ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΛΙΚΗΣ ΥΔΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΣΤΟ ΠΑΡΘΕΝΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ ΤΩΝ ΑΠΑΙΤΗΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΚ 432/212 «ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗ ΘΕΣΠΙΣΗ ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ ΕΠΙΤΡΕΠΟΜΕΝΩΝ ΙΣΧΥΡΙΣΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ» ΜΑΣΤΡΑΛΕΞΗ ΑΣΠΑ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΥΠΕΎΘΥΝΗ: ΚΑΘ. Μ. ΤΣΙΜΙΔΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 213

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΛΙΚΗΣ ΥΔΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΣΤΟ ΠΑΡΘΕΝΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ ΤΩΝ ΑΠΑΙΤΗΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΚ 432/212 «ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗ ΘΕΣΠΙΣΗ ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ ΕΠΙΤΡΕΠΟΜΕΝΩΝ ΙΣΧΥΡΙΣΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ» ΜΑΣΤΡΑΛΕΞΗ ΑΣΠΑ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΥΠΕΎΘΥΝΗ: ΚΑΘ. Μ. ΤΣΙΜΙΔΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 213

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΑΣΤΡΑΛΕΞΗ ΑΣΠΑ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΛΙΚΗΣ ΥΔΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΣΤΟ ΠΑΡΘΕΝΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ ΤΩΝ ΑΠΑΙΤΗΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΚ 432/212 «ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗ ΘΕΣΠΙΣΗ ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ ΕΠΙΤΡΕΠΟΜΕΝΩΝ ΙΣΧΥΡΙΣΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ» εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τομέα Χημικής Τεχνολογίας και Βιομηχανικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια ΜΑΡΙΑ ΤΣΙΜΙΔΟΥ - Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Αναπλ. Καθηγητής ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΜΠΛΕΚΑΣ - Μέλος εξεταστικής επιτροπής Λέκτορας ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΕΝΑΔΗΣ- Μέλος εξεταστικής επιτροπής Η τριμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε σύμφωνα με τη Γ.Σ.Ε.Σ. 254/ , για τη κρίση της Διπλωματικής Εργασίας της Μαστραλέξη Ασπασίας, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την 27/5/213, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της εργασίας με τίτλο ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΛΙΚΗΣ ΥΔΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΣΤΟ ΠΑΡΘΕΝΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ ΤΩΝ ΑΠΑΙΤΗΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΚ 432/212 «ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗ ΘΕΣΠΙΣΗ ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ ΕΠΙΤΡΕΠΟΜΕΝΩΝ ΙΣΧΥΡΙΣΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ» και την ενέκρινε με βαθμό 9,5.

4 Στα αγαπημένα μου πρόσωπα που με στηρίζουν και με ενθαρρύνουν

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στη Χημεία και Τεχνολογία Τροφίμων, στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κατά το χρονικό διάστημα Σεπτέμβριος 212 Μάιος 213. Θέλω να ευχαριστήσω βαθύτατα την καθηγήτρια κα Τσιμίδου Μαρία, επιβλέπουσα καθηγήτρια, που μου εμπιστεύτηκε το παρόν θέμα και την ευκαιρία που μου έδωσε να συνεργαστώ μαζί της. Η επιστημονική της καθοδήγηση και οι εύστοχες υποδείξεις της καθ όλη τη διάρκεια της διεξαγωγής της μελέτης συνέβαλαν καθοριστικά στο τελικό αποτέλεσμα της παρούσας εργασίας. Επίσης θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τις πολύτιμες συμβουλές της όχι μόνο σε επιστημονικό αλλά και σε προσωπικό επίπεδο. Ευχαριστώ ακόμα, τα μέλη της τριμελούς επιτροπής: κ. Γ. Μπλέκα, Αναπληρωτή Καθηγητή και κ. Ν. Νενάδη, Λέκτορα, για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους κατά τη διόρθωση της διπλωματικής εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω όλο το επιστημονικό προσωπικό του εργαστηριού για τις γνώσεις που μου μετέδωσαν στο πρώτο έτος των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Ευχαριστώ ακόμα, όλους τους συναδέλφους, μεταπτυχιακούς και διδάκτορες του εργαστηρίου, για τη φιλική ατμόσφαιρα και το συναδελφικό πνεύμα που επικρατούσε στο εργαστήριο. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τις υποψήφιες διδακτόρισσες Κυριακούδη Αναστασία και Λάλου Σοφία αλλά και τον λέκτορα Νενάδη Νίκο για τη βοήθειά τους σε θέματα τεχνογνωσίας αλλά και για τη φιλία τους. Τέλος ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου, που αποτελεί την κινητήριο δύναμή μου, για την ηθική και υλική υποστήριξή της όλα αυτά τα χρόνια των σπουδών μου. Άσπα Μαστραλέξη Θεσσαλονίκη 213

6 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ορισμός παρθένου ελαιολάδου Εμπορικές βρώσιμες κατηγορίες παρθένου ελαιολάδου Κριτήρια ποιότητας και γνησιότητας για την κατάταξη του παρθένου ελαιολάδου σε εμπορικές κατηγορίες στην Ευρωπαική Ένωση Χημική σύσταση παρθένου ελαιολάδου Φαινολικά συστατικά του παρθένου ελαιολάδου Χημική σύσταση του υδατομεθανολικού εκχυλίσματος του παρθένου ελαιολάδου Παραλαβή, διαχωρισμός και ταυτοποίηση των φαινολικών ενώσεων του παρθένου ελαιολάδου Παραλαβή πολικού κλάσματος Προσδιορισμός ολικών φαινολών Χρωματομετρικός προσδιορισμός Φθορισμομετρικός προσδιορισμός Τεχνικές διαχωρισμού φαινολικών συστατικών Η αντίστροφης φάσης υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (RP-HPLC) Συστήματα ανίχνευσης,καιδιαδικασίες ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού φαινολικών ενώσεων μετά το διαχωρισμό Συστήματα ανίχνευσης φαινολικών ενώσεων Διαδικασίες ταυτοποίησης των φαινολικών ενώσεων Διαδικασίες ποσοτικού προσδιορισμού των φαινολικών ενώσεων Απλοποίηση του χρωματογραφικού προφίλ μετά από όξινη ή αλκαλική κατεργασία του πολικού κλάσματος Ανάκτηση της υδροξυτυροσόλης από δεσμευμένες μορφές μετά από όξινη υδρόλυση Περιεκτηκότητα Ισπανικών, Ιταλικών, Ελληνικών και Πορτογαλικών ελαιολάδων σε ολικές φαινόλες Ισχυρισμοί υγείας για τις φαινόλες του παρθένου ελαιολάδου ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά και όργανα Δείγματα

7 Περιεχόμενα Πρότυπες ενώσεις Διαλύτες και χρωματογραφικά υλικά Συσκευές Όργανα Μέθοδοι Παραλαβή πολικού φαινολικού κλάσματος Χρωματομετρικός προσδιορισμός ολικών φαινολών στο πολικό κλάσμα (Singleton et al.,1999) Κατασκευή καμπύλης αναφοράς Ποσοτική εκτίμηση ολικών φαινολών στο πολικό κλάσμα (Ανδρουλάκη 25) Υδρόλυση πολικού κλάσματος Υδρόλυση παρθένου ελαιολάδου ( Romero & Brenes 212) Εφαρμογή της διαδικασίας υδρόλυσης σε διάλυμα πρότυπης υδροξυτυροσόλης, τυροσόλης και ελαιοευρωπαΐνης Υγροχρωματογραφικός προσδιορισμός φαινολικών συστατικών στο πολικό κλάσμα Ποσοτικός προσδιορισμός της υδροξυτυροσόλης, τυροσόλης και της ελαιοευρωπαΐνης Επικύρωση μεθόδου Επικύρωση μεθόδου Η επικύρωση της μεθόδου περιλάμβανε προσδιορισμό των ορίων ανίχνευσης και μελέτη της inter- και intraday επαναληψιμότητας τηςυδρόλυσης: Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πειραματικός σχεδιασμός Έλεγχος χημικής σταθερότητας της υδροξυτυροσόλης κάτω από τις συνθήκες της όξινης υδρόλυσης με διάλυμα H 2 SO 4 1Μ Όπως προκύπτει και από τα παρακάτω χρωματογραφήματα διαλύματος πρότυπης υδροξυτυροσόλης, αυτή παραμένει σταθερή πριν και μετά την όξινη υδρόλυση Έλεγχος χημικής σταθερότητας της τυροσόλης στις συνθήκες τις όξινης υδρόλυσης με διάλυμα H 2 SO 4 1Μ Έλεγχος του βαθμού υδρόλυσης της ελαιοευρωπαΐνης (διάσπαση του εστέρα) και αξιολόγηση της ποσότητας της υδροξυτυροσόλης που απελευθερώνεται στις συνθήκες όξινης υδρόλυσης με διάλυμα H 2 SO 4 1Μ Εφαρμογή της επιλεγείσας νης διαδικασίας παραλαβής πολικού κλάσματος από δείγματα διαφορετικών ποικιλιών παρθένου ελαιολάδου και της υδρόλυσης των πολικών τους κλασμάτων για την αξιολόγηση της περιεκτηκότητάς τους σε ολική υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη Επιλογή δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου Παραλαβή πολικού κλάσματος δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου

