ביטוי. .Blot. In-vitro פלסמידים).

Transcript

1 שם המרצה סאלי שפונגין שם מחבר(ת) הסיכום אדוה דרזי דברי המחבר: כמידי שנה החלטתי לכתוב סיכום מעבדה אשר אמור להוות את ה"חומר האולטמטיבי" למבחן. לפני שאתם מתחילים לקרוא ברצוני להדגיש את הנקודות הבאות: הנני מזהירה כי הסיכום אינו ממצה כלל!!! כלומר, למי שאין כח לקרוא 40 עמודים, לא כדאי אפילו להתחיל. ניתן להתנחם בכך שבין השורות קיים מרווח של 1.25 שורות. ניתן גם לציין שהסיכום הוא צבעוני ואינו חוסך בדיו בעת ההדפסה. (לכל החסכנים שביננו). השתדלתי שהסיכום יכלול את החומר התיאורטי הנאמר בכיתה, החוברת, והמצגות. גם הפעם כהרגלי, חתימת שמי מופיעה באפור בכל עמוד לצורך פרסום עצמי. אם יש הערות טענות או הצעות ייעול, ניתן לפנות בדואר אלקטרוני ל- וכמו שידידיי שכתבו את חוברת מולקולרית אומרים: "כל הכתוב הינו באחריות המחבר, ניתן ואף רצוי לבוא בטענות" בנוסף יש להדגיש כי אין לעשות שימוש מסחרי בסיכום זה, והפצתו מיועדת למשתתפי הקורס בלבד.

2 אז מה עשינו?.1 שיבוט הגן Fer Tyrsine Kinase לתוך הפלסמיד.KS 2. ייצור חלבון רקומביננטי (האנזים (GST בחיידקים מהונדסים אשר הוחדר להם גן זר על גבי פלסמיד ביטוי. 3. הפקת החלבון הרקומביננטי מן החיידקים באמצעות ליזיס לחיידקים וקבלת מיצוי גס של חלבונים. 4. ניקוי האנזים הרקומביננטי בשיטת האפיניות אנזים-סובסטרט. 5. בדיקת דרגת הניקוי בשיטת.SDS-PAGE 6. בדיקת ביטוי החלבון הרקומביננטי במיצוי הגס בעזרת נוגדנים ייחודיים נגד GST בשיטת Western.Blt שיבוט גנים השיבוט של גן ) = מחדר= אינסרט) לתוך נשא (= וקטור) יכול להיעשות לשם מטרות שונות לדוג': ריבוי הגן לצורך שימושו כגלאי להפקת הגן בכמויות גדולות, החדרתו בטרנספקציה במטרה לבטא בתאים את החלבון. In-vitr לצורך שעתוק-תרגום ביטוי החלבון בחיידקים לצרכים כגון: - הזרקת החלבון לחיות על-מנת ליצור נוגדנים - הפקת חלבון רקומביננטי כסובסטרט לאנזים - הפקת חלבון שהוא פקטור שעתוק ובדיקת מידת קישוריו לרצפי בקרה בשיטת Gel shift assay ביטוי החלבון בשמרים לגילוי אינטרקציות בין חלבונים שונים בשיטת Tw hybrid system רענון לגבי שיטות שיבוט (לידע כללי): 1. ניתן לשבט גן בעזרת יצירת ספריית :DNA מגוון רחב של פרגמנטים משובטים מתא מסוים ומתוכם אנו מקווים שלפחות אחד מכיל את הגן הרצוי. ניתן ליצור ספריות בעזרת וירוסים או וקטורים פלסמידים (כיום משתמשים בעיקר בוקטורים פלסמידים). שלב 1: אנו מפיקים פלסמיד וחותכים אותו בעזרת אנזימי רסטריקציה, כך ניצור דנ"א לינארי. גם את הדנ"א התאי אנו חותכים עם אותם אנזימי רסטריקציה ובכך ניצור פרגמנטים רבים. את שני התוצרים הנ"ל נצרף יחדיו ונוסיף את האנזים ליגאז שתפקידו לקשור את הפרגמנט קוולנטית לפלסמיד. כמובן בנוסף חייבת להיות התאמה של הקצוות החתוכים. בכך יצרנו פלסמדים רקומביננטים המכילים פרגמנטים שונים מאותו דנ"א תאי. שלב 2: השלב הבא הוא ביצוע טרנספורמציה: החדרת הפלסמיד לתאי בקטריה והקניית מצע מתאים לחלוקה הכולל אנטיביוטיקה מסויימת שהפלסמיד שלנו מכיל את הגן לעמידות אליה ובכך ניצור סלקטיביות לחיידקים שעברו את הטרנספורמציה (רק הם יוכלו לשרוד). כאשר התאים יוכפלו, יוכפל גם הפלסמיד הרקומביננטי שהוחדר... בכל מושבה שנוצרה מחיידק אחד יש פלסמידים המכילים את אותו פרגמנט ששובט. התערובת של סוגי הבקטריה השונות שגדלו, מהווה ספריית,DNA המכילה מס' גדול של מקטעי DNA שונים. רק מעט בקטריות יכילו את הפלסמיד הרקומביננטי הספציפי המכיל את הגן הרצוי. יש צורך לזהות את התאים הנדירים האלו על מנת לגלות את המקטע בו אנו מעוניינים. 1

3 שלב 1: שלב 2: אדוה דרזי בשיטה הנ"ל בדרך כלל לא יהיו טעויות ברצף ה-,DNA אך ניתן להיתקל בבעיות בגלל אי התאמה באתרי אנזימי רסטריקציה או שכניסת הגן לא תהיה במסגרת הקריאה ל- Tag הרצוי. 2. כיום ניתן להגביר גן מסוים למספר רב של עותקים, בלי צורך ביצירת ספריות דנ"א, בעזרת שיטת Plymeras chain reactin - PCR (מה שאנו עשינו במעבדה, שתפורט בהמשך). בשיטה זו יש סיכוי לטעויות במהלך סינטזת הדנ"א וכך עלולות להיווצר מוטציות בנוקלאוטיד אחד שעלולות להביא למוטצית עצירה או שינוי בחומצה אמינית. (היום ניתן לרכוש אנזים High fidelity אשר טועה פחות מהאנזים הרגיל) את הגן ניתן להכניס כמו שהוא Dwn Sream לפרומוטר, או בהמשך ל-,Tag שישמש לזיהוי החלבון ובידודו, כמובן בלי לפגוע במסגרת הקריאה. כאשר מתכננים שיבוט אנו צריכים להקפיד על הדברים הבאים: 1. שהאנזימים אתם אנו חותכים לא יחתכו בתוך הפלסמיד עצמו אלא רק באתר ה- MCS המכיל מספר רב של רצפי חיתוך של אנזימי חיתוך שונים. זאת על מנת לא לפגוע בביטוי גנים שונים בפלסמיד שישמשו אותנו לאחר מכן. 2. הימצאות קודון סיום שעתוק לתרגום של אותו גן שהוגבר, שאותו אנו נחדיר לפלסמיד. 3. הימצאות קודון התחלת שעתוק ATG ב - Tag שבפלסמיד או בגן המוגבר. לפעמים נשבט את כל התעתיק ובדר"כ רק את ה- - ORF מסגרת הקריאה per reading frame תהליך השיבוט מתבצע במספר שלבים: BamHI + PstI וניקוי הפלסמיד לאחר החיתוך. KS בעזרת אנזימי רסטריקציה א. חיתוך הפלסמיד הגברת המחדר אותו מעוניינים לשבט לתוך הפלסמיד בשיטת ה- PCR כך שקצוות התוצר המוגבר ב.. BglII + PstI מכילים את אתרי החיתוך לאנזימים ניקוי התוצר המוגבר כפי שנעשה בסעיף א' וזאת על מנת להכינו לתהליך החיתוך. ג. חיתוך הגן המוגבר בעזרת אנזימי הרסטריקציה הנ"ל. ד. ניקוי המחדר החתוך הכנה לליגציה. ה. הפרדת הוקטור והמחדר החתוכים והמנוקים (המוכנים לליגציה) בג'ל אגרוז לצורך הערכת כמויות ו. DNA לפני ליגציה.. º C 4 ליגציה בין הוקטור לבין המחדר בעזרת האנזים ליגאז למשך לילה ב- ז. טרנספורמציה של תוצר הליגציה לתוך חיידקי XL Blue וזריעת החיידקים על גבי קרקע מזון מוצקה ח. המכילה אמפיצילין,. X Gal, IPTG ט. בדיקת המושבות הלבנות בשיטות שונות על ידי הפקת הפלסמידים החדשים, חיתוכם, שליחתם לריצוף על מנת לוודא שאומנם המחדר נכנס לפלסמיד ובמקום הנכון. 2

4 : גן ל- β לקטמאז - Ori נקודת התחלת השכפול :KS : גן lacz המקודד ל- β לקטוזידז prmter : Rep אלמנט פאג' 626 :791 איזור הפולי-לינקר :(MCS) הפולי-לינקר מכיל רצפי הכרה של שני אנזימי רסטריציה שהשתמשנו: BamH1 ו- Pst1 458 :816 גן lacz המקודד ל- β לקטוזידז. β לקטוזידז מפרק את הלקטוז.(Lac-pern) כאשר ניתן להשתמש בלקטוז כמשרן Inducer) - מפעיל פרומוטור) או ב- IPTG דמוי לקטוז כמשרן. אנו נשתמש ב- IPTG מכיוון שאת הלקטוז החיידקים מפרקים במהירות ולעומת זאת הם מתקשים לפרק את ה- IPTG ובכך נפיק אינדוקציה יעילה יותר. X Gal סובסטרט מלאכותי ש- β לקטוזידז עובד עליו והופך אותו לכחול. זאת כמובן במידה והגן.IPTG הופעל ע"י lacz האינסרט יכנס בתוך הפולי-לינקר, דבר שישנה את מסגרת הקריאה של LacZ וימנע תגובה עם X.Gal ובכך ימנע יצירת צבע כחול וכך נוכל לזהות באופן ראשוני האם האינסרט ישנו. כלומר: מושבה עם אינסרט לבנה. מושבה בלי אינסרט כחולה : Rep אלמנט פאג' שעוזר לחיידק להרבות את הפלסמיד בצורה אופטימלית. : גן bla ל- β לקטמאז. מפרק טבעת β לקטמית באמפצילין, כך החיידק עמיד לאמפצילין. 190(-), 165(+) replicatin rigin f נק' הכפלת השעתוק. דו כיווני, שכפול מעגלי לשני הכיוונים. 3

5 שלב א': חיתוך הפלסמיד בעזרת אנזימי(נוקלאזות) רסטריקציה: נוקלאזות הרסטריקציה מוצו מחיידקים. החיידקים האלו מתגוננים מפני פלישת גנום זר כגון וירוסים ע"י ביקוע הגנום הוירלי. הביקוע נעשה באתר קידוד ספציפי בגנום. החיידק מגן על עצמו מפני חיתוך עצמי באמצעות מתילציה של בסיסי A/C באתר המזוהה ע"י נוקלאזות הרסטריקציה, כך שאין זיהוי לאתר הביקוע והחיתוך לא מתבצע. בד"כ מדובר ברצף בסיסי בעל מבנה פולנדרומי (דו-גדילי משלים) הנע בין 4 8 בסיסים. החיתוך נעשה בשני הגדילים במקביל כך שמתקבלים פרגמנטים נפרדים. תגלית אנזימי הרסטריקציה פרצה דרך למיצוי והפרדת גנים והביאה להתקדמות רבה בתחום המחקר. נוקלאזות הרסטריקציה יכולים ליצור 3 סוגי חיתוכים: blunt (קצוות קהים) - כאשר אנזימי הרסטרקציה חותכים באופן ישר בשני הגדילים. לדוגמא: 5'GAT ATC 3' 3'CTA TAG 5' '5 prime - חיתוך המשאיר קצה '5 דביק. לדוגמא: 5'T CGA 3' 3'AGC T 5' '3 prime - חיתוך המשאיר קצה '3 דביק. לדוגמא: 5'CAT G 3' 3'G TAC 5' במעבדה השתמשנו בשני אנזימי רסטריקציה החותכים את הפלסמיד באזור הפולי-לינקר: BamH1 1. היוצר קצה 5' דביק: G CCTAG 5' GTGCA 3' G + + 5' GATCC G G 3' ACGTC ' 5'G GATCC 3' 3'CCTAG G 5' Pst1 2. היוצר קצה 3' דביק: 5'GTGCA G 3' 3'G ACGTC 5' החיתוך בשני אנזימים ייצור כיווניות בליגציה, היות וגם המחדר נחתך באנזימים היוצרים תוצרים המתאימים לשני אנזימים אלו, בהתאמה לכיוון הכניסה הרצוי. איך מבצעים חיתוך?: 1. נכניס למבחנה מספר מרכיבים ונדגיר ב- 37 למשך 45 דקות : c כמות ב- µl חומרים לפי סדר ההוספה מים תפקידם של המים הם להשלמת הנפח. בופר 10 O - הבופר נבחר בהתאם לאנזימים שהשתמשנו לפי הוראות היצרן. נמהל פי 10 KS BamHI PstI סה"כ.2 נוסיף למבחנה, 3µl,CIP = Calf Intestine Alkaline Phsphatas ALKP על מנת להוריד פוספט מקצה '5 פריים כדי שהפלסמיד לא יסגר על עצמו במידה והתבצע חיתוך חלקי עם אנזים אחד בלבד. ולאחר מכן הדגרנו חצי שעה נוספת ב- 37. c יש להקפיד לסכרז לפני כל הדגרה מכיוון שאנו משתמשים בכמויות קטנות שיכולות להישאר על דפנות המבחנה. האנזימים מצויים בתמיסה המכילה 50% גליצרול אשר לא קופאת בטמפ' נמוכה של 20 c, שבה שומרים את האנזימים. ומכיוון שיותר מ- 5% גליצרול יעכב את הריאקציה יש לשים לב שמסביב לטיפ לא יווצרו שאריות, וכן לנגב את הטיפ בדפנות מבחנות האנזימים. 4

