Iranian Journal of Biomedical Engineering 3 (2010)

Transcript

1 DOI: /ijbme Iranian Journal of Biomedical Engineering 3 (2010) Investigation of Human Mesenchymal Stem Cells Adhesion and Diffusion into Poly (lactic-co-glycolic acid)/hydroxyapatite Porous Scaffold Coated with a Biodegradable Triblock Copolymer M. Haghbin Nazarpak 1, F. Pourasgari 2, M.N. Sarbolouki 3 1 PhD, New Technologies Research Center (NTRC), Amirkabir University of Technology, Tehran, Iran 2 PhD, Stem Cells Technology Research Center, Tehran, Iran, pourasgari@ibb.ut.ac.ir 3 PhD, Biomaterials Research Center (BRC), University of Tehran, Iran, sarbol@ibb.ut.ac.ir Abstract The scaffolds for bone tissue engineering should consider the functional requirements: porosity, biocompatibility, and biodegradability. In this study, porous Poly (lactic-co-glycolic acid)/hydroxyapatite composites were prepared with different weight ratios. Porous samples were fabricated by freeze-extraction method, coated with triblock copolymer and sterilized by UV. Then, human mesenchymal stem cells were cultured on scaffolds. Microstructural studies with SEM suggest the formation of about 50 micrometer size porous structure and interconnected porosity so that cells adhesion within the structure is well in depth in coated samples. DAPI fluorescence microscopy showed cells adhesion to the coated scaffolds and cells diffusion into the pores. Also, direct assay of cell proliferation performed with MTT test showed that, cells grew on the scaffold similar to or more than control samples result. Therefore, these findings suggest that the triblock-coated Poly (lactic-coglycolic acid)/ Hydroxyapatite porous composite scaffolds could provide cells adhesion and proliferation and are appropriate matrices for bone tissue engineering. Keywords: Scaffold, Bone tissue engineering, Freeze-extraction, Mesenchymal stem cells, Cell adhesion, Porosity, PLGA, Composite. * Corresponding author Address: Masoume Haghbin Nazarpak, New Technologies Research Center (NTRC), Research Administration of Amirkabir University of Technology, Wali Asr' Crossroad, after Balawar Alley, Tehran, Iran Tel: Fax: mhaghbinn@aut.ac.ir

2 DOI: /ijbme ۹۱ مجله مهندسی پزشکی زيستی دوره سوم شماره ۴ زمستان ۹۸-۹۱ ۱۳۸۸ بررسی چسبندگي و نفوذ سلولهای مزانشيم به داربست متخلخل از کامپوزيت هيدروکسی ا پاتيت/ PLGA با روکش پليمر سهقطعهای ۳ ۱ معصومه حقبين نظرپاک فرزانه پورعسگری محمدنبی سربلوکی ۱ دکترای بيومواد عضو هيي ت علمی پژوهشكده فناوريهاي نو دانشگاه صنعتي اميركبير تهران دکترای بيوشيمی عضو هيي ت علمی شرکت فنا وری بنياخته تهران ۳ دکترای پليمر عضو هيي ت علمی مرکز پژوهشی زيستمواد دانشگاه تهران چکيده داربستهای مورد استفاده در مهندسی بافت بايد علاوه