Involvement of serum amyloid A protein in Multiple Myeloma

Transcript

1 ב 6 מעורבות החלבון סרום עמילואיד A במיאלומה נפוצה Involvement of serum amyloid A protein in Multiple Myeloma עבודת הגמר של התלמיד עפר אלגור ת.ז כמילוי חלק מהדרישות לשם קבלת תואר דוקטור לרפואה (M.D.) מטעם בית-הספר לרפואה של האוניברסיטה העברית וביה"ח "הדסה", ירושלים בהדרכתם של המנחים: שמחה אוריאלי-שובל,Ph.D. היחידה להמטולוגיה, ביה"ח הדסה הר-הצופים, ירושלים כתובת דוא"ל: simcha@hadassah.org.il משה גת,M.D. המחלקה להמטולוגיה, ביה"ח הדסה עין כרם, ירושלים כתובת דוא"ל: rmoshg@hadassah.org.il דינה בן-יהודה,M.D. מנהלת המערך להמטולוגיה, ביה"ח הדסה עין כרם, ירושלים כתובת דוא"ל: dbyehuda@hadassah.org.il מקום ביצוע העבודה: היחידה להמטולוגיה, ביה"ח הדסה הר-הצופים והמחלקה להמטולוגיה, ביה"ח הדסה עין כרם תאריך ההגשה: אפריל

2 תודות כתיבתה של עבודה זו התאפשרה הודות להנחייתם המקצועית של ד"ר מושי גת, רופא וחוקר מהמחלקה להמטולוגיה בביה"ח "הדסה עין-כרם", ושל ד"ר שמחה אוריאלי-שובל, חוקרת ראשית ביחידה להמטולוגיה בביה"ח "הדסה הר-הצופים". ד"ר גת האיר בפניי את ההיבטים הקליניים של העבודה, ואילו ד"ר אוריאלי- שובל הדריכה אותי בהיבטיה המעבדתיים-המחקריים של העבודה. אני מודה לד"ר גת ולד"ר אוריאלי-שובל על הליווי והסיוע שהובילו לגיבושה של עבודה זו. תודה שלוחה לפרופ' דינה בן-יהודה, על נכונותה לתרום מעצותיה לשכלול הנוסח הסופי של העבודה. תודה מיוחדת והערכה רבה שלוחות לגב' דנה פינצ'י יחזקאל ולמר גוראן רייס. בטרם יצאה לגמלאות מעבודתה ביחידה להמטולוגיה בהדסה הר-הצופים, דנה ליוותה אותי באופן צמוד, תוך הפגנת סבלנות ואדיבות מרובות, בעבודה המעשית במעבדת-המחקר שבה בוצעו בדיקות ה- ELISA. גוראן, שפרש גם הוא לגמלאות מעבודתו במעבדת הביוכימיה בהדסה הר-הצופים, סייע לי במסירות, בליווי יחס חם, בביצוע הבדיקות למדידת רמת ה- CRP. עזרתה של גב' טלי בדולח-אברם, העובדת כסטטיסטיקאית של ביה"ס לרפואה של האוניברסיטה העברית ו"הדסה", אפשרה את הניתוח הסטטיסטי של הנתונים המעבדתיים והקליניים שנאספו בעבודה זו. תודתי שלוחה לטלי על סיועה המקצועי והאדיב. לבסוף, אבקש להודות לבני משפחתי ולשירה, בת-זוגי, שליוו אותי במהלך כתיבת-העבודה, היטו אוזן לחוויותיי והפגינו סבלנות, גם בימים שבמהלכם הקדשתי שעות ארוכות להתקדמות בעבודה, על חשבון השהות עימם. תודתי והערכתי שלוחה לכל אחד מהנזכרים לעיל, ולכל המסייעים האחרים, שייתכן ושכחתי לציינם ברשימה זו. 2

3 ה. ב) 1. מבוא.(Acute סרום עמילואיד A סרום עמילואיד A SAA) (serum amyloid,a הינו חלבון הפעיל בפאזה החריפה של תהליכים דלקתיים protein) phase רמתו בדם עולה עד פי 1,000 כתגובה למצבי דחק שונים, כגון טראומה, זיהום, דלקת או ממאירות SAA- הוא (2) Apo-lipoprotein המיוצר בעיקר בכבד. מוכרים 4 גנים למשפחת ה- SAA הממוקמים על (1) הזרוע הקצרה של כרומוזום SAA1 11: ו- SAA2 האחראים לייצור החלבונים במהלך התגובה האקוטית,,SAA3 הנחשב בעבר לגן ללא תוצר חלבוני, אך ידוע כגן המקודד ל- mrna בתגובה לגירוי הורמונלי או חיידקי (3) ו- SAA4 המתבטא קונסטיטוטיבית. לצד ביטויים בכבד, SAA זוהה גם בנגעים טרשתיים בכלי-דם, ברקמות סינוביאליות של חולי Rheumatoid Arthritis וברקמות אנושיות תקינות. החלבון מבוטא אף ברקמות העוברות התמרה ממאירה. תפקידו של SAA בבריאות ובחולי אינו ברור דיו; ידוע כי החלבונים משתלבים במטאבוליזם השומן בגוף וכן בפעילותה של מערכת החיסון. חלבוני SAA נקשרים ל-( Lipoprotein,HDL (High Density ובכך מגבירים את האפיניות של HDL למקרופאגים (4 זמן דלקת. חלבוני SAA ניחנים גם ביכולת קישור לחומר-חוץ-תאי, ביכולת למשוך מונוציטים ולימפוציטים וכן לעודד הפרשת ציטוקינים. SAA מוכר עמיל אידוזיס מסוג AA המתפתחת משנית למחלות דלקתיות. גם כחלבון precursor במחלת זיקת החלבונים למגוון ממאירויות נבחנה בעבר: Weinstein מצא שרמת ה- SAA בדם של חולים עם ממאירות גרורתית גבוהה מהרמה המקבילה בדם של חולים עם ממאירות מוגבלת (5). אף נמצא מתאם בין הרמה הממוצעת של SAA לזו של (CRP) C-reactive protein בדמם של חולים במחלות ממאירות. נראה כי קיים מתאם חיובי בין SAA ברקמות של חולים במחלות ממאירות במערכת העיכול ובמערכת הרבייה הנשית, לבין מידת החומרה של המחלה. במעבדתנו נמצא כי ביטוי ה- mrna SAA בתאי אפיתל של מעי גס, הולך ומוגבר עם המעבר מרקמת מעי גס תקינה, דרך פוליפ וכלה בגידול ראשוני של רקמת המעי הגס. צביעות אימונוהיסטוכימיות גילו כי גם החלבון עצמו מתבטא ברקמות המעי הגס (6). כן נמצא כי ביטוי ה- mrna SAA בגידולי שחלה אפיתליאליים, מוגבר עם העלייה ב- Grade הגידולי (7). לשון אחר, ביטוי מוגבר של SAA בחולים עם ממאירויות עשוי להימדד הן בדם ההיקפי והן ברקמות הסולידיות שעברו התמרה. ממצאים אלו מרמזים כי 3

4 SAA איננו מיוצר רק על ידי Hepatocytes כי אם גם על ידי תאים של רקמות ממאירות. זיקתו של ה- SAA אינה מוגבלת לממאירויות סולידיות; הקשר בין החלבון לבין ממאירויות המטולוגיות הוצג כבר לפני שנים רבות. בשנות ה- 70 של המאה הקודמת, הודגמה רמת SAA מוגברת בסרום של חולים שאובחנו אצלם סוגים שונים של לימפומה, לויקמיה,,Amyloidosis associated with Multiple Myeloma ו- Myeloma (8). IgA בחלוף כעשור, הודגמה נוכחות של protein AA like material בדגימות כליה של חולי (9). Primary and Myeloma associated Amyloidosis במחקר אחר מאותה תקופה הודגם כי SAA קיים כ- Apolipoprotein של HDL בחולי.(10) Multiple Myeloma אף במעבדתנו נבחן הקשר שבין SAA לבין ממאירויות המטולוגיות. מחקרים שנערכו במעבדתנו אך טרם פורסמו, מצביעים על ביטוי מוגבר של SAA בחולים עם ממאירויות המטולוגיות, במיוחד אלו מהשורה הלימפואידית (11). באחד המחקרים, נבחנו חתכי מח עצם בשיטת.Non-radioactive In-situ hybridization צביעת החתכים, שתוצאותיה מוצגות להלן, מלמדת כי חלבון ה- SAA איננו קיים רק בדמם של חולי Multiple Myeloma כי אם מתבטא גם ברקמה הסולידית, במקרה זה מח העצם תמונה 1 Specimens Non-radioactive In-situ Hybridization Staining of Bone Marrow בשלוש התמונות המופיעות לעיל נראים חתכי מח עצם צבועים לאחר Non-radioactive In-situ Hybridization ל- SAA. הציטופלזמה של התאים שבהם זוהה ביטוי של mrna המקודד ל- SAA נצבעה 4

5 Multiple,(1 בכחול. הביטוי שלילי-חלש בתאי מח עצם של אדם בריא (תמונה חזק במח עצם של חולה MGUS (Monoclonal gammopathy 2) וחלש-בינוני וספציפי בתאי פלזמה של נבדק עם (תמונה Myeloma מצב מקדים של מחלת תאי-פלזמה קלונלית, העלול לבשר,(of undetermined clinical significance התפתחות של Multiple Myeloma (תמונה 3). Multiple בהשראת מחקרים אלו, בעבודה זו תיבחנה רמות חלבון ה- SAA בדגימות דם שנלקחו מחולים ב-.Plasma Cells מחלה מונוקלונאלית של,Myeloma מיאלומה נפוצה מיאלומה היא ממאירות-דם, שבה חלה במוח-העצם התרבות של clone של תאי,Plasma תאים מייצרי-נוגדנים שמוצאם בשורה הלימפואידית הבשלה. ההתרבות הבלתי-מבוקרת של תאי ה- Plasma עלולה להוביל להרס השלד עם הופעת נגעים אוסטיאוליטיים, פגיעה במאסת העצם (Osteopenia) ויצירת שברים פתולוגיים. ביטויי המחלה כוללים גם אנמיה, היפרקלצמיה, ופגיעה כלייתית (12). לרוב, המחלה מתפתחת מ- MGUS :,Monoclonal gammopathy of undetermined clinical significance שבה עשויה לחול התרבות קלונאלית אסימפטומטית של תאי פלזמה. התמרת חלה בתהליך התאים מורכב הכולל טרנסלוקציות כרומוזמליות לצד תמורות במיקרו -סביבה של התאים, כמו שינויים בביטוי מולקולות תאחיזה על פני התאים, הפרשת ציטוקינים וגורמי גדילה וכן ערעור של תהליכי שחלוף העצם (12). עם הכלים המעבדתיים המסייעים לאבחון Myeloma נמנים בדיקת מוח-עצם ובדיקה של נוכחות נוגדנים מונוקלונליים המופרשים מתאי הגידול. ה-( ISS ) International Staging System לקביעת ה- Stage של ה- Myeloma משמשות שתי שיטות: כוללת שלושה Stages המוגדרים לפי הרמות בדם של 2-microglobulin ואלבומין, בעוד שה- Staging Durie-Salmon נסמכת על רמות ההמוגלובין, הסידן, האימונוגלובולינים והקריאטינין בדם, כמות החלבון המונוקלונאלי המופרש בשתן, ומספרם של הנגעים הליטיים בעצמות. טרנסלוקציות כרומוזומליות מסייעות לקביעת קבוצת הסיכון שבה נתון המטופל ולהערכת הפרוגנוזה שלו. 5