6 שלב ב': ניקוי הפלסמיד החתוך: אדוה דרזי ניקוי המחדר והפלסמיד נעשה ע"י PCR Purificatin Kit ע"פ הוראות היצרן. דגימת תוצר הפלסמיד לאחר חיתוך או ה- PCR לפני או לאחר חיתוך מכילים מלבד הדנ"א עצמו גורמים נוספים אשר אנו רוצים להיפטר מהם כגון שאריות דנ"א, חלבונים מלחים וכו', גורמים אלו עלולים להפריע בשלבים הבאים של הניסוי למשל בליגציה. ברצוננו לנקות את התוצר שלנו על מנת שיכיל רק את הדנ"א הרצוי. ולכן אנו משתמשים ב- - PCR Purificatin Kit ערכה שמנקה מולקולות שגדולות מ- 100bp אשר משווקת למעבדות ע"י חברות שונות. עיקרון ה- Kit מבוסס על קשירת הדנ"א לפילטר זכוכית (סיליקה), המצוי בקולונת פלסטיק, בנוכחות " salt " Chatrpic כגון: Sudim idide (NaI) Guanidine thicynate Guanidine hydrchlride (לידע כללי) Chatrpic salt הוא מושג שבדר"כ מתייחס ליכולת של תרכובת להפריע לקשרי מימן במים. קשרי המימן גם משפיעים על המבנה השניוני של פולימרים כגון דנ"א ורנ"א. Chatrpic salt מגבירים את המסיסות של מרכיבים לא פולריים במים, הם גורמים לדנטורציה של חלבונים בגלל הפרעת קשרי המימן אך לא גורמים לדנטורצית חומצות גרעין. וכך הריכוז הגבוה של המלח גם מסייע לקשירה של חומצות הגרעין לפילטר שבקולונה. פילטר הזכוכית שבקולונה: 1. קושר רק חומצות גרעין, גורם להפרדת מולקולות כגון חלבונים, סוכרים, ליפידים וכו'. 2. עמיד בפני מיקרוצנטריפוגה. 3. היבול שמקבלים חזרה לאחר הניקוי הוא בין 85%-75% גם בהתאם לנפח האלוציה. עקרון תהליך הניקוי ב- Kit כולל בתוכו שימוש בריאגנטים הבאים:.1 PB) - PCR Binding Buffer ( הבופר מכיל Chatrpic salt אשר גורם להיקשרות הדנ"א לסיליקה שבקולונה. 2. WB) - Washing Buffer ( גורם לשטיפת החומרים המיותרים עבורנו מהקולונה מכיל אתנול, לכן הדנ"א, שאינו מסיס באתנול, לא יוצא מהסיליקה, שאר החומרים מסיסים באתנול ולכן נשטפים. 3. EL) - Elutin Buffer ( גורם להפרדת הדנ"א הרצוי מהקולונה, במקרה שלנו מדובר במים מכיוון שבמידה ולא יהיה לנו כמות דנ"א מספקת נוכל לרכזו. כאשר מוסיפים את המים נוצרת תחרות בין המים והסיליקה על הקישור לדנ"א המים מנצחים(כמותם גדולה יותר)... בגלל שהפלסמיד והמחדר שלנו יחסית גדולים נשתמש במים מחוממים לאלוציה יעילה יותר. פרוטוקול עבודה בידינו מבחנה המכילה: דנ"א שאנו רוצים לבודד שאריות של דנ"א, חלבונים ומלחים שאנו רוצים לסלק. הוסף כמות שוות נפח של בופר PB לכמות תוצר ה- PCR /פלסמיד. כמות תוצר ה- KS הוא,100µl נוסיף. PB 100µl יש לערבב בעדינות. הצב את קולונת הקשירה במבחנת אפנדורף והעבר את תכולת הדגימה לקולונה. 5 סרכז במשך 60 שניות במהירות g 000, 13 כדי לגרום לכך שהבופר יעבור דרך הקולונה והדנ"א ישאר קשור לקולונה. הוצא את הקולונה,שפוך את הדגימה שעברה דרך הקולונה והחזר את הקולונה בחזרה למבחנה.

7 הוסף לקולונה 700µl של בופר. WB 13,000 כדי לגרום לכך שהמרכיבים שאנו רוצים לסלק יעברו סרכז במשך 60 שניות במהירות g דרך הקולונה והדנ"א ישאר קשור לקולונה. הוצא את הקולונה,שפוך את הדגימה שעברה דרך הקולונה והחזר את הקולונה בחזרה למבחנה. הוסף לקולונה 500µ l של בופר. WB סרכז במשך 60 שניות כדי לגרום לכך שהמרכיבים שאנו רוצים לסלק יעברו דרך הקולונה והדנ"א ישאר קשור לקולונה. הוצא את הקולונה,שפוך את הדגימה שעברה דרך הקולונה והחזר את הקולונה בחזרה למבחנה. סרכז למשך 2 דקות נוספות לייבוש יש לוודא שהקולונה יבשה לגמרי מכיוון שבופר WB יכול לעכב את ראקציית נוספות שנבצע לאחר מכן (ליגציה) לא לשכוח להניח את הקולונה במבחנה חדשה לאחר הסרכוז. הוסף למרכז הקולונה 40µ l מים מחוממים ב-, 65 c והמתן 3 דקות. (אלוציה ( סרכז במשך 60 שניות כדי לגרום לכך שהדנ"א יפרד מהקולונה: בידנו 40µ l של דוגמא המכילה ריכוז מסויים של KS נקי וחתוך. על מנת שנוכל להריץ את הדוגמא 4µ לאפנדורף נוסף, הוספנו 8µ l מים, ו- 3µ l בופר העמסה המכונה בחוברת "צבע העברנו מהדוגמא l לדנ"א". שלב ג': הגברת המחדר באמצעות :PCR שיטת ה- PCR משמשת אותנו לשיבוט הגן,mFer Tyrsine Kinase טירוזין קינאז מעכבר, לתוך.KS נחוצים כ- 30 מחזורי תגובה על מנת להגדיל את כמות ה- DNA בצורה יעילה. כל מחזור מכפיל את כמות ה- DNA המסונתז במחזור הקודם. מחזור יחיד דורש כמה דקות בלבד, כך שניתן לייצר שיבוטי DNA ללא תא תוך מס' שעות, בהשוואה למס' הימים הנדרשים לתהליך שיבוט רגיל. מחזור תגובה כולל: דנטורציה - הפרדת הגדילים. -Annealing הצמדת הפריימרים לדנ"א. Extensin - סינטזת הגדילים ע"י הטק פולימרז אולטרה. כאשר חוזרים על התהליך, המקטעים המסונתזים משמשים בעצמם כתבנית, ותוך מס' מחזורים התוצר העיקרי הוא מקטע ה- DNA הספציפי שאורכו שווה למרחק בין שני הפריימרים המקוריים. שיטת ה- PCR רגישה ביותר- יכולה לאתר מולקולות DNA יחידה בדגימה. בידינו פלסמיד המכיל את הגן,Fer Tyrsine Kinase שאותו אנו רוצים להגביר בהתאם למסגרת הקריאה. אורך מסגרת הקריאה הוא. 2471bp 6

8 לכך אנו צריכים את המרכיבים הבאים (תערובת שהוכנה עבורנו מראש): 1. סטים של אוליגונוקלאוטידים יחודיים המשמשים כפריימרים, הם נבחרו כך שיוכלו לאתר את קצוות הגן הרצוי ע"י זיווג בסיסים. פריימר קדמי - זהה לגדיל עליון Sense) - ב- 18 נוקלאוטידים) ומשלים לתחתון. מכיל אתר רסטריקציה של.PstI הפריימר יכול להכיל - ATG במקרה שלנו אין צורך מכיוון שכביכול קיים קודון התחלה בתג שבפלסמיד. פריימר אחורי זהה לגדיל תחתון Antisense) - ב- 22 נוקלאוטידים) ומשלים לעליון. מכיל אתר רסטריקציה של BglII (בחיתוכו נשארים קצוות דביקים משלימים לחיתוך של ), BamHI מכיל משלים לקודון סיום. המטרה היא לייצר מחדר שיכיל את אתרי ההכרה של אנזימים היוצרים תוצרים מתאימים לתוצרי האנזימים שחתכנו בהם את הפלסמיד, עמ"נ לאפשר ליגציה בינהם. אתר חיתוך הנותן תוצר מתאים לאתר של BamH1 TM של הפריימרים נקודת ההתכה בין ה- target לפריימר (תלוי ב- % ה- GC,אורך הפריימר וכו') 5 מתחת ל- TM של הפריימר עם ה- TM הנמוך. טמפרטורת ההדבקה ב- PCR היא בדר"כ c הורדה והעלאה של טמפרטורת ההדבקה תווסת בין קבלת תוצרים ספצפיים לבין העדר תוצרים כתוצאה מהעלאת או הורדת ה- stringency (תנאי הריאקציה כמו טמפרוטרה המשפיעים על ה- annealing של הפריימרים לדנ"א. כשה- stringency גבוה יהיה annealing רק במידה והפריימר יהיה ספציפי לדנ"א. כשה- stringency נמוך, אין יהיה annealing גם אם הפריימרים מכילים נוקלאוטידים שאינם משלימים לקצוות גן המטרה). רצוי שה- TM של שני הפריימרים יהיה קרוב. G - ככל שיותר שלילי המצב המקופל מועדף ואז קשה לפריימרים להידבק לגן המטרה ולכן רצוי שיהיה כמה שפחות שלילי..2 Dntp - 4 נוקלאוטידים הדרושים לסינטזה. 3. Plymeras Taq שבודד מחיידקים תרמופילים כך שיהיה יציב בטמפרטורות גבוהות מהרגיל. 4. בופר פעילות לאנזים לקחנו מבחנת א. הוספנו Taq Plymeras המכיל גם קופקטור. Mg +2 :PCR 500ml PCR מתערובת ה- 95ul ב. הוספנו את ה- DNA (פלסמיד מכיל את גן המטרה 5µl :(mfer מתמיסה שריכוזה. 10ng / µ l ג. סרכוז קצר להשקעת שאריות שבדפנות ד. הכנסה למכשיר ה- PCR 7

9 1 טבלת תוכנית הריארקציה כפי שבוצעה: פקודה למכשיר שלב טמפרטורה זמן 00:01:00 00:00:40 94 c 94 c 56 c 2 3 הסבר דנטורציה על מנת להפריד בין הגדילים המשך דנטורציה אדוה דרזי - annealing הצמדת הפריימרים לדנ"א. את הטמפ' קובעים לפי ה- TM (כ- 5 מעלות פחות), זאת מכיוון שריאקצית ה- PCR מבוססת על עקרון ההצמדות הספציפית בין הפריימר ל- target התלויה בגורמים כמו % ה C,אורך / G הפריימר וכו'. במידה והטמפ' נמוכה הפריימר יצמד פחות ספציפית, בטמפ' גבוהה הפריימר לא יצמד מספיק חזק או שלא יצליח כלל להקשר... במקרה שלנו רצינו קישור פחות ספציפי כי הפריימרים מכילים אתרי חיתוך שלא נמצאים בגן המטרה, ואנו רוצים שהם יקשרו ולכן הורדנו את הטמפ' ל- 56. c - Extensin סינטזת הגדילים ע"י הטק פולימרז. הטמפ' תלויה באנזים (לפי העלון לצרכן). יש לקחת בחשבון שהטק לא עמיד עד אינסוף ולכן רצוי לא לתכנת זמן מיותר לשלב זה. GO TO שלב 2 ל- 3 מחזורים. 4 מחזורים ראשונים להשגת קישור של הפריימרים (בטמפ' נמוכה יותר היות ויש אתרי חיתוך שלא קיימים בגן המטרה) Annealing (בטמפ' 00:00:40 00:03: :00:40 00:00:40 00:03:00 72 c c 61 c 72 c דנטורציה גבוהה יותר כעת לאחר שהפריימרים נקשרו יש צורך בקישור ספציפי) Extensin GO TO שלב 6 ל- 27 מחזורים. 28 מחזורים להשגת תוצרים ספציפיים. על מנת לבצע השלמות הטק פולימראז יסנטז אזורים נקודתיים שעדיין לא פולמרו עד שנפסיק את המכשיר הטמפ' תעמוד על 10 c לשמירה על המצב הקיים. (את ה PCR השארנו (Over night :10:00 hld c 10 c יש לתכנת את טמפ' המכסה ל- - זאת על מנת שלא יתעבו מים בפקק המבחנה אשר 105 c LID יגרמו לריכוז החומר - עלול ליפריע לפעילות האנזים. בעבר השתמשו בשמן למטרה זו היום השתכללו. גודל התוצר: מסגרת קריאה של הגן - bp 2471 אתר אנזימי הרסטריקציה - bp 6+ קצוות לאחר/לפני אנזימי הרסטריקציה - bp 5+ העדר ATG קודון תחל שכביכול קיים בתג שבפלסמיד ולכן לא הוכנס לתוצר - bp 3- סה"כ - bp 2479 לא כל כך מובן מדוע זה רק 11 ולא 22 גם המדריכים לא כ"כ יודעים מדוע, אולי היא טעתה... 8

10 שלב ד': ניקוי התוצר המוגבר - הכנה לחתוך: ניקוי תוצר ה- PCR הוא זהה לניקוי שעשינו עם הפלסמיד. (יש לבצע גם לפני החיתוך, כי בהכנתו השתמשנו במרכיבים העלולים לפגוע במהלך הניסוי. ההבדל היחיד שהאלוציה התבצעה עם מחוממים (לעומת קודם ). 40µl שלב ה': חיתוך התוצר המנוקה: נכניס למבחנה מספר מרכיבים ונדגיר ב- בופר 37 למשך 45 דקות : c חומרים לפי סדר ההוספה מים להשלמת נפח אדוה דרזי 82µl מים כמות ב- µl O - הבופר נבחר בהתאם לאנזימים שהשתמשנו לפי הוראות היצרן. נמהל פי 10 mfer BglΙΙ - אתר הכרה היוצר תוצר המתאים ל- BamHI PstI סה"כ הפעם לא משתמשים ב- CIP מכיוון שבמידה ונוריד פוספט לא תהיה ליגציה. (יש צורך בפוספט שיתקיף את הקצה 3 פריים הקרבוקסילי בפלסמיד) Bgl2 1. יוצר קצה 5' דביק (נשתמש בו ולא ב- BamHI היות והאחרון חותך בתוך האינסרט עצמו): A + 5' GATCT 5'A GATCT 3' TCTAG 5' A 3'TCTAG A 5' Pst1 2. יוצר קצה 3' דביק: GTGCA 3' + G 5'GTGCA G 3' G 3' ACGTC ' 3'G ACGTC 5' שלב ו': ניקוי התוצר המוגבר לאחר חיתוך הכנה לליגציה: ניקוי תוצר ה- PCR הוא זהה לניקוי שעשינו עם הפלסמיד. האלוציה התבצעה עם 40µl מים מחוממים. 4µ לאפנדורף נוסף, הוספנו 8µ l מים, ו- 3µ l בופר העמסה למטרת הרצה גם כאן העברנו מהדוגמא l בג'ל. שלב ז': הכנת ג'ל אגרוז 1% והרצה בג'ל: רענון: דגימות מתוצאות החיתוך עם אנזימי הרסטריקציה הורצו בג'ל בשיטת האלקטרופורזה, ע"ג ג'ל אגרוז פולימר סוכרי שהופק מאצות המאפשר הפרדה לפי גודל ומבנה מרחבי. מטרת ההרצה היא הערכת כמויות, לוודא שהוקטור נחתך כראוי וכי נעשתה הגברה רצוייה ב-. PCR ההרצה נעשתה בג'ל 1% בבופר,TBE ככל שהאחוז גדול יותר, הג'ל סבוך יותר - החרירים קטנים יותר, ולכן כושר ההפרדה גדול יותר. ג'ל פחות מרוכז נועד לגדלים של 5,000 bp שהם גדולים יחסית. מיקום נדידת התוצרים בג'ל יהיה ניתן לזיהוי ע"י צביעת חומצות הגרעין באטידיום ברומיד (חומר פלואורוסנטי הנקשר לדנ"א) שנמצא בתוך הג'ל בריכוז סופי של 1µ g / µ l (ניתן להוסיפו גם לבופר ההרצה לקבלת תמונה ברורה יותר). חומר זה, נכנס בין בסיסי חומצות הגרעין, וכך לאחר ההרצה מקרינים את הג'ל באור U.V ומתקבלת תמונת ההרצה. הג'ל נמצא במצב נוזלי כשהוא מורתח, והוא מתקרש לאחר קירור. תנועת החומר בתוך הג'ל נעשית ע"י זרם חשמלי בהתאם לגודל, מבנה, מטען המולקולה, ריכוז הג'ל ועוד. התוצרים שלנו רצים מהקטודה (שלילי) לאנודה (חיובי) מפני שהד.נ.א הינו בעל מטען כללי שלילי בגלל הפוספטים שבשלדו. 9