بر عملکرد مناسب متخلخل زيستسازگار و زيستتخريبپذير باشند. در اين تحقيق داربستهاي روکشدهی و با نور متخلخل کامپوزيتی PLGA/HA UV استريل شدند. مشاهدات به روش تعويض حل ال ساخته حاصل از ميكروسكوپ الكتروني روبشي و با پليمر سهقطعهای شده حاکی از تشکيل ريزساختار متخلخل با اندازه حفرات حدود ۵۰µm و حفرات به هم پيوسته است. سلولهای بنيادی مزانشيم انسانی بر روی داربستها بذرافشانی شدند و سلولها در داخل اين ساختار بهطور مطلوب چسبيدند. رنگا ميزی فلورسانس با DAPI نشاندهنده چسبندگی سلولهای مزانشيم به نمونههای دارای روکش و نفوذ سلولها به داخل حفرات بود. همچنين به منظور بررسي ميزان تكثير سلولها روي داربستها ا زمايش MTT روي ا نها انجام شد و نشان داد كه تعداد سلولهاي كشت شده روي داربستها در مقايسه با نمونههاي كنترل تفاوت معناداري ندارد. از نتايج به دست ا مده استنباط میشود كه داربستهاي روكشدار شده با پليمر سهقطعهای بستر مناسبي براي سلولهاي مزانشيم و روش بهکار رفته روشي كارامد در ساخت داربست مهندسي بافت استخوان است. کليد واژگان: داربست مهندسی بافت استخوان تعويض حل ال سلول بنيادی مزانشيمی چسبندگی سلولی تخلخل PLGA کامپوزيت. عهدهدار مکاتبات نشاني: تهران بالاتر از چهارراه وليعصر نبش کوچه بالاور معاونت پژوهشی دانشگاه امير کبير پژوهشکده فناوریهای نو تلفن: ۶۶۴۰۰۴۴ دورنگار: ۶۶۴۰۰۴۴ پيام نگار:

3 حقبين نظرپاك و همكاران ۹ ۱- مقدمه مهندسي بافت رويکرد جديدی در طراحی و دوبارهسازی بافتهای ا سيبديده است [۶-۱]. استراتژی مهندسی بافت شامل استفاده از سلول داربست و عوامل زيستفعال است به اين ترتيب که داربست قالب مناسب را برای رشد تکثير و تمايز سلولها فراهم میکند و موجب چسبندگی و مهاجرت سلولها میشود [۹-۷]. يک داربست ايدي ال بايد زيستسازگار و زيستتخريبپذير باشد فعل و انفعال سلول و بافت را افزايش دهد و خواص فيزيکی و مکانيکی مناسبی داشته باشد [۴ ۱۰]. برای ساخت يک داربست سهبعدی در مهندسی بافت ويژگیهای مختلفی بايد در نظر گرفته شوند [۱۳-۱۱]. اول اينکه داربست بايد متخلخل باشد تا موجب تکثير و تفکيک سلولی شده تشکيل بافت استخوانی را افزايش دهد.[۱۵ ۱۴ ۴] همچنين داربست بايد به منظور ايجاد چسبندگی و رشد سلولها و تشکيل بافت سهبعدی متخلخل باشد [۱۶-۱۸]. تخلخل بالا (بيش از %۹۰) برای ساخت همه داربستهای مهندسی بافت ضروريست [۱۶ ۰]. ۱۹ اين امر موجب افزايش سطح ويژه و چسبندگی سلولی و رشد بافت میشود.[۱] همچنين اندازه حفرات بايد به اندازه کافی بزرگ باشد تا تعداد زيادی از سلولها به راحتی در ساختار به هم پيوسته حفرات در کنار هم قرار گيرند و توزيع اکسيژن مواد غذايی و سلولها و مبادله مواد زاي د درون ساختار يکنواخت باشد [۶ ۴]. - ۱۵ به علاوه داربست مهندسی بافت استخوان بايد دارای خواص مکانيکی مشابه استخوان باشد [۱۵] و پس از تخريب تدريجی امکان رشد استخوان را در نقص بافتی فراهم ساخته و در نهايت با بافت استخوان طبيعی جايگزين شود []. اثبات شده است که هيدروکسیا پاتيت ساختار معدني استخوان را شبيهسازی میکند و خواص مکانيکی و هدايت رشد استخوان مطلوبی نيز دارد.