6 לאור הזיקה הידועה בין SAA לבין ממאירויות המטולוגיות, ובמיוחד אלו שמקורן לימפואידי, ייערך בעבודה זו נסיון לבחון את אופי הזיקה שבין SAA לבין.Multiple Myeloma מטרת העבודה מטרת העבודה היא לבחון את רמות חלבון ה- SAA בדם של חולי,Multiple Myeloma תוך השוואת רמה זו לרמת ה- SAA בדמם של נבדקים בריאים (קבוצת הביקורת). כמו כן, בעזרת איסוף פרמטרים קליניים מרובים על המטופלים (כדוגמת אחוז תאי הפלזמה בביופסית מח-העצם, קיום או היעדר מעורבות חוץ לשדית, וה- Stage של המחלה לפי שתי שיטות ה- Staging שהוזכרו לעיל - ה- ISS וה- Staging,(Durie-Salmon ייערך ניסיון לבדוק האם קיים קשר בין רמת הביטוי של ה- SAA בדם החולים לבין השלב הקליני של מחלתם ומאפייניה. לאור היותו חלבון,acute phase תיערך השוואה בין ה- SAA לבין נוכחות חלבון אחר מקבוצת חלבוני התגובה:- C (CRP) CRP.Reactive Protein ידוע כ- Reactant Positive Acute Phase שרמתו בדם עולה הן במסגרת תגובה דלקתית בגוף החולה (13) והן ב- Myeloma (14, Multiple 15). הנחת היסוד של עבודה זו היא כי יימצא ביטוי מוגבר של SAA בדמם של הנבדקים החולים. השערה ראשונית נוספת שניצבה בבסיס עבודה זו הייתה כי ככל שה- Stage של המחלה גבוה יותר, כך ביטוי ה- SAA יוגבר. הממצאים בעבודה זו עשויים לתרום להבנת התפקיד של SAA בפתוגנזה של.Multiple Myeloma זיהוי קשר בין הפתוגנזה של לבין מיאלומה עשוי לפתוח צוהר לשימוש עתידי בחלבונים ככלי מעבדתי משלים בהערכת SAA המחלה, בדומה לשימוש במרקרים אונקולוגיים מוכרים, כדוגמת (PSA) Prostate specific antigen ו-( CEA ).Carcinoembryonic antigen עבודה זו אף עשויה לעודד מאמצים עתידיים שיקבעו האם ה- SAA יוכל לשמש כחלבון-מטרה טיפולי. 6

7 2. שיטות א. אוכלוסית החולים: במחקר זה נבחנו דגימות דם פריפרי של חולי,Plasma-Cell Dyscrasis ובראשן - Myeloma.Multiple לצורכי המחקר נאספו דגימות דם פריפרי של 93 חולים ו- 21 דגימות דם של תורמים בריאים (קבוצת בקורת). איסוף דגימות הדם בוצע לאחר שנתקבל אישור לעריכת הניסוי מועדת הלסינקי המוסדית. דגימות הדם של החולים כללו דגימות של חולי,Multiple Myeloma לצד דגימות דם של נבדקים שאובחנו עם MGUS, Smoldering Myeloma, נוספות, כמפורט להלן: Plasma-Cell Dyscrasias.Primary ו- Amyloidosis Light-Chain Deposition Disease,Plasma-Cell Leukemia הדגימות חולקו ל- 4 קטגוריות אבחנתיות ראשיות: קטגוריה אחת, המכונה,Multiple Myeloma כוללת את הדגימות של חולי ה- Myeloma Multiple וה- Leukemia Plasma-Cell עם מחלה פעילה. קטגוריה שנייה כוללת את החולים עם Smoldering Myeloma (מחלה שאינה פעילה, המתאפיינת באחוז תאי פלזמה במח העצם העולה על 10% או ב- Paraprotein הגבוה מ- 3 גרם). קטגוריה שלישית הוקדשה לאנשים שאובחנו עם MGUS וקטגוריה רביעית המכונה,Primary Amyloidosis כוללת את דגימות החולים עם Primary Amyloidosis ו- Light Chain.Deposition Disease הממצאים שעלו מניתוח דגימות-הדם, שימשו לעריכת אנליזות סטטיסטיות, בניסיון למצוא קורלציות עם הנתונים הקליניים של הנבדקים. נתונים אלו נאספו מתוך תיקיהם הרפואיים הממוחשבים. על החולים נאספו הנתונים הקליניים הבאים: מין המטופל וגילו בזמן אבחנת המחלה, התאריך שבו בוצעה אבחנת המחלה, מה MGUS הייתה אבחנת המטופל Myeloma),Multipe Myeloma, Smoldering וכדומה), האם הדגימה מדם (Relapse) המטופל נלקחה סביב מועד האבחנה או סביב התלקחות המחלה ומהו השיעור (באחוזים) של תאי הפלזמה בדגימה שהופקה בביופסית מח-עצם. נתונים קליניים נוספים שנאספו היו רמת ה- Albumin וה-- Beta-2 Microglobulin ששימשו לקביעת דרגת ה-( System,ISS (International Staging וכן הנתונים הנדרשים לקביעת דרגת ה- Staging,Durie-Salmon לרבות המוגלובין, רמות אימונוגלובולינים, סידן וקריאטינין בדם והערכה של מספר הנגעים הגרמיים הליטיים בהדמיות. עוד נתונים קליניים שנאספו היו האם זוהה חלבון מונוקלונאלי בדם 7

8 המטופל, ואם זוהה, מה היו מאפייניו: סוג הנוגדן המונוקלונאלי IgM,IgG, IgA, האם זוהו רק שרשראות קלות של הנוגדן המונוקלונאלי Jones),(Bence ומהו סוג השרשראות הקלות Lambda.Kappa or הציטוגנטיקה של המטופלים נבחנה גם כן, בשאלה האם, ואם כן אילו, הפרעות כרומוזומליות זוהו אצל המטופלים (טרנסלוקציות, נתונים קליניים נוספים שקובצו היו האם זוהתה מעורבות חוץ-לשדית.(Hypo-/Hyperdiploidy כמו כן, נאספו נתונים לגבי סוג הטיפול הראשון שקיבל המטופל Involvement) (Extramedullary של המחלה. (Survival) ותגובתו לטיפול. בנוסף, נאספו נתונים על הישרדות המטופל, כאשר השרידות מוגדרת כפרק הזמן (בחודשים) שחלף ממועד לקיחתה של דגימת הדם, ששימשה לבדיקת רמות ה- SAA וה- CRP, ועד למועד האחרון שבו נודעו פרטים כלשהם על המטופל, בין אם המדובר בתאריך הפטירה ובין אם בתאריך המעקב הרפואי האחרון. ב. קביעת ריכוז חלבון ה- SAA בדם ההיקפי בשיטת ELISA אנליזת דגימות הדם בוצעה בשיטת (ELISA).Enzyme-Linked Immunosorbent Assay בשיטה נעשה שימוש בעבר במעבדה, כפי שפורסם (7). הערכה Kit) (ELISA ששימשה בעבודה זו יועדה למדידת רמות Human SAA ויוצרה ע"י.Invitrogen Corporation ל- SAA שלושה איזופורמים (Isoforms) מוכרים: SAA1 ו- SAA2 ידועים כ- Reactants,Acute Phase כאשר SAA1 הוא האיזופורם שרמתו עולה משמעותית במצבי דחק, בעוד ש- SAA2 מתבטא ברמות נמוכות. האיזופורם השלישי הוא SAA4 המתבטא באופן קונסטיטוטיבי. ערכת ה- ELISA, שבה נעשה שימוש בעבודה זו, מודדת בעיקר את רמת האיזופורם.SAA1 בעלון היצרן המצורף לערכה (16), אין נתון כמותי מדוייק באחוזים המציין את הרגישות (Sensitivity) של הערכה, אולם נטען כי הריכוז המינימלי של SAA ממקור אנושי שאותו הערכה מסוגלת לזהות הוא "נמוך (כך במקור-ע.א.) מ- 4 נ"ג/מ"ל". (Specificity) בעלון אף אין נתון כמותי מדוייק המציין את באחוזים הסגוליות של הערכה, אולם ה-- Cross של הערכה נמוכה מאוד. היצרן ערך בעזרת הערכה ניסיונות זיהוי של מגוון חלבונים ממקור אנושי reactivity רקומביננטי, חלבונים שמקורם בעכבר וחלבונים שמקורם בחולדה. החלבון היחידי שזוהה בשוגג על ידי ערכת ה- ELISA כחלבון SAA ממקור אנושי, היה חלבון SAA1 שמקורו בעכבר SAA1).(rMs בעבודות קודמות שבהן נבדק ערך ה- SAA בנבדקים בריאים, נמצא SAA בערך ממוצע של (17) 3.7 mg/l 8