8 Περιεχόμενα Υδρόλυση πολικού κλάσματος δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου Υδρόλυση των δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Romero και Brenes (212) Επικύρωση της μεθόδου ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

9 Ευρετήρια Ευρετήριο Πινάκων Πίνακας Σελ. 1.1 Φαινολικές ενώσεις στο Παρθένο Ελαιόλαδο (Tsimidou, 213) Χημική δομή φαινολικών ενώσεων του παρθένου ελαιολάδου Σεκοϊριδοειδείς ενώσεις και παράγωγά τους στο παρθένο ελαιολάδο Χαρακτηρισμός κορυφών πολικού κλάσματος εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου στα 28 nm Κύρια αποπρωτονιωμένα μοριακά ιόντα των φαινολικών ενώσεων και θραύσματά τους ( De la Torre-Carbot et al.,25) Εκατοστιαία ανάκτηση της υδροξυτυροσόλης από δοκιμές σταθερής προσθήκης ελαιοευρωπαΐνης (Mulinacci et al., Συγκέντρωση ολικών φαινολών σε Ισπανικά παρθένα ελαιόλαδα Συγκέντρωση ολικών φαινολών σε Ιταλικά παρθένα ελαιόλαδα Συγκέντρωση ολικών φαινολών σε Ελληνικά παρθένα ελαιόλαδα Περιεκτηκότητα σε ολικές φαινόλες δειγμάτων παρθένου ελαιολάδου πριν και μετά το φιλτράρισμα (Tsimidou et al., 25) Συγκέντρωση ολικών φαινολών σε πορτογαλικά παρθένα ελαιόλαδα Σύστημα έκλουσης φαινολικών συστατικών υδατομεθανολικού εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου Σύστημα έκλουσης πρότυπης υδροξυτυροσόλης και τυροσόλης Σύστημα έκλουσης πρότυπης ελαιοευρωπαΐνης Συγκέντρωση ΟΗ- Tyr πριν και μετά την όξινη υδρόλυση, και ποσοστό μεταβολής της μετά από υγροχρωματογραφική ανάλυση 5

10 Ευρετήρια 3.2 Συγκέντρωση Tyr πριν και μετά την όξινη υδρόλυση και ποσοστό μεταβολής της μετά από υγροχρωματογραφική ανάλυση Συγκέντρωση ελαιοευρωπαΐνης, σε ppm, πριν την όξινη υδρόλυσή της και συγκέντρωση της υδροξυτυροσόλης που προκύπτει λόγω της υδρόλυσής της Συγκέντρωση ελαιοευρωπαΐνης σε mmols/l πριν την όξινη υδρόλυσή της και συγκέντρωση της υδροξυτυροσόλης που προκύπτει μετά την υδρόλυση Συγκέντρωση ολικών φαινολών στα δείγματα παρθένου ελαιολάδου Ελληνικής προέλευσης Συγκέντρωση ολικών φαινολών στα δείγματα παρθένου ελαιολάδου Τυνησιακής προέλευσης Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr πριν και μετά τη όξινη υδρόλυση στα δείγματα των Τυνησιακών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένα με βάση την πρότυπη καμπύλη της υδροξυτυροσόλης Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr πριν και μετά τη όξινη υδρόλυση στα δείγματα των Τυνησιακών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένα με βάση την πρότυπη καμπύλη της τυροσόλης Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr πριν και μετά τη όξινη υδρόλυση στα δείγματα των Ελληνικών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένα με βάση την πρότυπη καμπύλη της υδροξυτυροσόλης Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr πριν και μετά τη όξινη υδρόλυση στα δείγματα των Τυνησιακών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένα με βάση την πρότυπη καμπύλη της τυροσόλης Περιεκτικότητα σε συνολική OH-Tyr και Tyr των επιλεχθέντων παρθένων ελαιολάδων Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr μετά τη όξινη υδρόλυση με διάλυμα HCl και H 2 SO 4 στα δείγματα των Τυνησιακών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένη με βάση την πρότυπη καμπύλη της υδροξυτυροσόλης Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr μετά τη όξινη υδρόλυση με διάλυμα HCl και H 2 SO 4 στα δείγματα των Τυνησιακών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένη με βάση την πρότυπη καμπύλη της τυροσόλης 71

11 Ευρετήρια 3.14 Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr μετά τη όξινη υδρόλυση με διάλυμα HCl και H 2 SO 4 στα δείγματα των Ελληνικών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένη με βάση την πρότυπη καμπύλη της τυροσόλης Συγκέντρωση ΟΗ-Tyr και Τyr μετά τη όξινη υδρόλυση με HCl και H 2 SO 4 στα δείγματα των Ελληνικών παρθένων ελαιολάδων υπολογισμένη με βάση την πρότυπη καμπύλη της τυροσόλης Συγκέντρωση ΟH-Tyr και Tyr μετά από όξινη υδρόλυση με διάλυμα HCl μετά από 6 και 12 h Συγκέντρωση ΟH-Tyr και Tyr μετά από όξινη υδρόλυση με διάλυμα HCl μετά από 6 και 12 h 73

12 Ευρετήρια Ευρετήριο Σχημάτων Σχήμα Σελ. 1.1 HPLC Χρωματογράφημα πολικού κλάσματος εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου στα 28 nm (COI/T.2/Doc No 29 November 29) α. HPLC Χρωματογράφημα μεθανολικού εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου πριν την όξινη ή αλκαλική υδρόλυση ( Owen et al., 2) β. HPLC Χρωματογράφημα μεθανολικού εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου πριν την όξινη υδρόλυση ( Owen et al., 2) γ. HPLC Χρωματογράφημα μεθανολικού εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου μετά την αλκαλική υδρόλυση ( Owen et al., 2) Καμπύλη αναφοράς καφεϊκού οξέος (Μέθοδος Folin-Ciocalteu) HPLC Χρωματογράφημα στα 28 mn με ανιχνευτή DAD διαλύματος πρότυπης υδροξυτυροσόλης πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα με ανιχνευτή φθορισμού διαλύματος υδροξυτυροσόλης πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα στα 28 mn με ανιχνευτή DAD διαλύματος πρότυπης τυροσόλης πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα με ανιχνευτή φθορισμού διαλύματος τυροσόλης πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα στα 28 mn με ανιχνευτή DAD διαλύματος πρότυπης ελαιοευρωπαΐνης πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου Zerrari Douirat (2) στα 28 nm πριν την όξινη υδρόλυση. 61

13 Ευρετήρια 3.7 HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου Zerrari Douirat (2) στα 28 nm μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου Zerrari Douirat (2) στα 28 nm πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου Zerrari Douirat (2) με ανιχνευτή φθορισμού πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος βιολογικού παρθένου ελαιολάδου στα 28 nm πριν την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος βιολογικού παρθένου ελαιολάδου με ανιχνευτή φθορισμού πριν την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος βιολογικού παρθένου ελαιολάδου στα 28 nm πριν και μετά την όξινη υδρόλυση HPLC Χρωματογράφημα εκχυλίσματος βιολογικού παρθένου ελαιολάδου με ανιχνευτή φθορισμού πριν και μετά την όξινη υδρόλυση. 65

