΔΜ ότι παύει να ισχύει η Αναλογία Απορρόφησης-C, πάει να πει ότι βρίσκονται έξω από την Χρήσιμη Περιοχή C. Eκεί Οριοθετώ την Cmax. 15

16 16