11 לפלסמיד המעגלי הבלתי חתוך יכולות להיות שלוש צורות מרחביות: 1. לינארי - דו גדילי. שבר בדנ"א כאשר שני הגדילים נפתחו באותה נקודה. 2. ciled - super דו-גדילי מעגלי המלופף סביב לעצמו. 3. nicked - בו אחד הגדילים נחתך ונפתח במהלך הפקת הפלסמיד. לכל אחד מהם יש מידת נדידה שונה: Super ciled הינו קומפקטי ולכן נע מהר יותר מאשר ד.נ.א לינארי בעל אותו גודל. nicked הינו בעל מבנה פתוח ומסורבל ולכן נע לאט יותר מ-ד.נ.א לינארי בעל אותו גודל. אדוה דרזי לרוב בפלסמיד שלם נבחין ב- super ciled ו- nicked ופחות בלינארי היות ויש צורך במכה חזקה לשבירה של 2 הגדילים. מידת הנדידה של הדוגמאות השונות מושוות לנדידה של מקטעי ד.נ.א לינאריים שמשקלם המולקולרי ידוע (מרקר מסחרי). מהלך העבודה הכנת הג'ל: 1. הכנסנו לארלנמאייר 200 מ"ל: 100 מ"ל בופר (1 TBE ),טריס-בוראט- EDTA +1 גרם אבקת אגרוז +2 Mg 2. כיסינו באלומניום את הארלנמאייר והרתחנו על התמוססות מוחלטת של האגרוז. 3. על כל 10 מ"ל ג'ל מוסיפים 0.5 מיקרוליטר אטידיום ברומיד. אז ב- 100 מ"ל נשים 5 מיקרוליטר. (שמנו בפועל 4) את האטידיום מוסיפים לאחר שטמפרטורת הג'ל יורדת מתחת ל- 50 כי עלול להתפרק. 4. יצקנו לתבנית מתאימה הנחנו על נייר רדיואקטיבי שמטרתו לספוג נוזלים מסוכנים וחיכינו להתמצקות מוחלטת. 5. הוספנו 100 מ"ל בופר TBE,טריס-בוראט- EDTA = בופר הרצה. 6. הטענו את הדוגמאות: א. 10µ l מרקר לינארי ) g λ 1µ) פאג' החתוך באנזים. StyΙ גודל גנום הפאג' 50,000 ז.נ. ב. דוגמת וקטור לא חתוך (הכלל בופר בעמסה) ג. דוגמת הוקטור החתוך והמנוקה (הכלל בופר העמסה) ד. דוגמת המחדר המנוקה החיתוך והמנוקה שוב (הכלל בופר העמסה) 7. בתום ההפרדה, צילום במצלמה המקרינה U.V הגורמת לאטידיום להתערער/לקלוט אורך גל קצר יותר ולפלוט ארך יותר באור הנראה. בופר העמסה (צבע לדנ"א) כולל: א. גליצרול בעל צפיפות גבוהה כדי שהדוגמא לא תצוף אלא תשקע בבאר. ב. ברומופנול כחול לאינדיקציה של ההרצה כדי שנוכל לעקוב אחרי הטענה מהלך ההרצה והפסקתה רץ בגדלים קטנים. ג. קסילם דיאנול (תכלת) לאינדיקציה של ההרצה רץ בגדלים גדולים יותר. את ההרצה ביצענו במתח של 80V עד יציאת הדוגמאות מהבארות ואחר כך העברנו ל- 100V. EDTA משמש להגנה - סופח יונים דו ערכיים כך שבמידה וקיימות נוקלאזות הנזקקות לקופקטורים כמו ה- הם יעוכבו ע"י ה- EDTA. בעבר השתמשו בטריס-אצטט- EDTA תמונת ההרצה: מה הרצנו? מה קיבלנו? היינו אמורים לקבל? 10µl מרקר לינארי ) g λ 1µ) פאג' החתוך באנזים. StyΙ גודל גנום הפאג' 50,000 ז.נ. א. היום כבר לא... ב. וקטור לא חתוך µl KS 10 לא חתוך + µl 3 צבע לדנ"א 3+10=13µl : היינו אמורים לקבל 3 בנדים, לכל היותר: Super ciled שאמור לרוץ הכי מהר (הכי קטן), לאחר מכן את ה הלינארי שקיבל מכה חזקה ונשבר בשני גדיליו (הסיכוי לראותו קטן הוסבר קודם לכן). ולבסוף את ה- nicked (או (Relaxed שבו רק אחד מהגדילים נשבר - מסורבל. חלק מהקב' קיבלו כמות קטנה ביותר של ה-,Super ciled חלק לא קיבלו אותו בכלל. וחלק מהקב' קיבלו כמה צורות Relaxed (כנראה שבר במיקום שונה). 10

12 הסברים אפשריים: הפלסמיד הלא חתוך מלכתחילה היה פגום. הרצנו פלסמיד אחר, מדגימה שונה פלסמיד שגוי. תקלה בעת הפקת הפלסמיד. יתכן קונקטמר מס' פלסמדים שהתחברו יחד עקב הקצוות המתאימים שלהם. הצעות יעול - ניתן להריץ שנית ולבדוק שאנו לוקחים מהדגימה המתאימה. במידה ונקבל אותה תוצאה (גרועה), רצוי לבצע הפקה חדשה של הפלסמיד ולבדוק האם יש שינוי. אם סוג הפלסמיד בעייתי ניתן להחליפו בפלסמיד אחר אשר דומה בתכונותיו לפלסמיד הנ"ל. ג. אינסרט לאחר חיתוך ) insert 4 µl דנ"א+ 8 µl מים + µl 3 צבע לדנ"א :( 15 µl הרבה קבוצות קיבלו מריחה - תוצרים לא ספציפיים. אך היה ניתן לראות בבירור את המחדר שגודלו כ-.2400bp הסבר אפשרי - ריאקצית PCR לא ספציפית: 1. עקב טמפ' anniling נמוכה התאפשר קישור לא ספציפי של הפריימרים לגדילים, ולכן נוצרו תוצרים לא ספציפיים. 2. יתכן והפולימראז לא רץ עד סוף ה- Target ולכן קיבלנו הגברה לא ספציפית, תוצרים הקטנים בגודלם מהתוצר הרצוי. הצעות יעול - ניתן לבצע שנית את ריאקצית ה- PCR ולשנות את התוכנית: 1. להעלות את הטמפרטורה של ה- anniling לקבלת תוצרים יותר ספציפיים. 2. להגדיל את זמן ה- Extensin על מנת לאפשר לפולימרז לסנטז עד סוף הגדיל. ד. וקטור לאחר חיתוך Vectr) 4 µl דנ"א + µl 8 מים + µl 3 צבע לדנ"א ( 15 µl אמורים לקבל בנד בסביבות גודל.3000bp הפלסמיד לאחר חיתוך הפך להיות לינארי (אמנם חתכנו עם שני אנזימים, אך איבדנו רק 16 נוקלאוטידים ביניהם, ולכן לא נראה אותם כבנד נוסף). ביקורת הרצה: הביקורת בהרצה זו היא הפלסמיד הלא חתוך והיא שימושית כדי שנוכל לראות שהפלסמיד נראה כפי שאנו מצפים. (במקרים שונים אכן התגלתה בעיה בפלסמיד,הוסבר לעיל) במידה ועושים השוואה בין הביקורת לפלסמיד החתוך: בהשוואת הביקורת אל מול הפלסמיד החתוך ניתן לראות כי הפלסמיד הלא חתוך מכיל מספר בנדים, היות ויש מספר צורות שונות בהן הפלסמיד מסתדר, לעומת זאת, פלסמיד חתוך הפך לינארי ולכן נבחין בצורה אחת בלבד. יש לבדוק ולהבחין בדברים להלן: א. בבאר הביקורת, שה- Super ciled אכן רץ קצת יותר מהר מהבנד של הפלסמיד החתוך. ב. בבאר הביקורת, הבנד שאמור להיות הלינארי (הבא לאחר ה- ciled (Super צריך להיות, פחות או יותר, באותו גובה (גודל) של הפלסמיד החתוך. במידה ובביקורת נקבל בנד שגדול מהפלסמיד החתוך - הבנד לא לינארי אלא צורה נוספת של.Relaxed ג. בבאר הביקורת, בנדים שמתעכבים יחסית לבנד הפלסמיד החתוך הם.Relaxed את ריכוז התוצרים ניתן להעריך בשתי שיטות: 1. קריאה בספרקטרופוטומטר באורך גל. 260nm 2. לאחר הרצה בג'ל וקבלת תמונה - הערכה לפי העין. פירוט שיטה מס' 1: קריאת הדוגמאות שהכנו בספרקטרופוטומטר. קודם לקריאה של הדוגמאות יש לבצע קריאת בלנק עם מים, על מנת לאפס את המכשיר. הקריאה נעשתה בקווטות למדידת ריכוז דנ"א ב-.260nm 11

13 e אדוה דרזי חוק ברלמברט (לידע כללי) במידה ובידינו דגימה צבעונית, ונקרין עליה אור מונוכרומטי (באורך גל אחד) תבלע אור ביחס ישר לריכוזה. זאת בשני תנאים: 1. האור שנפלט מהתמיסה נמצא במקסימום פיק הבליעה. 2. ריכוז המולקולות מספיק נמוך יש ריכוז מסויים של מולקולות, שבו הן יכולות לבלוע ולפלוט אור. אסור לעבור אותו אם כן נגיע לרוויה (מצב פלטו), יהיו מולקולות שלא יבלעו/יפלטו. ספקטרופוטומטר מאיר אור בכמות ידועה,בודק כמה אור עבר, מחשב את ההפרש ומכאן מחשב את הבליעה שמהווה מדד לריכוז. ב- DNA הטבעות הארומטיות בנוקלאוטידים הן אלו שבולעות את אורך הגל 260nm בחלבונים חומצות אמינו ארומטיות, כגון טריפטופן, הן אלו שבולעות את אורך הגל, 280nm זאת מכיוון שיש בהן קשרים כפולים, שאותה אנו מודדים. תמיסה המכילה 50µ g נקי ב- חופשיים קופצים ועוברים אורביטל וכאשר הם חוזרים נפלטת אנרגיה.O) באורך "ל תמיסה מימי, תבלע יחידה אחת של בליעה ). AU D, 50µ g / ml 1 O. D? O. D result לתמיסת חומצות גרעין, תהיה בליעה גבוהה יותר באורך הג'ל 260nm לעומת 280nm וההפך הוא הנכון לגבי תמיסת חלבון. היחס בין הבליעה ב- 280nm לבין הבליעה ב-, 260nm / 280nm 260nm מעיד על דרגת הניקיון של הדנ"א. אמור להיות בין וזה מעיד על הרחקה מספיק טובה של החלבונים. היחס בין הבליעה ב- 230nm לבין הבליעה ב-, 230nm / 280nm 260nm מעיד על דרגת הניקיון של הדנ"א לגבי מלחים, קרבוהידראטים, פנול כלורופורם וכו'. היחס אמור להיות קטן מ בליעה ב- 320nm אמורה להיות מאוד נמוכה, מבטאת פיזור אור בדר"כ ע"י חלקיקים הנמצאים בדוגמא. החסרון של שיטה זו שהיא קוראת תוצרים לא ספצפיים בנוסף לתוצר הרצוי וכך הערכה אינה מדוייקת. מ 1 גל. 260nm כך שלפי ערך משולש ניתן לחשב את ריכוז התמיסה: הדגימות שנקראו בספקטרופוטומטר:. 1 l 5µ ממבחנת המחדר + l 55µ מים מזוקקים עורבבו, והוכנסו לקיווטה מיוחדת למדידת DNA באורך גל. 260nm הדוגמא נמהלה פי. 12 DNA מים מזוקקים עורבבו, והוכנסו לקיווטה מיוחדת למדידת 55µl + ממבחנת הפלסמיד 5µ l. 2 באורך גל. 260nm הדוגמא נמהלה פי 12. מה קיבלנו? היינו אמורים לקבל? ריכוז הדנ"א שקיבלו הקב' השונות הספיק להמשך מהלך הניסוי. במידה והיינו רוצים דנ"א בכמות c גבוהה יותר, ניתן היה לרכזו ע"י אמוניום אצטט ואתנול אבסולוטי בסרכוז ב-. 4 כמובן שמלכתחילה הייתה אפשרות לבצע אלוציה בנפח נמוך יותר, לקבלת תוצר מרוכז יותר. חלק מהקב' קיבלו דרגת ניקיון 260nm / 280nm נמוכה מהמצופה, השערות: 1. השטיפות בניקוי לא היו מספיק טובות. 2. אי קישור מקסימלי של בופר הקישור. 3. ערכת הניקוי אינה יעילה מספיק. הצעות ייעול: החלפת ערכת ה- PCR Purificatin Kit וביצוע שטיפות נוספות. 12