14 Εισαγωγή ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ελαιόλαδο είναι ένα προϊόν υψηλής διατροφικής αξίας με ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά που το ξεχωρίζουν από τις υπόλοιπες φυτικές λιπαρές ύλες. Τα ιδιαίτερα οργανοληπτικά και θρεπτικά χαρακτηριστικά σε συνδυασμό με το κόστος παραγωγής του, μετατρέπουν την εμπορία ελαιολάδου σε ένα ανταγωνιστικό και κερδοφόρο εμπορικό τομέα που διέπεται από αυστηρούς κανόνες εμπορίας και επισήμανσης. Στη συσκευασία των ελαιολάδων που διακινούνται στο λιανικό εμπόριο μπορεί να αναγράφεται πέρα των υποχρεωτικών ενδείξεων και οποιαδήποτε άλλη πληροφορία υπό την προϋπόθεση ότι μπορεί να τεκμηριωθεί αντικειμενικά. Με άλλα λόγια η αναγραφή μιας φυσικοχημικής ιδιότητας ή της παρουσίας μιας κατηγορίας ενώσεων πρέπει να βασίζεται στα αποτελέσματα αναλυτικής μεθόδου εγκεκριμένης από διεθνή φορέα ή επικυρωμένης διεργαστηριακά. Μια νέα τάση στον τομέα της επισήμανσης των τροφίμων αποτελεί η διαφήμισή τους με ισχυρισμούς διατροφής και υγείας. Ως ισχυρισμός υγείας χαρακτηρίζεται εκείνος που «δηλώνει, υπονοεί ή οδηγεί στο συμπέρασμα ότι υπάρχει σχέση μεταξύ κατηγορίας τροφίμων, τροφίμου ή συστατικού του και της υγείας» ((ΕΚ) αριθ. 1924/26 της 2ής Δεκεμβρίου 26). Απαραίτητη προϋπόθεση για την αναγραφή τέτοιου είδους ισχυρισμών είναι να είναι κατανοητοί από τους καταναλωτές ώστε να μην παραπλανούν και να μπορούν να τεκμηριωθούν επιστημονικά. Οι επιχειρήσεις τροφίμων που επιθυμούν να διαφημίσουν τα προϊόντα τους με ισχυρισμούς υγείας θα πρέπει να είναι σε θέση να τους αιτιολογούν. Συγκεκριμένα για το παρθένο ελαιόλαδο ο ισχυρισμός υγείας που μπορεί να το συνοδεύει αναφέρεται στην ικανότητα μιας κατηγορίας ενώσεών του, αυτής των φαινολικών ενώσεων, να προστατεύουν τα λιπίδια του αίματος από το οξειδωτικό στρες. Ο ισχυρισμός αυτός μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο αν το παρθένο ελαιόλαδο «περιέχει τουλάχιστον 5 mg υδροξυτυροσόλης και παραγώγων της (σύμπλοκο ελαιοευρωπαΐνης και τυροσόλης) ανά 2 g παρθένου ελαιολάδου». Επίσημα επικυρωμένη μέθοδος για την επαλήθευση ενός τέτοιου ισχυρισμού σε δείγμα παρθένου ελαιολάδου δεν έχει αναφερθεί. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας ποσοτικού προσδιορισμού της συνολικής ελεύθερης και δεσμευμένης μορφής τόσο της υδροξυτυροσόλης όσο και της τυροσόλης η οποία θα παρέχει εύκολα, γρήγορα και οικονομικά την πληροφορία για τα επίπεδα των δύο αυτών κύριων φαινολικών ενώσεων σε δείγμα παρθένου ελαιολάδου ώστε να αποτελέσει ένα πολύτιμο εργαλείο για τις εταιρείες παραλαβής και τυποποίησης του ελαιολάδου. Έτσι ο τυποποιητής θα μπορεί να διαφημίσει το περιεχόμενο του προϊόντος του σε φαινόλες στην ετικέτα του και με ισχυρισμό υγείας.

15 Εισαγωγή Συγκεκριμένα, με μια τέτοια μεθοδολογία θα ελέγχεται αν το εκάστοτε υπό εξέταση δείγμα παρθένου ελαιολάδου επιτρέπεται να φέρει ισχυρισμό υγείας. Μετά την ανάπτυξη της μεθοδολογίας μπορεί να αποβεί απαραίτητο να επανεξεταστεί το όριο των τουλάχιστον 5 mg υδροξυτυροσόλης (και παραγώγων της) ανά 2 g ελαιολάδου που ισχύει σήμερα Για τις ανάγκες του πειράματος χρησιμοποιήθηκε η υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης σε σύνδεση εν σειρά με ανιχνευτές συστοιχίας διόδων λυχνιών (DAD) και φθορισμού. Η διαδικασία ανάπτυξης της μεθοδολογίας ποσοτικού προσδιορισμού της συνολικής (ελεύθερης και δεσμευμένης μορφής) υδροξυτυροσόλης και της τυροσόλης σε ένα δείγμα παρθένου ελαιολάδου περιλάμβανε τα παρακάτω τρία βασικά στάδια: 1. Έλεγχο της χημικής σταθερότητας πρότυπης υδροξυτυροσόλης και τυροσόλης στις εφαρμοζόμενες συνθήκες υδρόλυσης. 2. Έλεγχο της πλήρους υδρόλυσης του εστερικού δεσμού πρότυπης ελαιοευρωπαΐνης στις εφαρμοζόμενες συνθήκες υδρόλυσης και αξιολόγηση της περιεκτικότητας σε ελεύθερη υδροξυτυροσόλη. 3. Έλεγχο της εφαρμοσιμότητας της επιλεγμένης διαδικασίας παραλαβής πολικών φαινολικών κλασμάτων από διαφορετικές ποικιλίες παρθένου ελαιολάδου και υδρόλυσης των πολικών τους κλασμάτων για την αξιολόγηση του περιεχομένου τους σε ολική υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη.

16

17 Θεωρητικό μέρος 1 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 Ορισμός παρθένου ελαιολάδου Ως παρθένο ελαιόλαδο χαρακτηρίζεται το έλαιο που λαμβάνεται από τους καρπούς της ελαίας της Ευρωπαϊκής (Olea europea) με μέσα αποκλειστικά μηχανικά και μεθόδους ή επεξεργασίες οπωσδήποτε φυσικές, σε θερμοκρασίες που να μην προκαλούν αλλοίωση του ελαίου. (Κώδικας Τροφίμων, Ποτών και Αντικειμένων Κοινής Χρήσης, Άρθρο 71, παράγραφος 1, και άλλοι φορείς όπως IOC: CODEX STAN ) 1.2 Εμπορικές βρώσιμες κατηγορίες παρθένου ελαιολάδου Στη νομοθεσία της Ευρωπαϊκής Ένωσης (Κανονισμός ΕΚ 1234/27 και ΕΚ 796/22) διακρίνονται οι παρακάτω τέσσερις βρώσιμες εμπορικές κατηγορίες του παρθένου ελαιολάδου : Εξαιρετικό (extra) παρθένο ελαιόλαδο: Αυτή η κατηγορία του παρθένου ελαιολάδου είναι η υψηλότερη ποιοτικά και λαμβάνεται απευθείας από υγιείς ελιές μόνο με μηχανικές μεθόδους. Η ελεύθερη οξύτητα του ελαίου, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, είναι κατά μέγιστο,8 g ανά 1 g, η διάμεση τιμή των οργανοληπτικών ελαττωμάτων είναι ίση με και η διάμεση τιμή για το φρουτώδες είναι μεγαλύτερη του. Παρθένο ελαιόλαδο: Αυτή η κατηγορία του παρθένου ελαιολάδου λαμβάνεται απευθείας από υγιείς ελιές με τις ίδιες μεθόδους με τις οποίες λαμβάνεται και το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο. Η διαφορά είναι ότι η ελεύθερη οξύτητά του εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, είναι κατά μέγιστο 2, g ανά 1 g Η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων είναι μεγαλύτερη του και μικρότερη ή ίση με 2,5 και η διάμεση τιμή για το φρουτώδες είναι μεγαλύτερη του. Ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισµένα ελαιόλαδα και παρθένα ελαιόλαδα: Μείγμα εξευγενισμένου και παρθένου ή εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου (μεταξύ 1% και 2%). Ό όρος παρθένο έχει παραλειφθεί επειδή κατά την παραγωγή του εξευγενισμένου ελαίου χρησιμοποιούνται χημικές διαδικασίες που επιφέρουν αλλοίωση της γεύσης και του - 1 -

18 Θεωρητικό μέρος αρώματος. Η ελεύθερη οξύτητά του εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, δεν υπερβαίνει το 1, g ανά 1 g Πυρηνέλαιο: Έλαιο που αποτελείται από μείγμα εξευγενισμένου πυρηνελαίου και παρθένων ελαιολάδων, εκτός από το ελαιόλαδο λαμπάντε, του οποίου η περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, δεν υπερβαίνει το 1 g ανά 1 g. Καθώς οι ΗΠΑ δεν είναι μέλος του International Olive Council (IOC) οι εμπορικές κατηγορίες της αντίστοιχης νομοθεσίας δεν ταυτίζονται υποχρεωτικά με αυτές που αναφέρθηκαν παραπάνω. Συγκεκριμένα, το Υπουργείο Γεωργίας των ΗΠΑ (USDA) είναι ο υπεύθυνος φορέας για την κατάταξη των εμπορικών κατηγοριών του παρθένου ελαιολάδου που παράγεται στη χώρα ή εισάγεται και διατίθεται στο εμπόριο. Οι κατηγορίες διαμορφώθηκαν με βάση τα ίδια κριτήρια δηλαδή την οξύτητα, και την απουσία μη επιθυμητών οργανοληπτικών χαρακτηριστικών. Οι εμπορικές βρώσιμες κατηγορίες όπως καθορίστηκαν από τον USDA σύμφωνα με την τελευταία αναθεώρηση στις 28 Απριλίου του 21 (United States Standards for Grades of Olive Oil and Olive-Pomace Oil Effective October 24, 21) είναι οι εξής: U.S. Extra Virgin Olive Oil: Παρθένο ελαιόλαδο με εξαιρετική γεύση και οσμή και περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, που δεν υπερβαίνει τα,8g ανά 1g. U.S. Virgin Olive Oil: είναι το παρθένο ελαιόλαδο το οποίο έχει αρκετά καλή γεύση και οσμή και περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, όχι περισσότερο από 2, g ανά 1g U.S. Olive Oil: είναι το έλαιο που αποτελείται από μείγμα εξευγενισμένου ελαιολάδου και παρθένου ελαιολάδου, είναι κατάλληλο για κατανάλωση χωρίς περαιτέρω επεξεργασία. Έχει περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, όχι περισσότερο από 1, g ανά 1 g, έχει αποδεκτή οσμή και τη χαρακτηριστική γεύση του "παρθένου ελαιολάδου. U.S. Refined Olive Oil: Είναι το ελαιόλαδο που λαμβάνεται από παρθένα ελαιόλαδα και έχει υποστεί τη διαδικασία του εξευγενισμού. Έχει περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, εκφραζόμενη ως περιεκτικότητα σε ελαϊκό οξύ, όχι περισσότερο από,3 g ανά 1 g, είναι άνοστο και άοσμο. Η προσθήκη της α-τοκοφερόλης επιτρέπεται ώστε να αποκατασταθεί η - 2 -