[۵] ترکيبات هيدروکسی ا پاتيت نظير هر ماده سراميکی ديگری فاقد الاستيسيته و تردی بالاست که موجب نگرانیهايی درباره عملکرد ۱ مکانيکی ا ن پس از ايمپلنت شدن میشود [۶]. استفاده از کامپوزيت پليمر/بيوسراميک میتواند راه حل اين مشکل باشد. به علاوه افزودن پليمرهای زيستتخريبپذير به سراميکهای کلسيمفسفاتی هادی رشد استخوان به افزايش زيستفعالی و کنترل ا هنگ تخريب منجر شده و [۷] موجب دستکاری بهتر و کنترل ريزساختار در شکلدهی میشود [۸]. پليمرهاي زيستتخريبپذير مصنوعي مانند ۳ پلي ال لاكتيد اسيد (PLLA) پلي گليكوليك اسيد (PGA) ۴ و پلي دي ال لاكتيك اسيد-كو- گليكوليك اسيد (PLGA) به طور گسترده به عنوان داربست براي كشت سلول و مهندسي بافت بهكار برده ميشوند.[۹ ۶] کامپوزيتها اغلب توازن خوبی بين استحکام و چقرمگی مواد مختلف فراهم میسازند که از استحکام و چقرمگی هر يک از اجزاء تشکيلدهنده خود مناسبتر است. استخوان طبيعی نيز در واقع ماده زمينه تركيبيی از کلاژن و هيدروکسیا پاتيت است که خواص منحصر به فرد ا ن ناشی از برهمکنش اجزای ا لی و معدنی در مقياس نانو است.[۳۱-۳۰ ۵ ۱۸] روشهای متعددی برای به دست ا وردن داربست متخلخل وجود دارد [۳] که از ا ن جمله روش ريختگی حل ال است که در ا ن پس از قالبگيری محلول حل ال خارج میشود که ممکن است با خشک کردن انجمادی همراه شود تا ساختار متخلخلتری به دست ا يد.[۳۳] به اين ترتيب که فضای اشغال شده بهوسيله حل ال در داربست پس از خروج مايع يا حل ال منجمد موجب ايجاد حفرات میشود. بنابراين مرحله خروج حل ال برای حفظ تخلخل داربست اهميت دارد. به همين دليل برخی از محققان از روش خشک کردن انجمادی برای خروج حل ال استفاده کردهاند اما اين روش زمانبر است و هزينه بالايی دارد. سوي از ديگر برای افزايش بازدهی فرايند ساخت از روش تعويض حل ال استفاده میشود که در ا ن نمونه پس از انجماد در يک حمام غيرحل ال غوطهور میشود تا حل ال قبل از خشک شدن نمونه از ا ن خارج شود [۰]. از طرف ديگر مهندسی بافت بر پايه سلول فرصت مناسب و سودمندی برای کاربردهای بالينی اراي ه میکند [۳۴]. به علاوه يافتن منبع سلولی مناسب يکی از ملاحظات اصلی در مهندسی بافت است.[۳۵] سلولهای بنيادی سلولهايی هستند که توانايی خودترميمی و تمايز به انواع 1 Implanting 2 Poly-L-Lactide Acid 3 Polyglycolic Acid 3 Poly (lactic-co-glycolic acid)

4 ۹۳ مجله مهندسی پزشکی زيستی دوره سوم شماره ۴ زمستان ۹۸-۹۱ ۱۳۸۸ سلولها نظير استخوان و غضروف را دارند [۳۶] و به همين دليل در تحقيقات گستردهای به کار رفتهاند. هدف از اين تحقيق کشت سلولهای مزانشيم انسانی روی داربست کامپوزيتی PLGA/HA و بررسی شده توليد چسبندگي و نفوذ سلولها به ا ن برای ترميم و دوبارهسازی بافت استخوانی است. - روش -۱- ساخت داربست کامپوزيتی PLGA پليمر (با نسبت (۸۵:۱۵ و پودر هيدروکسیا پاتيت تهيه شده در ا زمايشگاه مورد استفاده قرار گرفت. درصدهای مختلف کامپوزيت PLGA/HA با حل کردن نسبتهای مختلف مخلوط / PLGA هيدروکسیا پاتيت در DMSO و هم زدن مخلوط به مدت ساعت بهدست ا مده و قالبگيری شد. سپس نمونهها در فريزر ۴ C- منجمد شده و پس از خروج از فريزر به منظور تعويض حل ال به مدت ۴ ساعت در محلول اتانول %۳۰ (غيرحل ال) غوطهور شدند. در مرحله