Μοριακή ταυτοποίηση Ελαιολάδων Κρήτης σε σχέση με τις καλλιεργούμενες ποικιλίες

Transcript

1 Μοριακή ταυτοποίηση Ελαιολάδων Κρήτης σε σχέση με τις καλλιεργούμενες ποικιλίες Α. Ντούλης, Ινστιτούτο Αμπέλου, Λαχανοκομίας & Ανθοκομίας Ηρακλείου (ΙΑΛΑΗ), Εθνικό Ίδρυμα Αγροτικών Ερευνών (ΕΘΙΑΓΕ) και Ι. Μετζιδάκης, Ινστιτούτο Ελιάς και Υποτροπικών Φυτών Χανίων (ΙΕΥΦΧ), ΕΘΙΑΓΕ Περίληψη Στα πλαίσια του Περιφερειακού Πόλου Καινοτομίας Περιφέρειας Κρήτης, τα Ινστιτούτα του ΕΘΙΑΓΕ στην Κρήτη (ΙΑΛΑΗ, ΙΕΥΦΧ), σε συνεργασία με το Πανεπιστήμιο Κρήτης, τις Ενώσεις Αγροτικών Συνεταιρισμών Σητείας, Μυλοποτάμου και Αποκορώνου-Σφακίων και το Εμπορικό Επιμελητήριο Ηρακλείου συμμετέχουν σε έρευνα που στοχεύει στην γενετική ταυτοποίηση τόσο του πολλαπλασιαστικού υλικού ελιάς όσο και του παραγόμενου ελαιόλαδου. Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας θα είναι χρήσιμα στην ποικιλιακή ιχνηλασιμότητα και στον έλεγχο αυθεντικότητας των παραγόμενων ελαιολάδων. Ελέγχεται δηλαδή με μοριακές τεχνολογίες (δείκτες DNA) γενετικό υλικό από τις κύριες Κρητικές ποικιλίες και ανακαλύπτονται οι πιστοποιήσιμες διαφορές. Εισαγωγή Η ποικιλία, όσο και οι εδαφοκλιματικές συνθήκες της περιοχής καλλιέργειας, είναι παράγοντες που παίζουν συνεργιστικό ρόλο στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του παραγόμενου ελαιόλαδου (οργανοληπτικά, φυσικά και χημικά). Κατά συνέπεια οι τεχνολογίες πιστοποίησης ποιότητας πρέπει να αναπτύξουν την αντίστοιχη αναλυτική ισχύ που θα μας επιτρέπει, όσο είναι τεχνολογικά εφικτό, να διακρίνουμε τη συμβολή των διαφορετικών αυτών παραγόντων στην ποιότητα του παραγόμενου γεωργικού προϊόντος. Αυτό καθίσταται ιδιαίτερα σημαντικό στην πιστοποίηση ποιότητας των ελαιόλαδων Προστατευόμενης Ονομασίας Προέλευσης (Π.Ο.Π.) και Προστατευόμενης Γεωγραφικής Ένδειξης (Π.Γ.Ε.). Ο ποικιλιακός χαρακτήρας του λαδιού είναι ακριβώς ίδιος με τον ποικιλιακό χαρακτήρα των καρπών και αλλάζει με βάση τη γενετική σύσταση της ποικιλίας. Η σύσταση αυτή με την σειρά της καθορίζεται άμεσα από το DNA του δένδρου. Το ίδιο ισχύει και για όλα τα χημικά συστατικά που συσχετίζονται με την ποικιλία και την γενετική της σύσταση. Ιχνηλασιμότητα ονομάζεται η ικανότητα να ιχνηλατήσει κανείς τα συστατικά ενός τροφίμου στην πηγή τους. Ιχνηλάτηση ενός συστατικού σημαίνει συσχετισμός με την παραγωγή και τον χώρο παραγωγής του ή τον αριθμό παρτίδας. Η ιχνηλασιμότητα αποσκοπεί στην ασφάλεια των τροφίμων, στο δίκαιο εμπόριο μεταξύ των διαφόρων επιχειρήσεων και στην αξιοπιστία των πληροφοριών που διατίθενται στους καταναλωτές. Οι τεχνικές της ιχνηλασιμότητας κατηγοριοποιούνται σε δυο, στην ιχνηλασιμότητα της εφοδιαστικής αλυσίδας (logistics traceability) και στην