14 פירוט שיטה מס' 2: הרצה בג'ל והערכת כמות לפי העין. לפי עוצמתו של בנד התוצר ניתן להשוותו לבנד המרקר. ומכיוון שאת ריכוז הבנדים של המרקר ניתן לחשב, נוכל להסיק שמדובר באותו ריכוז לגבי התוצר שלנו (יש התחשבות כמעט זניחה בגודל, הערכה מתבצעת בעיקר לפי עוצמה): 1. המרקר מכיל.50,000bp ( 1µ 2. בהטענה של 10 מיקרוליטר מרקר,הריכוז הסופי יהיה 1 מיקרוגרם למיקרוליטר. ) 1000ng g = טבלת הריכוזים של הבנדים השונים במרקר λ פאג': ריכוז בנד המרקר ) l ( ng / µ גודל בנד המרקר (bp) דוגמא לחישוב ריכוז הבנד המרקר והסקה לגבי ריכוז בנד התוצר: לדוג' בנד התוצר זהה בעוצמתו לבנד שגודלו 3472: bp לפי ערך משולש ניתן לחשב את ריכוז בנד המרקר: 50,000bp 1000ng 3472bp X X = = 69ng יש להתחשב בכמות הדנ"א מהטענו - אנו הטענו 4 מיקרוליטר תוצר ולכן ריכוז בנד התוצר הוא 69 = 17.25ng / µl : ולכן 1µl אך אנחנו צריכים לחשב ל- 69 ng / 4µ l 4 יש לציין כי לא ניתן להסיק גודל תוצר לא לינארי ע"י השוואה למרקר, היות והמרקר לינארי ולא מייצג נכונה מבנים לא לינאריים. כלומר, לא ניתן להסיק לגבי ריכוז ה- Super ciled בפלסמיד מכיוון שהמרקר הוא לינארי והפלסמיד הוא שלם. בשל אי הדיוק התייחסנו בחישוב הריכוזים לליגציה בתוצאות שהתקבלו בספקטרופוטומטר (על אף שגם בשיטה זו יש אי דיוק, היות ויש קריאת בליעה גם של התוצרים הבלתי ספציפיים). מדוע קב' רבות קיבלו הבדלים ניכרים בין קריאת הספקטרופוטומטר להערכה בעין? השערות: בהערכת הריכוז בעין תיתכן הטענה חלקית (לא מטעינים את כל הדוגמא) לכן יתכן כי בפועל היה יותר דנ"א מאשר הערכנו. קריאת כל התוצרים, כולל תוצרים בלתי ספציפיים ע"י הספקטרופוטומטר. (במיוחד באינסרט בו רואים בברור (smear עוצמת תוצרים העולה על עוצמת הבנדים המקבילים בעוצמתם במרקר ולא מאפשרת חישוב מדוייק. 13

15 שלב ח': ליגציה: על מנת שיהיה איחוי בין המחדר לוקטור נכניס למבחנה את המרכיבים הדרושים ונשרה תנאי ליגציה - 4 למשך הלילה. O.N c עלינו לחשב את הכמויות שאנו צריכים לשים במבחנה. לפני כן נחשב את היחס לפי החישוב הבא: Vactr = 3000ng 60 ng Insert = 144ng 7200ng גודל :(bp) יחס מולרי מומלץ לקצוות דביקים. יחס מסה (נתיחס לגודל כאל ( m.w לאחר צמצום בהתאם לריכוזי הדנ"א שקיבלנו בוקטור ובפלסמיד ובהתאם ליחס שמצאנו נחשב כמות וקטור ומחדר כך שכמות הריאציה הסופית תהיה כ-. 25µl T 4 החומרים בופר ליגאז 10 וקטור מחדר מים מזוקקים DNA Ligase 5µ g / µ l נפח ריאקציה סופי כמויות ב- µ l (השלמה ל- 25 ) µl ג. מדוע כמות של תמיסת הוקטור היא? 2µl : 26ng לדוגמא קיבלנו בקריאה בספקטרופוטומטר שריכוז ה- KS הוא / µ l = 312ng א. נכפיל במיהול / µ l ב. אנו צריכים 60ng ולכן נמהל פי - 10 µl = 31.2ng / / במיקרוליטר אחד יש מדוע כמות של תמיסת המחדר היא? 2µl א. ב., 31.2ng אנו צריכים, 60ng ולכן נשים 2 מיקרוליטר. :12ng לדוגמא קיבלנו בקריאה בספקטרופוטומטר שריכוז המחדר הוא / µ l ע"פ היחסים אנו צריכים 144ng (באמת אחרי הכפלה בפקטור מיהול יש (144ng אך בגלל שבהרצה בג'ל המחדר יצא כמריחה - smear - אנו יודעים שיש עוד חומצות גרעין במבחנה שהם לא המחדר שלנו תוצרים לא ספציפיים. מכאן הריכוז שמדדנו איננו אמין כלומר הוא לאו דווקא המחדר (המכשיר לא מבדיל בין תוצר רצוי לתוצרים לא ספציפיים) לכן נאמר לנו לקחת 2µl כדי לוודא שיהיה מספיק מחדר. שלב ט' טרנספורציה לחיידקים: תהליך טרנספורמציה הוא תהליך בו מחדירים DNA זר לתוך תא חיידק. אנו מבצעים 2 טרנספורמציות: הפלסמיד הרקומביננטי שהכנו לאחר הליגציה, אשר גן ל- FER נכנס במיקום אשר מפריע ליצירת מושבות כחולות כפי שהוסבר ולכן אנו אמורים לקבל מושבות לבנות. בנוסף אנו נבצע טרנספורציה לפלסמיד לא חתוך אשר לא הופרע הגן LacZ ולכן אנו מצפים למושבות כחולות ביקורת. 14

16 פרוטוקול עבודה: אדוה דרזי MgCl 2 להגברת חדירות הממברנה שלהם חיידקים 1. לפני הטרנספורמציה החיידקים מטופלים ב- קומפטנטיים. חיידקים אלה הוגשו לנו כאשר הם קפואים ב- 70 ולכן בשלב 1 אנו שמים אותם בקרח יחד עם ה- DNA הפלסמידי שהוספנו, למשך 20 דקות לפני מתן שוק החום בכדי שלא יתפוצצו במעבר טמפרטורות מהיר. (קיבלנו שתי מבחנות של 200µ l חיידקים קומפטנטיים לשתי טרנספורמציות). c 2. החדרת הפלסמיד לחיידק נעשית באמצעות שוק חום לכ- 90 שניות בטמפרטורה, 42 והחזרה לקרח. הפלסמיד חודר טוב יותר בטמפרטורה גבוהה. במקרה הטוב ביותר 1 מתוך 10,000 חיידקים מקבל.DNA 37. זאת על מנת שיתאוששו ויוכלו. 3 מוסיפים מצע נוזלי LB כ- 800µ l ושמים אותם במשך שעה ב- c לסנטז חלבונים שלהם ושל הפלסמידים במידה ויוחדרו להם. למעשה, כבר אחרי 20 דקות הם מסנטזים חלבונים של הפלסמידים שהוכנסו אליהם.. 4 זריעת החיידקים בצלחות אשר מכילות: LB + AMP + IPTG + XGal תתבצע כך שכל טרנספורמציה זורעים בשתי צלחות כדלהלן: סה"כ בכל מבחנה היה לנו קצת יותר מ- 1000µ l בתחילה זרענו 150 מיקרוליטר מהמבחנה. על מנת ליצור חיידקים בריכוז גבוה יותר סרכזנו מה שנותר וזרקנו את רוב הנוזל עליון, הרחפנו את החיידקים עם הנוזל שנשאר וזרענו. 5. את הצלחות הדגרנו ב- 37 c למשך 24 שעות. (בפועל הדגרנו ל- 48 שעות מכיוון שהמושבות לא הספיקו להכחיל ב- 24 שעות - יתכן בשל ריכוזם הנמוך של Xgal ו- IPTG שעוברים דיפוזיה איטית באגר). הפלסמידים מכילים גן לחלבון β לקטמאז המקנה עמידות לאנטיביוטיקה אמפצילין. כך קיימת סלקציה של החיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י גידול על מצע אמפיצילין. רק חיידקים שיש להם את הגן לאנזים β לקטמאז מסוגלים לפרק אמפיצילין ולכן לגדול על מצע המכיל אנטיביוטיקה זו, חיידקים שאין להם גן זה לא יגדלו כיוון שהאנטיביוטיקה אמפיצילין גורמת לעיכוב אנזימים המעורבים בסינטזת דופן החיידק. E. Cli דוגמא והסבר לתוצאות שהתקבלו: תוצאות הטרנספורמציה של חיידקי וקטור + מחדר בקורת וקטור לא חתוך ע"י פלסמיד סוג מושבות מושבות כחולות מושבות לבנות ניתן לראות שהתוצאות שקיבלנו הן כפי שציפינו מספר רב יותר של מושבות כחולות לעומת הלבנות בצלחת הביקורת, ומספר רב של מושבות לבנות בצלחת של תוצר ליגציה, שבה הכנסת המחדר לפלסמיד אכן פגעה בגן LacZ אשר אחראי ליצור המושבות הכחולות במצע המתאים. יתכן כי בהארכת זמן הליגציה 16 המושבות הלבנות היו מכחילות בצלחת הביקורת. השערה (התקבלה ע"י אוראל): התקבלה כמות גדולה יותר של מושבות בצלחת הביקורת לעומת צלחת הניסוי, היות ובפלסמיד הרקומביננטי יש שני Nicked שנוצרו עקב הורדת הפוספטים מקצה 5 פריים ב- KS (למטרת ליגציה). מבנה כזה מתקשה יותר במעבר ממברנת החיידק לעומת פלסמיד ללא.Nicked יעילות הליגציה תלויה בשני גורמים: א. יעילות חיתוכים סוגי אנזימים (יוצרים קצה דביק/ישר), איכות אנזימים, נפחי הריאקציה וריכוז ליגאז. ב. יעילות חיידקים קומפטנטיים חיות החיידקים וצורת הפלסמיד (צורת Super ciled היעילה ביותר לחיתוך וליגציה). 15

17 לאחר קבלת התוצאות ניתן לחשב את יעילות החיידקים הקומפטנטיים: (1000ng דנ"א הגדרת יעילות החיידקים - מספר המושבות שגדלות בצלחת עקב החדרת )1µg לחיידקים. דרך החישוב: בשלב ה- 1 של הטרנספורמציה הוספנו 5µl פלסמיד KS לא חתוך המהווים של חיידקים קומפטנטיים. לאחר שוק החום הוספנו מצע נוזלי 200µl פלסמיד, ל- 100ng LB כ- 800µl להתאוששות (סה"כ נפח אליו הכנסנו פלסמיד 1000µ) l, מתוכם זרענו 150µ. l לפי ערך משולש ניתן לחשב את כמות ה- KS שזרענו ( Xבחישוב): 1000µ l 100ng 150µl X X = = 15ng 1000 כלומר זרענו.KS 15ng כעת נחשב את היעילות ע"פ יחס משולש: (הכנסנו לחישוב את מס' המושבות הלבנות תוך הנחה שבמתן זמן הדגרה נוסף הן היו הופכות כחולות) 15ng 880clnies 1000ng Y Y = = 58667clnies התוצאה שקיבלנו מאפיינת יעלות נמוכה. לדברי החברה המשווקת אנו אמורים לקבל יעילות של כ צורה זו היא האופטימלית לחדירה ולביטוי בחיידק.במקרה שלנו היה ריבוי צורות אחרות פחות אופטימליות. השערות לגבי קבלת יעילות נמוכה: החיידקים נפגמו במהלך הטרנספורמציה/הכנתם לקראת הטרנספורמציה מפאת חוסר זהירות א. הרי מדובר בחיידקים מאוד רגישים. לעיתים אף טיפול שאמור לסייע להגברת החדירות שלהם עלול להרוס אותם. החיידקים הקומפטנטים עצמם, מראש לא יעילים לשימוש (כבר לפני הכנתם לטרנספורמציה). ב. KS בתמונת ההרצה ראינו כי ברוב הקב' התקבל ריכוז נמוך של צורת ה- Super ciled בפלסמיד ג. הלא חתוך, צורה זו היא אופטימלית לחדירה ולביטוי בחיידק. במקרה שלנו היה ריבוי צורות אחרות פחות אופטימליות. יתכן שבחלק מהחיידקים הייתה בעיה בפלסמיד עצמו בגן ל- β לקטמאז, כתוצאה מכך אבדה ד. העמידות לאנטיביוטיקה ולכן גדלו פחות מושבות. הצעות יעול: ניתן לבצע אלקטרופורציה טרנספורמציה בשיטת שוק חשמלי שאמורה לתת תוצאות טובות יותר. רכישת חיידקים קומפטנטיים שונים או מחברה שונה. ניסיון איתור מקור הבעיה ע"י ביקורות שונות לדוג' החדרת פלסמיד שונה לאותם חיידקים קומפטנטיים. במידה ונקבל אותם תוצאות הבעיה אכן בחיידקים הקומפטנטיים. 16

18 ה ) אדוה דרזי במידה והניסוי הצליח אנו אמורים לקבל פלסמיד רקומביננטי שגודלו :5415bp גודלו של KS לפני החיתוך הוא.2961bp האנזימים חותכים בפולילינקר במקומות המסומנים בחץ אדום: עקב החיתוך גודלו של הפלסמיד יהיה: = 2945 bp גודל תוצר ה- PCR לאחר חיתוך: = bp 1+ - זה מה שנשאר מאתר אנזימי הרסטריקציה לאחר חיתוך, ה- 3- בגלל הורדת ה- ATG :נראה לי, לא בטוח כל העניין לא הכי מובן...) לאחר חיבור המחדר והאינסרט נקבל: = 5415 bp במידה והיינו משתמשים בפלסמיד הרקומביננטי למטרת מחקר, היינו צריכים לבצע בדיקות נוספות: 1. הפקת הפלסמיד בכמות קטנה ע"י Miniprer ולאחר מכן חיתוכים באנזימי חיתוך והרצה במה אפשר לחתוך? (נשתמש במושבות הלבנות היות והסיכוי שהמחדר הרצוי קיים בהן הוא גדול כל מושבה ניקח בנפרד כי היא עלולה להיות בעלת קלון שונה) א. באותם אנזימים שהשתמשנו מקודם (אי אפשר לחתוך ב-,BglII כי לאחר הליגציה אתר ההכרה מתאים רק ל- (BamHI זאת בתקווה שנקבל פרגמנטים מתאימים בהתאם לאנזימים שבהם חתכנו. ב. באנזים בתוך האינסרט ומחוץ לאינסרט לבדוק את הכיוון הנכון של הכניסה. 2. ביצוע קביעת רצף - Sequencing DNA לתוצר וכך לבדוק האם קיים התג ומסגרת הקריאה נשמרה. מטרת התג- להפיק חלבון ולזהות אותו ע"י נוגדן/קולונה כנגד התג. לדוג', 6 שיירי His כרומטוגרפית זיקה על קולונת ניקל או לצבוע חלבונים ע"י צבע פלורסנטי - ע"י אנטי מיק(שם תג מסויים) + נוגדן עם צבע קוראים את זה במיקרוסקופ קונפיקלי. 17