19 Θεωρητικό μέρος φυσική τοκοφερόλη που χάνεται κατά τη διαδικασία εξευγενισμού. Το μέγιστο επίπεδο είναι 2 mg / kg της συνολικής α-τοκοφερόλης στο τελικό προϊόν. 1.3 Κριτήρια ποιότητας και γνησιότητας για την κατάταξη του παρθένου ελαιολάδου σε εμπορικές κατηγορίες στην Ευρωπαική Ένωση Η κατάταξη του παρθένου ελαιολάδου σε εμπορικές κατηγορίες γίνεται με βάση κριτήρια ποιότητας και γνησιότητας. Εκτός από τα θεσπισμένα κριτήρια ποιότητας υπάρχουν και αυτά που προτείνονται από την επιστημονική κοινότητα. Θεσπισμένα κριτήρια ποιότητας Η ποιότητα του παρθένου ελαιολάδου επηρεάζεται σημαντικά από πληθώρα παραγόντων που είναι δυνατό να σχετίζονται με το στάδιο ανάπτυξης του καρπού, προσβολή από παράσιτα ή μικροοργανισμούς, επίδραση υγρασίας, οξυγόνου, έντονου φωτός, και θερμοκρασίας και προσδιορίζεται με την μέτρηση ορισμένων φυσικοχημικών παραμέτρων όπως η οξύτητα, ο αριθμός υπεροξειδίων και η απορρόφηση στο υπεριώδες φως (232 και 27 nm). Ως κριτήρια ποιότητας έχουν θεσμοθετηθεί: η οξύτητα, ο αριθμός υπεροξειδίων και οι συντελεστές απορρόφησης Κ 232 και Κ 27. Για τα παρθένα ελαιόλαδα στα κριτήρια ποιότητας συμπεριλαμβάνεται και η οργανοληπτική αξιολόγηση. (πηγή : Μη θεσπισμένα κριτήρια ποιότητας Η ποιότητα του παρθένου ελαιολάδου επηρεάζεται σημαντικά και από παράγοντες που επιδρούν και κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, αλλά και από τις συνθήκες συντήρησής του. Σύμφωνα με επιστημονικές μελέτες, η σταθερότητα του παρθένου ελαιολάδου βασίζεται στην περιεκτικότητά του σε συγκεκριμένες τάξεις ενώσεών του όπως σε μονοακόρεστες τριακυλογλυκερόλες και σε φυσικά αντιοξειδωτικά όπως η α-τοκοφερόλη και οι φαινολικές ενώσεις (Psomiadou & Tsimidou 1998, Psomiadou & Tsimidou 22). Κριτήρια ποιότητας μπορεί να είναι η υψηλή περιεκτικότητα σε ολικές φαινόλες και σε α-τοκοφερόλη. Επιπλέον ως κριτήριο υποβάθμισης της ποιότητας μπορεί να θεωρηθεί η παρουσία φαιοφυτινών και παραγώγων τους (Psomiadou and Tsimidou 21, Gertz & Fiebig 26), ενώ η υψηλή περιεκτικότητα σε σκουαλένιο (Psomiadou and Tsimidou 1999) ενισχύει τη βιολογική αξία του παρθένου ελαιολάδου - 3 -

20 Θεωρητικό μέρος Κριτήρια γνησιότητας Προκειμένου να συλλεχθούν πληροφορίες σχετικές με την γνησιότητα του παρθένου ελαιολάδου προσδιορίζονται διάφορες παράμετροι ελέγχου οι οποίες χαρακτηρίζονται ως κριτήρια γνησιότητας. Μέσω αυτών ανιχνεύεται η παρουσία σπορελαίων ή άλλων ξένων ελαίων στο υπό εξέταση παρθένο ελαιόλαδο. Η ανίχνευση στηρίζεται στις διαφορές που υπάρχουν μεταξύ χημικής σύστασης των παρθένων ελαιολάδων και του προστιθέμενου άλλου ελαίου. Η προστασία της αυθεντικότητας του παρθένου ελαιολάδου επιτυγχάνεται με την χρήση μεγάλου αριθμού κριτηρίων γνησιότητας. Για παράδειγμα για την ανίχνευση νοθείας με σπορέλαιο πραγματοποιείται προσδιορισμός των επιπέδων των trans λιπαρών οξέων καθώς και υπολογισμός της ΔΕCN42 (διαφορά μεταξύ θεωρητικής και πειραματικής περιεκτικότητας σε τριγλυκερίδια, με ισοδύναμο αριθμό ατόμων άνθρακα 42),για την ανίχνευση νοθείας με πυρηνέλαιο προσδιορίζεται το επίπεδο της ερυθροδιόλης και της ουβαόλης (τριτερπενικές διαλκοόλες) καθώς και η περιεκτικότητα σε κηρούς, και τέλος για την ανίχνευση εξευγενισμένων ελαίων γίνεται φασματισκοπική εξέταση στο υπεριώδες (27 nm, ΔΚ) (πηγή: 1.4 Χημική σύσταση παρθένου ελαιολάδου Το παρθένο ελαιόλαδο αποτελείται κυρίως από τριακυλογλυκερόλες (~98%). Σε μικρότερες ποσότητες απαντώνται μονο- και διακυλογλυκερόλες, ελεύθερα λιπαρά οξέα, ελεύθερες και δεσμευμένες στερόλες, τριτερπενοειδείς αλκοόλες, φωσφολιπίδια, ευχυμικά συστατικά, τοκοφερόλες, πολικές φαινόλες, χρωστικές, κηροί και υδρογονάνθρακες. (Boskou et al., 26a). Το σύνολο των παραπάνω συστατικών κατηγοριοποιείται σε σαπωνοποιήσιμα συστατικά (τριακυλογλυκερόλες, μονο- και διακυλογλυκερόλες, λιπαρά οξέα, φωσφατίδια), που αποτελούν και το 99% της μάζας του ελαίου και σε μη σαπωνοποιήσιμα ή ασαπωνοποίητα συστατικά (στερόλες, τοκοφερόλες, υδρογονάνθρακες, ανώτερες αλκοόλες, χρωστικές και πολικές φαινόλες) που αποτελούν μόλις το 1% αυτής

21 Θεωρητικό μέρος 1.5 Φαινολικά συστατικά του παρθένου ελαιολάδου Το πολικό φαινολικό κλάσμα του παρθένου ελαιολάδου, γνωστό για πολλά χρόνια και ως πολυφαινόλες είναι ένα σύνθετο μίγμα από χημικές ενώσεις που περιέχουν ένα τουλάχιστο βενζολικό δακτύλιο που φέρει μια ή περισσότερες υδροξυλικές, συμπεριλαμβανομένων και παραγώγων τους όπως εστέρων, μεθυλαιθέρων, γλυκοζιτών, κ.ά. (Tsimidou, 1998). Οι φαινολικές αυτές ενώσεις, που είναι κατά κανόνα υδατοδιαλυτές και ελάχιστα λιποδιαλυτές, παίζουν σπουδαίο ρόλο στην ποιότητα του ελαιολάδου επηρεάζοντας και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. Μέρος των φαινολικών συστατικών του καρπού, παραμένουν στο ελαιόλαδο κατά την παραγωγική διαδικασία. Τα φαινολικά συστατικά συγκρατούνται με τη βοήθεια διεπιφανειακών δυνάμεων, που αναπτύσσονται κατά τη μάλαξη και φυγοκέντρηση, στη λιποπρωτεϊνική μεμβράνη της ελαιώδους σταγόνας και μεταφέρονται έτσι από τον καρπό στο ελαιόλαδο (Montedoro et al., 1978). Η ενεργοποίηση υδρολυτικών και οξειδωτικών διαδικασιών από την δράση των υδρολασών (εστεράσες, γλυκοσιδάσες), καθώς και ενδογενών οξειδοαναγωγασών (πολυφαινολοξειδάσες, υπεροξειδάσες) επηρεάζουν τη μορφή και τη σύσταση των φαινολικών ενώσεων (Servilli & Montedoro, 22, Gutiérrez-Rosales et al., 23). Εκτός από την ποικιλία, η τεχνολογία παραλαβής είναι καθοριστική για τη σύσταση και τη συγκέντρωση των φαινολών στο τελικό προϊόν. Το πολικό φαινολικό κλάσμα παραλαμβάνεται κατά τη εκχύλιση του ελαιολάδου κατά με μίγμα μεθανόλης-νερού Χημική σύσταση του υδατομεθανολικού εκχυλίσματος του παρθένου ελαιολάδου. Τα φαινολικά συστατικά του καρπού είναι κυρίως γλυκοζίτες σεκοϊριδοειδών ενώσεων (ελαιοευρωπαΐνη, απομεθυλιωμένη ελαιοευρωπαΐνη, λιγκστροζίτης, (nǜzhenide), παράγωγα υδροξυκιναμμωμικού οξέος (βερμπασκοζίτης), φλαβονών (7-γλυκοζίτης της λουτεολίνης), φλαβονολών (ρουτίνη), και γλυκοζίτες ελενολικού οξέος (Amiot et al., 1989, Boskou et al., 26b). Οι σεκοϊριδοειδείς ενώσεις βρίσκονται και σε άλλα φυτά της βοτανικής οικογένειας Oleaceae, μέλος της οποίας είναι και η Olea europaea L (Servilli and Montedoro, 22). Η ωρίμανση του καρπού και η αύξηση της υδρολυτικής δράσης, δικαιολογεί την εμφάνιση συστατικών όπως απλές φαινόλες (υδροξυτυροσόλη, τυροσόλη), - 5 -