2 ποιοτική ιχνηλασιμότητα. Η πρώτη παρακολουθεί την φυσική ροή του προϊόντος στην εφοδιαστική αλυσίδα και βασίζεται στην προσέγγιση «ένα βήμα πίσω» - «ένα βήμα μπροστά» (ή ν-1/ν+1). Η δεύτερη χρησιμοποιεί μία σειρά από αναλυτικές τεχνικές (χημικές, μοριακές) για να συνάγει άμεσα συμπεράσματα για την ποιότητα του προϊόντος, π.χ. του ελαιόλαδου, προσδιορίζοντας τις φυσικές, χημικές και μοριακές ιδιότητες του. Η γενετική ταυτοποίηση θα μπορεί να απαντήσει ακόμη και σε θέματα προσμίξεων (μονοποικιλιακά ελαιόλαδα). Οι τεχνολογικές διαστάσεις της ποιότητας ελαιόλαδου είναι επίκαιρες διεθνώς και, τα επόμενα χρόνια, θα βρεθούν στο επίκεντρο των διεργασιών όσο αφορά τις τεχνολογίες πιστοποίησης, ιχνηλασιμότητας και διασφάλισης ποιότητας από αναλυτική-ποικιλιακή πλευρά. Από την άλλη, το ελαιόλαδο στο ράφι είναι, πολλές φορές, ένα μίγμα διαφορετικής ποικιλιακής και ποιοτικής σύστασης. Η επωνυμία πιστοποιημένης προέλευσης (όπως στα ελαιόλαδα ΠΟΠ, ΠΓΕ) προέρχεται από ένα συνδυασμό της περιοχής και της / των ποικιλιών από τις οποίες παράχθηκε. Έχει παρατηρηθεί γενετική διαφοροποίηση των ποικιλιών της ελιάς από περιοχή σε περιοχή και από χώρα σε χώρα. Γι αυτό το λόγο η αναφορά της ποικιλίας και της γεωγραφικής περιοχής από την οποία παράχθηκε το ελαιόλαδο συμβάλλει στην επωνυμία προέλευσης και παίζει σημαντικό ρόλο στην επιλογή των καταναλωτών και έτσι αποκτά υψηλή εμπορική σημασία. Ένας από τους στόχους της παρούσας εργασίας ήταν ο εντοπισμός μοριακών δεικτών υψηλής διαχωριστικής ικανότητας που θα χρησιμοποιηθούν για την μοριακή πιστοποίηση και την ποικιλιακή ιχνηλασιμότητα του ελαιόλαδου. Στη συνέχεια θα δημιουργηθούν και θα προτυποποιηθούν χημικά και μοριακά εργαλεία για ένα ολοκληρωμένο σύστημα ταυτοποίησης, παρακολούθησης και προώθησης του Κρητικού ελαιόλαδου στην παγκόσμια αγορά - ιχνηλασιμότητα εισροών / εκροών ελαιοκομικού τομέα. Ειδικότερα ερωτήματα που κλήθηκε η συγκεκριμένη δράση να εξετάσει είναι τα εξής: Αγρο-οικονομικό / διατροφικό Διακίνηση πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού Ιχνηλασιμότητα προϊόντων / τροφίμων Κατοχύρωση ΠΟΠ, ΠΓΕ (ανίχνευση και κατοχύρωση πιστοποιήσιμων διαφορών) Δυνατότητα διάκρισης με μοριακή και χημική τεχνολογία διαφόρων ποικιλιών & παραγόμενων γεωργικών προϊόντων (πιστοποίηση γεωργικών εισροών /εκροών). Επιστημονικό Γενετικά χαρακτηριστικά (παραλλακτικότητα, ετεροζυγωτία, δομή) βοτανική εξέλιξη & προέλευση χρησιμοποιούμενων φυτικών ειδών γενετική ταυτότητα, γενετικό αποτύπωμα επιλεγμένων γενοτύπων (barcode, fingerprint) Υλικά και μέθοδοι Συλλέχθηκαν δείγματα καρπού και φύλλων της ποικιλίας (π.) «Κορωνέικη» από την ελαιοκομική περιοχή κάθε μιας από τις 3 Ενώσεις, δείγματα της π. «Μαστοειδής» από την ελαιοκομική περιοχή της Ένωσης Αποκορώνου και Σφακίων, και δείγματα π. «Θρουμπολιά» από την ελαιοκομική περιοχή της Ένωσης Μυλοποτάμου. Επίσης, συλλέχθηκαν δείγματα φυλλικού υλικού από τη συλλογή αναφοράς ελιάς του

