του Βασιλείου. Σανακίδη

Transcript

1 i «Η επίδραση της άσκησης στο οξειδωτικό στρες ηλικιωµένων» του Βασιλείου. Σανακίδη Μεταπτυχιακή διατριβή που υποβάλλεται στο καθηγητικό σώµα για την µερική ολοκλήρωση των απαιτήσεων για την απόκτηση του µεταπτυχιακού τίτλου σπουδών του Τµήµατος Επιστήµης Φυσικής Αγωγής και Αθλητισµού Σερρών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης µε τίτλο «Κινησιολογία» 2013 ΣΕΡΡΕΣ Κύριος Επιβλέπων: ρ. Βράµπας Ιωάννης, Καθηγητής ΤΕΦΑΑ, Σερρών, Α.Π.Θ Μέλος: ρ. Νικολαΐδης Μιχάλης, Λέκτορας, ΤΕΦΑΑ, Σερρών, Α.Π.Θ Μέλος: ρ. Κυπάρος Αντώνιος, Λέκτορας, ΤΕΦΑΑ, Σερρών, Α.Π.Θ

2 ii 2013 Σανακίδης Βασίλειος ALL RIGHTS RESERVED

3 iii ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στο σηµείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τους επιβλέποντες καθηγητές µου κ. Ιωάννη Βράµπα (Καθηγητή), κ. Μιχάλη Νικολαΐδη (Λέκτορα) και κ. Αντώνιο Κυπάρο (Λέκτορα) για την κατανόηση, τη πολύτιµη επιστηµονική βοήθεια και συµπαράσταση που µου παρείχαν σε όλη τη διάρκεια µέχρι και την τελική συγγραφή της εργασίας. Ειδικά για τον κ. καθηγητή Ιωάννη Βράµπα ένα µεγάλο ευχαριστώ, διότι µε βοήθησε να ασχοληθώ µε την επιστήµη του οξειδωτικού στρες. B.Σανακίδης

4 iv Περίληψη Σανακίδης. Βασίλειος «Η επίδραση της άσκησης στο οξειδωτικό στρες ηλικιωµένων» (Υπό την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Ιωάννη Βράµπα) Ο σκοπός της µελέτης ήταν διπλός: α) ο προσδιορισµός και η σύγκριση των αντιδράσεων µιας οµάδας νέων και µιας οµάδας ηλικιωµένων ατόµων στην έκκεντρη άσκηση από την οπτική γωνία της µυϊκής λειτουργίας και της οξειδοαναγωγικής οµοιοστασίας, συγκρίνοντας τις οµάδες στις διαφορετικές παραµέτρους µία προς µία και β) να καταδειχθεί η καταλληλότητα χρησιµοποίησης των ηλικιωµένων ατόµων στις έρευνες του οξειδωτικού στρες που χρησιµοποιούν έκκεντρη άσκηση ως γενεσιουργό παράγοντα καταπόνησης. Στην έρευνα συµµετείχαν οκτώ νέοι άνδρες ηλικίας ( ± 0.5 ) και οκτώ ηλικιωµένοι (64.6 ± 1.1). Οι µεταβλητές που µετρήθηκαν και αναλύθηκαν στατιστικά: α) Γλουταθειόνη ερυθροκυττάρων σε τέσσερις επανειληµµένες µετρήσεις, πριν την άσκηση, αµέσως µετά την άσκηση, 48 ώρες µετά και 96 ώρες µετά, β) Πρωτεϊνικά καρβονύλια στο πλάσµα στις ίδιες επανειληµµένες µετρήσεις, γ) Κρεατινική κινάση σε τρείς επανειληµµένες µετρήσεις, δ) Ισοµετρική ροπή των εκτεινόντων του γονάτου σε τέσσερις επανειληµµένες µετρήσεις. Για τη διερεύνηση πιθανών στατιστικά σηµαντικών διαφορών χρησιµοποιήθηκε η ανάλυση GLM repeated measures (επίπεδο σηµαντικότητας p 0.05), ( IBM SPSS 20.0 για ΜacOs ). Οι τιµές της Γλουταθειόνης στους ηλικιωµένους ήταν µειωµένες σε όλες τις µετρήσεις χωρίς να είναι στατιστικά σηµαντική η διαφορά µεταξύ των οµάδων για την εκάστοτε µέτρηση. Οι τιµές της κρεατινικής κινάσης δεν είχαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δύο οµάδων για τις αντίστοιχες µετρήσεις. Τα πρωτεϊνικά καρβονύλια είχαν υψηλότερες τιµές στους ηλικιωµένους χωρίς να υπάρχει σηµαντική διαφορά µεταξύ των δύο οµάδων. Η ισοµετρική ροπή όπως ήταν αναµενόµενο ήταν χαµηλότερη στους ηλικιωµένους. Η τυπική απόκλιση της ισοµετρικής ροπής των νέων ήταν τρείς έως τέσσερις φορές µεγαλύτερη απ ότι η τυπική απόκλιση των ηλικιωµένων. Τέλος από τα αποτελέσµατα φαίνεται ότι η αντίδραση στην οξειδωτική καταπόνηση είναι παρόµοια και στις δύο οµάδες και ότι τα ηλικιωµένα άτοµα είναι ικανά να συµµετέχουν σε πειράµατα για τη διερεύνηση της οξειδοαναγωγικής οµοιοστασίας χωρίς να υποστούν δυσµενείς επιδράσεις στο µυϊκό τους σύστηµα. Λέξεις κλειδιά: οξειδοαναγωγική οµοιοστασία, οξειδωτικό στρες ηλικιωµένων, έκκεντρη άσκηση

5 v Abstract Vasilios Sanakidis The effect of the exercise on the oxidative stress of the elderly (Under the supervision of Professor Ioannis Vrabas) The purpose of this study was firstly to determine and to compare reactions of the young and elderly people to the eccentric exercise from the perspective of the muscular function and the redox homeostasis. Three representative indicators ( Glutathione, Creatine kinase and protein carbonyls ) of the redox stress and isometric torque of the knee extensors were measured in four repetitive measurements ( pre-exercise, immediately post exercise, 48 h and 96 h after the exercise bout ) with the exception of Creatine kinase which was measured three times (preexercise, 48 h and 96 h after the exercise bout). Secondly the study aimed to show that elderly individuals can be equally suitable subjects for the study of the redox stress when eccentric exercise is used as a stressor. Eight men (64.6±1.1yrs) consisted the experimental (elderly) group. The control group (young) contained eight men (20.6±0.5yrs). Members of the both groups underwent isokinetic eccentric exercise session under standardized and predetermined conditions. To investigate the possible statistically significant differences between the two groups GLM repeated measures was used (level of significance was set to p 0.05 ) and for the determination of possible between groups differences on particular measurements the independent t-tests were carried out. Statistics package IBM SPSS v for ΜacOs was used. Glutathione values in experimental group were lower during all the experiment but the differences between experimental and control group weren t statistically significant. Creatine kinase values weren t significantly different for the respective measurements. The protein carbonyls were elevated in the elderly but without significant differences for the respective measurements. The isometric torque as expected was lower in elderly. The standard deviation of the isometric torque measurement was three to four times higher in young when compared with the elderly group. In conclusion the reaction to the exercise induced oxidative stress was similar in the elderly and young subjects. Additionally it seems that the elderly are able to participate in experiments for the investigation of redox homeostasis when eccentric exercise is used as a causative stressor. No adverse effects to their musculoskeletal system due to eccentric exercise were observed. Key Words: redox homeostasis, eccentric exercise, oxidative stress in the elderly.

6 vi Πίνακας περιεχοµένων Πρόλογος Περίληψη Abstract Πίνακας περιεχοµένων Κατάλογος πινάκων Κατάλογος εικόνων και σχηµάτων 1. Εισαγωγή 1.1 Τα δραστικά είδη 1.2 Το οξειδωτικό στρες 1.3 Πειραµατική σηµασία του οξειδωτικού στρες 1.4 Άσκηση και οξειδωτικό στρες 1.5 Η έκκεντρη άσκηση και το οξειδωτικού στρες 1.6 είκτες του οξειδωτικού στρες είκτες οξειδωτικού στρες που µετρήθηκαν στη µελέτη 2. Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας 2.1 Άσκηση και οξειδωτικό στρες 2.2 Μυϊκή βλάβη κατά την έκκεντρη άσκηση 2.3 Μυϊκή βλάβη και φλεγµονή 2.4 Άσκηση ως παράγοντας καταπόνησης στους ηλικιωµένους και το οξειδωτικό στρες 2.5 Συµπεράσµατα της ανασκόπησης 3. Σκοπός της µελέτης 3.1 Οριοθετήσεις της έρευνας 3.2 Ερευνητικές υποθέσεις 4. Μέθοδοι 4.1 είγµα 4.2 Πειραµατικός σχεδιασµός Ισοκινητικό πρωτόκολλο Μυϊκή λειτουργία και επιδόσεις ιαδικασία αιµοληψίας 4.3 Οξειδοαναγωγική οµοιοστασία είκτες οξειδωτικών τροποποιήσεων iii iv v vi viii ix

7 vii 5. Αποτελέσµατα 5.1 Στατιστική ανάλυση 5.2 Ανθρωποµετρικά χαρακτηριστικά και διατροφή Μυϊκή λειτουργία και µυϊκή βλάβη Οξειδοαναγωγική οµοιοστασία 6. Συζήτηση 6.1 Μυϊκή λειτουργία και βλάβη 6.2 Οξειδοαναγωγική οµοιοστασία 7. Συµπεράσµατα 8. Βιβλιογραφία