بعد نمونهها از اتانول خارج شده و در هوا خشک شدند. پليمر سهقطعهای (فوماريک (تشکيل شده از پلی اتيلن پلی گليکول ۵ - سباسيک اسيد )-پلی اتيلن گليکول) [۳۷ ۳۸] نيز در اتانول حل شد و نمونهها با غوطهوری در اين محلول روکشدهی شده و در هوا خشک شدند. انجام کشت سلولی بهوسيله شدند. نور ۶ فرابنفش -- ساخت پودر هيدروکسی ا پاتيت نمونهها قبل از استريل (UV) روشهای مختلفی برای ساخت بلورهای هيدروکسیا پاتيت وجود دارند از جمله روش شيمی تر س ل- رسوبدهی الکتريکی. ۷ و ژل در اين تحقيق از روش رسوبدهی شيمی تر استفاده شد که در ا ن سوسپانسيون نانوبلورهای هيدروکسیا پاتيت با واکنش زير به دست میا يد: 10Ca(OH) 2 +6H 3 PO 4 Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) H 2 O فرايند تهيه هيدروکسی ا پاتيت شامل هم زدن سوسپانسيون ۰/۵mol هيدروکسيد کلسيم قبل و طی افزودن قطره قطره محلول اسيدی است. ۰/۳mol محلول برای تهيه رسوب ژلهای اسيد فسفريک قطره قطره به سوسپانسيون هيدروکسيدکلسيم افزوده شد. ph مخلوط با افزودن مقادير مناسب NH 4 OH طی فرايند رسوب کنترل رسوب شد. حاصل يک شب ساکن مانده و مايع رويی دور ريخته شد. سپس رسوب با استفاده از سانتريفوژ با دور ۱۵۰۰۰rpm فيلتر شده و در دمای ۸۰ C خشک شده و در دمای ۱۰۰۰ C به مدت ۸ ساعت سينتر شد. تا ي يدکننده تشکيل فاز ا پاتيت بود. -۳- کشت سلولی الگوهای پراش پرتو ايکس داربستها قبل از بذرافشانی با اشعه UV استريل شدند و سپس برای بررسي استريليتي و همچنين به منظور سازگار شدن با محيط كشت به مدت يك روز در محيط كشت ۹ DMEM قرار گرفتند. سلول مزانشيم انسانی به عنوان منبع سلولی مورد استفاده قرار گرفت و روی داربستها بذرافشانی شد. به طوري كه روي هر داربست با قطر ۱۰۰۰۰ سلول در محيط DMEM داراي %۱۰ داده شد. -۴- رنگ ا ميزي فلورسانت ۱cm ۱۰ FBS كشت DAPI داربستها سه روز پس از بذر افشاني مورد ا زمايش ۱۱ DAPI قرار گرفتند. به اين منظور محيط كشت هر چاهك بشقاب ۴ خانهاي داراي داربست برداشته شد و پس از دو بار شستشو با ۱ DAPI به ا نها محلول ۳۰s به مدت PBS اضافه شد. سپس باز هم دو بار با PBS شستشو انجام شد و با ميكروسكوپ فلورسانس با لنز DAPI مشاهده شدند. --۵ ا زمايش MTT سلولهاي كشت داده شده بر روي داربستها پس از ۵ ۳ ۱ و ۷ روز مورد ا زمايش ۱۳ MTT قرار گرفتند. به اين منظور محيط كشت هر چاهك بشقاب ۴ خانهاي داراي داربست برداشته شد و به ا ن محيط محلول %۱۰ داراي DMEM ۵ mg/ml MTT اضافه شد و به مدت ۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ºC و %۵ دي اكسيد كربن قرار داده شد. سوپ سلولي به 5 Fumaric acid/ Sebacic acid 9 Dulbecco's modified Eagle's medium 12 Phosphate buffered saline 6 UltraViolet 7 Sol-gel 10 Fetal bovine serum 11 4',6-diamidino-2-phenylindole (4, 5-dimethyl thiazolyl-2)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide 8 Sinter