9 וערך חציוני של (18). 3 mg/l באופן כללי, ELISA מבוססת על שקיעה של תצמידי אנטיגן-נוגדן. נוגדן ספציפי לחלבון ה- SAA מוסף אל באר- פלסטיק קטנה, הצפויה להכיל את הדגימה הביולוגית. ביצוע שטיפה מותיר בבאר הפלסטיק רק את הנוגדנים היוצרים תצמידים עם החלבון המבוקש. לאחר השטיפה, מוסף סוג שני של נוגדנים הספציפיים לנוגדן הראשון. הייחוד של הנוגדנים מהסוג השני טמון בצימודם לאנזים. האנזים מאפשר תגובה כימית המתבטאת בשינוי צבע לאחר הוספת סובסטראט.(Chromogen) לאחר הוספת תמיסה העוצרת את התגובה הכימית Solution),(Stop ניתן למדוד את עוצמת הצבע או הצפיפות האופטית Density).(Optical לריכוז ה- SAA בכל אחת מהדגימות שנבדקו. הצפיפות האופטית מצויה ביחס ישר שלבי העבודה שבוצעה בעבודה זו בעזרת הערכה למדידת רמת ה- SAA,Human מפורטים בכתב להלן, ומוצגים באיור המצורף בהמשך: 1. הכנה ומיהול של הדגימות ששימשו כבסיס לגיבוש עקומת ה- Standard וכ- Controls, וכן הכנה ומיהול של דגימות ה- Plasma של הנבדקים החולים והבריאים. 2. לכל באר-פלסטיק, שצופתה ע"י היצרן בנוגדן ל- SAA,Human הוספה דגימת Control,Standard או.Plasma 3. לכל באר הוספו 50 מיקרוליטר נוגדן ל- SAA המצומד ל- Biotin. 4. הדגרת הדוגמאות בבאריות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. 5. ריקון תכולת הבאריות ושטיפתן 4 פעמים עם תמיסת שטיפה שהוכנה מראש. 6. לכל באר הוספו 100 מיקרוליטר של Streptavidin המצומד לאנזים (HRP).Horseradish Peroxidase התמיסה הודגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ואז תכולת הבאריות רוקנה ונערכו 4 שטיפות. 7. לכל באר הוספו 100 מיקרוליטר של TMB) Stabilized Chromogen (Tetramethylbenzidine, ונערכה הדגרה של התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. 8. לכל באר הוספו 100 מיקרוליטר של.Stop Solution 9. עוצמת הצבע שהתפתח בכל באר, וליתר דיוק הצפיפות האופטית Density),(Optical נמדדו ע"י 9

10 ה,.450nm באורך גל של Microtiter plate reader 10. ריכוז ה- SAA בכל אחת מדגימות הדם חושב תוך הסתייעות בעקומה שגובשה על בסיס ערכי ה- SAA שנמדדו בדגימות ה- Standard. דוגמא לעקומה ממין זה, השאולה מאחד מניסויי ה- ELISA שנערכו במסגרת עבודה זו, מצורפת להלן: גרף מספר 1 דוגמא לעקומת סטנדרט מניסוי ELISA הגרף מציג "עקומת סטנדרט" הלקוחה מניסוי ה- ELISA השביעי במספר שבוצע במסגרת העבודה: ניתן לראות (450 את ערכי ה- Density Optical (נקראו באורך גל של nm כתלות במיהולי ה- SAA השונים של תמיסת ה- 150). יש לשים לב כי ציר y מציין את ערך ה- Optical,75 Standard ביחידות של נ"ג/מ"ל,0),37.5,18.8,9.4 Density שממנו מנוכה "ערך הרקע".Background- ערך ה- Background הוא ערך ה- Optical Density שנמדד בעבור תמיסת Standard במיהול של O. ng/ml לעיתים, ערך ה- Background שונה מאפס, בגלל בליעה מסויימת של הריאגנטים. ניתן לראות כי קיים מתאם חיובי חזק בין ריכוז תמיסת הסטנדרט לבין ה- Density (0.9667=R²). Optical על מנת להבהיר את השלבים השונים של שיטת ה- ELISA, מצורף התרשים המאוייר הבא, השאול מתוך העלון ל- :(16) Invitrogen של חברת ELISA Kit 10

11 תמונה 2: תרשים להמחשת שלביו של ה- ELISA למדידת רמת ה- SAA האנושי 11

12 ג. קביעת ריכוז CRP בדם היקפי בדגימות הדם (הפלזמה) של הנבדקים החולים והבריאים נקבעו גם ריכוזי ה- CRP. לצורך כך, נעשה שימוש במכשיר IN),COBAS INTEGRA 800 (Roche Diagnostics, Indianapolis, המצוי במעבדה לביוכימיה Particle Enhanced Turbidimetric קלינית בבית החולים "הדסה" הר-הצופים. המכשיר פועל לפי שיטת ה- חלבון ה- CRP בדגימות הפלזמה עובר צימוד לנוגדנים מונוקלונליים ל- CRP ונוצרים :Immunoassay (PETIA) ככל שריכוז ה- CRP.(Latex particles) הנוגדנים עצמם מצפים חלקיקי לטקס.Antigen-Antibody complexes גבוה יותר, צפויים להיווצר יותר קומפלקסים של נוגדן (המצפים לטקס) ואנטיגן, ומידת העכירות (turbidity) של הדגימה צפויה להיות רבה יותר. העכירות נמדדת בצורה כמותית ע"י העברת קרן אור באורך גל של.552nm מידת העכירות מתורגמת על-ידי המכשיר לריכוז ה- CRP בדגימה. 12

13 3. שיטות סטטיסטיות במסגרת עבודה זו, נעשה שימוש במגוון שיטות לניתוח סטטיסטי. על מנת לבחון את הקשר בין שני משתנים קטגוריאליים, נעשה שימוש במבחן χ 2 או במבחן המדוייק של פישר.(Fisher s Exact test) השוואת משתנה כמותי, בין שתי קבוצות בלתי-תלויות, מבחן Mann-Whitney הא-פרמטרי. נעשתה בעזרת מבחן,(t-test) t או השוואת משתנה כמותי, בין שלוש קבוצות או יותר, נעשתה בעזרת מבחן ניתוח שונות,(ANOVA) או במבחן Kruskal-Wallis הא-פרמטרי. הקשר בין שני משתנים כמותיים נאמד על ידי חישוב מקדם המתאם של Pearson ומקדם המתאם של.Spearman ניתוח הישרדות נעשה בעזרת מודל,Kaplan-Meier מבחן Log Rank להשוואת עקומות הישרדות וכן בעזרת מודל.COX Regression כל המבחנים הסטטיסטיים היו דו-כיווניים. ערך P של 5% או פחות נחשב כמובהק סטטיסטית. 13

14 4. תוצאות א. תיאור נתוני הנבדקים החולים והבריאים דגימות הדם ההיקפי ששימשו בעבודה נלקחו מ- 93 חולים שאובחנו עם Plasma-Cell Dyscrasias ומ- 21 נבדקים בריאים (קבוצת ביקורת). להלן מוצגות שתי טבלאות עם מאפייני הנבדקים: טבלה 1 מסכמת את נתוני החולים ואילו טבלה 2 מסכמת את נתוני הנבדקים הבריאים. טבלה 1 סיכום נתוני החולים MGUS (N=5) MM (N=69) SMM (N=3) 1-AL (N=16) P value מין החולה: מספר החולים (%) א. נשים ב. גברים 2 (40) 3 (60) 30 (43.48) 38 (55.07) 2 (66.66) 1 (33.33) 9 (56.25) 7 (43.75) 0.72 ג. לא ידוע - 1 (1.45) - - גיל החולה באבחנה (שנים) ( range) 69 א. חציון (48 75) 64 (33 89) 71 (65-73) 65.5 (35 92) 0.64 עיתוי לקיחת הדגימה מס' החולים (%) א. Diagnosis ב. Relapse 5 (100) 0 (0) 38 (55.07) 31 (44.93) 3 (100) 0 (0) 15 (93.75) 1 (6.25) אחוז תאי ה- Plasma במח העצם (2-100) (10-20) 15 (2-100) 45 (2-10) 5 א. חציון range) ( דרגת ה- ISS : מספר החולים (%) א. Stage I ב. Stage II ג. Stage III - 27 (58.7) 13 (28.3) 6 (13) 3 (100) 0 (0) 0 (0) - N/A 14

15 MGUS (N=5) MM (N=69) SMM (N=3) 1-AL (N=16) P Value דרגת ה- Durie-Salmon : מס' החולים (%) א. Stage I ב. Stage II ג. Stage III (14.52) 8 (12.9) 45 (72.58) 3 (100) 0 (0) 0 (0) N/A סוג החלבון המונוקלונאלי: מס' החולים (%) (40) 2 א. IgG 32 (50) 1 (33.33) 6 (37.5) (20) 1 ב. IgA 12 (18.75) 1 (33.33) 2 (12.5) 0.51 (20) 1 ג. IgM 1 (1.56) 0 (0) 0 (0) (20) 1 ד. LC 17 (26.6) 1 (33.33) 8 (50) (0) 0 ה. Non-Secretory 2 (3.1) 0 (0) 0 (0) סוג השרשרת הקלה: מס' החולים (%) (60) 3 א. Kappa 36 (56.3) 1 (33.33) 5 (31.25) 0.43 (40) 2 ב. Lambda 26 (40.6) 2 (66.66) 11 (68.75) (0) 0 ג. Non-Secretory 2 (3.1) 0 (0) 0 (0) 15

16 MGUS (N=5) MM (N=69) SMM (N=3) 1-AL (N=16) P Value ציטוגנטיקה סוגי השינויים הכרומוזומליים: מס' החולים (%) א. Bad 0 7 (13.5) 0 (0) 0 (0) ב. Good ג. Intermediate (15.4) 17 (32.7) 1 (100) 0 (0) 1 (16.66) 0 (0) 0.15 (100) 3 ד. Other 20 (38.5) 0 (0) 5 (83.33) 2 ה. Not Done מקרא טבלה 1: סיכום נתוני החולים קיצורים: MGUS Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance, MM Multiple Myeloma, SMM Smoldering Multiple Myeloma, 1-AL Primary Amyloidosis, ISS International Staging System, LC Light Chain, N/A Not applicable הערות לטבלה 1: סיכום נתוני החולים t(11;14) כוללת Good קטגורית.t(4;14), t(14;16), 17p- א. ציטוגנטיקה: קטגורית Bad כוללת ו- hyperdiploidy. קטגורית Intermediate כוללת -13q. קטגורית Other כוללת שינויים בלתי ספציפיים בכרומוזום 14 לצד ציטוגנטיקה תקינה. קטגורית Not Done כוללת מטופלים שלא נערכה בעבורם הבדיקה. אצל חלק מהנבדקים זוהו מספר שינויים כרומוזומליים בעבור אותו מטופל. במקרים אלו, המטופל סווג לפי הממצא הציטוגנטי המבשר את הפרוגנוזה הגרועה יותר. 16