19 מודל אופרון הלקטוז אדוה דרזי בשנות ה- 60 נתגלו בניסויים מספר סוגי רנ"א פרוקריוטים וכמו כן ידעו שבהעברת חיידקים ממצע אחד אל מצע שני, הם היו מסוגלים לעכל אותו, כלומר הם סנטזו אנזימים שעיכלו את המצע החדש. מכאן הבינו שהיה רפרסור שעיכב סינטוז אנזים אחד וגרם לסינטוז של אנזים אחר. כל זאת הוביל ללמידת מנגנון שנכתב ע"י ג'קוב (לא המדריך לביולוגיה מולקולרית...) ומונוד בשם מודל האופרון. אופרון הלקטוז הוא מקרה ספציפי שיכול ללמדנו על תהליכים אחרים. מודל אופרון הלקטוז מדגים אזור בדנ"א שאחראי על שעתוק אנזים לעיכול לקטוז. כפי שרואים האופרון מכיל: 3 גנים שקשורים זה בזה ומקודדים לאנזימים שקשורים בלקטוז -. z y ואזור הפרומוטור המכיל גם a אופרטור.(Operatr) בכיוון 5' ללקטוז האופרון ישנו גן מבקר i,,regulatr gene שמקודד ל- Repressr ולו פרומוטור משלו. i z y a התהליך, כפי שמתואר באיור:. 1 בצורה שגרתית מולקולת רפרסור מסונטזת ע"י הגן המבקר ויושבת על האזור שנמצא בכיוון 5' לשלושת הגנים,Operatr ומשתקת את סנטוז גני האופרון. 2. כאשר מגיע העת כן לשעתק גנים אלו, יש נוכחות של Inducer (משרן) - IPTG משרן מלאכותי לקטוז או שמשתמשים במחקרים, שריכוזו נשאר קבוע מכיוון שלא מושפע מ-. β Galactsidase המשרן נקשר לרפרסור ומשנה את המבנה שלו. 3. התוצאה היא הורדת עיכוב ה- Repressr מכיוון שלא יכול להיקשר לאופרטור. 4. מתבצע שעתוק ונוצר mrna אחד. 5. תרגום לשלושת החלבונים, לכל אחד מהם יש תפקיד במטבוליזם של הלקטוז. אזורי הקישור של החלבונים השונים לפרומוטר של אופרון הלקטוז: בפרומוטור יש אזורים ספציפיים שאומרים לפולימרז היכן להתחיל לשעתק:.1 אזור המכיל :TATGTT אזור המכיל :TTTACA לאחר קביעת הרצף התגלו שני אזורים נוספים: 82-, 435+ המזון הטוב ביותר לחיידק הוא גלוקוז, חד סוכר. זמין ונכנס למעגל קרבס ליצירת אנרגיה. כשאין יפרק לקטוז. 18

20 בקרות באופרון הלקטוז: המצב שתואר בו ישנה מולקולת רפרסור שמעכבת שעתוק ע"י הפרעה סטרית מכונה בקרה שלילית. מנגנון הבקרה החיובית שונה. חשוב לציין שמולקולות camp הן נמוכות בסביבה עשירה בגלוקוז. אולם, כאשר מלאי הגלוקוז במצע אזל, רמות ה- camp עולות, ויחד עם camp,atp נקשרים למולקולות - CAP/CRP רצפטורים לפרוטאין camp הנקשרים לדנ"א ובמידה ואין רפרסור מביאים לשעתוק. בקרה זו פועלת במקרה ורמות הגלוקוז אפסיות. יש מספר מצבים: (a) יש גלוקוז, אין לקטוז: בקרה שלילית. הרפרסור יושב על האופרטור. (b) יש גלוקוז, יש לקטוז: אך השעתוק ברמה בזאלית. (c) אין גלוקוז, יש לקטוז: בקרה חיובית, השעתוק ברמה ברמה גבוהה. (רמות camp גבוהות זה מוביל לקשירה של camp ל- CRP ליצירת קומפלקס. הקומפלקס נקשר לדנ"א לפני תחילת אזור השעתוק מה שיגרום להלבשת רנ"א פולימרז על הדנ"א) (d) אין גלוקוז ואין לקטוז: בקרה שלילית, רפרסור יושב על האופרטור. 19

21 ייצור חלבון רקומביננטי בחיידקים מהונדסים: אדוה דרזי הפקת חלבונים רקומביננטים בחיידקים, שמרים, תאי בע"ח וצמחים מהונדסים הינו תהליך תעשייתי שכיח המאפשר הפקת חלבונים לצרכים רפואיים. למשל: אינסולין, הורמון גדילה, תרכיב חיסוני לצהבת מסוג B והרשימה עוד ארוכה. כשרוצים להפיק חלבון בחיידק צריך לוודא: שהחלבון אינו טוקסי לחיידק. א. שאין בזבוז גדול מדיי של אנרגיה ע"י החיידק אשר יגרום לו למוות. ב. במעבדה זאת נעשה שימוש בחיידקי.E cli מזן 21 BL מהונדסים המכילים את פלסמיד הביטוי החיידקי pgex 3x המכיל את הגן האאוקריוטי GST המקודד לאנזים גלוטטיון - S - טרנספרז. Schistsma הגן המקודד ל- GST נלקח מן הטפיל japanicum ומסתו המולרית היא 26,000 דלתון. הזן 21 BL הוא זן הדפוק במספר פרוטיאזות עובדה ההופכת זן זה יעיל לייצור חלבונים רקומביננטים אשר לא יפורקו בתוך החיידק באופן אגרסיבי. הבדלים בין משתמשים ב- pgex KS ובין 3x :pgex 3x מרכיבים ואלמנטים בתוך הפלסמידים. לייצור חלבונים מחיידקים לא משתמשים ב- KS לייצור חלבונים אלא ליצור מקטעי דנ"א (בפלסמידים אלו בדר"כ יש כבר תג)..1 Ptac - פרומוטור אינדוסיבילי 5. גן ל- GST.4 LacIQ - גן שמייצר רפרסור למודל אופרון הלקטוז 2. גן עמידות ל- AMP rigin f replicatin.3 lac וחלק של פרומוטר של trp פרומוטור כימרי אינדוסיבילי חזק: לקחו חלק של פרומוטר של - Ptac 1. אופרון, וצרפו אותו ל-.tac זאת ע"מ ליצור פרומוטור לשעתוק אופטימלי שהמשרן של ה- tac הוא :IPTG trp tac lac 2. גן עמידות ל- :AMP החיידקים גדלים בקרקע מזון נוזלית עשירה LB בנוכחות האנטיביוטיקה אמפצילין על מנת לגרום לסלקציה לחיידקים המכילים את הפלסמיד ולהימנע מגידול חיידקים שאינם 20

22 מכילים את הגן לעמידות האנטיביוטיקה. התבוננות בפלסמיד מראה נוכחות הגן לעמידות לאמפצילין, הגן המקודד לאנזים β לקטמאז המפרק את האנטיביוטיקה אמפצילין. 3. replicatin :rigin f השכפול מתחיל מאתרים ספציפיים - replicatin,rigin f בחיידק יש נקודה אחת כזו, לנקודה מגיעים חלבוני אתחול יש פתיחה של הגדילים ושיכפול לשני הכיוונים עד חיבור ביניהם. 4. :LacIQ גן שמייצר רפרסור למודל אופרון הלקטוז. הגן משועתק כל הזמן (לאו דווקא כאשר מוסיפים משרן). הגן מייצר רפרסור שמדכא את אופרון הלקטוז, וכך מדכא יצירת חלבונים כל עוד לא הופיע המשרן. במידה והפרומוטור דולף שעתוק חלבונים ללא אינדוקציה, החלבונים יכולים להיות רעילים לחיידק. ברגע שניתן משרן יקשר לרפרסור, הרפרסור לא יתפקד וכך בעצם יהיה שעתוק וייצור חלבונים. המשרן הטבעי כידוע הינו סוכר החלב, לקטוז כאן נעשה שימוש במשרן מלאכותי IPTG אשר נקשר לרפרסור המקודד ע"י הגן I שנמצא בפלסמיד הנ"ל, מנתקו מהאופרטור ובכך מביא לשעתוק. במידה והיינו שמים לקטוז כמשרן החיידקים היו מפרקים אותו במהירות, ה- (Isprpyl bd-thigalactpyranside)iptg הוא אנלוג יציב ללקטוז (דו סוכר המורכב מגלוקוז וגלקטוז), אך האינדוקציה מתמשכת מכיוון שהחיידקים לא מפרקים אותו וריכוזו נשאר קבוע. לא קיימת בקרה חיובית ב- pgex 3x מכיוון שאין CAP Site אלא רק בקרה שלילית ע"י הרפרסור. 5. גן ל- :GST נמצא תחת בקרת פרומוטר אינדוקטיבי. פעילות האנזים :GST האנזים שכיח ביצורים אאוקריוטים ומתפקד בנטרול רעלים בתאים (דטוקסיפיקציה). הוא מנטרל אתרים אלקטרופילים של רעלים ) (RX ע"י צימודם לגלוטטיון (טרי פפטיד המורכב מחומצה גלוטמית, ציסטאין וגליצין). הגלוטטיון המצומד הופך בהמשך לחומצה מרקפטורית המופרשת מן התאים במהירות משום שתוצר זה הינו מסיס בשתן ובנוסף פחות רעיל. ישנם מספר איזופורמים (חלבונים בעלי פעילות דומה) של האנזים ומיקומם בתאים, ציטוזולי או מיקרוזומלי. משמש במחקר להפקת חלבונים כימריים ונוגדנים. מהלך העבודה: גידול חיידקים: המדריך הכין סטרטר(תרבית תחילית) ארלנמייר המטולטל למשך הלילה ב- 37 c המכיל חיידקים המכילים את הפלסמיד, נוזל גידול, אנטביוטיקה לסלקציה. למחרת בבוקר המדריך העביר את החיידקים לארלנמייר יותר גדול המכיל נוזל גידול(שכבר חומם ל- 37 c התנאים הנ"ל ניתנים לקיצור שלב ההמתנה,lag ומעבר מהיר לשלב הלוגריתמי יוסבר בהמשך) גלוקוז ואנטיביוטיקה. כך שהחיידקים טולטלו עוד שעות נוספות עד שבעזרת קריאה בספקרופוטומטר (אורך גל (600nm בדקנו אם הגענו לריכוז הרצוי: הקריאה הרצוייה לנו היא בין יח' בליעה. החיידקים אמורים להיות בשלב הגידול הלוגריתמי המואץ, בשלב זה יש ריבוי מקסימלי של הפלסמיד המכיל את הגן לחלבון הרצוי. תזכורת - עקום גידול אופייני לתאים במערכת סגורה: שלב ההמתנה - החיידקים נייחים,ואינם מתחלקים מסנטזים אנזימים נצרכים ומתאקלמים למדיום החדש. שלב לוגריתמי (lag) - קצב הגידול קבוע. בשלב זה ניתן לחשב את זמן הדור. שלב זה יכול להסתיים במידה ולא יהיה עוד מזון זמין בכלי הגידול ובגלל תוצרי פסולת טוקסיים שהחיידקים מפרישים. שלב העמידה (סטטציונרי) - אין תוספת במספר החיידקים. נוצר ש"מ אשר בו מספר החיידקים שמתים שווה לאילו הנוצרים. שלב התמותה - מספר החיידקים ילך ויקטן כתוצאה ממוות. ימשיך עד מוות התרבית כולה. 21

23 הקריאה שהתקבלה בקבוצות השונות הייתה בסביבות יח' בליעה. תוצאה זו גבוהה לעומת הצפי הרצוי אך החיידקים עדיין בשלב הלוגריתמי. במידה והיינו עוברים את השלב הלוגריתמי ומגיעים לשלב הסטטציונרי, בו מצבם של החיידקים אינו אופטימלי (כל חיידק שנוצר מלווה במוות חיידק אחר), האינדוקציה הייתה פחות יעילה. הצעת יעול: 1. להכניס ריכוז התחלתי נמוך יותר של חיידקים לכלי. 2. לטלטל את החיידקים לזמן קצר יותר. אינדוקציה: הכנסנו את המשרן,IPTG ישירות אל תוך הנוזל לריכוז סופי של 1mM וטילטלנו לעוד כשעה. ליזיס החיידקים לאחר האינדוקציה הכנסנו את החיידקים לסרכוז ושפכנו נוזל עליון. c 180 ( למשך 30 שניות והפשרנו לאחר מכן: יש מולקולות הקפאנו את החיידקים בחנקן נוזלי ב- ) מים בחיידק, הקפאה והפשרה מיידית גורם להתרחבות הממברנה ומסייע לליזיס של החיידק. הרחפת החיידקים בעדינות בבופר ליזיס ) Buster (Bug המכיל: ליזוזים רקומביננטי המפרק פפטידוגליקן - מרכיב דופן החיידקים. א. DNase המפרק דנ"א גנומי שגורם לצמיגות התמיסה. ב. מעכבי פרוטאזות שמונעים את פרוק החלבון שבו אנו מעוניינים. ג. הדגרה בקרח (תוך ערבוב מדי פעם), למשך חצי שעה. סרכוז והפקת מיצוי גס: סרכזנו את התמיסה בקור., העברנו נוזל עליון מיצוי גס של חלבוני החיידק שניקינו בהמשך. בעיות אפשריות בייצור חלבון רקומביננטי בחיידקים: הפרומוטר "דולף" והחלבון רעיל לחיידק להתגוננות, החיידקים יוצרים Inclusin bdies בהם שמים את החלבון הרעיל ובכך מונעים פגיעה. החלבון לא מתקפל למבנה הנכון חוסר פעילות. (אצלנו הוא יתקפל טוב כי עושים ניקוי-מה הקשר?) אין תהליכי גליקוזילציה בחיידקים לא מתאים לייצור גליקופרוטאינים. (אין מודיפיקציות כמו באאוקריוטים) אם החלבון מורכב ממספר תת יחידות המשימה קשה האם החיידק ייצר את כל היחידות ביחס נכון החלבון עובר פרוק בתוך החיידק. דגשים שנאמרו בכיתה: אינסולין רקומביננטי מופק היום מחיידקים ומשמרים מהונדסים. חלבונים רקומביננטים רבים מיוצרים בתאים אנימליים וצמחיים אם בתרביות ואם בחיה השלמה, בחלב. יצרו אינטרפרם בתאי ערלה אינטרפרון לטרשת נפוצה. 22