5 حقبين نظرپاك و همكاران ۹۴ ا رامي بدون هم زدن محتويات چاهكها و به طور كامل خارج شد. سپس به هر چاهك به مقدار اضافه ۱۴ DMSO از ۱۰۰µl ۱۵ شد و دو تا سه بار پيپتاژ گرديد و جذب در طول ۱۶ موج ۵۷۰nm به وسيله دستگاه الايزا ريدر خوانده شد. -۶- ا زمايشهای ميكروسكوپ الكتروني روبشي ۱۷ (SEM) داربستها سه روز پس از بذرافشاني به منظور مشاهده با PBS ثابت شدند به اين صورت كه پس از شستشو با SEM به مدت و ۱۸ ساعت در محلول گلوتارالدي يد تثبيت %/۵ شدند مجدد ا بار شستشو با PBS انجام شد و سپس در سري صعودي اتانول به ترتيب %۵۰ %۶۰ %۷۰ %۸۰ %۹۰ %۱۰۰ هر كدام به مدت ۱۵ تا ۱۰ دقيقه قرار گرفتند تا دهيدراته شوند. در انتها داربستهاي ثابت شده خشك و با طلا پوشش داده شدند و با SEM مشاهده شدند. ۳- نتايج ۳-۱- بررسي وجود سلولها بر روي داربست با رنگا ميزي فلورسانت هسته سلولها DAPI پس از ا زمايش با DAPI ميكروسكوپ فلورسانس مشاهده شدند. در مشاهدات ميكروسكوپي هسته سلولها هم در سطوح و هم در داخل حفرات داربستها قابل مشاهده بودند. اين مشاهده بيانگر اندازه مناسب و به هم پيوسته بودن حفرات است كه موجب نفوذ سلولها به لايه زيرين داربستها ميشود و عبور مواد غذايي به سلولها را نيز تسهيل مینمايد. نتايج رنگ ا ميزی خلاصه در جدول ۱ اراي ه شده است. به طور DAPI ۳-- بررسي ميزان زنده ماندن سلولها با ا زمايش MTT ا زمايش MTT تفاوت معناداري را در زنده ماندن سلولها در زمانهای ۵ ۳ ۱ و ۷ روز بين نمونه کنترل و ساير نمونهها نشان نداد. اين نتيجه مو يد اين نكته است كه داربست توليد شده براي رشد و چسبندگي سلولها در زمان ياد شده مناسب بوده و موجب مرگ سلولي يا كنده شدن ا ن از داربست نشده است. فرجهاي داربست براي كاشت بنابراين نتيجهگيری میشود خلل و سلول به اندازه كافي بزرگ هستند و سطحي به اندازه كافي وسيع براي چسبندگي سلول و نفوذ مواد غذايي و متابوليتها فراهم ميكنند كه ا ن را براي كاربرد به عنوان داربست مهندسي بافت مناسب ميسازد. جدول ۱- نتايج بررسیهای ميکروسکوپ فلورسانس پس از مقدار سلولها در DAPI متوسط سطحي و متوسط سطحي و متوسط سطحي و سطحي كم ولي زياد كم بيشتر سطحي كم ولي زياد رنگا ميزی با DAPI بودن معمولي تا حدودي زياد معمولي كمي كمي كمي كمي معمولي زياد تا حدودي معمولي نمونه % ۳HA کد نمونه ۱۱ ۱۴ ۱۶ ۱ ۱۳ ۱۵ ۱ ۳ ۵ ۴ ۶ % ۱۰HA % ۱۵HA % HA % ۱۰HA % ۱۵HA با روکش HA % با روکش ۱۰HA % با روکش ۱۵HA % با روکش ۳HA % با روکش ۱۰HA % با روکش ۱۵HA % 14 Dimethyl sulfoxide 15 Pipetage 16 ELISA Reader 17 Scanning Electron Microscope 18 Glutaraldehyde

6 مجله مهندسی پزشکی زيستی دوره سوم شماره ۴ زمستان ۹۸-۹۱ ۱۳۸۸ ۳-۳- بررسي چسبندگي سلولها به داربست با ميكروسكوپ الكتروني روبشي مشاهده ريزساختار با استفاده از SEM نشان داد سلولها هم در سطح و هم در داخل حفرههای داربستها ديده میشوند. همچنين ريختشناخت سلولها نيز نشانگر پهن شدن ا نها روي داربست است كه تاي يد ميكند سطح تخلخلها هم از نظر اندازه حفرات و هم از نظر نوع مواد به كار رفته براي قرارگيري سلولها مناسب است. اين نتيجه كه در تا ي يد نتايج به دست ا مده از DAPI و MTT است نشان ميدهد كه نوع داربست و اندازه حفرات حاصل در اين روش براي چسبندگي و نفوذ سلولي مناسب بوده است به طوري كه سلولها در داخل حفرات هم مشاهده ميشوند. ۹۵ خوبی در ا ن قرار گرفتهاند. همانطور که از شکل ۱ ميتوان دريافت سلولها با ايجاد