17 טבלה - 2 נתוני הנבדקים הבריאים (קבוצת הביקורת) מספר הנבדקים (%) הקטגוריה הנבחנת מין א. נשים ב. גברים 6 (28.6) 15 (71.4) גיל (שנים) (range) 29 א. חציון (22 32) 17

18 ב. ההבדלים ברמת חלבוני ה- SAA וברמת חלבוני ה- CRP בין קבוצות המחקר בניסויי,ELISA נמדדו רמות חלבוני ה- SAA וה- CRP בדגימות הדם ההיקפי שנלקחו מ- 93 חולים ומ- 21 נבדקים בריאים (קבוצת ביקורת). בשל מיעוט החולים בכל אחת משתי הקטגוריות של MGUS ושל,SMM אוחדו שתי האבחנות. סיכום התוצאות מובא בטבלה מס' 3: טבלה מספר 3: ערכי ה- SAA וה- CRP בדגימות דם היקפי של החולים והבריאים SAA (µg/ml) CRP (mg/dl) MGUS & SMM (N=8) (9 294) 0.22 ( ) MM (N=69) (3 3,094) ( ) 1-AL (N=16) (3 1,915) 0.43 ( ) Healthy (N=21) (2 61) 0.06 ( ) הערה לטבלה 3 כל הערכים של ה- SAA ושל ה- CRP הם ערכי החציון,(median) כאשר בסוגריים מופיע טווח הערכים, מהערך הנמוך ביותר לערך הגבוה ביותר.(range) כמודגם בגרף 2, קיים הבדל מובהק בין ערכי ה- SAA של 4 קבוצות המחקר השונות (0.019=p). אף בין ערכי ה- CRP של 4 קבוצות המחקר השונות קיים הבדל מובהק, כמודגם בגרף (0.001=p). 3 ההבדל שבין ערך ה- SAA של קבוצת ה- Myeloma Multiple לבין ערך ה- SAA של קבוצת ה-,MGUS & SMM וההבדל שבין ערך ה- SAA של קבוצת ה- Myeloma Multiple לבין ערך ה- SAA 18

19 של קבוצת הבריאים נמצאו כמובהקים ביותר. בערכי ה- CRP נמצאו הבדלים מובהקים באותה המידה בין קבוצות אלו. גרף 2 ההבדל בערכי ה-( µg/ml ) SAA של קבוצות המחקר הערה לגרף 2: חלק מערכי ה- SAA החריגים, העולים על 1,000 µg/ml אינם מופיעים בגרף 2, לאחר הגדלת עמודות הגרף והתרכזות בטווח שבו נתונים רוב הערכים. ההגדלה בוצעה על מנת להמחיש את ההבדל הקיים בין ערכי ה- SAA של קבוצות המחקר השונות. יש לציין כי במסגרת העיון בכלל הממצאים של עבודה זו, פעמים רבות נמצא כי ההתפלגות של ערכי ה- SAA וערכי ה- CRP אינה נורמלית. ההתפלגות החריגה מתבטאת לעיתים בהבדל משמעותי בין הערך הממוצע לבין ערך החציון, כאשר הממוצע לרוב גבוה מהחציון. הבדל זה משקף את קיומם של ערכים מועטים החריגים בגובהם, המסיטים את הממוצע כלפי מעלה. לדוגמא, בקבוצת חולי ה- MM, טווח הערכים של SAA היה 3,094, g/ml 3 g/ml עם ממוצע g/ml) ) הגבוה משמעותית מהחציון.(75.5 g/ml) 19

20 גרף 3 ההבדל בערכי ה-( mg/dl ) CRP של קבוצות המחקר 20

21 ג. מתאם (קורלציה) בין ערכי ה- SAA לבין ערכי ה- CRP ניתוח סטטיסטי לפי מבחן Pearson מלמד כי קיים מתאם (קורלציה) חיובי חזק (0.821) בין ערכי ה- SAA לבין ערכי ה- CRP בעבור כל 114 הדגימות הכלולות במחקר. מבחן א-פרמטרי (Spearman) מאושש את קיומו של מתאם חיובי (0.71) בין שני החלבונים. בשל זיהוי של חפיפה משמעותית בייצוג הגרפי בין הנקודות המייצגות את ערכי ה- SAA לבין אלו המייצגות את ערכי ה- CRP, חושב המתאם בין Log SAA לבין Log CRP לפי (0.74). Pearson מתאם זה מוצג בגרף 4: גרף 4 תצוגה לוגריתמית של המתאם (קורלציה) בין ערכי ה-( SAA(µg/mL לבין ערכי ה-( CRP(mg/dL בקבוצות המחקר השונות בהשוואה בין 4 קבוצות המחקר, קיים הבדל בעוצמת המתאם בין שני החלבונים: בשני המבחנים, המתאם החזק ביותר קיים בקבוצת ה- 1-AL (0.95 לפי,Pearson 0.79 לפי.(Spearman המתאם השני בחוזקתו קיים בקבוצת ה- Myeloma (0.79 Multiple לפי,Pearon 0.67 לפי.(Spearman 21

22 המתאם השלישי בחוזקתו קיים בקבוצת הנבדקים הבריאים (0.64 לפי,Pearson 0.49 לפי (Spearman והמתאם הרביעי בחוזקתו קיים בקבוצת ה- SMM (0.37 MGUS & לפי,Pearson 0.29 לפי.(Spearman על מנת להבין את משמעות העלייה ברמות בין הקבוצות השונות, קבענו ערך סף ל- SAA : אחוזון ה- 90 של ערכי ה- SAA של קבוצת הבריאים (הביקורת). ערך זה חושב ונמצא שהוא µg/ml ערכי ה- SAA שייבחנו ביחס לערך זה יכונו.SAA Categorized הרף שנקבע ל- CRP הוא הסף התקין העליון המקובל בקיטים של היצרן המספק את הציוד למעבדת השירות:.CRP Categorized ביחס לערך זה יכונו שייבחנו (19, 20). ערכי ה- CRP 0.5 mg/dl נמצא כי קיימת זיקה מובהקת (0.001>p) בין ערכי ה- categorized SAA ל- categorized CRP כפי שמוצג בטבלה 4: טבלה 4 ערכי ה- Categorized SAA וה- Categorized CRP של 88 חולים CRP, categorized (mg/dl) Total SAA categorized (µg/ml) Total SAA<=22.8 SAA>22.8 CRP<=0.5 CRP>0.5 Count % of Total 20.5% 3.4% 23.9% Count % of Total 31.8% 44.3% 76.1% Count % of Total 52.3% 47.7% 100.0% מעניין לציין כי אצל 57 חולים (64.8%), נמצאה התאמה בין ערך ה- categorized SAA לבין ערך 22

23 ה- categorized :CRP בעבור 18 חולים (20.5%) נמצאו הן ערכי SAA והן ערכי CRP הנמוכים מסף הייחוס, ובעבור 39 חולים (44.3%) נמדדו הן ערכי SAA והן ערכי CRP הגבוהים מסף הייחוס. אצל 31 חולים בלבד (35.2%) זוהה שוני בין ערכי ה- SAA לערכי ה- CRP : ערך CRP גבוה מסף היחס עם ערך SAA נמוך מסף הייחוס, או ערך CRP הנמוך מסף הייחוס עם ערך SAA הגבוה מסף הייחוס. 23

24 -68 חולים ב) ד. הבדל בערכי ה- SAA וה- CRP מקבוצת ה- MM לפי עיתוי לקיחת הדגימה Diagnosis/Relapse) 37 מהדגימות (54.4% מכלל דגימות הקבוצה) נלקחו בעת האבחנה, בעוד ש- 31 דגימות (45.6%) מכלל דגימות הקבוצה) נלקחו בעת.Relapse טבלה 5 מרכזת את עיקרי הנתונים אודות ערכי ה- SAA וה- CRP של החולים בקבוצת ה- MM תוך חלוקת הדגימות לפי העיתוי שבו נלקחו. טבלה 5 הנתונים אודות ערכי ה- SAA וה- CRP של קבוצת ה- Myeloma Multiple באבחנה ובהתלקחות SAA (µg/ml) CRP (mg/dl) Diagnosis (N=37) Relapse (N=31) (3 3,094) 0.61 ( ) (9 858) 0.50 ( ) הערה לטבלה 5 ערכי ה- SAA וה- CRP מציינים את ערכי החציון. בסוגריים מצויין טווח הערכים, מהערך הנמוך ביותר לערך הגבוה ביותר. ערך החציון של ה- SAA 63) µg/ml) באבחנה נמוך מערך החציון של ה- SAA ב- Relapse 87), µg/ml) אך הבדל זה איננו מובהק סטטיסטית (0.15=p). גם בין ערכי החציון של CRP לא נמצא הבדל מובהק מבחינה סטטיסטית (0.24=p). 24

25 ה. ערכי ה- SAA וה- CRP בזיקה לדרגת ה-( ISS ) International Staging System סיווג ה- ISS בוצע בעבור 59 מתוך 93 החולים. לאור מיעוט החולים היחסי בכל אחת משתי הדרגות המתקדמות של שיטת ה- Staging (17 Stage II חולים) ו- III (9 Stage חולים), ומתוך ניסיון להגדיל את הסיכוי לזהות ממצאים בעלי מובהקות סטטיסטית, שתי הקטגוריות של Stage II ושל Stage III כונסו יחדיו בניתוחים הסטטיסטיים. בקרב 59 החולים, ערך ה- SAA החציוני הוא 81 µg/ml (טווח: 5) µg/ml 3,094 µg/ml וערך ה- CRP החציוני הוא 0.39 mg/dl (טווח:.(0.04 mg/dl 5.95 mg/dl אצל 33 החולים ב- 1,Stage ערך ה- SAA החציוני הוא 56 µg/ml (טווח: (5 µg/ml - 3,094 µg/ml.(0.06 mg/dl וערך ה- CRP החציוני הוא 0.5 mg/dl (טווח: 5.95 mg/dl בעבור 26 החולים בקבוצה המשותפת ל- 2 Stage ול- 3,Stage ערך ה- SAA החציוני הוא 86.5 µg/ml (טווח: (10 µg/ml 648 µg/ml וערך ה- CRP החציוני הוא mg/dl (טווח:.(0.04 mg/dl 5.94 mg/dl אין הבדל מובהק בערכי ה- SAA בין Stage I לבין הקטגוריה המאחדת את Stage II עם Stage III.(p=0.67) לא נמצא אף הבדל מובהק בערכי ה- CRP בין Stage I לבין הקטגוריה המאחדת את Stage II עם Stage III.(p=0.41) הגרף הבא מציג את התפלגות ערכי ה- SAA תוך חלוקת הממצאים לשתי קטגוריות על סמך סיווג ה- ISS :.Stage III עם Stage II לעומת איחוד של Stage I 25