22 Θεωρητικό μέρος φαινολικά οξέα (βανιλλικό, καφεϊκό, π-κουμαρικό), καθώς και των αγλυκονών της ελαιοευρωπαΐνης και του βερμπασκοζίτη (Boskou et al., 26b). Το παρθένο ελαιόλαδο (VOO) περιέχει φαινολικές ενώσεις που αποτελούν ένα πολύπλοκο μίγμα παραγώγων των προαναφερθέντων συστατικών που μπορούν να ταξινομηθούν σε πέντε διαφορετικές κατηγορίες φαινολικών συστατικών: φαινολικά οξέα, απλές φαινόλες, σύνθετα παράγωγα ελαιοευρωπαΐνης (oleuropein), φλαβονοειδή, λιγνάνες (lignans) και (υδροξυ-ισοχρωμάνες)) (πίνακας 1.1) Τα φαινολικά οξέα διακρίνονται σε παράγωγα του κινναμωμικού οξέος (C3-C6) ή του βενζοϊκού οξέος (C6-C1)). Τα παράγωγα της ελαιοευρωπαΐνης και του λιγκστροζίτη αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του φαινολικού κλάσματος. Τα σε αφθονία σεκοϊριδοειδή είναι η διαλδευδική μορφή του ελενολικού οξέος συνδεδεμένη με την υδροξυτυροσόλη και ένα ισομερές του άγλυκου της ελαιοευρωπαΐνης, ενώ οι κύριες φαινολικές αλκοόλες είναι η υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη, και οι λιγνάνες (1-ακετοξυπινορεσινόλη, πινορεσινόλη, 1- υδροξυπινορεσινόλη). Σε ελαιόλαδα με υψηλή περιεκτικότητα σε φαινόλες οι κύριες ενώσεις είναι οι 3,4- DHPEA-EDA και 3,4-DHPEA-EA ενώ σε ελαιόλαδα με χαμηλή περιεκτηκότητα σε φαινολικά συστατικά, κυρίαρχες ενώσεις είναι τα φαινολικά οξέα (βανιλλικό οξύ, ο- και π- κουμαρικό οξύ, καφεϊκό οξύ, φερουλικό οξύ )και οι φαινολικές αλκοόλες (τυροσόλη, υδροξυτυροσόλη).τα εξευγενισμένα ελαιόλαδα δεν περιέχουν φαινόλες αφού οι τελευταίες είναι πολικές και απομακρύνονται με το νερό κατά τη διάρκεια του εξευγενισμού (Tsimidou, 1998)

23 Θεωρητικό μέρος Πίνακας 1.1 Φαινολικές ενώσεις στο Παρθένο Ελαιόλαδο (Tsimidou, 213) Φαινολικά οξέα Συριγγικό οξύ, καφεικό οξύ, βανιλλικό οξύ, π-κουμαρικό οξύ, ο-κουμαρικό οξύ, φερουλικό οξύ, γαλλικό οξύ, π-υδροξυβενζοικό οξύ,κινναμωμικό οξύ, βενζοϊκό οξύ πρωτοκατεχικό οξύ Απλές φαινόλες 3,4-διυδροξυφαιναιθυλαλκοόλη (3,4-DHPEA) ή υδροξυτυροσόλη, οξικός εστέρας της υδροξυτυροσόλης, 4-υδροξυφαιναιθυλαλκοόλη (p-hpea) ή τυροσόλη, οξικός εστέρας της τυροσόλης, βανιλλίνη, γλυκοζίτης της 3,4-διυδροξυφαιναιθυλαλκοόλης Παράγωγα ελαιοευρωπαΐνης Διαλδεϋδική αποκαρβοξυλιωμένη μορφή του άγλυκου συστατικού της ελαιοευρωπαΐνης (3,4-DHPEA-EDA), διαλδεϋδική αποκαρβοξυλιωμένη μορφή του άγλυκου συστατικού του λιγκστροζίτη (p-hpea-eda), άγλυκο της ελαιοευρωπαΐνης (3,4-DHPEA-EA), άγλυκο λικστροζίτη (p-hpea-eα), αλδεϋδική μορφή του άγλυκου συστατικού της ελαιοευρωπαΐνης, αλδεϋδική μορφή του άγλυκου συστατικού του λιγκστροζίτη Φλαβονοειδή Απιγενίνη, Λουτεολίνη Λιγνάνες (+)-1-ακετοξυπινορεσινόλη, (+) - πινορεσινόλη Υδροξυ-ισοχρωμάνες - 7 -

24 Θεωρητικό μέρος Πίνακας 1.2. Χημική δομή φαινολικών ενώσεων του παρθένου ελαιολάδου 3,4-διυδροξυκινναμωμικό οξύ (καφεϊκό οξύ) OH 3,4-dihydroxycinammic acid HO COOH (caffeic acid) 3, 4-διυδροξυφαιναιθυλαλκοόλη HO (υδροξυτυροσόλη) 3,4-dihydroxy- HO OH phenethylalcohol (hydroxytyrosol) 4-υδροξυφαιναιθυλαλκοόλη (τυροσόλη) 4-hydroxyphenethylalcohol HO OH (tyrosol) ελενολικό οξύ (μη φαινολική O OH COOMe ένωση) elenolic acid O OH HO Ελαιοευρωπαΐνη HO O O COOMe Oleuropein O OGlu Glu=γλυκόζη - 8 -

25 Θεωρητικό μέρος 1- ακετοξυπινορεσινόλη 1-acetoxypinoresinol Πινορεσινόλη Pinoresinol 1-υδροξυπινορεσινόλη 1-hydroxypinoresinol Πίνακας 1.3 Σεκοϊριδοειδείς ενώσεις και παράγωγα του παρθένου ελαιολάδου

26 Θεωρητικό μέρος 1.6 Παραλαβή, διαχωρισμός και ταυτοποίηση των φαινολικών ενώσεων του παρθένου ελαιολάδου Παραλαβή πολικού κλάσματος Το λεγόμενο πολικό κλάσμα του παρθένου ελαιολάδου που περιέχει τις φαινολικές ενώσεις παραλαμβάνεται κυρίως με εκχύλιση υγρού-υγρού (LLE) ή εκχύλιση στερεάς φάσηςυγρού (SPE). Η εκχύλιση υγρού-υγρού (LLE) γίνεται με πλύση του υδατομεθανολικού διαλύματος του ελαίου (σε διάφορες αναλογίες) με εξάνιο. Ακολουθεί απομάκρυνση του διαλύτη από την υδατική φάση και κατ επέκταση απομάκρυνση των υδρόφοβων συστατικών και προσδιορισμός των φαινολικών συστατικών (ολικών ή επιμέρους). Οι Montedoro & Cantarelli (1969) πρότειναν την αναλογία μεθανόλη : νερό, 8:2 ν/ν για την παραλαβή του πολικού κλάσματος με εκχύλιση υγρού υγρού (LLE). Οι Vazquez- Roncero et al. (1976), βελτιστοποίησαν την αναλογία προτείνοντας την χρήση μίγματος μεθανόλης 6 % ως μέσο εκχύλισης, αφού με τον τρόπο αυτό διαχωρίζεται καλύτερα η υδατομεθανολική από την οργανική στοιβάδα. Παρόλα αυτά η εκχύλιση με μίγμα μεθανόλης νερού, 8:2 ν / ν, παραμένει η πιο δημοφιλής μέθοδος εκχύλισης και έχει υιοθετηθεί από το COI/T.2/Doc No 29 (29) ( Tsimidou 213). Οι ερευνητές που ακολούθησαν, χρησιμοποίησαν τα συγκεκριμένα πρωτόκολλα εκχύλισης υγρού υγρού (LLE) με διαφοροποιήσεις ως προς την ποσότητα του ελαίου (π.χ. 2,5 ±,1 g,). (Psomiadou & Tsimidou 2). Το φαινολικό κλάσμα απομονώνεται επίσης και με την εκχύλιση της στερεής φάσηςυγρού (SPE) σε μικροστήλες πληρωμένες με υλικό (C18 ή C8 ή διόλη). Με τη μεθοδολογία αυτή, περιορίζονται οι απαιτούμενες ποσότητες δείγματος και διαλυτών καθώς και η διάρκεια της εκχύλισης Σύμφωνα, με τους Pirisi et al., (2), Bendini et al., (23),και Servilli et al., (24), οι απλές φαινόλες παραλαμβάνονται καλύτερα με τη SPE, ενώ οι σύνθετες φαινόλες ανακτώνται καλύτερα με τη LLE (Hrncirik and Fritsche, 24). Είναι λοιπόν προφανές ότι η διαδικασία εκχύλισης επηρεάζει τα αποτελέσματα του προσδιορισμού των φαινολικών ενώσεων