8 viii Κατάλογος πινάκων Πίνακας 1. Τα κυριότερα δραστικά είδη οξυγόνου, αζώτου, χλωρίου και θείου 2 Πίνακας 2. Συνηθισµένοι βιολογικοί δείκτες του ασκησιογενούς οξειδωτικού στρες 7

9 ix Κατάλογος εικόνων και σχηµάτων Σχήµα 1. Γενική απεικόνιση της µετάδοσης οξειδοαναγωγικών σηµάτων 3 Σχήµα 2. Εξίσωση Siri για τον προσδιορισµό του σωµατικού λίπους από 7 σωµατικές πτυχές Σχήµα 3. Μέγιστη ισοµετρική ροπή κατά την έκκεντρη σύσπαση στην οµάδα νέων και ηλικιωµένων Σχήµα 4. Καµπύλες των ροπών της οµάδας των ηλικιωµένων Σχήµα 5. Καµπύλες των ροπών της οµάδας των νέων Σχήµα 6. Πρωτεϊνικά καρβονύλια του πλάσµατος Σχήµα 7. Γράφηµα των επιπέδων γλουταθειόνης Σχήµα 8. Οι µεταβολές των επιπέδων της κρεατινικής κινάσης

10 1 1. Εισαγωγή 1.1 Τα δραστικά είδη Η διατήρηση της σταθερότητας ή ισορροπίας του εσωτερικού περιβάλλοντος (οµοιοστασία) κάθε ζωντανού οργανισµού εξαρτάται από την παρουσία και τη σωστή λειτουργία ρυθµιστικών φυσιολογικών µηχανισµών. Η µετατόπιση της ισορροπίας µεταξύ του ρυθµού παραγωγής των δραστικών ειδών ή των οξειδωτικών τροποποιήσεων των βιοµορίων και της ικανότητας του οργανισµού να εξουδετερώνει τα δραστικά στοιχεία, τους ενδιάµεσους µεταβολίτες ή να επιδιορθώνει τις βλάβες που προκαλούνται από αυτά ορίζεται σαν «οξειδωτικό στρες» ( διαταραχή της οξειδοαναγωγικής οµοιοστασίας ). Τα δραστικά είδη χαρακτηρίζονται από υψηλή έφεση προς τα χαλαρά δεσµευµένα ηλεκτρόνια του εξωτερικού τροχιακού των βιοµορίων. Έχουν δηλαδή την ικανότητα να αποσπούν τα ηλεκτρόνια και να προκαλούν οξείδωση των µορίων. Όλα τα µακροµόρια από τα οποία αποτελούνται οι ζωντανοί οργανισµοί µπορούν να υποστούν οξείδωση µε αποτέλεσµα την αλλοίωση των δοµικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών τους. Τα δραστικά είδη είναι συνήθως µόρια ή τµήµατα µορίων ή και άτοµα µε υψηλή σχετική ηλεκτροαρνητικότητα. Κυρίως πρόκειται για το οξυγόνο σε ατοµική µορφή, τις υπεροξειδικές του ενώσεις τις ελεύθερες ρίζες καθώς και για µόρια ηλεκτροστατικά ουδέτερα που είναι ισχυροί οξειδωτικοί παράγοντες. Μερικές ενώσεις αζώτου µε το οξυγόνο και σπανιότερα ενώσεις που περιέχουν θείο ή χλώριο αποτελούν επίσης σηµαντικούς οξειδωτικούς παράγοντες λόγω της ισχυρής ετεροπολικής κατανοµής του ηλεκτροστατικού φορτίου του µορίου τους.

11 2 Τα κυριότερα δραστικά είδη οξυγόνου, αζώτου, χλωρίου και θείου ραστικά στοιχεία οξυγόνου Χρόνος ηµιζωής Μονοατοµικό οξυγόνο 1 O s Ρίζα υπεροξειδίου - Ο 2 - Υπεροξείδιο του υδρογόνου Η 2 Ο 2 - Ρίζα υδροξυλίου ΟΗ 10-9 s Ρίζα περυδροξυλίου ΗΟ 2 - Ρίζα υδροπεροξυλίου ROOH - Υποχλωριώδες οξύ HOCl - Ρίζα περοξυλίου ROO 7 s Όζων Ο 3 ώρες µέρες ραστικά στοιχεία αζώτου Ρίζα του µονοξείδιου του αζώτου ΝΟ 1s 10 s ιοξείδιο του αζώτου NO 2 - Περοξυνιτρίλλιο - ΟΝΟ s 1 s ραστικά στοιχεία θείου Υδρόθειο Η 2 S - Πίνακας 1: Στον πίνακα αναφέρονται µερικά από τα πιο συχνά απαντώµενα δραστικά είδη και η ηµιπερίοδος ζωής τους. 1.2 Το οξειδωτικό στρες Στη διάρκεια και αµέσως µετά τη λήξη της επίδρασης των παραγόντων καταπόνησης οπότε η παραγωγή των δραστικών ειδών είναι αυξηµένη είναι πιθανό οι δυνατότητες ρύθµισης της αντιοξειδωτικής άµυνας να µην επαρκούν για την εξουδετέρωση του οξειδωτικού στρες. Τέτοιες συνθήκες µπορεί να οδηγήσουν σε σταδιακή οξείδωση των συστατικών του κυττάρου όπως των λιπιδίων, πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων και έχουν συσχετιστεί µε πλήθος παθολογικών καταστάσεων συµπεριλαµβανόµενης και της γήρανσης. Σε πολλές περιπτώσεις οι συσχετισµοί αυτοί έχουν βασιστεί µόνο στην παρατήρηση αυξηµένων επιπέδων των δεικτών του οξειδωτικού στρες ( δηλ. αυξηµένοι δείκτες οξείδωσης λιπιδίων, πρωτεϊνών και δείκτες οξείδωσης DNA ). Όµως εκτός από τα εν δυνάµει προβλήµατα που µπορεί να προκαλέσουν τα δραστικά είδη όταν η συγκέντρωση τους ξεπεράσει κάποιο όριο που υπερβαίνει τις δυνατότητες

12 3 εξουδετέρωσης τους από τον οργανισµό, αυτά συµµετέχουν και σε αρκετές φυσιολογικές λειτουργίες όπως η µετάδοση οξειδοαναγωγικών σηµάτων µεταξύ των κυττάρων, η οξειδοαναγωγική ρύθµιση της αντιγραφής των γονιδίων η κυτταρική ανοσία και ο κυτταρικός θάνατος (απόπτωση). Οξειδωτικό στρες Υψηλό Χαµηλό Βλάβη κυτταρική / Βλάβη στους ιστούς Μετάδοση σηµάτων Νέκρωση Παράγοντες αντιγραφής Κυτταρική διόγκωση Ρήξη κυτταρικής µεµβράνης Αποδοµή οργανυλλίων Κυτταρικός Θάνατος Γονίδια ενεργοποιούµενα από τα ραστικά είδη Γονιδιακή εκδήλωση - ρύθµιση Κυτοκίνες ιαφοροποίηση Πολλαπλασιασµός Απόπτωση Αντιοξειδωτικά ενζυµα Κυτταροπροστασία Φλεγµονή Εικόνα 1: Γενικό σχήµα της µετάδοσης σηµάτων µε διαµεσολάβηση των δραστικών ειδών που περιέχουν οξυγόνο (ROS). Σε χαµηλές συγκεντρώσεις τα δραστικά είδη µπορούν να διαµεσολαβήσουν στη µετάδοση σηµάτων που προκαλούν διαίρεση, διαφοροποίηση ή θάνατο (απόπτωση). Αντίθετα οι υψηλές συγκεντρώσεις των δραστικών ειδών οδηγούν κατευθείαν στον κυτταρικό θάνατο (νέκρωση). Έτσι λοιπόν τα δραστικά είδη είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική λειτουργία του οργανισµού και τα «υγιή» επίπεδα τους που δεν ξεπερνούν κάποιο όριο δεν φαίνονται να είναι προβληµατικά. Οι παροδικές αυξοµειώσεις των επιπέδων των δραστικών ειδών µε τη σειρά τους αυξοµειώνουν τα επίπεδα των ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύµων που σηµαίνει ότι µία