24 שיטות שונות לניקוי חלבונים (שהוזכרו במצגת): אדוה דרזי עמודות סינון מולקולרי - סינון מולק' משמש להפרדת מלחים, הפרדה וקביעת משקל מולקולרי של בין מולקולות. סינון המולקולרי מפריד מולק' על סמך משקל מולקולרי. הפאזה מכילה חלקיקים אינרטיים עם חורים בעלי גודל מסוים, תמיסה אשר מכילה גדלים שונים של מולק' עוברת בפאזה העומדת. מולק' גדולות מדיי לא יעברו דרך החורים של החלקיקים לכן לא יתעכבו ויצאו החוצה לפני הקטנות העוברות דרך החלקיקים. כלומר יציאת מולק' שונות תלוי במשקל המולקולרי. עמודות מחליף יונים - הכנסת גרגירים אינרטיים חיוביים או שליליים לקולונה והעברת חלבונים בקולונה. החלבונים עם המטען שמנוגד לגרגירים האינרטיים יקשרו אליהם, מול' בעלות מטען זהה ידחו וישטפו וכך ניתן יהיה להפריד חלבונים. עמודות אפיניות (זיקה) - למולקולה מסוימת ישנה זיקה ספציפית למולקולה אחרת, כגון: נוגדן-אנטיגן או סובסטרט-אנזים. ניתן לנקות חלבונים בעזרת תכונות אלו בשני אופנים שהוזכרו: 1. ניקוי חלבון בעזרת נוגדן ייחודי לחלבון.Immunaffinity 2. ניקוי אנזים בעזרת קישור למצע או מעכב תחרותי. עמודת האפיניות מורכבת מפאזה ניידת ונייחת. נייחת: גרגירים (רזין-שרף) בקולונה/עמודה. ניידת: בופר הרצה, בופר קישור ובופר אלוציה. הגרגירים הם אינרטיים קושרים ליגנד או נוגדנים, הם מיקרוסקופיים ולא נראים בעין. קושרים את הנוגדן/ליגנד לגרגירים בקשר קוולנטי,את הגרגירים שמים בקולונה. מעבירים דרך הקולונה מיצוי חלבונים. אותו האנטיגן המתאים לנוגדן יקשר לגרגירים האנרטיים ושאר המיצוי החלבוני ישטף. לעומת זאת אנחנו עשינו ניקוי בשיטת ה- :Batch כל הניקוי ללא עזרת עמודה אלא בתוך מבחנה! (טובה לניקוי סובסטרט-אנזים). ניקוי GST רקומביננטי בכרומוטוגרפיה בשיטת האפיניות שיטת הניקוי מבוססת על קשירת אנזים למצע שלו באפיניות גבוהה בעוד חלבונים רבים אחרים אינם נקשרים כלל למצע שהוא ייחודי לאנזים. כך ניתן להרחיק בקלות חלבונים לא רצויים אשר אינם נקשרים למצע. הניקוי בשיטה זו הוא יעיל ומאפשר העשרה גבוהה בשלב ניקוי אחד בלבד. גרגרי ספרוז (אגרוז) הינם כדורים מיקרוסקופיים הבנויים מפולימר אגרוז (רב סוכר). גרגירים אלה הינם אינרטיים ואליהם קשורים בקשרים קוולנטיים מולק' רבות של גלוטטיון מחוזר, שאינו מסיס בתמיסה. הגרגירים נקראים גם רזין או שרף. (פאזה נייחת) כאשר מערבבים גרגיגרי גלוטטיון - ספרוז על האנזים GST בתנאים מתאימים לפעילות אנזימתית, נקשר האנזים באפיניות גבוהה אל המצע (סובסטרט), גלוטטיון מחוזר, ונשאר קשור אליו. בהמשך נשטפים הגרגירים כדי להרחיק חלבונים לא קשורים, והשלב האחרון בניקוי הוא שלב האלוציה, שחרור החלבון מגרגירי הספרוז. האלוציה נעשית ע"י הכנסת המצע, גלוטטיון מחוזר, מסיס בתמיסה, בעודף רב, אשר מצליח להתחרות בהצלחה עם הגלוטטיון הקשור על הקישור ל- GST וכך משחרר את ה- GST הקשור אל תמיסת האלוציה. באלוציה תתבצע הוספת גלוטטיון מסיס בעל ריכוז גבוה גרגירים שאליהם קשורים מולק' גלוטטיון לא מסיס. 23 אנזים GST

25 ניתן להרחיק את הגלוטטיון אשר שימש לאלוציה במספר אופנים כגון: דיאליזה, אולטרה פילטרציה. אנו לא נרחיק את הגלוטטיון כי הוא אינו גורם מפריע לתהליכים הבאים. הסבר סכמתי: 1. במבחנה (כאן מתוארת עמודה...) שבידנו מצויים הגרגירים שכוללים: גרגירים אינרטיים אליהם קשורים מולק' רבות של ליגנד - גלוטטיון מחוזר, שאינו מסיס בתמיסה GST 2. הוספת מיצוי גס למבחנה: מיצוי גס תערובת של אלפי חלבונים שונים הכוללים את ה- GST 3. קשירה חזקה וספציפית של ה- GST למצע, גלוטטיון מחוזר: חלבונים אחרים קשור חלש או בכלל לא. 4. שלב השטיפות בעזרת ה- PBS נבצע מס' שטיפות וננקז בכל שטיפה את החלבונים המיותרים עבורנו: שטיפה נוספות: שטיפה ראשונית: חלבונים שנקשרו חלבונים שלא באופן חלש נקשרו ישטפו: ישטפו : 5. שלב אלוציה - שחרור האנזים GST בעזרת הוספת סובסטראט חופשי, גלוטטיון מחוזר מסיס, בריכוז גבוה מאד היוצר תחרות. קבלת התוצר הרצוי: פרוטוקול עבודה (חוברת) א. הכנת הגרגירים: 24 4 כשעתיים מ"ל PBS הוספו ל- 10 מ"ל אגרוז (גרגירים קשורים לגלוטטיון) והודגרו ב c 2.ערבוב, סרכוז 3 דקות הגרגירים הושקעו, והוצאת נוזל עליון עם פיפטה..3 הוספת 50 מ"ל.PBS 4. ערבוב,סרכוז, הוצאת נוזל עליון. 5. הרחפה ב- 12 מ"ל.PBS 6. ערבוב יסודי, חלוקת 200 מיקרוליטר תרחיף למבחנות פרוליפרופילן קוניות עם פקק בנפח 15 מ"ל. ב. בשלב הקודם הכנו מיצוי גס יש להפשירו ולהוסיף נפח זהה PBS מטרתו למהול את הדטרגנטים ולאפשר קישור טוב לגלוטטיון אגרוז. ה- PBS מכיל, מים מזוקקים,, KCl, NaCl - NaH PO 2 4 יש לשמור אותו בקרח., KH PO 2 4 ערבוב והעברה 20 מיקרוליטר מהמיצוי לאפנדורף ושמירה בקרח. השמירה נעשית בקרח על מנת לשמור

26 על החלבונים שלא יעברו דנטורציה. (ב- 20 מיקרוליטר השתמשנו אחר כך להרצה ול- (Western ג. מה שנשאר מהמיצוי גס המהול נוסיף למבחנת קונית עם פקק גרגירי הגלוטטיון-אגרוז. נטלטל בקור למשך 15 דקות שלב הקישור, בו נקשר אנזים ה- GST לגרגירים בקשר קוולנטי יציב. הטלטול מתבצע בקור על מנת להעלות את ספציפיות הקישור, ושמירה על החלבונים. ד. סרכוז למשך 2 דקות. את יתר הנוזל העליון נשפוך לאשפה נוזלית. ה. הוספת למבחנת הקונית עם פקק 13 מ"ל PBS ערבוב, סרכוז למשך 2 דקות שלב השטיפה לחלבונים לא קשורים. סילוק נוזל עליון ע"י פיפטור. ו. את סעיף ה' נבצע עוד פעמיים. ז. כעת נבצע את שלב האלוציה ע"י פירוק הקשר GST גלוטטיון. השחרור נעשה ע"י הוספת 300 מיקרוליטר בופר אלוציה PBS המכיל 100 מילימולר גלוטטיון מחוזר.כפי שהוזכר, הגלוטטיון המחוזר המסיס, הוא בעודף רב על פני הגלוטטיון הלא מסיס ולכן מתחרה על הקישור ומשחרר את החלבון מן הגרגירים. הדגרה בקרח למשך 5 דקות תוך ערבוב מדיי פעם. ח. סרכוז, אסיפת נוזל עליון תוצר האלוציה, חלבון האלוציה. על המבחנה רשמנו E1 GST קשור לגלוטטיון שהיה בבופר ט. חזרה על שלב האלוציה (סעיף ז, ח) הפעם על המבחנה רשמנו E2. י. הפרדה בג'ל אקרילאמיד בשדה חשמלי. הכנת דוגמאות להפרדה: א. 15 מיקרוליטר מן המיצוי הגס + 5 מקרוליטר בופר דוגמא SBX 5 ב. 15 מקרוליטר מן ה- GST הנקי (E1) + 5 מקרוליטר בופר דוגמא SBX 5 ג. 15 מקרוליטר מן ה- GST הנקי (E2) + 5 מקרוליטר בופר דוגמא SBX 5 ערבוב, סרכוז, הרתחה במשך 5 דקות, וסרכוז נוסף. הרתחה לפריסת החלבון והטענתו. י"א. הטענת הדוגמאות על גבי הג'ל והוספת דוגמת סמן חלבונים בעלי מסה מולרית ידועה. לסיכום: ישנם 3 שלבים עיקריים בניקוי ה- :GST 1. שלב הקישור: כאשר מוסיפים את המיצוי גס (המכיל תערובת אלפי חלבונים שונים) למבחנה, מתבצע קישור של האנזים GST למצע (גלוטטיון מחוזר בלתי מסיס) באפיניות גבוהה, בעוד שחלבונים אחרים אינם נקשרים או נקשרים באופן חלש. 2. שלב השטיפות: לאחר סירכוז והוצאת הנוזל העליון (המכיל חלבונים לא קשורים) מבוצעות מספר שטיפות, על מנת להרחיק חלבונים שאינם קשורים/קשורים בצורה חלשה. 3. שלב האילוציה הכנסת המצע (גלוטטיון מחוזר מסיס ב- PBS ), בעודף רב סובסטרט חופשי בריכוז גבוה, שיתחרה בקישור על האנזים (GST) עם הסובסטרט הנייח. היות והסובסטרט החופשי בעודף הוא "ינצח" ויצליח בשחרור האנזים מהסובסטרט שעל גבי הגרגירים. ביצענו סרכוז ואיסוף נוזל עליון (אילואט E) 1 המכיל את האנזים ששוחרר.שלב האלוציה נעשה פעמיים, בפעם השנייה נוצר (אילואט.(E 2 25

27 הנדסה ביוטכנולוגית כדי להשתמש בחלבונים בקנה מידה גדול, כגון לצרכים רפואיים יש צורך במעבר מנפחים קטנים לפרמנטורים בעלי נפח גדול up.scale בנוסף מדובר במעבר משיטות אנליטיות המשתמשות בעמודות קטנות לשיטות פרפרטיביות, כמויות גדולות של תוצר, ושימוש בעמודות ענקיות. כאשר עובדים בנפחים גדולים ישנם פרמטרים אשר חייבים להיות מבוקרים תמידית ובאופן ממוחשב: טמפרטורה,,Ph לחץ, ערבול, אוורור, סטריליות. מעקב ע"י דרגת ניקוי של אנזים SDS-PAGE GST ע"י הפרדת חלבונים בשדה חשמלי בשיטת Sdium Ddecyle Sulfate Ply Acryl amide Gel Electrphresis :SDS PAGE בשיטה זו אנו מפרידים בשדה חשמלי בין החלבונים ע"פ משקלם המולקולרי ע"מ לעקוב אחר יעילות הניקוי של החלבון.GST קיימת פאזה נייחת ופאזה ניידת. הפאזה הנייחת באמצעותה מופרדים החלבונים היא רשת הבנויה מן הפולימר אקרילאמיד. פוליאקרילאמיד נוצר מפילמור אקרילאמיד וביסקרילאמיד (נקשרים בינהם) ע"י מערכת של רדקלים חופשיים שנוצרת ע"י כימיקלים. אמוניום פרסולפט Sulfate)APS (Ammnium Ddecyle מתחיל יצירת רדיקליים חופשיים ו- טטרא-מתיל-אתילן-די-אמין - TAMED מזרז שרשרת תגובות להמשך יצירת הרדיקלים. תחילה בונים את הג'ל התחתון ג'ל מפריד. לאחר מכן בונים ג'ל עליון ג'ל המרכז המביא את כל החלבונים לנקודת התחלה זהה. הפאזה הניידת היא בופר הרצה/הפרדה: טריס-גליצין המכיל.SDS הכנת חלבונים להפרדה כוללת טיפול בהרתחה החלבון עובד דנטורציה בהרתחה ובנוכחות SDS ו- : DTT DTT מחזר קשרי S-S המחזיק את המבנה המרחבי של החלבון. Sdium Ddecyle Sulfate SDS הן מולק' בעלת ראש טעון שלילי וזנב הידרופובי, ה- SDS פותח את המבנה המרחבי (שבירת מבנים רבעוניים, שלישוניים, שניוניים) ויוצר מטען כללי שלילי ע"י אינטרקציות הידרופוביות קישור בין הזנב ההידרופובי לשיירי ה- R ההידרופוביים בח.אמינו שבחלבונים. החלבון נפתח למבנה בצורת מקל עם מול' SDS שליליות. SDS אחת נקשרת בממוצע לשני שיירי חלבון החלבון נשאר פרוס בגלל דחיית מטענים שליליים בתנאים אלו הנדידה בשדה החשמלי יהיו בהתאם לגודל 26

28 מבנה אקרילאמיד וביסקרילאמיד: מבנה הג'ל לאחר הפולימרזציה: יש להטעין את הדוגמאות יחד עם מרקר חלבונים המכיל חלבונים בגדלים ידועים על ג'ל אקריל אמיד ולבצע את ההפרדה בבופר ההרצה תחילה במתח 80 וולט, יותר מאוחר נעלה ל- 150 וולט. בתום ההפרדה יצבע הג'ל בצבע לצביעת חלבונים cmassie נכנס בדיפוזיה לג'ל, נקשר לחלבונים ולג'ל עצמו. את הצביעה נדגיר למשך הלילה ובסופה יתבצע תהליך DESTAIN שמטרתו להוציא את הצבע הכחול מן המרקע כך שיהיה ניתן להבחין רק בחלבונים הצבועים בכחול. (לידיעה - במידה ונעשה זאת למשך זמן יותר ארוך בסופו של דבר הצבע יומס גם מהחלבונים עצמם) ה- cmassie מגלה ריכוז קטן של חלבון ( מיקרוגרם).אך Silver stain רגישה יותר, מגלה ריכוזים נמוכים יותר. פרוטוקול הכנת ג'ל אקריל אמיד 12% בעובי 0.75 מ"מ 1. ג'ל תחתון מפריד 12% - אחוז הג'ל נקבע לפי גודל החלבון, ככל שה- % גדול יותר, הג'ל צפוף יותר מתאים לחלבון קטן יותר. החלבון שלנו, 27kd יחסית קטן. (חלבונים גדולים 7% חלבונים קטנים ( 12% בופר טריס - שומר על ph על מנת להגן על החלבון. מים אקריל אמיד- ביסאקריל אמיד - 40% את % הג'ל אנו קובעים לפי מיהול הביסאקריל אמיד. - 10% SDS פריסת החלבון והטענתו במטען כללי שלילי. 10% APS TEMED קטליזטורים לפלמור הג'ל. לכסות באיזופרופנול לאחר הכנת הג'ל התחתון (ע"י אוראל) שמנו למעלה איזופרופנול ליישר את פני הג'ל ולהפריד בין החמצן לבין הג'ל. זאת מכיוון שהחמצן יוצר תגובה עם APS ו- TEMED וכך ריאקציה הפילמור נעשית איטית יותר. צריך להרחיק אותו לפני הכנת הג'ל העליון ג'ל עליון מרכז 4% - חורים גדולים. תמיד 4% כי מדובר בסך הכל בנק' שמרכזת את כל החלבונים באותה נקודה לפני תחילת הריצה. בופר טריס - שומר על ph על מנת להגן על החלבון. מים אקריל אמיד- ביסאקריל אמיד 40% 10% SDS 10% APS קטליזטורים לפלמור הג'ל. TEMED % BPB ברומופנול בלו. (בבארות ההרצה, שנוכל לראותם) 3. בופר הרצה ל- SDS-PAGE (בופר הפרדה) מים גליצין - נותן את ה- ph החומצי בסיס טריס - נותן את ה- ph SDS הבסיסי