27 Θεωρητικό μέρος Προσδιορισμός ολικών φαινολών Χρωματομετρικός προσδιορισμός Η χρωματομετρική μέθοδος εφαρμόζεται ευρέως για τον προσδιορισμό των φαινολών στο εκχύλισμα νερού - μεθανόλης και βασίζεται στον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό τους, μετά από αντίδραση με το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu (Tsimidou, 1998). Το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu (FC) είναι διάλυμα φωσφομολυβδαινικών και φωσφοβολφραμικών αλάτων με νάτριο. Κατά την ανάμειξη ενώ το αντιδραστήριο ανάγεται δίνοντας σύμπλοκο μολυβδαινίου-βολφραιμίου (Μο-W) χαρακτηριστικής μπλε χρώσης που απορροφά στο ορατό (725 nm) οι φαινόλες οξειδώνοται. Η ρύθμιση του ph στην αλκαλική περιοχή γίνεται με κορεσμένο διάλυμα Να 2 CO 3 (35%,W/V) για την επιτάχυνση της αντίδρασης των φαινολών. Η Gutfinger (1981), παρουσίασε ένα αναλυτικό πρωτόκολλο χρωματομετρικού προσδιορισμού τόσο των ολικών πολικών φαινολών όσο και των ο- διφαινολών που έγινε εξαιρετικά δημοφιλές. τις επόμενες δεκαετίες. Με τη διαδικασία αυτή, εκτιμάται η παρουσία όλων των ενώσεων που είναι οξειδώσιμες κάτω από τις συνθήκες της αντίδρασης. Αυτή η μέθοδος δεν είναι εξειδικευμένη, αφού συνπροσδιορίζονται εκτός από τις μονο- και διφαινόλες, και άλλα φαινολικά συστατικά του εκχυλίσματος που έχουν αναγωγική δράση (φλαβόνες, λιγνάνες). Επιπλέον, η μέθοδος δεν είναι επίσημη αλλά έχει γίνει αποδεκτή ως «universal» για την εκτίμηση των ολικών πολικών φαινολών σε τρόφιμα όπως το κρασί, οι χυμοί φρούτων, το παρθένο ελαιόλαδο κλπ. (Singleton et al., 1999). Σύμφωνα με τους Blekas et al. (22), η μέθοδος της Folin-Ciocalteu δίνει επίσης ένα μέτρο του δυναμικού οξειδοαναγωγής του εκχυλίσματος που εξετάζεται για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης του ελαιολάδου. Τα αποτελέσματα εκφράζονται συνήθως ως ισοδύναμα καφεϊκού οξέος «mg καφεϊκού οξέος / kg ελαίου» (ppm καφεϊκού οξέος ) αν και έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί και άλλες φαινόλες (τυροσόλη, υδρόξυτυροσόλη, γαλλικό οξύ, και το π-υδροξυβενζοϊκό οξύ ) ως πρότυπα. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των φαινολών στο δείγμα, κατασκευάζεατι μια καμπύλη αναφοράς με την χρησιμοποίηση μεθανολικών διαλυμάτων καφεϊκού οξέος ή άλλης πρότυπης φαινόλης. Η επιλογή του προτύπου για την κατασκευή της καμπύλης αποτελεί κρίσιμο σημείο της αναλυτικής διαδικασίας. Η επιλογή του θα πρέπει να γίνεται μεταξύ των πλέον αντιπροσωπευτικών φαινολικών ενώσεων του υπό εξέταση δείγματος. Στην περίπτωση του παρθένου ελαιολάδου θα έπρεπε να είναι η υδροξυτυροσόλη. Η χρήση της τελευταίας δεν είναι πάντοτε εφικτή καθώς η ένωση είναι ασταθής, ιδιαίτερα ακριβή (ενδεικτική τιμή 668 τα 1 μg) και όχι εύκολα εμπορικά διαθέσιμη. Συνεπώς, εναλλακτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν

28 Θεωρητικό μέρος δομικά παρόμοιες φαινολικές ενώσεις (ίδιος αριθμός δραστικών ομάδων υδροξυλίου) (Blekas et al., 22) ή να αποφασιστεί η χρήση συγκεκριμένου προτύπου διεθνώς προκειμένου τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα. Σύμφωνα με τους Hrnsirik & Fritsche (24) οι ολικές πολικές φαινόλες μπορούν να προσδιοριστούν και υγροχρωματογραφικά αθροίζοντας τις κύριες κορυφές του χρωματογραφήματος στα 28 nm. Με αυτόν τον τρόπο απέδειξαν ότι οι ολικές πολικές φαινόλες προσδιοριζόμενες χρωματομετρικά συσχετίζονται γραμμικά με τις αντίστοιχες ολικές όπως αυτές προσδιορίζονται υγροχρωματογραφικά. Στο υδατομεθανολικό εκχύλισμα δεν φαίνεται να περιέχονται συστατικά που παρεμποδίζουν κατά τον χρωματομετρικό προσδιορισμό ο οποίος μπορεί να αποτελέσει τελικά ένα πολύτιμο εργαλείο ποιοτικού ελέγχου του παρθένου ελαιολάδου σε ελέγχους ρουτίνας (Blekas et al. 22) Φθορισμομετρικός προσδιορισμός Μια εναλλακτική πρόταση για την εκτίμηση των ολικών φαινολών αποτελεί η φθορισμομετρική διαδικασία (Papoti and Tsimidou, 29) που μπορεί να εφαρμοστεί αποτελεσματικά στο παρθένο ελαιόλαδο, σε έλαιο καρπού και σε πολικά εκχυλίσματα φύλλων. Το περιεχόμενο σε φαινολικά συστατικά προσδιορίζεται στα μήκη κύματος διέγερσης / εκπομπής στα 28/32 nm. Η in house επικυρωμένη αυτή μέθοδος είναι αξιοσημείωτη, καθώς είναι πιο ευαίσθητη από την Fοlin-Ciocalteau (LOD και LOQ τιμές δέκα φορές χαμηλότερες), τρεις φορές πιο γρήγορη, δεν χρειάζεται αντιδραστήρια και το πιο σημαντικό, δεν είναι καταστροφική για το δείγμα, το οποίο μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί σε σειρά άλλων προσδιορισμών Τεχνικές διαχωρισμού φαινολικών συστατικών Ο διαχωρισμός των φαινολικών συστατικών του ελαιολάδου έχει επιτευχθεί τα τελευταία χρόνια τόσο με την υγρή χρωματογραφία όσο και με την αέρια χρωματογραφία και πιο πρόσφατα με την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. (Tsimidou, 213) Η αντίστροφης φάσης υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (RP- HPLC) Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης και αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στο διαχωρισμό των φαινολικών ενώσεων στο παρθένο ελαιόλαδο

29 Θεωρητικό μέρος για περισσότερο από 2 χρόνια. Διαχωρισμός των απλών και σύνθετων μορφών των φαινολικών και άλλων ενώσεων του πολικού κλάσματος του παρθένου ελαιολάδου επιτυγχάνεται με τη χρήση μιγμάτων νερού-μεθανόλης ή νερού-ακετονιτριλίου οξινισμένων με οξικό, φωσφορικό ή θειϊκό οξύ (μέχρι 3%, pη <2), και βαθμωτή έκλουση. Ο έλεγχος του ph γίνεται για να καταστεί δυνατός ο διαχωρισμός των φαινολών στην αδιάστατη μορφή τους ώστε να επιτυγχάνεται η βελτίωση της ασυμμετρίας των κορυφών. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στις διαφορετικές τιμές pka των επιμέρους φαινολών. (Tsimidou 213) Οι χημικές ενώσεις που περιέχονται σε φυσικά εκχυλίσματα όπως αυτό του ελαιολάδου είναι δομικά συγγενείς μεταξύ τους γεγονός που δυσχεραίνει το χρωματογραφικό διαχωρισμό τους. Γι αυτό τον λόγο και τα χρωματογραφήματα που προκύπτουν μετά τον χρωματογραφικό διαχωρισμό τους έχουν σύνθετη μορφή. Ένα τυπικό χρωματογράφημα πολικού κλάσματος του παρθένου ελαιολάδου παρουσιάζεται παρακάτω:

30 Θεωρητικό μέρος Σ Σ χήμα 3.1 Χρωματογράφημα πολικού κλάσματος εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου στα 28 nm (COI/T.2/Doc No 29 November 29) Στον παρακάτω πίνακα δίνεται η ταυτότητα των ενώσεων του πολικού κλάσματος του παραπάνω χρωματογραφήματος. Πίνακας 1.4 Χαρακτηρισμός κορυφών πολικού κλάσματος εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου στα 28 nm

31 Θεωρητικό μέρος Οι διαλύτες που έχουν χρησιμοποιηθεί για το χρωματογραφικό διαχωρισμό των φαινολικών ενώσεων είναι : (A) νερό με.2 % H 3 PO4 (V/V), (B) μεθανόλη, (Γ) ακετονιτρίλιο. Η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιείται σύμφωνα με το παρακάτω σύστημα βαθμωτής έκλουσης Χρόνος ( min) A % B % Γ% Ροή ml/ min , , , , , , , Οι συνθήκες διαχωρισμού που ακολουθούνται κάθε φορά είναι ανάλογες με τον σκοπό του προσδιορισμού έτσι ώστε η μελέτη και αξιοποίηση των χρωματογραφημάτων που προκύπτουν να είναι ευκολότερη και αποδοτικότερη για τον ερευνητή. Αν για παράδειγμα σκοπός της ανάλυσης είναι ο προσδιορισμός επιλεγμένων φαινολών η μέθοδος της υγρής χρωματογραφίας μπορεί να τροποποιηθεί κατάλληλα (συνθήκες βαθμωτής έκλουσης) ώστε να προσδιοριστούν μόνο αυτά τα συστατικά (Inarejos-Garcia et al 29.) Ως αποτέλεσμα, οι πληροφορίες που θέλει ο αναλυτής μπορούν να ληφθούν σε μικρότερο χρόνο ανάλυσης (Tsimidou et al.,1992). Αν τώρα σκοπός της ανάλυσης είναι ο προσδιορισμός όλων των φαινολικών ενώσεων που βρίσκονται τόσο σε απλή όσο και σε δεσμευμένη μορφή (πχ υδροξυτυροσόλη και παράγωγά της) τότε το σύστημα της βαθμωτής έκλουσης που ακολουθείται έχει μεγαλύτερη διάρκεια και το χρωματογράφημα που προκύπτει έχει πιο σύνθετη μορφή και η ταυτοποίηση των κορυφών απαιτεί ισχυρότερους ανιχνευτές όπως ο φασματογράφος μάζας Συστήματα ανίχνευσης,καιδιαδικασίες ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού φαινολικών ενώσεων μετά το διαχωρισμό Οι διαδικασίες ανίχνευσης, ταυτοποίησης και ποσοτικοποίησης των φαινολικών ενώσεων μετά το διαχωρισμό εξαρτώνται από το στόχο της μελέτης και από τα διαθέσιμα

32 Θεωρητικό μέρος επιστημονικά όργανα. Τα συστήματα ανίχνευσης που χρησιμοποιούνται ευρύτερα είναι η φασματοφωτομετρία UV, τη φθορισμομετρία και τη φασματοσκοπία μάζας Συστήματα ανίχνευσης φαινολικών ενώσεων Η φασματοφωτομετρία UV είναι εξαιρετικά χρήσιμη για την ταυτοποίηση των φαινολικών ενώσεων αλλά και για την παρακολούθηση της καθαρότητας των κορυφών στο HPLC χρωματογράφημα. Η περιοχή σάρωσης του φάσματος είναι συνήθως αυτή μεταξύ 2 και 29 nm, όπου οι απλές φαινόλες και τα φαινολικά οξέα εμφανίζουν ένα ή δύο μέγιστα. (Montedoro et αl., 1993). Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο μήκος κύματος είναι αυτό στα 28 nm, που αποτελεί ένα αντιπροσωπευτικό μήκος κύματος ανίχνευσης των φαινολικών ενώσεων. Οι διαφορές στο μέγιστο μήκος κύματος και στη μοριακή απορρόφηση μεταξύ των διαφόρων φαινολικών ενώσεων επηρεάζει τη διαδικασία ποσοτικοποίησής τους και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν διερευνώνται τα «πραγματικά» επίπεδα της συγκέντρωσής τους. Για παράδειγμα, η ποσοτικοποίηση της ίδιας ποσότητας του ομοβανιλλικού οξέος στα 28 nm και στα 325 nm έχουν προκύψει δεδομένα τρεις φορές υψηλότερα στην πρώτη περίπτωση (Tsimidou et al, 1996). Η ευρεία χρήση των συστημάτων ανίχνευσης συστοιχίας φωτοδιόδων λυχνιών σε συνδιασμό με την HPLC (HPLC-DAD) αποτελεί μια σημαντική πρόοδο στην on line ταυτοποίηση των φαινολικών ενώσεων καθώς παρέχει τη δυνατότητα εκτίμησης της συγκέντρωσης σε περισσότερα του ενός μήκη κύματος αυξάνοντας την εκλεκτικότητα του προσδιορισμού, για παράδειγμα ποσοτικό προσδιορισμό των παραγώγων της υδροξυτυροσόλης στα 24 nm, του κινναμωμικού οξέος και των λιγνανών στα 28 nm και των φλαβονών και φερουλικού οξέος στα 335 nm (Tsimidou, 213). Η χρήση ενός φθορισμομετρικού ανιχνευτή είτε σε σειρά με τον ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων λυχνιών είτε όχι αποτελεί ένα πολύτιμο εργαλείο τα τελευταία χρόνια, στην ανάλυση των φαινολικών ενώσεων και άλλων συστατικών του παρθένου ελαιολάδου καθώς παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση και χαμηλότερα όρια ανίχνευσης (Cartoni et al. 2, Brenes et al.,22, Selvaggini et al., 26). H μεγαλύτερη εξειδίκευση που προσφέρει η φθορισμομετρική τεχνική στη ταυτοποίηση των φαινολικών ενώσεων οφείλεται στο γεγονός ότι από τις ενώσεις που απορροφούν στο υπεριώδες μόνο μερικές φθορίζουν. Γενικά, οι ενώσεις που φθορίζουν χαρακτηρίζονται από εκτεταμένη συζυγία. Σύμφωνα με τους Ryan et al. (1999), ο φθορισμός στα 32 nm (με λexc=28 nm) αποτελεί: the best compromise for general profiling κατά την ανάλυση των φαινολικών ενώσεων του ελαιοκάρπου. Οι

33 Θεωρητικό μέρος φαινόλες που φαίνεται να ευνοούνται κατά τη φθορισμομετρική ανίχνευσή τους είναι οι απλές φαινόλες όπως η τυροσόλη και η υδροξυτυροσόλη, και οι λιγνάνες ειδικά η πινορεσινόλη (λexc = 28 nm / λemiss = 32 nm). Στην περίπτωση που επιδιώκεται ο προσδιορισμός συγκεκριμένων απλών φαινολών οι οποίες φθορίζουν η χρήση του φθορισμού βοηθά στη ταυτοποίησή τους προσφέροντας μεγαλύτερη εξειδίκευση στην ανάλυση των συγκεκριμένων φαινολικών ενώσεων. Η φασματοσκοπία μαζών και πιο συγκεκριμένα η τεχνική LC-MS είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την ταυτοποίηση ενώσεων φυσικών προϊόντων, όπως τα εκχυλίσματα φυτών Για την ανάλυση των πολικών, μη-πτητικών, θερμοευαίσθητων, και υψηλού μοριακού βάρους φαινολικών ενώσεων ( φαινολικές ενώσεις του παρθένου ελαιολάδου και των φύλλων της ελιάς) χρησιμοποιούνται ήπιες πηγές ιονισμού όπως για παράδειγμα ηλεκτροψεκασμός (ESI) και χημικός ιονισμός υπό ατμοσφαιρική πίεση (APCI) ( Torre-Carbot et al., 25) Τα φάσματα μάζας που προκύπτουν με πηγή ιονισμού ΑΡCΙ περιλαμβάνουν πρωτονιωμένα μοριακά ιόντα, [Μ + Η], + ή μοριακά ιόντα με προσθήκη νατρίου [Μ + Νa] + υπό μορφή θετικού ιόντος, ή αποπρωτονιωμένα μοριακά ιόντα, [Μ-Η], - υπό μορφή αρνητικού ιόντος και με λίγα θραύσματά τους με αποτέλεσμα οι πληροφορίες που παρέχονται για τη δομή μιας ένωσης να είναι περιορισμένες. Σε σπάνιες περιπτώσεις, το σύστημα LC-MS μπορεί να παρέχει δεδομένα που να επαρκούν για την πλήρη ανάλυση της δομής μιας φαινολικής ένωσης. Γενικότερα όμως χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της μοριακής μάζας της ένωσης αλλά και για τον καθορισμό της κατανομής των υποκαταστατών στο φαινολικό δακτύλιο (Carrasco-Pancorbo et al., 25). Πίνακας 1.5. Κύρια αποπρωτονιωμένα μοριακά ιόντα των φαινολικών ενώσεων και θραύσματά τους ( De la Torre-Carbot et al.,25)