26 גרף 5 התפלגות ערכי ה-( µg/ml ) SAA לפי דרגת ה- ISS 26

27 ו. ערכי ה- SAA וה- CRP בזיקה לדרגת ה- Staging Durie-Salmon סיווג ה- Durie-Salmon נערך ל- 65 חולים, כולם אובחנו כלוקים ב- Myeloma Multiple או ב- Myeloma.Smoldering הטבלה הבאה מרכזת את הנתונים על ערכי ה- SAA וה- CRP לפי שלוש דרגות הסיווג. טבלה 6 ערכי ה- SAA וה- CRP לפי שלוש קטגוריות ה- Staging Durie-Salmon Durie-Salmon Stage SAA (µg/ml) CRP (mg/dl) 1a & 1b (N=9) (6 3,094) 0.74 ( ) 2a & 2b (N=8) (5 792) 0.26 ( ) 3a & 3b (N=44) (3 2,690) 0.45 ( ) הערה לטבלה 6 ערכי ה- SAA וה- CRP הם ערכי החציון. בסוגריים מצויין טווח הערכים מהערך הנמוך ביותר לערך הגבוה ביותר. מעיון בטבלה עולה כי ערכי החציון של ה- SAA (ביחידות,(µg/mL מהגבוה לנמוך, הם: (91) 3,Stage (0.311=p). לא נמצא הבדל מובהק בין ערכים אלו.Stage 2 ו-( 34.5 ) Stage 1 (87) עיון בערכי ה- CRP מגלה כי ערכי החציון של ה- CRP (ביחידות,(mg/dL מהגבוה לנמוך הם:.(p=0.33) לא נמצא הבדל מובהק בין ערכים אלו.Stage 2 (0.26) ולבסוף Stage 3 (0.45) אחריו,Stage 1 (0.74) 27

28 ז. ערכי ה- SAA וה- CRP בזיקה לסוג הנוגדן (Immunoglobulin) ולסוג השרשרת הקלה Chain) (Light מקרב כלל 93 החולים, נמצאו ונאספו נתונים על סוג החלבון המונוקלונאלי (monoclonal) של 88 חולים, מתוכם 63 חולים בקבוצת ה- MM. עיקרי הנתונים אודות ערכי ה- SAA וה- CRP בהתאם לסוג החלבון המונוקלונאלי, מפורטים בטבלה הבאה: טבלה 7 ערכי ה- SAA וה- CRP לפי סוג החלבון המונוקלונאלי (5 קטגוריות) בקבוצת חולי ה- MM Myeloma Type SAA (µg/ml) CRP (mg/dl) IGG (N=31) IGA (N=12) IGM (N=1) LC only (N=17) Non secretory (N=2) (5-2,690) 0.43 ( ) (5 3,094) ( ) ( ) 0.64 ( ) (3 792) 0.30 ( ) (54 609) ( ) הערה לטבלה 7 ערכי ה- SAA וה- CRP הם ערכי החציון. בין הסוגריים טווח הערכים, מהנמוך ביותר לגבוה ביותר. לא נמצא הבדל מובהק לא בערכי ה- SAA (0.46=p) ולא בערכי ה- CRP (0.96=p) בין 5 הקטגוריות השונות המתייחסות לסוג החלבון המונוקלונאלי בקבוצת ה- MM. 28

29 נערכה השוואה נוספת, בין קבוצה שכוללת את 44 החולים, שבדמם נמצא חלבון מונוקלונאלי מסוג IgM,IgG או (Whole Ig) IgA לבין הקבוצה הכוללת את 17 החולים עם Monoclonal Peak של שרשרת קלה בלבד,(5 µg/ml 3,094 µg/ml (טווח: 97 µg/ml הוא Whole של קבוצת ה- Ig החציוני ערך ה- SAA.(LC only) ואילו ערך ה- SAA החציוני של קבוצת ה- only LC הוא 49 µg/ml (טווח: 3). µg/ml 792 µg/ml הבדל זה איננו מובהק סטטיסטית, אך תיתכן נטייה (trend) לקיומו של הבדל (0.088=p), כפי שניתן לראות בגרף 6. ערך ה- CRP החציוני של קבוצת ה- Ig,Whole העומד על 0.53 mg/dl (טווח: 0.05), mg/dl mg/dl גבוה מהערך המקביל של קבוצת ה- only 0.3, mg/dl) LC טווח: 0.06). mg/dl 5.94 mg/dl הבדל זה איננו מובהק (0.47=p). גרף 6 התפלגות ערכי ה-( µg/ml ) SAA של החולים בקבוצת ה- MM תוך השוואת בין קטגורית Whole LC לקטגורית ה- only Ig 29

30 ערכי ה- SAA וה- CRP בזיקה לסוג השרשרת הקלה Chain) (Light עיקרי הנתונים על ערכי ה- SAA וה- CRP של 63 מחולי קבוצת ה- MM מוצגים בטבלה הבאה, תוך חלוקת החולים ל- 3 קטגוריות המתייחסות לשרשרת הקלה:.Kappa, Lambda, Non-Secretory טבלה 8 נתוני ה- SAA וה- CRP של חולי קבוצת ה- MM בזיקה לאופי השרשרת הקלה Light Chain Type SAA (µg/ml) CRP (mg/dl) KAPPA (N=35) LAMBDA (N=26) Non secretory (N=2) (3 3,094) 0.39 ( ) (5 2,690) ( ) (54 609) ( ) הערה לטבלה 8 ערכי ה- SAA וה- CRP הם ערכי החציון. בין הסוגריים טווח הערכים, מהנמוך ביותר לגבוה ביותר. לא נמצא הבדל מובהק בערכי ה- SAA בין שלוש הקבוצות (0.56=p). אף ההבדל בערכי ה- CRP בין שלוש הקבוצות איננו מובהק (0.49=p). 30

31 ח. ערכי ה- SAA וה- CRP לפי חלוקת החולים לפי מאפייני ציטוגנטיקה (Cytogenetics) ממצאי הציטוגנטיקה של 62 החולים שעבורם נערכה בדיקת הציטוגנטיקה הרלוונטית, מוצגים בטבלה 9. החולים חולקו ל- 4 קטגוריות, לפי המשמעות הפרוגנוסטית של הממצא הציטוגנטי: ו-(- 17p ) t(14;16),t(4;14) :Bad ו- hyperdiploidy t(11;14) :Good 13q- :Intermediate :Other שינויים בלתי ספציפיים בכרומוזום 14 וציטוגנטיקה תקינה. יש לציין כי בקרב חלק מהחולים זוהו מספר ממצאים ציטוגנטיים אצל אותו החולה, שהשתייכו לקטגוריות השונות מבחינה פרוגנוסטית (ראו הערה לטבלה 1). טבלה 9 ערכי ה- SAA וה- CRP לפי חלוקת הממצאים הציטוגנטיים ל- 4 קטגוריות Cytogenetics SAA (µg/ml) CRP (mg/dl) Bad (N=7) Good (N=10) Intermediate (N=17) Other (N=28) (19 555) 1.10 ( ) 28.5 (5 1,153) ( ) (5 792) 0.23 ( ) (3-2,690) ( ) הערה לטבלה 9 ערכי ה- SAA וה- CRP הם ערכי החציון. בין הסוגריים טווח הערכים, מהנמוך ביותר לגבוה ביותר. 31

32 ההבדל בערכי ה- SAA, כמו גם ההבדל בערכי ה- CRP, בין 4 הקבוצות, איננו מובהק (0.41=p ו- p=0.25, בהתאמה). יצויין כי ההבדלים בערכי ה- SAA ובערכי ה- CRP התבררו כבלתי-מובהקים אף בניסיונות חלוקה אחרים של הנתונים, כמפורט להלן: א. חלוקת נתוני הציטוגנטיקה ל- 3 קבוצות: Good,Bad וקבוצה שלישית הכוללת את Intermediate עם.Other ב. חישוב ערך ה- SAA הניצב באחוזון 90 מתוך טווח ערכי ה- SAA של הנבדקים הבריאים (קבוצת הביקורת) לצורך ניתוח קטגוריאלי. הניתוח נערך כך שבכל אחת מהקבוצות הציטוגנטיות (הן בחלוקה ל- 4 קבוצות ציטוגנטיות והן בחלוקה ל- 3 קבוצות ציטוגנטיות, כפי שאלו הוצגו לעיל), נמנה מספר ערכי ה- SAA של החולים הנמצאים מעל אחוזון 90 של קבוצת הביקורת ומתחת לאחוזון זה. 32

33 ט. מתאם (קורלציה) בין ערכי ה- SAA וה- CRP לבין אחוז תאי הפלזמה במח-העצם אחוז תאי הפלזמה במח העצם של 75 חולים נבדק על מנת לזהות האם קיימת התאמה בינו לבין רמת :SAA 7 ה- SAA או רמת ה- CRP בדם. כפי שמודגם בגרפים ו- 8, לא נמצאה התאמה מובהקת (בעבור.(Correlation coefficient=(-0.138) :CRP בעבור,Correlation coefficient=(-0.61) גרף 7 ערך ה-( µg/ml ) SAA כתלות באחוז תאי הפלזמה במח העצם גרף 8 ערך ה-( mg/dl ) CRP כתלות באחוז תאי הפלזמה במח העצם 33

34 כ, י. ערכי ה- SAA בקבוצת ה- MM וה- CRP לפי מעורבות חוץ-לשדית Involvement) (Extra-Medullary מתוך 63 חולים בקבוצת ה- MM, אצל 22 חולים זוהתה מעורבות חוץ-לשדית. ערך החציון של SAA בקבוצת החולים שבהם זוהתה מעורבות חוץ-לשדית µg/ml) 151, טווח 5) µg/ml 1,153 µg/ml היה גבוה מהערך המקביל של SAA בקבוצת החולים שבהם לא זוהתה מעורבות (3 µg/ml 3,094 µg/ml חוץ-לשדית µg/ml),51 טווח מתואר בגרף 9. הבדל זה נמצא מובהק (0.029=p). לעומת זאת, לא נמצאה התאמה בין מעורבות חוץ-לשדית לבין ערכי ה- CRP : אף כי ערך החציון של CRP בקבוצת החולים שבהם זוהתה מעורבות חוץ-לשדית mg/dl),0.78 טווח mg/dl (0.05 mg/dl 5.94 היה גבוה מהערך המקביל בקבוצת החולים שבהם לא זוהתה מעורבות חוץ-לשדית mg/dl) 0.32, טווח mg/dl 0.05), mg/dl 11.9 הבדל זה, המתואר בגרף 10, לא היה משמעותי (0.13=p). גרף 9 התפלגות ערכי ה-( µg/ml ) SAA לפי קיומה או היעדרה של מעורבות חוץ-לשדית בקבוצת ה- MM 34