13 4 τακτική έκθεση σε ήπια επίπεδα των δραστικών ειδών έχει τελικά σαν αποτέλεσµα την αύξηση της ικανότητας του οργανισµού να αντιµετωπίσει το οξειδωτικό στρες. 1.3 Πειραµατική σηµασία του οξειδωτικού στρες Αρκετοί παράγοντες καταπόνησης έχουν χρησιµοποιηθεί επανειληµµένα από ερευνητές στο πεδίο της οξειδοαναγωγικής βιοχηµείας και της βιοχηµείας των δραστικών ειδών µε σκοπό την πρόκληση πειραµατικού οξειδωτικού στρες. Αυτό γίνεται κυρίως για δύο λόγους: πρώτον για να φανούν οι πιθανές διαφορές στην οξειδοαναγωγική οµοιοστασία µεταξύ διαφορετικών οργανισµών η / και καταστάσεων που δεν είναι ευδιάκριτες σε κατάσταση ηρεµίας ή κατά δεύτερο λόγο για να εκτιµηθεί η καταλληλότητα των διαφόρων δεικτών για τον προσδιορισµό των επιπέδων του οξειδωτικού στρες. Οι περισσότεροι παράγοντες καταπόνησης είναι φαρµακευτικής φύσεως και παρουσιάζουν συχνά ανεπιθύµητες παρενέργειες (π.χ. τετραχλωράνθρκας Kadiiska et al. 2005; υπεριώδης ακτινοβολία, Breusing et al. 2010; Paraquat - Gramoxone, Hassett et al. 1987; η έκθεση στο όζων, Morgan & Wenzel 1985) αυτό περιορίζει τη χρήση τους µόνο σε κυτταροκαλλιέργειες και σε πειραµατόζωα. Κατά συνέπεια η ανάπτυξη και χρήση ενός φυσιολογικού παράγοντα καταπόνησης που να µπορεί να χρησιµοποιηθεί και στον άνθρωπο θα ήταν πολύ χρήσιµη στις έρευνες της οξειδοαναγωγικής βιοχηµείας. 1.4 Άσκηση και οξειδωτικό στρες Η έντονη άσκηση είναι πιθανώς το πιο συχνά χρησιµοποιούµενο πειραµατικό µοντέλο για την πρόκληση οξειδωτικού στρες µε φυσικό τρόπο (Nikolaidis et al. 2012a). Παρ όλα αυτά µόνο σπάνια έχει διερευνηθεί αυστηρά κατά πόσο το επιλεγµένο µοντέλο άσκησης όντως ανταποκρίνεται στο σκοπό αυτό (Nikolaidis et al. 2012b). Για παράδειγµα αρκετές µελέτες δεν κατάφεραν να προκαλέσουν οξειδωτικό στρες µετά από έντονη προσπάθεια (Dixon et al. 2006; Jimenez et al. 2000; Sacheck et al. 2000). Κατά τη γνώµη µερικών ερευνητών ο πιο σοβαρός λόγος γι αυτή την αποτυχία ήταν η χρήση της αερόβιας άσκησης µικρής η µέτριας έντασης και διάρκειας ( που συνοδεύτηκε από περιορισµένη µυϊκή βλάβη ) ως πειραµατικού µοντέλου. Τέτοιου είδους άσκηση παρήγαγε

14 5 βραχύβιες επιδράσεις στην οξειδοαναγωγική οµοιοστασία ( συχνά διάρκειας µικρότερης των δύο ωρών µετά την λήξη της άσκησης Michailidis et al. 2007; Nikolaidis et al. 2012b). Λαµβάνοντας υπ όψιν τη σύγχυση που προκαλείται από τα παραπάνω προτάθηκε πρόσφατα το µοντέλο της έκκεντρης άσκησης ως πιο κατάλληλο αντί της σύγκεντρης άσκησης για τη διερεύνηση της δυναµικής της οξειδοαναγωγικής οµοιοστασίας (Nikolaidis et al. 2012b). 1.5 Η έκκεντρη άσκηση και το οξειδωτικό στρες Ο βασικός λόγος για τον οποίο προτάθηκε η έκκεντρη άσκηση είναι ότι µε αυτόν τον τύπο άσκησης προκαλούνται µεταβολές στη οξειδοαναγωγική οµοιοστασία που χαρακτηρίζονται από σηµαντική διάρκεια ( έως και τέσσερις µέρες µετά την άσκηση ) και µέγεθος ( ακόµη και 40% αύξηση σε σύγκριση µε την ηρεµία ) των µεταβολών των οξειδωτικών δεικτών ( Nikolaidis et al. 2007; Nikolaidis et al. 2008; Nikolaidis et al. 2012b; Theodorou et al. 2010; Theodorou et al. 2011). Εξ ίσου σηµαντικό είναι το γεγονός ότι η έκκεντρη άσκηση προκαλεί γρήγορες προσαρµογές στην οξειδοαναγωγική οµοιοστασία του αίµατος και στη λειτουργία των µυών µετά από µία και µόνη προσπάθεια (Nikolaidis et al. 2007; Theodorou et al. 2010). Γεγονός που επιτρέπει στους ερευνητές να παρακολουθούν τις ανταποκρίσεις αλλά και τις προσαρµογές στο οξειδωτικό ερέθισµα χρησιµοποιώντας µόνο δύο έκκεντρες προσπάθειες αντί για περισσότερο από ένα µήνα προπόνηση που συνήθως χρειάζεται για την πρόκληση παρόµοιου µεγέθους προσαρµογών όταν δεν χρησιµοποιείται η έκκεντρη άσκηση. Η έρευνα που διεξάγεται στις µέρες µας έχει εστιάσει την προσοχή της στο ρόλο της άσκησης και στην επίδρασή της πάνω στην υγεία των ηλικιωµένων. Στη βιβλιογραφία υπάρχει παλιά αλλά ενεργή συζήτηση όσον αφορά την επίδραση της γήρανσης στην οξειδοαναγωγική βιοχηµεία του ανθρώπου και των ζώων. Παρ όλη την πρόοδο των αναλυτικών τεχνικών και την εκλέπτυνση των πειραµατικών σχεδιασµών σηµαντικές διαφορές υφίστανται µεταξύ µελετών που αφορούν την επίδραση της άσκησης στη µυϊκή βλάβη και την οξειδοαναγωγική οµοιοστασία των ηλικιωµένων. Πράγµατι αρκετές έρευνες έχουν δείξει ότι η γήρανση αυξάνει (Dedrick and Clarkson 1990; Clarkson and Dedrick 1988; Manfredi et al. 1991), µειώνει (Lavender and Nosaka 2006), ή δεν επηρεάζει (Lavender and Nosaka 2008;

15 6 Sacheck et al. 2003) το βαθµό της ασκησιογενούς µυϊκής βλάβης. Παροµοίως αρκετές έρευνες αναφέρουν ότι η γήρανση αυξάνει (Bejma et al. 2000; Gunduz et al. 2004; Navarro-Arevalo et al. 1999), τροποποιεί (Leeuwenburgh et al. 1994; Ohishi et al. 2005), ή δεν επηρεάζει (Navarro- Arevalo and Sanchez-del-Pino 1998; Santiago et al. 1993) το ασκησιογενές οξειδωτικό στρες. Όσον αφορά την προσαρµοστική ικανότητα των γερασµένων οργανισµών και την ικανότητα να ανταποκριθούν στην επαναλαµβανόµενη οξειδωτική καταπόνηση έχει αναφερθεί ότι είναι χαµηλότερη (Rousseaua et al. 2006; Bailey et al. 2010) ή ότι δεν διαφέρει (Kostka et al. 2000; Sacheck et al. 2006) µε αυτή των νέων οργανισµών. Η διάσταση απόψεων µεταξύ διαφόρων µελετών επισηµάνθηκε και η ανάγκη για πιο ολοκληρωµένη έρευνα τονίστηκε σε αρκετά σχετικά ανασκοπητικά άρθρα (Aoi & Sakuma 2011; Carter et al. 2007; Close et al. 2005; Jackson & McArdle 2011; Ristow & Schmeisser 2011). Οι πιθανοί λόγοι για τη διαφωνία απόψεων που αφορούν τις επιδράσεις της γήρανσης στις προσαρµογές της άσκησης και στην οξειδοαναγωγική οµοιοστασία είναι πολλοί και µπορεί να συµπεριλαµβάνουν µεταξύ άλλων διαφορές στο 1) είδος των ζώων που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα, 2) τα µοντέλα άσκησης που έχουν χρησιµοποιηθεί, 3) την προπονητική κατάσταση των συµµετεχόντων, 4) τους δείκτες οξειδωτικού στρες που έχουν προσδιοριστεί και 5) το βιολογικό υλικό µέσα στο οποίο προσδιορίστηκαν οι δείκτες. Για να λάβει υπ όψιν µερικούς από τους παραπάνω παράγοντες που προκαλούν σύγχυση, η παρούσα µελέτη χρησιµοποίησε εγκεκριµένο µοντέλο έκκεντρης άσκησης για να προκαλέσει τροποποιήσεις στην οξειδοαναγωγική ισορροπία που να χαρακτηρίζονται από διάρκεια, και εκτεταµένη αύξηση του οξειδωτικού στρες (Nikolaidis et al. 2007; Paschalis et al. 2011; Theodorou et al. 2010; Theodorou et al. 2011). Επιπλέον οι ανταποκρίσεις στην άσκηση µετρήθηκαν σε νέους και ηλικιωµένους ταυτόχρονα µε σκοπό τη σύγκριση µεταξύ τους. Προσδιορίστηκαν αντιπροσωπευτικοί οξειδοαναγωγικοί δείκτες ( δείκτες οξειδωτικής βλάβης και µη ενζυµατικός αντιοξειδωτικός ρυθµιστής ) στο πλάσµα και στα ερυθροκύτταρα. Οι µετρήσεις αυτές αποτελούν ένα σηµαντικό προκαταρκτικό βήµα για την επιβεβαίωση της πιθανής επίδρασης του οξειδωτικού στρες στην διαδικασία της γήρανσης.