29 4 ב. ופר דוגמא לחלבונים מרוכז פי SBX5-5 כדי שלא יהיה צורך להגדיל את ריכוז החלבון, בהכנסתו לדוגמא הוא נמהל פי 5 וריכוזו הופך (SBx1 בופר טריס גליצרול - 50% גורם לשקיעת הדגימה בבאר. - 10% SDS נקשר לחלבון וטוען אותו שלילית. בנוסף גם פורס את החלבון. β - חיזור קשרי s s פנימיים, או בתת יחידות. marcaptethanl מילימולר במקום 500 DTT ברומופנול בלו % צבע על מנת שנוכל לראות את הריצה, לא נקשר לחלבון. 5. צבע לצביעת חלבונים בג'ל הצבע נקשר בקשרים אלקטרוסטטיים לשיירים האמיניים של ח.אמיניות. קומשיי ברולמונט בלו מכיל 2 סוגים R ו- G אחד משמש לברדפורד והשני לצביעת חלבונים. חומצה אצטית מים (בחוברת כתוב מתנול אוראל אמר שזו טעות) 6. תמיסת DESTAIN המסת הקומשיי בלו מתנול חומצה אצטית מים דגשים חשובים: אפשר להריץ דנ"א גם בג'ל אקרילאמיד. אך אי אפשר להריץ חלבונים באגרוז. כנראה בגלל שהחלבון גדול מדיי לרוץ באגרוז (אם מישהו יודע אחרת, הוא מוזמן לשתף אותי) שיטת הפרדה זו היא שיטה אנליטית, בהכנת החלבון להפרדה אנו הורסים את מבנהו ולכן לא ניתן להמשיך ולהשתמש בו לאחר ההרצה. רגישות צבע הקומזי בלו גבוהה מזהה ריכוז קטן של חלבון עד. 1µg (לעומת סילברסטיין המזהה רק ריכוזים גבוהים יותר) מה קיבלנו? היינו אמורים לקבל? מרקר - סמן תערובת חלבונים שמסתם המולרית ידועה. מיצוי גס בהרצות של הקבוצות השונות ניתן היה להבחין במספר רב של חלבונים בגדלים שונים. ניתן היה לראות בברור את חלבון ה- GST, ריכוזו גבוה וגודלו.27kd E 1 (אילואט 1) - זוהי דוגמה מנוזל החלבון שהוצא באילוציה הראשונה בניקוי. היה ניתן להבחין בבנד עיקרי המייצג את החלבון GST שגודלו,27kd אך עדיין היו קיימים בנדים בהירים המרמזים על חלבונים נוספים, בריכוז נמוך. E 2 (אילואט 2) - זוהי דוגמה מנוזל החלבון שהוצא באילוציה השניה בניקוי. כאן כבר היה ניתן לראות באופן ספציפי, בברור ובריכוז גבוה את החלבון הרצוי.GST ניתן היה לראות בנדים נוספים בריכוז זניח. יתכן כי הופעתם נובעת משטיפות לא יעילות בניקוי שאפשרו הוצאת חלבונים לא רצויים, באלוציות. הצעת ייעול: שטיפות נוספות להרחקת חלבונים בלתי קשורים. ביקורת הרצה - המיצוי הגס מהווה ביקורת לאילואט 1 ואילואט 2 בו ציפינו לקבל בנד עוצמתי מייצג לחלבון.GST ואכן באילואט 1 התקבל בנד פחות עוצמתי ופחות ספציפי ובמיצוי הגס כלל לא התקבל בנד ספציפי. ככל שהבנד עוצמתי יותר הוא מעיד על ריכוז גבוה יותר. כלומר באילוציה השנייה התקבל ריכוז ה- GST הגבוה ביותר, היות והורחקו במהלך הניקוי שאר החלבונים הבלתי רצויים. 28

30 מעקב וזיהוי החלבון הרקומביננטי אשר הופק מחיידקים בעזרת שיטת תספיג מערבי Western blt שיטה לזיהוי החלבון שבו אנו מעוניינים תוך שימוש בנוגדנים אשר מזהים כמויות זעירות ביותר של החלבון (ננוגרמים עד פיקוגרמים) ויחודיים לחלבון. בשלב ראשון מפרידים את החלבונים במיצוי הגס ב-.SDS-PAGE אדוה דרזי לאחר מכן מעבירים את החלבונים מן הג'ל לממברנת ניטרוצלולוז נייר העשוי מפולימר ניטרוצלולוז, אשר סופח חלבונים על בסיס אינטרקציות חלשות (כנראה) כגון: אלקטרוסטטיים/הדרופוביים/קשרי מימן. לאחר העברה שוטפים את הממברנה עם מים מזוקקים. קיימות 2 שיטות העברה של חלבונים לממברנה (יפורטו בהמשך): העברה חצי יבשה מיועדת לחלבונים קטנים יותר, חסכנית בבופר, יעילה - אפשר 4 ממברנות בבת אחת. (בה השתמשנו). העברה רטובה מיועדת לחלבונים גדולים יותר. התהליך כולו מתבצע במתקן מלא בבופר (העברה). ההעברה נעשית גם כאן בעזרת זרם חשמלי בבופר ההעברה הדומה לבופר הרצה המכיל: א. - SDS מקנה מטען שלילי לחלבונים, המאפשר תנועה בכיוון אחד. ב. מתנול - כנראה, חושף שיירים הדרופוביים בחלבונים וגורם לקישור טוב יותר לממברנה. ג. בופר גליצין-טריס - לשמירת PH תקין ובנוסף גם החלבונים כזכור "מצופים" ב- SDS כך שהחלבונים יכולים לנוע אל הקוטב החיובי שבו נמצאת ממברנת הניטרוצלולוז ולהיספח אל הממברנה. בשלב הבא, התהליך מאפשר הגבת החלבונים לאחר ההפרדה עם הנוגדנים הייחודיים לחלבון.GST בעזרת שיטה זאת נזהה האם החלבון הרקומבביננטי נוצר בחיידקים. במחקר שיטה מיושמת במרבית המעבדות אשר חוקרות תפקוד חלבונים. מהלך התגובה: 1. צביעת החלבונים בצביעה הפיכה מיוחדת לחלבונים צביעת פונסו (במשך 60 שניות): צבע קושר חלבונים המכיל קב' סולפט בעלות מטען שלילי הנקשרות לח.אמינו חיובית בחלבון בקשר בלתי קוולנטי. הצבע אדום מטרתו לתת לנו אינדיקציה ראשונית לגבי הצלחת הטרנספר. חשיבות הפונסו בניסוי כמותי בניסוי כמותי יש משמעות לכמות החלבון שמטעינים. על מנת לוודא שהטענו בעמודת הניסוי והביקורת כמות זהה של חלבונים מתייחסים לעוצמת הצבע שנוצרת בקישור לפונסו, כך שככל שהעוצמה גדולה יותר ריכוז החלבון גבוה יותר. כך אפשר להשוות בין העוצמות ולבדוק אם הטענו אותה כמות. 2. צילום תמונת החלבונים וסימון מרקר חלבונים: המרקרים גם נצבעים מסמנים אותם בעיפרון על מנת שלאחר החשיפה תהיה לנו אינדיקציה לגבי הגודל (כי בשטיפות הצבע יירד). 3. שטיפת הצבע: ע"י PBST דטרגנט לא יוני הנקשר לחלבונים. 4 ח. סימת הממברנה על ידי טבילתה בבופר חסימה (30 דקות) בופר פוספט המכיל דטרגנט Tween % חלב דל שומן: הבופר פוספט הוא ה-,PBST ובחלב דל שומן קיים קזאין חלבון החלב. חלבוני החלב הלא ספציפיים נקשרים לממברנה ומונעים קישור לא ספיציפי של הנוגדנים אל הממברנה: בופר החסימה גורם לקישור הממברנה בצורה כזו שתהיה חסומה לקישור בלתי ספציפי (באיזורים ריקים בהם אין חלבון). וכך מוודאים כי רק הנוגדן הספציפי לחלבון שלנו יקשר המיסוך גורם להגברת הספציפיות. בנוסף חלבוני המיסוך ייצרו גם אינטרקציות עם, GST הנוגדן הוא בעל אפיניות חזקה יותר ל-,GST זה יוצר תחרות וזה מגביר ספציפיות נוגדנים. 5. טלטול הממברנהבתמיסת בופר חסימה + נוגדן נגד GST שהופק מסרום ארנבות נוגדן פוליקלונלי, ראשוני. הנוגדן יקשר בצורה ספציפית ל-.GST (מנוקה בעמודת מחליף יונים ולא באימיונואפיוניות) 6. שטיפות טובות ואגרסיביות לסילוק נוגדנים לא קשורים: בוצע 6 פעמים. 7. טלטול הממברנה עם נוגדן שניוני אנטי rabbit המכוון נגד החלק FC של נוגדני IgG של ארנבת. אל הנוגדן השניוני קשור קו-ולנטית אנזים פראוקסידאז: נוגדן שניוני אשר נקשר לראשוני. 29

31 אדוה דרזי 8. שטיפות טובות ואגרסיביות לסילוק נוגדנים לא קשורים: בוצע 6 פעמים. 9. תגובה עם סובסטרט לאנזים פראוקסידאז ליצירת תוצר בעל צבע כחול אשר שוקע על הממברנה בו במקום ובכך צובע את ה- :GST הוספת סובסטרט לפרוקסידאז. מדובר ב- TMB ומי חמצן שבנוכחות האנזים יבצעו את הריאקציה הבאה: פראוקסידז מחמצן TMB TMB מחומצן מחזר מי חמצן תוצר שלב חמצון ראשוני תוצר כחול, קשה תמס, שוקע על הבנד. (זה מה שכתוב במצגת אך אם מישהו יודע אחרת...) הריאקציה מופסקת עם הופעת הצבע הכחול ע"י שטיפת הממברנה במים מזוקקים. ( H SO 2 4 לא במקרה שלנו וליצור חומר תוצר שלב חמצון ראשוני לעבור חמצון נוסף ע"י חומצה ) צבעוני קל תמס המשמש לאלייזה. לנוגדן השניוני יכול להיות קשור גם אנזים אחר המבצע ראקציה כלומונסיה עם ECL ריאקציה פוטונים. שמים פילים והיכן שהייתה קשירה יש השחרה של הפילים, מתבצע בחדר חושך. מהלך עבודה ודגשים נוספים שנאמרו בכיתה הרצה ב- 14%: SDS-PAGE הדוגמאות שהוכנו: א. מיצוי גס מהחלבון הרקומביננטי. ב. מיצוי גס מחיידקי ביקורת BL-21 - חיידקים חסרי הפלסמיד המהונדס, לא אמורים ליצור GST ולכן לא אמורים להתקבל בנדים, זוהי ביקורת שלילית (בניגוד לצפי בניסוי דוגמא 1). לדוגמאות הוסף בופר דוגמא ) 5 ( SB X תפקידו פורט קודם, והם הורתחו למטרת דנטורציה וטעינת החלבון. הדוגמאות נמהלו (1:40) עמ"נ למנוע בנד עוצמתי מדי או מעין מריחה, בשל קישור נוגדן לעודף,GST היות והנוגדן ספציפי ורגישות השיטה גבוהה (זיהוי כמות של פיקרוגרם) יותר מהצביעה בעזרת קומזי בלו בשיטת ה-.SDS PAGE העברת החלבונים לממברנה: מדוע לא מגיבים את הנוגדנים עם החלבונים שבג'ל? מדוע יש צורך בבופר העברה? א. החלבונים נמצאים בתוך הג'ל העבה ולא תמיד חשופים לנוגדנים ב. הנוגדן גדול מדי, נדידתו בג'ל היא איטית ביותר ותיקח זמן רב. ואילו הממברנה דקה, החלבונים חשופים בה והנוגדנים נקשרים בקלות. העברה בשיטה הרטובה: בתוך מתקן העברה מניחים ספוג לבן טבול בבופר העברה, עליו מניחים נייר פילטר שעוביו 3 מ"מ טבול באותו הבופר. על גביו את הג'ל שהרצנו. מעל נניח את נייר הניטרוצלולוז טבולה מראש בבופר העברה ושוב נייר פילטר 3 מ"מ טבול בבופר, על גביו שוב ספוג לבן. סגירת המתקן והכנסתו למכשיר העברה, תוך שימוש בבופר טרנספר. חיבור לספק מתח למשך שעה. הסנדוויץ שנוצר: ספוג טבול בבופר העברה. נייר פילטר טבול בבופר העברה. ממברנת ניטרוצלולוז טבולה בבופר העברה ג'ל שהרצנו נייר פילטר טבול בבופר העברה ספוג טבול בבופר העברה + הסכמה באה להסביר את אופן הכנת המרכיבים, לאחר ההכנה, ההעברה עצמה מתבצעת במאוזן (לא כלפי מעלה, כפי שמתואר). 30

32 העברה בשיטה החצי יבשה (זה מה שעשינו בפועל): בתוך קערה עם בופר העברה מניחים ספוג לבן, את הספוג מניחים על המכשיר לאחר שנספג בו בופר העברה. מעליה מניחים ממברנת ניטרוצלולוז ספוגה בבופר. מעליה את הג'ל ושוב ספוג לבן טבול. הוספת בופר טרנספר וסגירת המתקן. הרצה למשך 25 דקות. הסנדוויץ שנוצר: ספוג טבול בבופר העברה. ג'ל שהרצנו ממברנת ניטרוצלולוז טבולה בבופר העברה ספוג טבול בבופר העברה מתקן העברה + בתום ההעברה התבצע מהלך התגובה כפי שהוסבר לעיל. פונסו - מה קיבלנו? היינו אמורים לקבל? בצביעה (של הקבוצה שלנו) נצפו בנדים אדומים בעוצמה נמוכה ביותר, ככל הנראה בשל המיהול הגבוה שנעשה לדוגמאות, (שגרם גם למיהול החלבון). העובדה כי המרקר עצמו יצא ברור ובעוצמה חזקה, מעידה על כך שהטרנספר היה יעיל וההסבר לתוצאה, אכן נעוץ במיהול. הצעות ייעול : א. ביצוע מיהול נמוך יותר עמ"נ לקבל תוצר חלבון מרוכז יותר ולכן קישור יעיל יותר של פונסו. ב. שטיפות חוזרות למשך זמן ארוך יותר בפונסו עד לקבלת עוצמת צבע גדולה יותר. תמונת ה- - Western מה קיבלנו? היינו אמורים לקבל? ניתן היה לראות כי בכל הדוגמאות של המיצוי הגס הרקומביננטי שהורצו, התבצעה תגובה עם נוגדן ראשוני, אנטי,GST ובהמשך תגובה עם נוגדן שניוני אשר קשור אליו פראוקסידז. בהוספת סובסטרט, ה- TMB חומצן ע"י הפראוקסידז המי חמצן חוזרו ע"י TMB מחומצן ונוצר צבע כחול ששקע ויצר בנד הנראה לעין. בכל דוגמאות המיצוי הגס מחיידקי הביקורת - לא נצפו כלל בנדים. זוהי ביקורת שלילית - החיידקים הנ"ל אינם מכילים פלסמיד רקומביננטי מהונדס עם הגן ל- GST ולכן אין סיבה שייצרו חלבון שנוגדן אנטי GST יקשר אליו. מטרת הביקורת היא לוודא כי הבנדים שהתקבלו בדוגמאות הניסוי מייצגים קישור ספציפי הנובע מנוכחות חלבון GST ולא בנדים שמקורם בקישור אקראי ובלתי ספציפי. ניתן לראות כי שיטה זו ספציפית יותר משיטת הצביעה ב-,SDS PAGE מבחינת כושר ורגישות הזיהוי של החלבון. ב- Western רואים בברור בנד אחד בלבד המייצג את החלבון, בשלב המיצוי הגס, בעוד שבצביעת הקומזי ב- PAGE SDS רואים שלל חלבונים בשלב זה ושיטת הצביעה אינה רגישה מספיק כדי לבודד רק את החלבון הספציפי הרצוי משאר החלבונים. (מה גם שהריכוז של החלבון נמוך יותר בשיטת Western היות ובוצע מיהול גדול) הדבר נובע מהבדלים במהות השיטות: שיטת Western מבוססת על עיקרון קישור נוגדן הנקשר באפיניות מקסימלית לחלבון, בעוד ששיטת הצביעה לאחר ההפרדה ב- SDS PAGE בקומזי בלו מבוססת על תכונות הצבע הנקשר לכל החלבונים בצורה כללית, דרך השייר האמיני ולא בצורה ספציפית כקישור נוגדן-אנטיגן. 31