35 גרף 10 התפלגות ערכי ה-( mg/dl ) CRP לפי קיומה או היעדרה של מעורבות חוץ-לשדית בקבוצת ה- MM הערה לגרף 10 על מנת לפשט את הצגת ההתפלגות של ערכי ה- CRP בכל אחת משתי הקבוצות, מגרף 10 הושמט הייצוג של ערך CRP יחיד של נבדק מקבוצת החולים ללא מעורבות חוץ-לשדית, שהיה חריג בגובהו (קרוב ל- mg/dl 12). 35

36 יא. נתוני השרידות (Survival) בזיקה לתגובה המיטבית לטיפול Response) (Best על 76 חולים נאספו נתונים לגבי תגובתם המיטבית לטיפול. התגובה המיטבית חולקה לפי שבע ההגדרות Progressive Disease (PD), Stable Disease (SD), Minimal Response (MR), Partial המקובלות (21): Response (PR), Very Good Partial Response (VGPR), Complete Remission (CR), Stringent Complete Remission (scr). המטופלים חולקו לשתי קבוצות: החולים שתגובתם לטיפול לא הייתה טובה MR) (PD + SD + וקבוצה עם החולים שתגובתם לטיפול הייתה חלקית או טובה יותר scr).(pr + VGPR + CR + נתוני החולים נבחנו לפי ערך הסף של SAA Categorized ולפי ערך הסף של.CRP Categorized לפי ניתוח זה, לא נמצא הבדל מובהק בערכי ה- SAA של שתי הקבוצות (0.50=p) ואף לא בערכי ה- CRP (0.56=p). 36

37 יב. ערכי ה- SAA וה- CRP בזיקה לשרידות (Survival) מכלל 93 החולים, נאספו נתונים על השרידות של 75 חולים: 60 חולים בקבוצת ה- MM ו- 15 חולים בקבוצת ה- 1-AL. מתוך 75 החולים שנאספו נתונים על שרידותם, (30.66%) 23 נפטרו. הערך החציוני של השרידות (בחודשים) בעבור כלל 75 החולים הוא (טווח ), בקבוצת חולי ה- MM (טווח 0.53,(47.15 ובקבוצת חולי ה- 1-AL (טווח 1.31.(37.98 לפי ניתוח,Cox-Regression נמצא כי ההבדל בערכי ה- SAA בין הנפטרים לבין הנותרים בחיים הוא מובהק (0.009=p). הנפטרים לבין הנותרים בחיים מובהק בין אף ההבדל בערכי ה- CRP (0.025=p). בחלוקת ערכי ה- SAA של כל אחד מ- 75 החולים לפי ערך הסף של,SAA Categorized 16 ערכים נמצאו כנמוכים או שווים ל- µg/ml 22.8, בעוד 59 ערכים נמצאו מעל ערך זה. לפי,Cox Regression ההבדל בערכי ה- SAA בין הנפטרים לבין הנותרים בחיים הוא על סף המובהקות (0.09=p) ואילו ההבדל בערכי ה- CRP בין הנפטרים לבין הנותרים בחיים איננו מובהק (0.83=p). Interval, ערך ה- HR Adjusted בעבור שני החלבונים גבוהים מ- 1, כמפורט להלן. רווח הסמך Confidence) 95%) מצויין בין הסוגריים: בעבור SAA 42.73) ( בעבור CRP 1.22) ( ניתוח נתוני השרידות של 75 חולים מקבוצות ה- MM וה- 1-AL לפי Kaplan Meier מתוך 16 החולים שערכי ה- SAA שלהם זוהו כקטנים או שווים לערך הסף של,SAA Categorized חולה אחד נפטר במהלך המעקב (6.25%) ו- 15 חולים (93.75%) נותרו בחיים במהלך המעקב. מתוך 59 החולים שערכי ה- SAA שלהם זוהו כגדולים מערך הסף, 22 חולים נפטרו (37.3%) ו- 37 חולים נותרו בחיים במהלך המעקב (62.7%). נמצא הבדל מובהק (0.051=p) בין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- SAA הקטנים או שווים לערך הסף של,SAA Categorized לבין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- SAA הגדולים מערך הסף. 37

38 הגרף הבא יבהיר באופן חזותי את ההבדל המובהק: גרף 11 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 75 הנבדקים (חולי MM ו- 1-AL ) תוך חלוקתם לפי מיקום ערך ה- SAA ביחס לערך הסף (22.8μg/mL) הערה: Survival) Cum Survival (Cumulative שרידות מצטברת. זיקתם של נתוני השרידות של 75 החולים לערכי ה- CRP נותחה אף היא בשיטת.Kaplan-Meier ערכי ה- CRP חולקו לפי ערך הסף של.CRP=0.5 mg/dl ל- 39 חולים נמדד ערך CRP תקין (קטן או שווה ל- mg/dl 0.5), ומתוכם נפטרו 9 אנשים (23.1%). ל- 36 חולים נמדד ערך CRP מוגבר (מעל 0.5), mg/dl ומתוכם נפטרו 14 אנשים (38.9%). ההבדל בין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- CRP התקינים לבין זו של הנבדקים בעלי הערכים המוגברים איננו מובהק (0.17=p). הגרף הבא מציג את עקומות השרידות של שתי קבוצות החולים, על בסיס החלוקה לערכי CRP תקינים ומוגברים: 38

39 גרף 12 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 75 הנבדקים (חולי MM וחולי (1-AL תוך חלוקתם לפי מיקום ערכי ה- CRP ביחס לערך הסף (0.5mg/dL) ניתוח נתוני השרידות של 60 חולים מקבוצת ה- MM לפי Kaplan Meier מתוך 12 החולים שערכי ה- SAA שלהם היו נמוכים או שווים ל- g/ml 22.8, חולה אחד נפטר במהלך המעקב (8.33%) בעוד 11 חולים (91.67%) נותרו בחיים במהלך המעקב. מתוך 48 החולים שערכי ה- SAA שלהם היו גבוהים מ- g/ml , חולים נפטרו במהלך המעקב (41.67%) בעוד 28 חולים (58.33%) נותרו בחיים במהלך המעקב. ההבדל (0.069=p) שנמצא בין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- SAA הקטנים או שווים ל- g/ml 22.8, לבין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- SAA הגדולים מערך הסף, איננו מובהק, אך קרוב לסף המובהקות. הגרף הבא יציג את המגמה, שאינה מובהקת, שתוארה לעיל: 39

40 גרף 13 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 60 חולי MM תוך חלוקתם לפי מיקום ערך ה- SAA ביחס לערך הסף (22.8μg/mL) זיקתם של נתוני השרידות של 60 חולי ה- MM לערכי ה- CRP נותחה אף היא בשיטת.Kaplan-Meier ל- 31 חולים היו ערכי CRP הנמוכים מערך הסף mg/dl) 0.5) או שווים לו, ומתוכם נפטרו 8 חולים (25.81%). ל- 29 חולים היו ערכי CRP הגבוהים מערך הסף, ומתוכם נפטרו 13 חולים (44.83%). ההבדל בין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- CRP התקינים לבין השרידות של הנבדקים בעלי הערכים המוגברים איננו מובהק (0.103=p). היעדר המובהקות של ההבדל תומחש בגרף הבא: 40

41 - עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 60 חולי MM תוך חלוקתם לפי מיקום ערכי ה- גרף 14 (0.5mg/dL) ביחס לערך הסף CRP ניתוח נתוני השרידות של 15 החולים מקבוצת ה- 1-AL לפי Kaplan-Meier שלישית, נותחו נתוני השרידות של 15 החולים מקבוצת ה- 1-AL, לפי.Kaplan-Meier כל 4 החולים שערכי ה- SAA שלהם קטנים מ- g/ml 22.8 או שווים לערך זה נותרו בחיים במהלך המעקב. מתוך 11 החולים שערכי ה- SAA שלהם גבוהים מערך הסף, שני חולים נפטרו (18.18%). לא נמצא הבדל מובהק (0.42=p) בין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- SAA הקטנים או שווים לערך הסף, לבין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- SAA הגבוהים מערך הסף. הגרף הבא יבהיר באופן חזותי את הממצאים: 41

42 גרף 15 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 15 חולי 1-AL תוך חלוקתם לפי מיקום ערך ה- (22.8μg/mL) ביחס לערך הסף SAA זיקתם של נתוני השרידות של 15 החולים מקבוצת 1-AL לערכי ה- CRP נותחה אף היא בשיטת Kaplan-.Meier מתוך 8 החולים בעלי ערכי ה- CRP הנמוכים מ- mg/dl 0.5 או השווים לסף זה, חולה אחד נפטר (12.5%). מתוך 7 החולים בעלי ערכי ה- CRP הגבוהים מערך הסף, חולה אחד נפטר (14.29%). לא נמצא הבדל מובהק (0.92=p) בין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- CRP התקינים לבין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- CRP המוגברים. הגרף הבא מציג את עקומות השרידות של שתי קבוצות החולים, על בסיס החלוקה לערכי CRP תקינים ומוגברים: 42

43 ל, גרף 16 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 15 חולי 1-AL תוך חלוקתם לפי מיקום ערכי ה- (0.5mg/dL) ביחס לערך הסף CRP ניתוח נתוני השרידות של חולים מקבוצת ה- MM בזיקה לנתונים פרוגנוסטיים כל אחד מהנתונים הפרוגנוסטיים של המטופלים, קרי אלו הנוגעים לסיווג ה- ISS Durie-Salmon- Staging ולמאפייני הציטוגנטיקה שלהם, נותחו בנפרד Analysis) (Univariate בניסיון למצוא האם קיימת קורלציה בינם לבין שרידות הנבדקים. נתוני ה- ISS של חולים מקבוצת ה- MM בזיקה לשרידות 43 החולים שעליהם נאספו נתוני סיווג ה- ISS חולקו לשתי קבוצות: (24 Stage 1 חולים) לעומת 19) Stage 2 + Stage 3 חולים). מתוך 24 החולים ב- 1,Stage 5 חולים נפטרו.(20.83%) מתוך 19 החולים בקבוצת,Stage 2 + Stage 3 9 חולים נפטרו (47.37%). 43