16 7 1.6 είκτες του οξειδωτικού στρες Μέθοδοι προσδιορισµού του ρυθµού δηµιουργίας των δραστικών ειδών Η πλειονότητα των εξετάσεων που εστιάζονται στη διερεύνηση του οξειδωτικού στρες λόγω άσκησης χρησιµοποιεί τις έµµεσες µεθόδους για τον προσδιορισµό των αλλαγών στην οξείδωση των λιπιδίων, πρωτεϊνών και του DNA των κυττάρων και των ιστών. Με βάση αυτή τη προσέγγιση το επίπεδο των δραστικών ειδών µετράται µε τον προσδιορισµό του βαθµού οξείδωσης των βιοµορίων και της µείωσης των επιπέδων των ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύµων. Σε µελέτες µε ανθρώπους τα δείγµατα επιλογής για τον προσδιορισµό του οξειδωτικού στρες είναι το αίµα και τα ούρα και σε µερικές περιπτώσεις οι βιοψίες µυών που υποβάλλονται σε άσκηση. Μόριο Βιολογικός δείκτης Μέθοδος προσδιορισµού Ισοπροστάνια ELISA Λιπίδια Υδροξυπεροξείδια ELISA MDA HPLC ELISA - Πρωτεΐνες Καρβονύλια Φωτοφασµατογράφος DNA Οξειδωµένες DNA βάσεις HPLC Αντιοξειδωτικές ουσίες Γλουταθειόνη Φωτοφασµατογράφος Ξανθίνη οξειδάση Φωτοφασµατογράφος ιάφορα Υπεροξείδιο του υδρογόνου Φωτοφασµατογράφος Πίνακας 2 Συνηθισµένοι βιολογικοί δείκτες του ασκησιογενούς οξειδωτικού στρες

17 είκτες οξειδωτικού στρες που µετρήθηκαν στη µελέτη α) Γλουταθειόνη Η γλουταθειόνη είναι ο κύριος κυτταρικός µη πρωτεϊνικός οξειδοαναγωγικός ρυθµιστής µε βάση τη θειόλη. Η σηµασία της για την κανονική κυτταρική λειτουργία είναι ζωτική. γ Η δοµή της γλουταθειόνης Η οµοιοστασία της ρυθµίζεται κυρίως ενζυµατικά. Η GSH µπορεί να ρυθµίζει αποτελεσµατικά την µετάδοση των σηµάτων µεταξύ των κυττάρων µε οξειδοεξαρτώµενο τρόπο. Όµως φαίνεται ότι η πρωταρχική λειτουργία της έγκειται στη διατήρηση της ενδοκυτταρικής οξειδοαναγωγικής οµοιοστασίας προσφέροντας προστασία έναντι των δραστικών ειδών που περιέχουν οξυγόνο και άζωτο όπως και κατά των ηλεκτρόφιλων ξενοβιοτικών ουσιών. Το µεγαλύτερο µέρος της GSH βρίσκεται µέσα στο κύτταρο σε ανηγµένη µορφή. Η κύρια οξειδωµένη µορφή της είναι η GSSG και προκύπτει από την ένωση δύο µορίων GSH µέσω δισουλφιδικής γέφυρας. Η προστασία από τα δραστικά είδη επιτυγχάνεται χάρη στη δράση αρκετών ενζυµικών συστηµάτων ειδικών για το κάθε δραστικό είδος. β) Πρωτεϊνικά καρβονύλια Η περιεκτικότητα του πλάσµατος σε πρωτεϊνικά καρβονύλια έχει γίνει µία από τις πιο συνηθισµένες και συχνές µετρήσεις για τον προσδιορισµό της οξείδωσης των πρωτεϊνών που οφείλεται στην επίδραση των δραστικών ειδών. Ο προσδιορισµός των πρωτεϊνικών καρβονυλίων είναι ένας γενικός δείκτης οξειδοαναγωγικής καταπόνησης και δεν παρέχει πληροφορίες για την πηγή του οξειδωτικού στρες. Τα συγκριτικά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε

18 9 τον προσδιορισµό κάποιων άλλων προϊόντων οξείδωσης είναι ο πρώιµος σχηµατισµός τους και η σχετική σταθερότητα των καρβονυλιωµένων πρωτεϊνών. Η µετουσίωση των οµάδων των καρβονυλίων γίνεται µε τη βοήθεια της 2,4 δινιτροφαινιλυδραζίνης (DNPH). Ακολουθεί ο σχηµατισµός του σταθερού δινυτροφαινυλίου (DNP) το οποίο προσδιορίζεται φασµατοφωτοµετρικά ή µε τη µέθοδο (ELISA) και µονο- ή δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση ακολουθούµενη από τη Western blot ανοσολογική µέθοδο. γ) Κρεατινική κινάση Η εµφάνιση της κρεατινικής κινάσης (CK) στο πλάσµα του αίµατος γενικά θεωρείται ως έµµεσος δείκτης της βλάβης την οποία υφίστανται τα µυοκύτταρα. Ειδικά για τη διάγνωση παθολογικών καταστάσεων και καταστάσεων οξειδωτικού στρες που είναι αποτέλεσµα φυσικής άσκησης. Στη µελέτη µας ο προσδιορισµός της δραστηριότητας της κρεατινικής κινάσης χρησιµοποιήθηκε σαν δείκτης βλάβης των κυτταρικών µεµβρανών και κατά συνέπεια της οξείδωσης των λιπιδίων που τις αποτελούν, λόγω του ότι η (CK) βρίσκεται αποκλειστικά στο κυτόπλασµα. Η βλάβη των λιπιδίων της µεµβράνης συνεπάγεται την αυξηµένη διαπερατότητα έως και ρήξη της κυτταρικής µεµβράνης µε αποτέλεσµα την έξοδο του κυτοπλάσµατος και του περιεχόµενού του στον µεσοκυττάριο χώρο και τελικά στην κυκλοφορία.

19 10 2. Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας 2.1 Η άσκηση και το οξειδωτικό στρες Το ζήτηµα του ασκησιογενούς οξειδωτικού στρες έχει τύχει σηµαντικής προσοχής την τελευταία τριακονταετία µε σχεδόν 300 αυθεντικές έρευνες µετά από την πρώτη έρευνα του Dillard et al.το 1978 που ανέφερε ότι η οξείδωση των λιπιδίων του σώµατος αυξανόταν µετά από 60 λεπτά άσκησης ποδηλασίας. Με βάση τη γενικά αποδεκτή άποψη φαίνεται ότι η άσκηση επαρκούς έντασης και διάρκειας αυξάνει τον ρυθµό παραγωγής των δραστικών ειδών που περιέχουν οξυγόνο και άζωτο µε πιθανότητα διαταραχής της ισορροπίας µεταξύ του ρυθµού παραγωγής και αποδόµησης εξουδετέρωσης αυτών. Η κατάσταση αυτή που κοινώς αναφέρεται σαν οξειδωτικό στρες µπορεί να οδηγήσει στην οξείδωση και βλάβη όλων των βιοµορίων που αποτελούν τα δοµικά και λειτουργικά στοιχεία του οργανισµού. Ο βαθµός οξείδωσης όπως και η πορεία της αύξησης των δεικτών του οξειδωτικού στρες µέσα στο χρόνο ποικίλουν ευρέως µεταξύ των µελετών και εξαρτώνται από τον τύπο, την ένταση, τον όγκο, τη διάρκεια της άσκησης, τον χρόνο συλλογής των δειγµάτων, τον ιστό που διερευνάται για το οξειδωτικό στρες και την πληθυσµιακή οµάδα που λαµβάνει µέρος στο εκάστοτε πείραµα.(bloomer 2008) Η άσκηση µεγάλης έντασης είναι το πιο συχνά χρησιµοποιούµενο πρότυπο για την πρόκληση οξειδωτικού στρες σε πειράµατα µε ανθρώπους (Nikolaidis et al. 2012a). Παρ όλα αυτά µόνο σπάνια έχει διερευνηθεί αυστηρά κατά πόσο το επιλεγµένο µοντέλο άσκησης όντως ανταποκρίνεται στο σκοπό αυτό (Nikolaidis et al. 2012b). Για παράδειγµα αρκετές µελέτες δεν κατάφεραν να προκαλέσουν οξειδωτικό στρες µετά από έντονη προσπάθεια (Dixon et al. 2006; Jimenez et al. 2000; Sacheck et al. 2000). Αντίθετα η διερεύνηση της επίδρασης της οξείας έκκεντρης άσκησης έδειξε, ότι αυτή οδηγεί σταθερά σε ιδιαίτερα έντονο και παρατεταµένο οξειδωτικό στρες (Paschalis et al., 2007; Close et al., 2004; Close et al., 2005; Goldfarb et al., 2005; Lee et al., 2002; Nikolaidis et al., 2008). Πιθανότερη αιτία για την αύξηση του οξειδωτικού στρες τις µέρες µετά από έκκεντρη άσκηση είναι η φλεγµονή που δηµιουργείται στην κατεστραµµένη µυϊκή περιοχή µε σκοπό την µυϊκή επανόρθωση και αναγέννηση (Close, Ashton, McArdle, et al., 2005a; Nikolaidis, Jamurtas, et al.,