33 בעיות רקע: חסימה לא טובה יש לשנות בופר חסימה על מנת לחסום קישור לא ספציפי לממברנה. נוגדן I פוליקלונלי לא מנוקה בשיטת האימיונואפיניות תגובות לא ספציפיות של נוגדנים נגד אנטיגנים אחרים בסרום הארנבת. יש לרדת בריכוז הנוגדן הראשוני על ידי מיהול גבוה יותר הנוגדן הראשוני עד קבלת תגובה ספציפית. נוגדן I I אשר יש לו crss reactivity עם אנטיגנים אחרים - יש לרדת בריכוז הנוגדן על ידי מיהול גבוה יותר. לפעמים אין פתרון אלא רכישת נוגדן אחר. שטיפות לא מספיקות יגרמו לעיתים לתגובת רקע גבוהה יש לשפר השטיפות בין השלבים השונים. נוגדן שניוני בעל פעילות לא ספיציפית (נוכחות נוגדנים נוספים שאינם כנגד FC של הנוגדן הראשוני אשר מקורם בסרום החיה) יש להוריד את ריכוז הנוגדן השניוני על ידי מיהול גבוה יותר. לפעמים רכישת נוגדן שניוני מחברה אחרת. ריכוז גבוה מדי של חלבונים על הממברנה - הקטנת ריכוז החלבונים המופרדים בג'ל. שימוש נפוץ בפלסמיד pgex 3x במעבדות מחקר לייצור נוגדנים(הרצאה ממעבדה מס' 3) 1. שיבוט הגן לחלבון הרצוי לתוך הפלסמיד תוך הקפדה על מסגרת הקריאה של גן ה- :GST בדר"כ לאחר מקטע ה- GST מכניסים גן לחלבון הרצוי ויוצרים חלבון כימרי, מכניסים בין GST לגן פרוטאזות ואז ניתן לחתוך את ה- GST ולנקות רק את החלבון הרצוי. במקרה שלנו היה רק,GST ללא חלבון כימרי. 2. טרנספורמציה לחיידקים E.cli זן.BL גידול החיידקים ואינדוקציה עם.IPTG 4. הפקת חלבון האיחוי מן החיידקים: GST Prtein X אתר חיתוך לאנזים תרומבין 6. ניקוי החלבון, והפקת נוגדנים - שתי אפשרויות: א. קשירת החלבון הרקומביננטי לגלוטטיטו אגרוז שחרור חלבון האיחוי מן הרזין הזרקת חלבון מאוחה לארנבת בסרום הארנבת תערובת נוגדנים של Anti GST ו-.Anti Prtein X ב. קשירת החלבון הרקומביננטי לגלוטטיון אגרוז חיתוך חלבון האיחוי הקשור לרזין על ידי תרומבין: קבלת חלבון חופשי X קבלת אנזים GST קשור לרזין הזרקת חלבון X נקי לארנבת בסרום הארנבת נוגדנים Anti Prtein X 32

34 הרצאה של חגית אדוה דרזי Knck (מעבדה Out (3 לעיתים משתמשים בפלסמיד למטרות שונות מאשר ביטוי חלבונים. Knck Out חיה שיש בה חסר בגן כלשהו ברמת הדנ"א בכל תאי גופה. זו אחת השיטות לאתר תפקיד חלבון מכיוון שבהעדרו ניתן לראות מה הפנוטיפ. טווח הפנוטיפים של השיטה הוא גדול. בעכבר, אם הגן החסר אחראי להתפתחות עוברית לא יהיה בכלל עכבר. דוגמא: עכבר ה- w.t הוא בגודל מסוים כאשר בצעו knck ut לגן nek1 העכבר שהתקבל קטן יותר... כך ניתן לשער למה אחראי הגן. לא תמיד נוכל להשתמש בשיטה זו לדוגמא כשבצעו knck ut לגן fer לא התקבלו תוצאות. רקומבינציה הומולוגית: 2 מולקולות דנ"א כמעט זהות מחליפות מקטע מסוים. זה קורה בעיקר בין כרומטידות אחיות בעת מיוזה שחלוף הומולוגי. אך אנו משתמשים בתהליך הנ"ל לצרכים שלנו יוצרים פלסמיד שיש לו מקטע הומולוגי לגן שלנו (ורוד), ההומולוגיה היא לפני ואחרי המקטע הרצוי. מחליפים בצורה זו את הגן שרוצים לעשות לו knck ut במקטע המקדד לסמן כלשהו כדי שנוכל להבחין בתאים בהם היה.knck ut הסמן יכול להיות גן ל- GFP שיגרום לזריחה ירוקה או גן לעמידות אנטיביוטיקה. ולפי הזריחה/העמידות ניתן לדעת היכן יש נוק אאוט. כיצד יוצרים מקטע הומולוגי? תכנון וקטור שישמש להשתקת (knuk ut) nek7 EcRI כפי שרואים באיור הדנ"א הגנומי, בו יש גן nek7 שאותו אנו רוצים XhI XbaI DNA גנומי להוציא, מורכב מ- 6 אקסונים. ניתן להשתמש ב- :KS עושים PCR לזרוע אחת של הגן (אקסון) IRES β-ge פלסמיד KS SacI XbaI XbaI XhI (לינאריזציה) SacII NtI EcRI HindIII SalI ועושים PCR לזרוע שניה של הגן (אקסון), ומשבטים אותם ל-.KS את ה- KS מחדירים לתאים בחלקם נעשית רקומבינציה הומולוגית שע"י הסלקציה שדיברנו ניתן לבחור אותם. את התאים שבחרנו מחדירים לתא עוברי בשלב מוקדם תא בלסטוציט, שלאחר 8 חלוקות ייצור 32 תאים. את התא הנ"ל מחדירים לרחם עכברה ונוצר עכבר כימרי: יש בו גם תאים נורמליים וגם תאי knck ut מהבלסטוציט. הכימרה מורכבת: 1. מתאי עור בעל פיגמנט שחור ut.knck 2. מתאי עור בעל פיגמנט לבן נורמלי. בתאי - knck ut גדיל אחד נורמלי וגדיל שני עבר.knck ut כימרה W.T מכיוון שרוצים שתאי knck ut יעברו לדור הבא תאים אלו צריכים להיות תאי מין. מכליאים עכברי כימרות עם לבנים במידה ויוצא כימרה: אם נקבל עכברים אפורים זאת אומרת שהעכברים האלו בעלי כימרה כימרה תאי מין עם knck ut א, חר כך עושים להם הכלאה עצמית. סיכוי של 25% שיצא עכבר שחור. לעיתים אנו מעוניינים לבצע knck ut מושרה שיתרחש רק במקרים מסוימים. ניתן לעשות זאת ע"י מע'.cre/lx לפני ואחרי הגן נכניס רצפי.lx במע' ישנו גן שמקודד לאנזים Cre recmbinase היודע לקרב את שני רצפי lx ולחתוך את הגן הנמצא בינהם. מכיוון שרק בהוספת חומר מסוים יופעל הפרומוטר ויבוטא האנזים, נוכל לשלוט ביצירת ה- knck ut שיגרום לפנוטיפ הנבדק. 33

35 נוגדנים פוליקלונליים ומונוקלונליים אדוה דרזי נוגדן מונוקלונלי מכיר אפיטופ אחד בלבד מזהה אתר מאוד ספיציפי מה שעושה אותם יותר שימושיים ואילו נוגדנים פוליקלונליים מכירים מספר אפיטופים על אותו אנטיגן (נוגדן 1 מכיר אפיתופ מסויים נוגדן 2 אפיתופ אחר וכך הלאה). מבנה נוגדן מורכב מ- 4 שרשראות: 2 שרשראות קלות זהות 2 שרשראות כבדות זהות מדובר במבנה של הומדימר, כאשר כל הומומר מכיל שרשרת קלה ושרשרת כבדה. נוגדן מחולק ל- Fab ו- Fc (כפי שמתואר) החלק Fab (החלק העליון בנוגדן) מורכב משהשרשראות הקלות, וחלק מהכבדות. והוא כולל את החלק המשתנה בנוגדן. החלק Fc (החלק התחתון) מורכב רק מהחלק הנוסף של השרשראות הכבדות והוא החלק הקבוע בנוגדן. ייצור נוגדנים פוליקלונליים: 1. הזרקת אנטיגן בסדרת זריקות - את סדרת הזריקות עושים במספר שבועות כך שכמות הנוגדנים הספציפיים לאנטיגן בדם תעלה. 2. אסוף דם תערובת של נוגדנים בדם שכוללים: כל הנוגדנים כנגד האנטיגנים השונים שהחיה פגשה בחייה + כמות גדולה של כמה סוגי הנוגדנים הרצויים המכוונים לאפיתופים שונים של אותו האנטיגן. 3. קרישת דם יחד עם תאים. 4. הפרדת הסרום. 5. בדיקת נוכחות נוגדנים יכול להתבצע ע"י אלייזה/ווסטרן. במידה ואכן קיימים נוגדנים נוכל לקחת דגימות מהחיה ולנקות בקולונה או באמינואפיניות. אלייזה שיטה רגישה וספציפית לזיהוי תצמידי אנטיגן-נוגדן. לנוגדן קשור אנזים שבנוכחות סובסטרט ספציפי - במידה ויש תצמידים יוצר צבע מסויים. במצבים שונים של האנטיגן, נטיבי/דנטורטיבי, יש אפיתופים שונים חשופים. יש נוגדנים שמגיבים גם כנגד מבנה נטיבי וגם כנגד מבנה דנטורטיבי. יש כאלו הנקשרים רק למבנה דנטורטיבי או רק למבנה נטיבי... לדוג' - בחלבון P53 במבנה נטיבי ובמבנה דנטורטיבי זוהו אזורים שונים כאפיטופים אשר נגדם קיימים נוגדנים המופרשים על ידי שבטים שונים של תאי B. במחקר כאשר עושים western החלבון עובר דנטורציה ולכן לא יקשר אליו נוגדן שנקשר רק למצב הנטיבי. אמונופרסיפיטציה (לאחר בירור השיטה הוסברה לנו ללא קשר ליצירת נוגדנים פוליקלונליים אלא על מנת להדגיש את השימוש בהם בשיטה זו) בדיקת היקשרות בין שני חלבונים ע"י תגובה בין אנטיגן(חלבון) מסיס לנוגדן ספציפי המכוון כנגדו מלווה בהיווצרות תצמיד - משקע. לוקחים תאים, ממצים חלבון בתנאים לא אגרסיביים שמאפשרים לחלבון להישאר נטיבי נשתמש בנוגדן שמזהה צורה נטיבית מכיוון שרק צורה זו יכולה להיקשר לחלבון הנוסף. נוגדנים פוליקלונליים יותר טובים להשקעה -נוצר סריג כי נוגדן אחד יכול לקשור שני תאים (בתנאי שהזרקנו לארנבת אנטיגן נטיבי). 34

36 ייצור נוגדנים מונוקלונליים: 1. חיסון: הזרקת אנטיגן לעכבר בסדרת הזרקות(נטיבי/דנטורטיבי תלוי מה רוצים). 2. איחוי: הוצאת טחול המכיל תאי פלסמה רבים תאי B היוצרים נוגדנים איחוי תאי פלסמה עם תאי מיאלומה תאי פלסמה סרטניים שמייצרים נוגדן מסוג אחד(יש להם חיי נצח). 3. העברה לתרבית: זריעת התאים בצלחות רב באריות. (בדר"כ מס' צלחות של 96 בארות) 3. סלקציה לתאים שעברו איחוי היברידומות: התאים הלימפואידים מתים כי אין להם חיי נצח. חומר סלקטיבי מוסף למדיום הגידול, תאי המיאלומה מורעלים ומתים. רק תאים שעברו היברידומה מתקיימים ומתרבים. 4. סיקור: גילוי קלונים מפרישים נוגדנים ספציפיים לאנטיגן. 5. בידוד: בידוד קלונים לקבלת שבט שכולו היברידומות המפרישות אותו הנוגדן המשך דילולים לקבלת תא אחד שיש בו נוגדן אחד ספציפי. 6. ייצור: ייצור נוגדנים in-vitr או.in-viv דוגמא לייצור נוגדנים נגד ארס נחש: לוקחים דגימה מארס הנחש מזריקים לעכבר מוציאים טחול מביאים לאיחוי עם תאי מיאלומה עושים סלקציה על מדיום Hat המדיום הנ"ל גורם למוות של תאי המיאלומה (שלא עברו איחוי עם טחול) בעוד תאי ההיברידומה ישארו. נשארים רק תאי היברידומה שלא כולם ייצרו את הנוגדן הרצוי ולכן עושים אלייזה רואים בארות שספציפיות לאנטיגן שלנו מדללים את הבארות עד הגעה לתא אחד כל קלון כזה מייצר נוגדן כנגד אפיתופ אחר... סלקציה על מדיום :Hat המדיום מכיל.Hypxanthine, Aminpterin,Thimidine הנ"ל מפריעים לייצור הנוקלאוטידים בתא ואם יש בעיה בייצור הנוקלאוטידים, התא לא ישרוד. יצירת נוקלאוטידים בתא יכולה להתבצע בשני דרכים: 1. מסלול דה נובו: ע"י ח.פולית 2. ע"י טימידין והיפוקסטנין המדיום Hat חוסם את מסלול מס' 1. חומצה פולית דיהידרופולאט רדוקטאז אמינופטרין HAT= Hypxanthine Aminpterin Thimidine חומצה אספרטית טטראהידרופולאט גליצין dgtp datp DNA dttp טימידין קינאז היפוקסנתין גואנין פוספוריבוזיל טרנספראז טימידין היפוקסנתין 35