34 Θεωρητικό μέρος Διαδικασίες ταυτοποίησης των φαινολικών ενώσεων H ταυτοποίηση των φαινολικών ενώσεων μετά τον διαχωρισμό τους (είτε με HPLC είτε με GC) βασίζεται συνήθως στην αντιστοίχηση των χρόνων συγκράτησης των εκλουσθεισών φαινολικών ενώσεων με αυτούς κατάλληλων προτύπων ενώσεων. Λόγω έλλειψης προτύπων χρησιμοποιούνται κυρίως οι σχετικοί χρόνοι συγκράτησης ως προς τυροσόλη ή άλλη γνωστή ένωση. Ένας άλλος τρόπος ταυτοποίησης των φαινολικών ενώσεων είναι μέσω της λήψης των UV φασμάτων τους που παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τη δομή της κάθε ένωσης και συνεπώς παρέχουν τη δυνατότητα διάκρισης των κατηγοριών των φαινολικών ενώσεων μεταξύ τους Διαδικασίες ποσοτικού προσδιορισμού των φαινολικών ενώσεων Για μια ακριβή ποσοτικοποίηση των φαινολικών ενώσεων χρησιμοποιείται η τεχνική του εξωτερικού προτύπου με μία ή περισσότερες πρότυπες καμπύλες. Η κατασκευή όμως πρότυπων καμπυλών είναι μια χρονοβόρα διαδικασία και πολλές φορές τα απαιτούμενα πρότυπα δεν είναι διαθέσιμα. Εξαιτίας αυτού, οι φαινόλες προτάθηκε να κατηγοριοποιούνται σε ομάδες με βάση την κλίση της πρότυπης καμπύλης τους. Για παράδειγμα η υδροξυτυροσόλη, ανήκει στην ομάδα Α μαζί με την τυροσόλη, το 3,4-διυδροξυφαινυλοξικό οξύ και το π-υδροξυφαινυλοξικό οξύ (Tsimidou et al., 1992). Επομένως για τον ποσοτικό υπολογισμό της απαιτείται η κατασκευή πρότυπης καμπύλης με χρησιμοποίηση ως πρότυπο μιας από τις φαινολικές ενώσεις της ίδιας ομάδας. Η ποσοτικοποίηση των φαινολών και με τη χρήση εσωτερικού προτύπου όπως το καφεϊκό οξύ, το γαλλικό οξύ, η ρεσορκινόλη και το συριγγικό οξύ προτιμάται ωστόσο από πολλούς ερευνητές. 1.7 Απλοποίηση του χρωματογραφικού προφίλ μετά από όξινη ή αλκαλική κατεργασία του πολικού κλάσματος Δυνατότητα απλοποίησης αυτού του χρωματογραφικού προφίλ προσφέρει η προκατεργασία του δείγματος που οδηγεί σε διάσπαση σύνθετων μορφών και σχηματισμό απλούστερων. Για παράδειγμα, η όξινη, αλκαλική ή ενζυμική υδρόλυση του φαινολικού κλάσματος μπορεί να οδηγήσει σε απλοποίηση του χρωματογραφικού προφίλ και στην παραλαβή απλούστερων μορφών. Σύμφωνα με τους Owen. et al., (2) και Mulinacci et al

35 Θεωρητικό μέρος (26) κατά την όξινη ή την αλκαλική υδρόλυση του φαινολικού κλάσματος γίνεται διάσπαση της εστερικής ομάδας που συνδέει το ελενολικό οξύ με τη φαινολική ένωση του σεκοϊριδοειδούς μορίου. Συνεπώς υδρολύονται όλες οι σεκοϊριδοειδείς δομές στο κλάσμα με αποτέλεσμα να αλλάζει δραματικά το χρωματογραφικό προφίλ. Στο σχήμα 1.2β φαίνεται ότι μετά την όξινη υδρόλυση του φαινολικού κλάσματος υδρολύθηκαν όλες οι σεκοϊριδοειδείς δομές και αυξήθηκε η συγκέντρωση της υδροξυτυροσόλης και της τυροσόλης αντίστοιχα (Σχήμα 1.2β κορυφές 1,2). Σχήμα 1.4α. HPLC Χρωματογράφημα μεθανολικού εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου πριν την όξινη ή αλκαλική υδρόλυση. ( Owen et al., 2). Κορυφές: 1. υδροξυτυροσόλη, 2. τυροσόλη, 3. Παράγωγο λιγκστροζίτη, 4. Παράγωγο ελαιοευρωπαΐνης, 5. Λιγνάνες (+)-1- ακετοξυπινορεσινόλη και (+) πινορεσινόλη, 6. ελαιοευρωπαΐνη, 7. Άγλυκο παράγωγο λιγκστροζίτη Σχήμα 1.2β. HPLC Χρωματογράφημα μεθανολικού εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου μετά την όξινη υδρόλυση. ( Owen et al., 2). Κορυφές: 1. υδροξυτυροσόλη, 2. τυροσόλη, 5. (+) πινορεσινόλη, και (+) -1 ακετοξυπινορεσινόλη

36 Θεωρητικό μέρος Με βάση τη μορφή του χρωματογραφήματος που προέκυψε μετά την όξινη υδρόλυση οι Owen et al. (2) συμπέραναν ότι σε συνθήκες όξινης υδρόλυσης του πολικού κλάσματος η υδροξυτυροσόλη και η τυροσόλη όχι μόνο δεν καταστρέφονται αλλά αυξάνονται σε ποσότητα. Επιπλέον οι ενώσεις στις οποίες δεν παρατηρείται ποσοτική αλλαγή είναι οι λιγνάνες καθώς διαφέρουν δομικά από τις σεκοϊριδοειδεις ενώσεις και δεν υδρολύονται. Μετά την αλκαλική υδρόλυση στο HPLC χρωματογράφημα (Σχήμα 1.2γ) που προκύπτει αποδίδει μόνο τυροσόλη από την υδρόλυση παραγώγων του λιγκστροζίτη (Σχήμα 1.2γ, κορυφή 2), διότι η υδροξυτυροσόλη που προέρχεται από την υδρόλυση παραγώγων της ελαιοευρωπαΐνης καταστρέφεται σε ισχυρά αλκαλικό διάλυμα. Επίσης μια νέα κορυφή (η κορυφή 5b Σχ. 1.2γ) εμφανίζεται στο φάσμα, ενώ η κορυφή 5 (Σχήμα 1.2β) είναι αισθητά ελαττωμένη (Σχήμα 1.2γ, κορυφή 5α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι δύο λιγνάνες ((+)-πινορεσινόλη και (+)-1- ακετοξυπινορεσινόλη) συνεκλούονται (κορυφή 5) και παρουσιάζουν και τα δύο σταθερότητα κατά την όξινη υδρόλυση, ενώ κατά την αλκαλική υδρόλυση σταθερότητα παρουσιάζει μόνο η (+)-1-υδροξυπινορεσινόλη (Owen et al., 2) Σχήμα 1.2 γ. HPLC Χρωματογράφημα μεθανολικού εκχυλίσματος παρθένου ελαιολάδου μετά την αλκαλική υδρόλυση. ( Owen et al., 2). Κορυφές: 2. τυροσόλη,, 5α και 5b (+) πινορεσινόλη, και (+) 1 υδροξυπινορεσινόλη - 2 -

37 Θεωρητικό μέρος 1.8 Ανάκτηση της υδροξυτυροσόλης από δεσμευμένες μορφές μετά από όξινη υδρόλυση. Προκειμένου να χρησιμοποιηθεί μια τέτοια μέθοδος πρέπει να ελεγχθεί η σταθερότητα των απλούστερων μορφών και η ανάκτησή τους από τις σύνθετες μορφές. Οι Mulinacci et al. (26) με δοκιμές σταθερής προσθήκης καθαρής ελαιοευρωπαΐνης (1,7mgmL -1 ) σε πολικά φαινολικά κλάσματα τεσσάρων εμπορικών ελαίων έδειξαν ότι η υδροξυτυροσόλη ανακτάται από την ελαιοευρωπαΐνη ύστερα από όξινη υδρόλυση σε ποσοστό 97-13,1% όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 1.6 Εκατοστιαία ανάκτηση της υδροξυτυροσόλης από δοκιμές προσθήκης ελαιοευρωπαΐνης (Mulinacci et al., 26) 1.9 Περιεκτηκότητα Ισπανικών, Ιταλικών, Ελληνικών και Πορτογαλικών ελαιολάδων σε ολικές φαινόλες Καθώς η κοινή αναλυτική μέθοδος εκτίμησης της περιεκτηκότητας του παρθένου ελαιολάδου σε φαινολικά συστατικά φαίνεται να είναι η χρωματομετρική μέθοδος με τη χρήση του αντιδραστηρίου Folin- Ciocalteau, για το λόγο αυτό στη συνέχεια δίνονται τα επίπεδα της συγκέντρωσης ολικών φαινολών σε ευρωπαϊκά παρθένα ελαιόλαδα που προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο αυτή