3 Ινστιτούτου Ελιάς και Υποτροπικών Φυτών Χανίων στην περιοχή Χρυσοπηγή Χανίων και περιλάμβανε τις κύριες ποικιλίες που καλλιεργούνται στην Κρήτη (Κορωνέικη, Μαστοειδής, Θρουμπολιά) όπως και από 35 συγγενικές - ανταγωνιστικές ποικιλίες, (Περισσότερες πληροφορίες για την Εθνική Συλλογή Ποικιλιών Ελιάς στην ιστοσελίδα: ). Αμέσως μετά τη συλλογή του καρπού εκχυλίστηκε ελαιόλαδο στο πειραματικό ελαιουργείο του Ινστιτούτου Ελιάς και Υποτροπικών Φυτών Χανίων. Στη συνέχεια τα δείγματα (φύλλων και ελαίου) στάλθηκαν στο Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας Φυτών, Ινστιτούτο Αμπέλου, Λαχανοκομίας & Ανθοκομίας Ηρακλείου (ΙΑΛΑΗ) του ΕΘΙΑΓΕ για να πραγματοποιηθούν οι μοριακές αναλύσεις με την βοήθεια μοριακών δεικτών SSR και AFLP, στο Εργαστήριο Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού NMR του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Κρήτης και στο Εργαστήριο χημικοτεχνικών υπηρεσιών ANALYSIS για και χημικές αναλύσεις. Η διαδικασία μοριακής ταυτοποίησης που αποτελεί το αντικείμενο της συγκεκριμένης εργασίας περιγράφεται συνοπτικά στην Εικόνα 1. Εικόνα 1. Διαδικασία ανάλυσης με μοριακούς δείκτες Αποτελέσματα και Συζήτηση Στην Εικόνα 2 παρουσιάζονται πρωτογενή δεδομένα από ανάλυση φυλλικου υλικού. Πρόκειται για γέλη πολυακρυλαμίδης με φθορίζοντες δείκτες AFLP. Περιλαμβάνονται 19 στήλες που η κάθε μια προέρχεται από ένα γενότυπο. (ελαιόδενδρο). Επίσης περιλαμβάνεται μια στήλη (αριστερά της 1) με πρότυπα μεγέθη αναφοράς (ladder). Κάθε οριζόντια ζώνη αντιπροσωπεύει ένα τμήμα DNA