44 נמצא הבדל מובהק (0.02=p) בין השרידות של החולים ב- 1 Stage לבין החולים בקבוצת.Stage 2 + Stage 3 הגרף הבא יציג את ההבדל המובהק: גרף 17 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 43 חולים מקבוצת ה- MM תוך חלוקתם לפי סיווג ה- ISS נתוני ה- Staging Durie-Salmon של חולים מקבוצת ה- MM בזיקה לשרידות 58 החולים שעליהם נאספו נתונים לגבי ה- Staging Durie-Salmon חולקו ל- 3 קבוצות:.Stage 1a&1b, Stage 2a&2b, Stage 3a&3b מתוך 9 החולים ב- 1a&1b,Stage שניים נפטרו (22.22%). מתוך 8 החולים ב- 2a&2b,Stage שניים נפטרו (25%). מתוך 41 החולים ב- 3a&3b,Stage 17 חולים נפטרו (41.46%). לא נמצא הבדל מובהק (0.39=p) בין השרידות של החולים בכל אחת מ- 3 קבוצות ה- Staging. עקומות ההישרדות של החולים מוצגות בגרף הבא: 44

45 גרף - 18 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 58 חולים מקבוצת ה- MM תוך חלוקתם לפי סיווג ה- Durie-Salmon נתוני הציטוגנטיקה של חולים מקבוצת ה- MM בזיקה לשרידות 48 החולים בקבוצת ה- MM שעליהם נאספו נתוני ציטוגנטיקה, חולקו ל- 3 קבוצות Intermediate) (Bad, Good, לפי המשמעות הפרוגנוסטית של הממצאים הציטוגנטיים. הממצאים שנכללו מוקדם יותר בקטגורית Other (שינויים בלתי ספציפיים בכרומוזום 14 או ציטוגנטיקה תקינה) סווגו כעת בקטגורית,Intermediate לצד הממצא של -13q. כאשר זוהו מספר שינויים כרומוזומליים אצל אותו הנבדק, המטופל סווג לפי הממצא הציטוגנטי המבשר את הפרוגנוזה הגרועה יותר. מתוך 7 החולים בקטגורית ה- Bad, 3 נפטרו (42.86%). מתוך 7 החולים בקטגורית ה- Good, חולה אחד נפטר (14.29%). מתוך 34 החולים החולים בקבוצת ה- Intermediate, 12 חולים נפטרו (35.29%). 45

46 לא נמצא הבדל מובהק (0.158=p) בין השרידות של החולים בארבע הקבוצות הציטוגנטיות השונות, כמתואר בגרף הבא: גרף 19 עקומת :Kaplan-Meier שרידות (חודשים) של 48 חולים מקבוצת ה- MM תוך חלוקתם לפי הממצאים הציטוגנטיים ניתוח :Multivariate נתוני ה- ISS, ערכי ה- Categorized SAA וה- CRP בזיקה לשרידות החולים מקבוצת ה- MM בניתוח מרובה משתנים של נתוני השרידות של 43 חולים מקבוצת ה- MM, לפי חלוקתם לשתי קבוצות ה- ISS שתוארו לעיל, ועל פי ערכי ה- CRP וערכי ה- Categorized,SAA נמצא הבדל מובהק רק בנתוני השרידות לפי סיווג ה- ISS (0.012=p). לא נמצא הבדל מובהק בנתוני השרידות לפי ערכי ה- SAA (0.106=p). ולפי ערכי ה- CRP (0.97=p) Categorized 46

47 ה- HR Adjusted של נתוני השרידות לפי סיווג ה- ISS הוא 4.38 עם רווח סמך (95%) של ה- HR Adjusted של נתוני השרידות לפי ערך ה- CRP הוא עם רווח סמך (95%) של הניתוח הסטטיסטי לא העלה נתונים ברורים לגבי ה- HR Adjusted של נתוני השרידות לפי ערך ה- Categorized,(Adjusted HR=652,535.33) SAA ללא רווח סמך). 47

48 5. דיון בלב עבודה זו ניצב חלבון ה- SAA, הידוע כ- Reactant,Acute Phase חלבון אשר רמתו בדם מוגברת בעת מצבי דחק. כמו כן, דווח בעבר על ביטוי החלבון ברקמות שעברו התמרה ממארת בקרב חולי ממאירויות המטולוגיות וסולידיות,6).(8,7 בעבודה נבדקה רמת החלבון SAA בדגימות דם היקפי של 93 חולים עם,Plasma-Cell Dyscrasias ובראשן.Multiple Myeloma קבוצת הביקורת כללה דגימות דם של 21 נבדקים בריאים. במקביל למדידת רמת ה- SAA בדם, נמדדה גם רמת החלבון CRP בדם ההיקפי של החולים והבריאים. מדידת רמות ה- CRP נועדה לצורכי ביקורת, על מנת להבין באיזו מידה השינויים ברמת ה- SAA עשויים להיזקף להיותו Acute Phase,Protein בדומה ל- CRP, ובאיזו מידה השינויים ייחודיים ל- SAA עצמו. התוצאות נותחו לאור ממצאים קליניים מרובים שנאספו על החולים. ערכי החציון של ה- SAA בקרב כל אחת מ- 3 הקבוצות האבחנתיות שאליהן חולקו החולים SMM),(MM, 1-AL, MGUS & היו גבוהים מערך ה- SAA החציוני בקבוצת הביקורת. ממצא זו תואם את הידוע על העלייה ברמת ה- SAA בשעת חולי, ובפרט בזיקה לממאירות סולידית, כמו סרטן המעי הגס או גידולי שחלה אפיתליאליים (6, 7), או ממאירות המטולוגית, כמו לימפומה, לויקמיה ו- Myeloma Rosenthal (8). Multiple ו- Franklin בחנו את רמת ה- SAA בדם בקרב מספר קטן של חולי Multiple Myeloma שהיו צעירים מגיל 70. לא נבדקו במאמרם נתונים קליניים או קורלציה לנתונים אחרים, פרט לגיל. בעבודתנו, התייחסנו לנתונים רבים, כפי שתואר בפרק התוצאות. בעבודתנו, מצאנו הבדל מובהק בערכי ה- SAA וה- CRP בין 3 הקבוצות האבחנתיות, כאשר ערך ה- SAA החציוני הגבוה ביותר נמדד בקבוצת ה- 1-AL, הערך החציוני השני בגובהו נמדד בקבוצת ה- MM והערך החציוני הנמוך ביותר נמדד בקבוצת ה- SMM.MGUS & תוצאות אלו תואמות את ההשערה כי במחלה אקטיבית, כדוגמת MM או,1-AL רמת ה- SAA תהא גבוהה מרמתו במחלה זוחלת או במצב פרה-ממאיר. 48

49 ה, לאור עבודה קודמת שבוצעה במעבדתנו (11), מעניין להצביע על ההבדל המצטייר בערכי ה- SAA בין ממאירויות המטולוגיות שונות: בעוד שערך ה- SAA הממוצע בקבוצת ה- MM בעבודה זו עומד על , µg/ml הרי שב- Lymphoma,Hodgkin s ערך ה- SAA הממוצע היה גבוה משמעותית, ועמד על µg/ml שתי המחלות נבדלות בפתוגנזה שלהן, וב- Lymphoma, במיוחד זו ע"ש,Hodgkin יש אלמנט דלקתי ותגובתי חזק ביותר (22, 23). מגמה שזוהתה פעמים רבות במהלך גיבוש הממצאים הייתה כי ההתפלגות של התוצאות (ערכי ה- SAA וה- CRP ) איננה נורמלית. ההתפלגות החריגה מתבטאת לעיתים בהבדל משמעותי בין הערך הממוצע לבין ערך החציון, כאשר הממוצע לרוב גבוה מהחציון. הבדל זה משקף את קיומם של ערכים מועטים החריגים בגובהם, המסיטים את הממוצע כלפי מעלה. לדוגמא, בקבוצת חולי ה- MM, טווח הערכים של SAA היה 3 µg/ml 3,094, µg/ml עם ממוצע µg/ml) ) הגבוה משמעותית מהחציון µg/ml) 75.5). הבדלים גדולים בין החולים מוסברים על ידי היותו של ה- SAA חלבון תגובתי. בעת אבחנת המחלה או בחזרה,(Relapse) ייתכן שחלק מהחולים סבלו גם מפגיעה באיברים אחרים או זיהומים הגורמים לתגובה דלקתית בגוף. תימוכין לכך מצוי בזיהוי הרמות הגבוהות של ערכי ה- CRP בחולים עם רמות גבוהות במיוחד של.SAA בדומה לכך, מצאנו מתאם חיובי חזק בין ערכי ה- SAA לבין ערכי ה- CRP בעבור כל דגימות הדם שנבדקו בעבודה זו, ובמיוחד בקבוצת ה- 1-AL. בקבוצת ה- MM גם נמצא מתאם גבוה, אך פחות מזה שנמצא ב- 1-AL. שתי המחלות נבדלות זו מזו: בעוד של- Myeloma Multiple אופי גידולי פרוליפרטיבי, הרי שב- 1-AL אופי זה פחות במידה ניכרת (24). לפיכך, אנו משערים כי לפגיעה הנרחבת באיברי המטרה ב- 1-AL בכל הגוף יש תפקיד בעידוד הייצור המוגבר של SAA ו- CRP. בעבודה זו נתגלה כי אצל כשליש מהחולים ב- Dyscrasias Plasma-cell זיקה בין שני החלבונים איננה נשמרת במלואה; כך, אצל רוב החולים הנמנים עם האוכלוסיה שבה הזיקה בין שני החלבונים נראית חלשה, ערכו של ה- SAA עולה על 22.8 µg/ml בעוד שערך ה- CRP קטן מ- mg/dl 0.5. כמו כן, מצאנו כי לרמות SAA גבוהות הייתה השפעה על הפרוגנוזה לאורך זמן, להבדיל מרמות ה- CRP, כפי שיתואר בהמשך. 49