20 a). Μετά από έκκεντρη άσκηση παρατηρείται σηµαντική αύξηση του αριθµού φαγοκυττάρων στην κυκλοφορία και µαζική εισβολή ουδετερόφιλων και µακροφάγων στο σηµείο της φλεγµονής στο µυϊκό ιστό. Η εισβολή αυτή προκαλεί αύξηση των δραστικών ειδών άµεσα και για ώρες µετά τη µυϊκή βλάβη που προκαλείται από την άσκηση (Close, Ashton, McArdle, et al., 2005; Close, et al., 2005; Nikolaidis, Jamurtas, et al., 2008). Κατά την έκκεντρη άσκηση µπορεί να προκληθεί λευκοκυτταρική διήθηση και κατ επέκταση σηµαντική οξειδωτική καταστροφή (Close, Ashton, McArdle, et al., 2005a; Close, et al., 2005b; Nikolaidis, Jamurtas, et al., 2008a), αφού τα ουδετερόφιλα και τα µακροφάγα που ενεργοποιούνται προκαλούν την παραγωγή αρκετών δραστικών ειδών όπως O - 2, H 2 O 2, και HOCl. Έπεται ο καταβολισµός του κατεστραµµένου µυϊκού ιστού και στη συνέχεια η επιδιόρθωση και αναγέννηση του µυός που υπέστη βλάβη (Close, Ashton, McArdle, et al., 2005a; Nikolaidis, Jamurtas, et al., 2008a). Η εκτέλεση έκκεντρων συστολών όπως π.χ. κατά το κατηφορικό τρέξιµο ακολουθείται από λευκοκυτταρική διήθηση που διαρκεί έως και 3 µέρες (Close, et al., 2004; Jamurtas, et al., 2005; Paschalis, et al., 2005; Paschalis, Nikolaidis, Giakas, et al., 2010c; Proske & Morgan, 2001; Theodorou, et al., 2010 ). Το οξειδωτικό στρες µετράται ποσοτικά µε την εκτίµηση ενός αριθµού έµµεσων δεικτών που απεικονίζουν την οξειδοαναγωγική κατάσταση του οργανισµού (Nikolaidis, Jamurtas, et al., 2008). Ο προσδιορισµός του οξειδωτικού στρες εξαρτάται πολλές φορές από τους δείκτες που πρόκειται να µετρηθούν. Οι αντιοξειδωτικές ουσίες ενζυµικής φύσεως που χρησιµοποιούνται για το σκοπό αυτό πιο συχνά είναι η υπεροξειδική δισµουτάση, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και η καταλάση. Από τα µη ενζυµικά αντιοξειδωτικά µόρια που χρησιµοποιούνται για τον προσδιορισµό των επιπέδων του οξειδωτικού στρες του οργανισµού είναι η γλουταθειόνη, το ουρικό οξύ, και οι βιταµίνες C και Ε (Powers, 2008). Ένας άλλος δείκτης που χρησιµοποιείται αρκετά είναι η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (ΤΑC), που αντιπροσωπεύει την ικανότητα του αίµατος ή του µυϊκού ιστού συνήθως να εξουδετερώνουν τα δραστικά στοιχεία οξυγόνου και αζώτου που παράγονται (Paschalis, Nikolaidis et al. 2007). 2.2 Η µυϊκή βλάβη κατά την έκκεντρη άσκηση Όπως είναι γνωστό, από την έκκεντρη άσκηση µπορεί να προκληθεί αξιοσηµείωτη βλάβη στους συµµετέχοντες µυς που διαρκεί για χρονικό διάστηµα της τάξης µερικών ηµερών

21 12 (Jamurtas, et al., 2005; Paschalis, et al., 2005; Nikolaidis, et al., 2007; Paschalis, Nikolaidis, et al., 2010a; Theodorou, et al., 2010). Η προκαλούµενη µυϊκή βλάβη από την έκκεντρη άσκηση έχει σαν αποτέλεσµα την µερική απώλεια της µυϊκής λειτουργίας και της µυϊκής δύναµης, τον περιορισµό του εύρους κίνησης, αλλοίωση της µικροσκοπικής δοµής του µυός, του συνδετικού ιστού, µεγάλη αύξηση της κυκλοφορίας των ενδοµυϊκών ενζύµων, εµφάνιση του καθυστερηµένου µυϊκού πόνου (DOMS) και οίδηµα. (Paschalis V, Nikolaidis M, 2007) Μετά το πέρας της έκκεντρης σύσπασης παρατηρείται αποδιοργάνωση των σαρκοµεριδίων µέσα στα µυοϊνίδια, διαταραχές στην ευθυγράµµιση των γραµµών Ζ, βλάβες στα Τ σωληνάρια και αποδιοργάνωση των µυονηµατίων (Brown & Hill, 1991; Close, Ashton, McArdle, & Maclaren, 2005; Friden, 1984; Friden, Sjostrom, & Ekblom, 1983). Ειδικότερα κατά την έκκεντρη µυϊκή συστολή επιµηκύνονται σε µεγαλύτερο βαθµό τα λεπτότερα σαρκοµερίδια των µυοϊνιδίων (Friden, et al., 1983). Σαν συνέπεια τα ήδη λεπτά µυοϊνίδια γίνονται ακόµη λεπτότερα και πιο εύθραυστα (Stauber, 1989). Φτάνοντας στο οριακό σηµείο διάτασης χάνουν την αληλοκάλυψη µεταξύ της ακτίνης και της µυοσίνης. Τα σαρκοµερίδια που έχουν διαταθεί υπερβολικά είναι διάσπαρτα µέσα στις µυϊκές ίνες (Proske & Allen, 2005). Όταν επέλθει η χαλάρωση του µυός τα περισσότερα σαρκοµερίδια που διατάθηκαν υπερβολικά επανέρχονται στο φυσιολογικό τους µήκος. Τα σαρκοµερίδια που δεν επανακτούν το αρχικό τους σχήµα και µέγεθος ρηγνύονται (Brown & Hill, 1991; Friden, et al., 1983; McCully & Faulkner, 1985; Newham, et al., 1983) ενώ ταυτόχρονα εξέρχονται ανεξέλεγκτα τα ιόντα ασβεστίου από το σαρκοπλασµικό δικτυωτό (McCully & Faulkner, 1985; Proske & Allen, 2005). Οι επαναλαµβανόµενες έκκεντρες συστολές έχουν σαν αποτέλεσµα συσσώρευση των ρηγµένων µυϊκών ινιδίων και εµφάνιση της µυϊκής βλάβης. Η πρωτοπαθής µυϊκή βλάβη πιθανώς να οφείλεται στην υπερβολική διάταση των σαρκοµεριδίων που συµβαίνει κατά τη διάρκεια των έκκεντρων συστολών. Ακολούθως η µυϊκή βλάβη αυξάνει σε έκταση και κορυφώνεται την 2-4 µέρα µετά από το τέλος της έκκεντρης άσκησης (Nikolaidis, et al., 2007; Paschalis, et al., 2005; Paschalis, Nikolaidis, Giakas, et al., 2010; Paschalis, Nikolaidis, et al., 2010a; Theodorou, et al., 2010). Οι αυξηµένες ενδοµυϊκές πρωτεΐνες στην κυκλοφορία του αίµατος η πτώση της µυϊκής απόδοσης και η αίσθηση έντονου µυϊκού πόνου στους µυς η τις οµάδες µυών που συµµετείχαν στην άσκηση (Jamurtas, et al., 2005; Nikolaidis, et al., 2007; Paschalis, et al., 2005; Theodorou, et al., 2010). Η δευτεροπαθής µυϊκή βλάβη πιθανώς να ενισχύεται και από άλλους παράγοντες στην συνέχεια µε αποτέλεσµα

22 13 να προκύπτει µεγαλύτερη µυϊκή βλάβη και νέκρωση µεγαλύτερου αριθµού µυϊκών κυττάρων (Close, Ashton, Cable, Doran, & MacLaren, 2004). Οι υποθέσεις που εκφράστηκαν για την εξήγηση της δευτεροπαθούς µυϊκής βλάβης την αποδίδουν στην απώλεια της ενδοκυττάριας οµοιοστασίας του ασβεστίου, σε απώλεια των ενεργειακών πηγών των µυϊκών κυττάρων και στην δράση δραστικών ειδών µέσα στο µυϊκό ιστό (McArdle & Jackson, 1997). Τα τελευταία χρόνια πολλές έρευνες έχουν στρέψει την προσοχή τους στην διερεύνηση του ρόλου των δραστικών ειδών που παράγονται κατά την διάρκεια της καθυστερηµένης µυϊκής βλάβης (Nikolaidis, Jamurtas, et al., 2008a). Η δράση των µορίων αυτών φαίνεται να είναι η πιο καθοριστική αιτία, αν και ο λόγος της ενέργειας των δραστικών ειδών µετά από µυϊκή βλάβη δεν έχει διευκρινιστεί ακόµη πλήρως. 2.3 Μυϊκή βλάβη και φλεγµονή. Μετά την αρχική µυϊκή βλάβη αναπτύσσεται φλεγµονή στον ασκηθέντα µυ και ταυτόχρονα ξεκινάει η διαδικασία ανανέωσης του κατεστραµµένου µυϊκού ιστού (Close, Kayani, Vasilaki, & McArdle, 2005b). Στη διάρκεια της φλεγµονής παρατηρείται µαζική εισβολή ουδετερόφιλων και µακροφάγων στην περιοχή που υπέστη βλάβη (Close, Ashton, McArdle, et al., 2005a; Nikolaidis, Jamurtas, et al., 2008a). Τα ουδετερόφιλα συγκεντρώνονται στην περιοχή σε διάστηµα 2 ωρών, µε αποκορύφωση µετά από 24 ώρες. Η επιστροφή της συγκέντρωσης των ουδετερόφιλων στα αρχικά επίπεδα πραγµατοποιείται έπειτα από την πάροδο 7 ηµερών (Koh, Peterson, Pizza, & Brooks, 2003; Pizza, Koh, McGregor, & Brooks, 2002; Pizza, Peterson, Baas, & Koh, 2005). Τα µακροφάγα λεµφοκύτταρα παραµένουν σε αυξηµένα επίπεδα για αρκετές µέρες µετά την άσκηση (Koh, et al., 2003; Pizza, et al., 2002; Pizza, et al., 2005). Τα ουδετερόφιλα θεωρείται ότι συνεισφέρουν στην µυϊκή αναγέννηση αποµακρύνοντας τον κατεστραµµένο µυϊκό ιστό από την περιοχή της φλεγµονής (Papadimitriou, Robertson, Mitchell, & Grounds, 1990). Τα ουδετερόφιλα µπορούν να επηρεάσουν τη µυϊκή αναγέννηση αφού παράγουν ουσίες οι οποίες συµµετέχουν στην µυογένεση (Seale & Rudnicki, 2000). Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα σχηµατίζοντας ιντερλευκίνη-6 (IL-6) ή ηπατοκυτταρικό αυξητικό παράγοντα (hepatocyte growth factor) ευνοούν την µυϊκή αναγέννηση, αφού οι δυο αυτοί παράγοντες προκαλούν πολλαπλασιασµό των µυοβλαστών (Seale & Rudnicki, 2000). Από την άλλη, τα ουδετερόφιλα έχει αναφερθεί ότι συνεισφέρουν αρνητικά (άµεσα ή έµµεσα) στην µυϊκή αναγέννηση (Hawke & Garry, 2001; Pizza, McLoughlin, McGregor, Calomeni, & Gunning, 2001; Seale & Rudnicki, 2000). Συγκεκριµένα, έχει αναφερθεί ότι τα ουδετερόφιλα παράγουν