4 που εμφανίζεται στον συγκεκριμένο γενότυπο. To σύνολο αυτών των ζωνών αποτελεί το αποτύπωμα ενός γενοτύπου. Τα αποτελέσματα επεξεργάζονται ηλεκτρονικά για να ανεύρεθουν οι μοναδικές ζώνες που θα διαχωρίζουν τις ομάδες συγγενών γενοτύπων μεταξύ τους. Τέτοιοι συγγενείς γενότυποι θεωρούνται αυτοί που ανήκουν σε μια ποικιλία. Στη συνέχεια ομαδοποιούνται οι γενότυποι και παράγονται τα δενδρογράμματα γενετικών σχέσεων (Εικόνα 3). Αυτά τα δενδρογράμματα μας επιτρέπουν να εξετάσουμε την επιτυχία της μεθόδου μοριακής ανάλυσης σε δυο επίπεδα. Πρώτο εξετάζεται η ομαδοποίηση των συγγενών γενοτύπων μεταξύ τους και δεύτερον ο διαχωρίσμος των διαφορετικών. Στο δενδρόγραμμα της Εικόνας 3 παρατηρούμε ότι τα δένδρα που ανήκουν στην π. Θρούμπα ομαδοποιούνται μεταξύ τους άρα προέρχονται από αρκετά ιδία γενετική ουσία. Αυτό με τη σειρά του σημαίνει ότι θα μπορέσουμε να διαφοροποιήσουμε τα υλικά που σχετίζονται με αυτή την ποικιλία. (πολλαπλασιαστικό υλικό και προϊόντα) εύκολα. Από την άλλη για την π. Τσουνάτη παρατηρούμε ότι κάποια δένδρα αποτελούν μια συγγενική ομάδα ενώ κάποια άλλα διαφοροποιούνται περισσότερο. Τέλος, τα δένδρα που ανήκουν σε πληθυσμούς της αγριελιάς κρητικής προέλευσης είναι ακόμα πιο απομακρυσμένα από τις δυο καλλιεργούμενες ποικιλίες παρουσιάζουν δε μεταξύ τους μικρή γενετική ομοιότητα. Οι παραπάνω γενετικές αναλύσεις συνεχίζονται με μια επιπλέον τεχνική μοριακών δεικτών που ονομάζονται μικροδορυφόροι ή SSR. Αυτή η τεχνική παρέχει πρόσθετες και συμπληρωματικές πληροφορίες στην τεχνική AFLP. Συμπεράσματα και τρέχουσα έρευνα Τα μέχρι τώρα αποτελέσματα δείχνουν ότι υπάρχουν σημαντικές γενετικές διαφορές μεταξύ αλλά και εντός των Κρητικών ποικιλιών ελαίας οι οποίες ανιχνεύονται με ικανοποιητική διακριτική ικανότητα με τη βοήθεια μοριακών δεικτών. Σε εξέλιξη βρίσκεται η ανάλυση της γενετικής ουσίας των ελαιόλαδων που αποτελεί και τον τελικό σκοπό αυτής της ερευνητικής εργασίας. Στο ελαιόλαδο αναμένεται να πιστοποιηθούν οι διαφορές που ανιχνεύτηκαν αρχικά στο αντίστοιχο φυλλικό υλικό. Επιπλέον βρίσκεται σε εξέλιξη η βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου για την διάκριση μεταξύ μονοποικιλιακών ελαιόλαδων με μοριακές τεχνικές όπως και η προσπάθεια για την ανίχνευση προσμίξεων σε δείγματα ελαιόλαδου. Πρακτικά, οι αναμενόμενες εφαρμογές της συγκεκριμένης ερευνητικής προσπάθειας είναι ο εντοπισμός ενός μοριακού προφίλ του Κρητικού ελαιόλαδου που θα το ξεχωρίζει από άλλα λάδια της αγοράς και η διασφάλιση της ποιότητας του προϊόντος μέσω της ανίχνευσης περιπτώσεων νοθείας και αναμίξεων του με κατώτερα ελαιόλαδα. Με τον τρόπο αυτό θα προστατευτεί η άριστη φήμη που έχει το Κρητικό ελαιόλαδο στις διεθνείς αγορές και θα ωφεληθούν οι Κρητικοί ελαιοπαραγωγοί από την καλύτερη αντιμετώπιση που θα έχει το προϊόν τους στο δίκτυο εμπορίας και διάθεσης. Στο μέλλον θα γίνει προσπάθεια να εξεταστεί η χρησιμότητα των δεικτών DNA στην πιστοποίηση ελαιόλαδων ΠΟΠ και ΠΓΕ. Ευχαριστίες Η χρηματοδότηση του έργου πραγματοποιήθηκε με κονδύλια από το Γ' ΚΟΙΝΟΤΙΚΟ ΠΛΑΙΣΙΟ ΣΤΗΡΙΞΗΣ (8), Ε.Π. ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΟΤΗΤΑ, Μέτρο 4.6, Δράση Έργο: Περιφερειακός Πόλος Καινοτομίας Κρήτης, Ενέργεια (i4crete): Α8 - Ολοκληρωμένο σύστημα ταυτοποίησης, ελέγχου και προώθησης ελαιολάδου.

5 Εικόνα 2. Γέλη πολυακρυλαμίδης με δείκτες faflp διαφορετικών γενοτύπων ελαιόδεντρων: στήλες 1-4 π. Τσουνάτη (Μαστοειδής), στήλες 5-8 π. Θρούμπα, στήλες 9-12 αγριελιές. Η εικόνα δημιουργήθηκε στον αυτοματοποιημένο αλληλουχητή LiCor IR2 και το λογισμικό SAGA.

6 TH10MW TH10MW AFLP 4 primer combinations AFLP 4 primer combinations Jaccard Similarity Coefficient A1 T16 A11 A20 T10 T2 T14 T6 T23 T21 T18 T27 T5 T8 TH6 TH7 TH10 TH11 TH12 TH16 TH17 TH18 TH19 TH20 TH21 TH9 TH22 TH13 TH14 TH15 TH24 TH8 TH1 TH2 TH3 TH4 T4 T22 TH23 T19 T26 T17 T11 T12 T13 T3 T9 A2 T7 T15 T20 T24 A5 A7 A6 A13 T25 A21 A8 A4 T1 A18 A19 TH5 A17 A10 A16 A3 A9 A14 A15 A Jaccard Similarity Coefficient Εικόνα 3. Δενδρόγραμμα γενετικής συγγένειας μεταξύ αναλυμένων γενοτύπων ελαιόδεντρων βάσει δεδομένων AFLP. Η ανάλυση κατ ομάδας πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό NTSys PC χρησιμοποιώντας τον δείκτη ομοιότητας Jaccard και την μέθοδο ομαδοποίησης UPGMA. Ακρωνύμια: Th Θρούμπα, T Τσουνάτη, A πληθυσμός αγριελιάς