50 מכאן ניתן לשער כי הרמות המוגברות של SAA אינן נובעות רק מהיותו,Acute Phase Protein אלא מהוות חלק מהתהליך הגידולי. אחד האמצעים המרכזיים לאבחון Multiple Myeloma או לזיהוי התלקחות של המחלה אצל חולה מוכר, הוא עריכת ביופסיה של מח-העצם ואומדן אחוז תאי הפלזמה במח העצם. ניתן היה לשער כי אם ה- SAA היה מופרש רק מתאי-הגידול, היינו מוצאים התאמה בין מספר תאי הפלזמה במח העצם לבין רמות ה- SAA בדם. עם זאת, בעבודה זו, לא זוהה מתאם מובהק בין רמת ה- SAA לבין אחוז תאי הפלזמה במח-העצם של החולים. חרף זאת, דווקא זוהה הבדל מובהק בערכי ה- SAA בין קבוצת החולים עם המעורבות החוץ-לשדית לבין קבוצת החולים ללא מעורבות חוץ-לשדית. ערך ה- SAA היה גבוה יותר, באופן מובהק, בחולים עם המעורבות. אף כי זוהתה קורלציה חיובית בין רמות ה- SAA לרמות ה- CRP, הרי שההבדל ברמות ה- CRP בין קבוצת החולים עם המעורבות החוץ-לשדית לבין מקבילתה ללא המעורבות, לא היה מובהק מבחינה סטטיסטית. ממצאים אלו עשויים לחדד את אחת השאלות המסקרנות הנוגעות לפתופיזיולוגיה של :Multiple Myeloma מהו המקור של חלבון ה- SAA? האם כולו מופרש ע"י,Hepatocytes כפי שקורה במצבי דחק ללא ממאירות, או שלפחות חלק מה- SAA מיוצר ומופרש לדם ההיקפי ממוקדים "סולידיים" של הממאירות, כמו מח העצם או ריכוזים של תאי פלזמה מחוץ למח-העצם (25). בעבודות קודמות ראינו כי בתאי אפיתל בממאירות המעי הגס (6), בגידולי שחלה אפיתליאליים (7) ואף בתאי פלזמה במח עצם של חולי (11), MM נמצא ביטוי מוגבר של.SAA לאור זאת, ובהתאם לתוצאות המתקבלות מעבודה זו, נראה כי יש ל- SAA מקור שאיננו רק תגובתי, גם אם קשה להגדירו באופן כמותי ביחס ל- SAA התגובתי, המופרש מהכבד. אחת ההנחות שניצבו ביסוד עבודה זו הייתה כי תוכל להאיר את רמתו בדם של חלבון ה- SAA כמדד פרוגנוסטי. אנו לא מצאנו קורלציה בין ערכי ה- SAA לבין מדדים פרוגנוסטיים שונים (זולת ה- ISS ), כמו ה- Staging Durie-Salmon או ציטוגנטיקה. בנוסף, לא זוהה קשר מובהק בין רמת ה- SAA או רמת ה- CRP בדם, לבין התגובה המיטבית לטיפול. על אף שלא נמצא קשר מובהק בין רמת ה- SAA לסוג 50

51 ה- Paraprotein, זוהתה מגמה של הבדל בערכי ה- SAA בין קבוצת ה- Ig Whole לבין קבוצת ה- Only.LC עובדה זו עשויה לנבוע מכך שחלבון ה- SAA ניצב בפני עצמו מבחינה פתוגנטית, או משום שמספר החולים שנכללו במדגם היה נמוך מכדי להעריך את הקורלציות. יש לזכור כי החולים לא טופלו בפרוטוקול אחיד, כך שהבסיס להשוואה ביניהם איננו זהה. עם זאת, במסגרת העבודה, זוהה הבדל מובהק בערכי ה- SAA בקורלציה להישרדות: חולים בעלי ערכי SAA מוגברים מעל הסף ניחנו בפרוגנוזה רעה יותר באופן מובהק, לעומת חולים עם רמות SAA הדומות לאלו של נבדקים בריאים. זאת בעוד ההבדל בין השרידות של הנבדקים בעלי ערכי ה- CRP התקינים לעומת המוגברים המוגברים אינו מובהק. בבחינת נתוני השרידות של חולי MM ו- 1-AL ביחד, על סמך חלוקת החולים לפי ערכי ה- Categorized,SAA מתגלה הבדל מובהק בין עקומות השרידות, כאשר פרוגנוזה טובה יותר נזקפת לזכות החולים עם ערכי ה- SAA הקטנים מערך הסף. על אף שניתוח תת הקבוצות (חולי MM בנפרד מחולי (1-AL לא הניב תוצאות מובהקות, הרי שנראה כי לקבוצת חולי ה- MM תרומה רבה יותר ביצירת ההבדל המובהק בין עקומות השרידות. יש לציין כי במודל רגרסיה לוגיסטי, רק ל- ISS הייתה משמעות פרוגנוסטית מרכזית. עם זאת, ממצאים חיוביים אלו, באשר לקורלציה להישרדות, ולמחלה חוץ-לשדית, מרמזים לכך שערכי ה- SAA אינם נובעים רק ממידת התגובה הדלקתית; הממצאים מרמזים על חשיבותו של SAA במיאלומה - לא רק כסמן, אלא גם כגורם ביולוגי בתהליך המחלה. נתונים אלו, לצד מציאת הבדל מובהק בין השרידות של החולים, מהווים צעד ראשון בדרך להבנת התפקיד של רמת ה- SAA בדם, כאמצעי אפשרי בעתיד להערכה כללית של הפרוגנוזה של חולי Multiple Myeloma או Plasma-Cell Dyscrasias אחרות. המידע שנותח תורם, בשלב זה, להערכה כי ל- SAA תפקיד בפתוגנזה של.Acute Phase מעבר להיותו חלבון,Multiple Myeloma 51

52 לסיכום, עבודה זו הדגימה כי רמתו בדם של חלבון ה- SAA עולה ב- Dyscrasias,Plasma-cell במיוחד במחלות הפעילות, כדוגמת.Multiple Myeloma על אף המתאם החיובי שזוהה בין רמות ה- SAA לרמות ה- CRP, הרי שנראה ש- SAA איננו מופרש רק באופן תגובתי כ- Reactant,Acute-Phase בדומה ל- CRP, אלא עשוי להיות מופרש אף ממקורות חוץ-כבדיים. בהינתן תוצאות קודמות, המדגימות ביטוי של SAA בתאי ה-,Myeloma אנו מניחים כי חלקו מגיע מתאי הגידול עצמם. ההבדל המובהק בערכי ה- SAA בין חולי ה- MM עם המעורבות החוץ-לשדית לבין חולי ה- MM ללא המעורבות החוץ-לשדית, עשוי לחזק את ההערכה הזו. העבודה מראה כי ערך SAA הגבוה מ- g/ml 22.8 מנבא פרוגנוזה גרועה למטופל, ביחס לערך נמוך יותר, אף כי לא יותר מאשר המשמעות הפרוגנוסטית של ה- ISS. ייתכן כי מחקר עתידי, שיקיף מספר חולים גדול יותר מזה שנבחן בעבודתנו, יוביל לממצאים מובהקים, שיאירו את ה- SAA כמרקר פוטנציאלי ב- Dyscrasias,Plasma-cell כמו.Multiple Myeloma כמו כן, עבודתנו מהווה בסיס למחקר ברמת המעבדה באשר לתפקידו הפונקציונלי של ה- SAA בתאי ה- Myeloma. 52

53 6. סיכום מטרתו של מחקר זה הייתה לבחון מהי רמת החלבון סרום עמילואיד,(SAA) A המוכר כ- Acute Phase,Reactant בדגימות דם של חולים עם,Plasma-cell Dyscrasias בהשוואה לרמת החלבון בדם של נבדקים בריאים, ובקורלציה למדדים קליניים ומעבדתיים. רמת ה- SAA נבדקה בעזרת (ELISA) Enzyme-Linked Multiple ב- 93 דגימות דם היקפי של חולים, שאובחנו, בין היתר, כלוקים ב- Immunosorbent Assay Myeloma וב- amyloidosis.primary רמת החלבון נבדקה במקביל בדם של 21 נבדקים בריאים (קבוצת הביקורת). לצורך השוואה, רמת החלבון (CRP),C-Reactive Protein הנמצא בשימוש קליני נרחב, נמדדה בעזרת ציוד מעבדתי-קליני בכל אחת מדגימות הדם של החולים והבריאים. לפן המעבדתי של המחקר נוסף הפן הרטרוספקטיבי, שכלל איסוף פרטים קליניים מתיקי החולים, לצורך ניסיון למצוא זיקות ומתאמים, בעזרת כלים סטטיסטיים, בין ערכי ה- SAA וה- CRP לבין מאפייני המחלות, ובראשן - Myeloma.Multiple SAA התגלה במחקר זה כחלבון שרמתו ב- Dyscrasias Plasma-cell עולה ביחס לרמתו בקרב נבדקים בריאים, תוך שניתן להצביע על הבדק מובהק ברמת החלבון בין המחלות השונות שמקורן בתאי ה- Plasma. רמת החלבון עולה במידה רבה יותר במחלות "הפעילות" יותר, כמו,Multiple Myeloma לעומת Monoclonal Gammopathy of או טרום-ממאירות, כדוגמת "זוחלות" Plasma-cell Dyscrasias (MGUS).Undetermined Significane מתאם מובהק זוהה בין ערכי ה- SAA לבין ערכי ה- CRP. בנוסף, זוהה הבדל מובהק בערכי ה- SAA בין קבוצת החולים עם מעורבות חוץ-לשדית לבין קבוצת החולים ללא מעורבות חוץ-לשדית. ניתוח נתוני השרידות של המטופלים זיהה הבדל מובהק בין שרידותם של חולים עם ערכי SAA הגבוהים מערך-הסף של הנורמה, העומד על 22.8, g/ml לבין שרידותם של חולים עם ערכי SAA הנמוכים מערך זה. אחת ממטרות עבודה זו הייתה לנסות ולהאיר את מקומו האפשרי של ה- SAA בפתוגנזה של Multiple,Myeloma מתוך השערה כי מדובר בחלבון שאיננו רק "בן-לוויה" למחלה, אלא נוטל חלק פעיל או "בעל תפקיד" בהתפתחות המחלה. הגדלת קבוצת-המדגם במחקר עתידי עשויה לסייע בגיבוש ממצאים סטטיסטיים מובהקים, שיבהירו מהו מקומו של חלבון ה- SAA בפתוגנזה של Multiple Myeloma והאם 53