23 14 διάφορες άλλες κυτοκίνες οι οποίες επηρεάζουν αρνητικά την µυϊκή αναγέννηση (Hawke & Garry, 2001; Seale & Rudnicki, 2000). Παράλληλα, έχει αναφερθεί ότι τα ουδετερόφιλα καταστρέφουν τα µυϊκά σωληνάρια καθυστερώντας περαιτέρω τη µυϊκή επιδιόρθωση (Pizza, et al., 2001). Ο Pizza και συνεργάτες του (2005) σε µια έρευνα τους σε ποντίκια ανέφεραν ότι µετά από έκκεντρες συστολές η µυϊκή απόδοση καθυστέρησε περισσότερο να επανέλθει όταν υπήρχε παρουσία ουδετερόφιλων. Σε αντίθεση µε αυτή την παρατήρηση, ο Teixeira και οι συνεργάτες του (2003) αναφέρουν ότι µετά από τραύµα τα ουδετερόφιλα ενίσχυσαν την µυϊκή αποκατάσταση (Teixeira, et al., 2003). Οι αντικρουόµενες αυτές παρατηρήσεις, όσον αφορά την δράση των ουδετερόφιλων, πιθανώς να υποδηλώνουν ότι το είδος (π.χ. ασκησιογενές) και ίσως και η διάρκεια της προκαλούµενης µυϊκής βλάβης να καθορίζει και την δράση που θα έχουν τα ουδετερόφιλα (Pizza, 2008). Τα µακροφάγα ενισχύουν την µυϊκή αναγέννηση αφού απελευθερώνουν συγκεκριµένες κυτοκίνες οι οποίες προάγουν τον πολλαπλασιασµό των µυοβλαστών (Hawke & Garry, 2001). Όπως και στην περίπτωση των ουδετερόφιλων όµως, έχει αναφερθεί ότι τα µακροφάγα εκκρίνουν και συγκεκριµένες κυτοκίνες οι οποίες αντί να ενισχύουν αναστέλλουν το πολλαπλασιασµό των µυοβλαστών (Hawke & Garry, 2001; Seale & Rudnicki, 2000). Συνεπώς, το ποιες κυτοκίνες απελευθερώνονται από τα µακροφάγα στην περιοχή της φλεγµονής, πιθανώς να καθορίζει και τον τελικό ρόλο των µακροφάγων στην αντιµετώπιση της φλεγµονής (Pizza, 2008). Επιπρόσθετα, ο πιο καθοριστικός παράγοντας για το ρυθµό της µυϊκής επιδιόρθωσης και αναγέννησης έπειτα από µυϊκή βλάβη ίσως να είναι ο χρόνος που µεσολαβεί µεταξύ της συσσώρευσης των µακροφάγων στην περιοχή της φλεγµονής και της αποµάκρυνσης τους (Pizza, 2008). 2.4 Η άσκηση ως παράγοντας καταπόνησης στους ηλικιωµένους και το οξειδωτικό στρες Για τη µελέτη του οξειδωτικού στρες σε ηλικιωµένους οι αναφορές στη βιβλιογραφία δεν είναι πολλές. Η θεωρία των δραστικών ειδών αναφορικά µε το γήρας προτείνει το σκεπτικό ότι η συσσώρευση της οξειδωτικής βλάβης που παρατηρείται στους ηλικιωµένους είναι αδιαίρετο και βασικό συστατικό της διαδικασίας της γήρανσης (Gianzi et al 2004). Η αυξηµένη παραγωγή δραστικών ειδών είναι ισχυρό ερέθισµα για την κινητοποίηση των αντιοξειδωτικών µηχανισµών. Η ανεπαρκής ανταπόκριση του οµοιοστατικού µηχανισµού στην συσσώρευση των δραστικών

24 15 ειδών στους ηλικιωµένους οδηγεί σε αύξηση της οξειδωτικής βλάβης των ιστών (Menocci et al. 2000). Η άσκηση έχει προταθεί επανειληµµένα ως παράγοντας καταπόνησης για την πρόκληση µετατόπισης της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας. Αυτό γίνεται κυρίως για δύο λόγους α) οι πιθανές διαφορές µεταξύ διαφόρων οργανισµών στην οξειδοαναγωγική οµοιοστασία ηρεµίας δεν είναι ευδιάκριτες και β) για να εκτιµηθεί η ευαισθησία των διαφόρων δεικτών στον προσδιορισµό των επιπέδων οξειδωτικού στρες (Nikolaidis et al. 2012a). 2.5 Συµπεράσµατα από την ανασκόπηση Από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας είναι εµφανές ότι οι παράγοντες που επηρεάζουν την οξειδοαναγωγική οµοιοστασία αποτελούν αντικείµενα µελέτης. Παρόλα αυτά όµως, υπάρχει διαφωνία στις απόψεις που αφορούν την επίδραση της γήρανσης στην οξειδοαναγωγική οµοιοστασία και στην προσαρµογή της άσκησης. Τα αίτια της επιστηµονικής αυτής διαφωνίας µπορεί να συµπεριλαµβάνουν µεταξύ άλλων διαφορές στο 1) µοντέλο άσκησης που έχουν χρησιµοποιηθεί, 2) την προπονητική κατάσταση των συµµετεχόντων, 3) τους δείκτες οξειδωτικού στρες που έχουν προσδιοριστεί και 4) το βιολογικό υλικό µέσα στο οποίο προσδιορίστηκαν οι δείκτες.. Συµπερασµατικά θα µπορούσε να λεχθεί ότι είναι αναγκαία η χρήση εγκεκριµένου και στανταρισµένου µοντέλου και χρήση δείγµατος σύγκρισης για να είναι δυνατή η εξαγωγή συµπερασµάτων.

25 16 3. Σκοπός της µελέτης Ο σκοπός της µελέτης ήταν να συγκριθούν οι αντιδράσεις νέων και ηλικιωµένων ατόµων στην έκκεντρη άσκηση από την οπτική γωνία της µυϊκής λειτουργίας και της οξειδοαναγωγικής οµοιοστασίας, συγκρίνοντας τις οµάδες στις διαφορετικές παραµέτρους µία προς µία. 3.1 Οριοθετήσεις και περιορισµοί της έρευνας Οι σηµαντικότεροι περιορισµοί της έρευνας ήταν οι εξής α) οι συµµετέχοντες ήταν µόνο άνδρες. β) οι µετρήσεις έγιναν σε χρονικά διαστήµατα πριν, µετά, σε 48 και σε 96 ώρες συνεπώς οποιεσδήποτε αλλαγές που ενδέχεται να συνέβησαν στο διάστηµα µεταξύ των µετρήσεων δεν µπόρεσαν να εντοπιστούν. Οι οριοθετήσεις της παρούσας διατριβής ήταν οι εξής: α) Στην έρευνα συµµετείχαν µόνο ενήλικες άνδρες, νοητικά ικανοί να δώσουν την συναίνεση τους για συµµετοχή στην έρευνα. β) Η διατήρηση σταθερών ανθρωποµετρικών χαρακτηριστικών των συµµετεχόντων κατά το τελευταίο έτος πριν τη διεξαγωγή του πειράµατος τουλάχιστο ήταν προϋπόθεση συµµετοχής. γ) Η αποχή για ένα πενθήµερο πριν από την έναρξη του πειράµατος από οποιαδήποτε εξαντλητική άσκηση. δ) Όλες οι µετρήσεις έγιναν από τον ίδιο ερευνητή κάτω από σταθερές συνθήκες (χώρος, θερµοκρασία, υγρασία, ώρα της ηµέρας). 3.2 Ερευνητικές υποθέσεις Οι ερευνητικές υποθέσεις της παρούσας µελέτης ήταν οι ακόλουθες: α) Υπάρχει διαφορά στη µυϊκή λειτουργία µετά από εκτέλεση έκκεντρης άσκησης µεταξύ νέων και ηλικιωµένων και β) Υπάρχει διαφορά µεταξύ της οξειδοαναγωγικής οµοιοστασίας, στους νέους και στους ηλικιωµένους κατά τη σύγκριση συγκεκριµένων παραµέτρων προσδιορισµού του οξειδωτικού στρες

26 17 4. Μεθοδολογία 4.1 είγµα Οκτώ νέοι άνδρες ηλικίας (20. 6 ± 0. 5) και οκτώ ηλικιωµένοι (64. 6 ± 1. 1) εκδήλωσαν οικειοθελώς ενδιαφέρον για τη συµµετοχή στην παρούσα µελέτη. Οι συµµετέχοντες αµφότερων των οµάδων προσκόµισαν υπογεγραµµένη άδεια του προσωπικού τους ιατρού προτού πάρουν µέρος στη µελέτη. Ανθρωποµετρικά χαρακτηριστικά: Ο κάθε συµµετέχων προσήλθε στο εργαστήριο το πρωί. Στη διάρκεια της πρώτης επίσκεψης µετρήθηκε το σωµατικό βάρος του συµµετέχοντα µε στρογγυλοποίηση προς το πλησιέστερο µισό κιλό (ζυγαριά BeamBalance 710; Seca, Birmingham, UK). Οι συµµετέχοντες ήταν ελαφρά ντυµένοι και ξυπόλυτοι. Το ύψος τους µετρήθηκε µε στρογγυλοποίηση προς το πλησιέστερο µισό εκατοστό. Το ποσοστό του σωµατικού λίπους (%) υπολογίστηκε από 7 σωµατικές πτυχές ( µέσος όρος δύο µετρήσεων της κάθε πτυχής ) χρησιµοποιώντας το παχύµετρο µέτρησης σωµατικών πτυχών Harpenden( John Bull, St. Albans, UK ) και µε βάση την εξίσωση Siri: όί ήό ήό έέ έέ ί Σχήµα 2. Εξίσωση Siri για τον προσδιορισµό του σωµατικού λίπους από 7 σωµατικές πτυχές Προϋπόθεση για τη συµµετοχή στη µελέτη ήταν η διατήρηση σταθερών ανθρωποµετρικών χαρακτηριστικών των συµµετεχόντων κατά το τελευταίο έτος πριν τη διεξαγωγή του πειράµατος τουλάχιστο. Ως σταθερό σωµατικό βάρος ενός ατόµου ορίστηκε η διακύµανση του κατά το τελευταίο χρόνο πριν τη συµµετοχή στη µελέτη µέσα στα όρια των ± 3 kg. Ο προσδιορισµός έγινε βάσει ερωτηµατολογίου που συµπληρώθηκε στην αρχή του πειράµατος. Συστήθηκε στους συµµετέχοντες να αναφέρουν άµεσα οποιαδήποτε παρενέργεια που οφειλόταν πιθανώς στην έκκεντρη άσκηση. Επίσης αποκλείστηκαν από τη µελέτη όσοι είχαν ιστορικό µυοσκελετικής

27 18 πάθησης τραυµατισµού των κάτω άκρων που θα µπορούσε να επηρεάσει την ικανότητα εκτέλεσης των ασκήσεων. Γραπτό ενηµερωτικό έντυπο συναίνεσης εγκεκριµένο από την Επιτροπή εοντολογίας συµπληρώθηκε πριν από την έναρξη της έρευνας από όλους τους συµµετέχοντες, αφού ενηµερώθηκαν για όλους τους πιθανούς κινδύνους και τα πλεονεκτήµατα του πειράµατος. Στους συµµετέχοντες συστήθηκε να απέχουν για ένα πενθήµερο πριν από την έναρξη του πειράµατος από οποιαδήποτε εξαντλητική άσκηση ( εκτός από τις ασκήσεις που εκτελέστηκαν στη διάρκεια του πειράµατος ). Επίσης συστήθηκε στους συµµετέχοντες να µην λαµβάνουν στη διάρκεια της µελέτης κανένα αντιφλεγµονώδες η αναλγητικό φάρµακο και δόθηκαν συµπληρωµατικές οδηγίες για την καταγραφή όλων των δραστηριοτήτων του ελεύθερου χρόνου τους (π. χ. βάδισµα, ποδηλασία, χορός) µέσω βαθµολογηµένου ερωτηµατολογίου (Warehametal., 2003). Τέλος ζητήθηκε από τους συµµετέχοντες κατά τη διάρκεια λήψης αναµνηστικού να θυµηθούν εάν στη διάρκεια των έξι µηνών που προηγήθηκαν συµµετείχαν σε οποιαδήποτε ασυνήθιστη η/και βαριά σωµατική άσκηση. Άτοµα που ανέφεραν συµµετοχή σε τέτοια άσκηση αποκλείστηκαν από το πείραµα. 4.2 Πειραµατικός σχεδιασµός Ο κάθε συµµετέχων εξοικειώθηκε µε την διαδικασία του πειράµατος τουλάχιστο 5 ηµέρες πριν από την έναρξη εκτελώντας 8 10 ισοκινητικές έκκεντρες συσπάσεις µε τους εκτείνοντες του γονάτου του κυρίαρχου ποδιού. Οι συσπάσεις ήταν πολύ χαµηλής έντασης έτσι ώστε να µην προκληθεί µυϊκή βλάβη, περιορισµός του εύρους κίνησης (ROM) η καθυστερηµένη εµφάνιση µυϊκού πόνου (DOMS) Ισοκινητικό πρωτόκολλο Το ισοκινητικό δυναµόµετρο Cybex Norm (Cybex, Ronkonkoma, NY) σταθµίστηκε σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πριν από την εκτέλεση της άσκησης προηγήθηκε προθέρµανση που συνίστατο από 8 λεπτά κυκλοεργόµετρο ( 70 σ. α. λ. και 50 W ισχύ ) και 5 λεπτά απλές εκτάσεις των κυρίων µυϊκών οµάδων των κάτω άκρων. Οι συµµετέχοντες στο πείραµα εκτέλεσαν την άσκηση σε καθισµένη θέση, µε γωνία ισχίου 120 και µε τον έξω κόνδυλο του µηριαίου ευθυγραµµισµένο µε τον άξονα περιστροφής του δυναµόµετρου. Η κνήµη του ποδιού προσδέθηκε στο δυναµόµετρο µε πόρπη

28 19 κεντρικά του έξω σφυρού. Η θέση του κάθε συµµετέχοντα καταγράφηκε και χρησιµοποιήθηκε στις µετέπειτα µετρήσεις. Έγιναν οι απαιτούµενες διορθώσεις ως προς την επίδραση του βάρους του περιστρεφόµενου τµήµατος του ποδιού πάνω στις µετρήσεις της ροπής. Το πρωτόκολλο άσκησης αποτελέστηκε από 5 σύνολα των 8 µέγιστων εκούσιων έκκεντρων συσπάσεων (MVC) µε εύρος κίνησης από 0 o πλήρης έκταση έως 90 o κάµψη και µε γωνιακή ταχύτητα 60 o Μεταξύ του κάθε σετ συσπάσεων µεσολάβησε διάστηµα ανάπαυσης 2 λεπτών. Η καταγραφή της διάρκειας και της έντασης της έκκεντρης σύσπασης έγινε αυτόµατα από το δυναµόµετρο που χρησιµοποιήθηκε και για τη µέτρηση της µέγιστης ισοµετρικής ροπής Μυϊκή λειτουργία και επιδόσεις Το ισοκινητικό δυναµόµετρο χρησιµοποιήθηκε για τη µέτρηση της µέγιστης ισοµετρικής ροπής των εκτείνοντων του γονάτου στη γωνία κάµψης των 90 o. Ο µέσος όρος των 3 καλυτέρων µεγίστων εκουσίων συσπάσεων του κυρίαρχου ποδιού καταγράφηκε. Για να επιβεβαιωθεί ότι οι συµµετέχοντες εκτέλεσαν τη µέγιστη προσπάθεια οι µετρήσεις επαναλαµβανόταν εφ όσον η διαφορά µεταξύ της µεγαλύτερης και της µικρότερης τιµής ξεπερνούσε το 10%. Η εκτίµηση του εύρους κίνησης (ROM) έγινε χειρωνακτικά µετακινώντας τη κνήµη µε πολύ χαµηλή γωνιακή ταχύτητα από τη θέση 0 µέχρι τη θέση όπου εκδηλωνόταν πόνος. Ο κάθε συµµετέχων εκτίµησε την εµφάνιση του καθυστερηµένου µυϊκού πόνου (DOMS) κατά τη διάρκεια ηµικαθίσµατος έως τη γωνία του γονάτου των 90 o και ο αντιλαµβανόµενος πόνος εκτιµήθηκε µε βάση τη κλίµακα από το 1 ( κανονικό ) έως το 10 (πάρα πολύ µεγάλος πόνος ).

29 ιαδικασία αιµοληψίας Πριν από κάθε άσκηση και εντός 2 λεπτών µετά τη συµπλήρωση της άσκησης συλλέχθηκε δείγµα αίµατος από τη κεφαλική φλέβα. Μέρος του αίµατος που συλλέχθηκε σε φιαλίδιο µε αντιπηκτικό (EDTA) και τοποθετήθηκε άµεσα στον πάγο για τον προσδιορισµό αργότερα του αιµατοκρίτη και της αιµοσφαιρίνης. Το υπόλοιπο του συλλεχθέντος αίµατος φυγοκεντρήθηκε στα 1370 g για 10 λεπτά στη θερµοκρασία των 4 C και έπειτα συλλέχθηκε το πλάσµα. Το συµπύκνωµα των ερυθροκυττάρων αιµολύθηκε µε ίση ποσότητα 1:1 (v/v) απεσταγµένου νερού, ανακινήθηκαν ζωηρά και φυγοκεντρήθηκαν στα 4,000 g για 15 λεπτά στους 4 C. Τα δείγµατα ερυθροκυττάρων καταψύχθηκαν και συντηρήθηκαν στους 80 C έτσι ώστε να αποψυχθούν µόνο µία φορά πριν την ανάλυσή τους. 4.3 Οξειδοαναγωγική οµοιοστασία είκτες οξειδωτικών τροποποιήσεων Πρωτεϊνικά καρβονύλια Τα πρωτεϊνικά καρβονύλια προσδιορίστηκαν αναµιγνύοντας 20 µl αιµολύµατος µε 500 µl 10 mm DNPH (2,4-dinitrophenylhydrazine σε 2. 5 N HCL). Ακολούθησε επώαση για 1 h και φυγοκέντρηση στα 15,000g για 5 min. Στο ίζηµα προστέθηκε 1 ml 10% TCA και φυγοκεντρήθηκε στα 15,000g για 5 min. Έπειτα προστέθηκε στο ίζηµα 1 ml αιθανόλη αιθυλοξικό οξύ και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 15,000 g για 5 min. Στο ίζηµα προστέθηκε1 ml 5 M ουρία (ph 2. 3), έγινε επώαση για 15 min, ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 15,000g για 3 λεπτά και η απορρόφηση µετρήθηκε στο φασµατοφωτόµετρο στα 375 nm. Κρεατινική κινάση Ο προσδιορισµός του ενζύµου της Κρεατινικής κινάσης έγινε φασµατοφωτοµετρικά χρησιµοποιώντας έτοιµο σετ ανάλυσης από την Spinreact (SantEsteve, Spain).

30 21 Γλουταθειόνη ( GSH ) Η γλουταθειόνη προσδιορίστηκε λαµβάνοντας 20 µl αιµολυθέντων ερυθροκυττάρων στο οποίο προστέθηκε 5% TCA αναµιγµένο µε 660 µl διαλύµατος 67 mm φωσφορικού νατρίου και καλίου (ph 8. 0) και 330 µl διαλύµατος 1 mm 5,5 - dithiobis -2 nitrobenzoate. Τα δείγµατα ακολούθως επωάστηκαν στο σκοτάδι σε θερµοκρασία δωµατίου για 45 λεπτά, και η απορρόφηση µετρήθηκε στο φασµατοφωτόµετρο στα 412 nm. Ο συντελεστής διακύµανσης για τη δοκιµή ήταν 4. 2%. 5. Αποτελέσµατα 5.1 Στατιστική ανάλυση Η κατανοµή όλων των εξαρτηµένων µεταβλητών διερευνήθηκε µε το τεστ Shapiro-Wilk και δεν βρέθηκε να διαφέρει σηµαντικά από την κανονική κατανοµή. Για την ανάλυση των αποτελεσµάτων των µετρήσεων της ισοµετρικής ροπής, της γλουταθειόνης και των πρωτεϊνικών καρβονυλίων χρησιµοποιήθηκε ανάλυση διακύµανσης ενός παράγοντα ANOVA [ οµάδα ( νέοι και ηλικιωµένοι ) χρόνος ( πριν, αµέσως µετά, 48 ώρες µετά την άσκηση, και 96 ώρες µετά την άσκηση ) ] µε επαναλαµβανόµενες µετρήσεις στο χρόνο. Για την ανάλυση των αποτελεσµάτων των µετρήσεων της κρεατινικής κινάσης χρησιµοποιήθηκε ανάλυση διακύµανσης ενός παράγοντα ANOVA[ οµάδα ( νέοι και ηλικιωµένοι ) χρόνος ( πριν, 48 ώρες µετά την άσκηση, και 96 ώρες µετά την άσκηση ) ]. Αντί της post-hoc ανάλυσης διενεργήθηκαν ξεχωριστά t test µεταξύ των αποτελεσµάτων των µετρήσεων (πριν - αµέσως µετά, πριν - 48 ώρες µετά την άσκηση, πριν - 96 ώρες µετά την άσκηση ) και επίσης για τις αντίστοιχες µετρήσεις διενεργήθηκαν ξεχωριστά t test µεταξύ των οµάδων ( πριν νέοι πριν ηλικιωµένοι, µετά νέοι µετά ηλικιωµένοι, 48 ώρες µετά νέοι 48 ώρες µετά ηλικιωµένοι, 96 ώρες µετά νέοι 96 ώρες µετά ηλικιωµένοι ). Το επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας ορίστηκε στο α = Το στατιστικό πακέτο SPSS έκδοση 20 χρησιµοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις (SPSS Inc., USA). 5.2 Ανθρωποµετρικά χαρακτηριστικά και διατροφή Όλα τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά διέφεραν σηµαντικά µεταξύ των δύο ηλικιακών οµάδων. Η ηµερήσια πρόσληψη ενέργειας µέσω της τροφής ήταν υψηλότερη στην οµάδα των νέων ενώ δεν υπήρχαν µεγάλες διαφορές στα υπόλοιπα διατροφικά χαρακτηριστικά ούτε και στη πρόσληψη αντιοξειδωτικών ουσιών.

31 Μυϊκή λειτουργία και µυϊκή βλάβη Η ισοµετρική ροπή της οµάδας των ηλικιωµένων ήταν µικρότερη σε σύγκριση µε την οµάδα των νέων σε όλες τις µετρήσεις (P <.05). Η ισοµετρική ροπή µειωνόταν µέχρι τις 48ώρες (3 η µέτρηση) στους νέους. Στους ηλικιωµένους άρχισε να αυξάνεται από την 3 η µέτρηση και µετέπειτα. Ροπή ισοµετρικής έκκεντρης σύσπασης νέοι ηλικ νέοι ηλικ νέοι ηλικ νέοι ηλικ Σχήµα 3. Μέγιστη ισοµετρική ροπή κατά την έκκεντρη σύσπαση στην οµάδα νέων και στην οµάδα ηλικιωµένων.

32 23 Σχήµα 4. Στις καµπύλες των ροπών της οµάδας των ηλικιωµένων φαίνεται η σχετικά µικρή διακύµανση µεταξύ των επιδόσεων των συµµετεχόντων. Η µικρή σχετικά διακύµανση πιθανώς οφείλεται στη σαρκοπενία που εµφανίζει αυτή η ηλικιακή οµάδα. Αυτό πιθανώς έχει ως αποτέλεσµα να έχουν παραπλήσιες µυϊκές µάζες και συνεπώς παραπλήσιες επιδώσεις στις µετρήσεις ροπής Ροπή ισοµετρικής έκκεντρης σύσπασης έ Σχήµα 5. Στις καµπύλες των ροπών της οµάδας των νέων φαίνεται η σχετικά µεγάλη διακύµανση µεταξύ των επιδόσεων των συµµετεχόντων. Η τυπική απόκλιση στους νέους ήταν περίπου έξι φορές µεγαλύτερη απ ότι στους ηλικιωµένους

33 24 Η διαφορά µεταξύ της αλληλεπίδρασης των παραγόντων (οµάδα χρόνος εκτέλεσης) στους νέους και στους ηλικιωµένους ήταν επίσης σηµαντική Ρ < Οξειδοαναγωγική οµοιοστασία είκτης οξειδωτικής βλάβης των πρωτεϊνών Το επίπεδο των πρωτεϊνικών καρβονυλίων στο πλάσµα σε κατάσταση ηρεµίας πριν την έναρξη του πειράµατος ήταν υψηλότερο στην οµάδα των ηλικιωµένων σε σύγκριση µε την οµάδα των νέων. Η παρατηρούµενη αυξηµένη οξείδωση των πρωτεϊνών του πλάσµατος στους ηλικιωµένους µπορεί να είναι αποτέλεσµα αυξηµένης παραγωγής πρωτεϊνικών καρβονυλίων ή και µειωµένης αποδόµησης των οξειδωµένων πρωτεϊνών του πλάσµατος. Πρωτεϊνικά καρβονύλια του πλάσµατος (nmol/mg pr. ) νέοι ηλικ νέοι ηλικ νέοι ηλικ νέοι ηλικ Σχήµα 6. Στο γράφηµα των πρωτεϊνικών καρβονυλίων φαίνεται ότι στην πειραµατική οµάδα (ηλικιωµένοι) τα επίπεδα είναι υψηλότερα κατά τη διάρκεια της ηρεµίας απ ότι στην οµάδα ελέγχου (νέοι). εν βρέθηκαν όµως σηµαντικές διαφορές στις επόµενες συγκριτικές µετρήσεις

34 25 Γλουταθειόνη Τα επίπεδα της γλουταθειόνης στα ερυθροκύτταρα των ηλικιωµένων ήταν στατιστικά χαµηλότερα σε σύγκριση µε την οµάδα των νέων. Η γλουταθειόνη είναι ένας από τους κύριους και τους πιο συχνά απαντώµενους µη πρωτεϊνικούς οξειδοαναγωγικούς ρυθµιστές των κυττάρων που αντιδρά in vitro µε σχεδόν όλα τα δραστικά είδη (Halliwell & Gutteridge 2007). Η υψηλή συγκέντρωση της γλουταθειόνης στα ερυθροκύτταρα κάνει δυνατή την εξουδετέρωση των δραστικών ειδών in vivo (Halliwell & Gutteridge 2007). Τα χαµηλότερα επίπεδα γλουταθειόνης στους ηλικιωµένους µπορεί εν µέρει να οφείλονται στη χρήση της για την εξουδετέρωση των δραστικών ειδών και την κατανάλωσή της για την επανασύνθεση του ασκορβικού οξέως και της α τοκοφερόλης Halliwell & Gutteridge 2007). Λαµβάνοντας υπ όψιν ότι το ήπαρ είναι ο βασικός προµηθευτής της GSH στην κυκλοφορία (Deneke & Fanburg 1989), τα χαµηλότερα επίπεδα της γλουταθειόνης στην οµάδα των ηλικιωµένων µπορεί επίσης να σηµαίνουν ότι η παροχή της ηπατικής γλουταθειόνης δεν αρκεί για τη κάλυψη των αυξηµένων αναγκών και έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της συγκέντρωσης της γλουταθειόνης στα ερυθροκύτταρα. GSH (µmol/g Hb) (ερυθροκύτταρα) νέοι ηλικ νέοι ηλικ νέοι ηλικ νέοι ηλικ Σχήµα 7. Στο γράφηµα των επιπέδων γλουταθειόνης φαίνεται ότι στην πειραµατική οµάδα (ηλικιωµένοι) τα επίπεδα είναι χαµηλότερα κατά τη διάρκεια της ηρεµίας απ ότι στην οµάδα ελέγχου (νέοι). Οι διαφορές ήταν µεγαλύτερες µόνο στη σύγκριση µεταξύ της µέτρησης στους