پايکها سعی در چسبيدن و قرار گرفتن در حفرات دارند (شكل ). همچنين شکل ۳ بيانگر نفوذ سلولها به لايههای زيرين و درون حفرات است. از طرف ديگر بررسیهای رنگا ميزی DAPI نيز نفوذ سلولهاي مزانشيم به داخل تخلخلها را نشان داد و اين امر نشاندهنده اندازه مناسب تخلخلهای ايجاد شده و در نتيجه کارايی روش به کار برده شده برای ايجاد تخلخل است. PLGA/HA ۴- نتيجهگيری در اين مطالعه داربست متخلخل کامپوزيتی روکشدهی شده با پليمر سه قطعهای ساخته شد و برخي از خصوصيات زيستي ا ن مورد بررسي قرار گرفت. نتايج مشاهده هسته سلولها پس از رنگا ميزی DAPI در سطوح مختلف بيانگر چسبندگي سلولها در سطح داربست و نفوذ سلولها به داخل حفرات بود. علاوه بر اين نتايج رنگا ميزی با DAPI نشاندهنده چسبندگی بيشتر سلولهای مزانشيم به نمونههای دارای روکش بود. ا زمايش MTT در روزهاي مختلف نشان داد كه داربستهاي توليد شده به علت زنده ماندن سلولها بستر مناسبي براي رشد و تکثير سلولهاي مزانشيم هستند. به علاوه در داربستهاي روكش داده شده با پليمر سهقطعهای چسبندگي سلولي افزايش يافته است كه بيانگر مناسب بودن روكش به كار رفته براي چسبندگي سلولهاست. از طرف ديگر نفوذ سلولها به داخل تخلخلها نيازمند اندازه مناسب تخلخلهاست که در مورد توليد بافتهاي استخواني حاي ز اهميت است. نتايج بررسی ريزساختار حاکی از تشکيل ساختار متخلخل با اندازه حفرات حدود ۵۰µm و به هم پيوستگی حفرههاست. تصاوير SEM نمونهها مو يد تشکيل ساختار متخلخل و حفرات به هم پيوسته است که سلولها به شکل ۱- نتايج بررسی MTT پس از گذشت روزهای مختلف کشت سلولی شکل - چسبندگی سلولها به سطح داربست نمونه %۳۰ PLGA و HA %۱۵ دارای روکش پليمر سهقطعهای شکل ۳- نفوذ سلولها در داخل حفرات نمونه %۳۰ PLGA و HA %۱۵ دارای روکش پليمر سهقطعهای

7 حقبين نظرپاك و همكاران ۹۶ [8] Hutmacher D. W., Garcia A. J., Scaffold-based bone engineering by using genetically modified cells, Gene, 2005; 347: [9] Zhu X., Cui W., Li X. and Jin Y., Electrospun fibrous mats with high porosity as potential scaffolds for skin tissue engineering, Biomacromolecules, 2008; 9: [10] Ma P. X., Biomimetic materials for tissue engineering, Adv Drug Deliv Rev, 2008; 60 (2): [11] Budyanto L., Ooi C.P. and Goh Y.Q., Fabrication and characterization of porous poly (L-lactide) PLLA scaffolds using liquid-liquid phase separation, IFMBE Proceedings, 2008; 21: [12] Gunatillake P.A. and Adhikari R., Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering, European Cells and Materials, 2003; 5: [13] Yang S., Leong K.F., Du Z., Chua C.K., The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part І. Traditional Factors, Tissue Engineering, 2001; 7 (6): [14] Jones A. C., Milthorpe B., Averdunka H., Limaye A., Senden T. J., Sakellariou A., Sheppard A. P., Soka R. M., Knackstedt M. A., Brandwood A., Rohner D., Hutmacher D. W., Analysis of 3D bone ingrowth into polymer scaffolds via micro-computedtomography imaging, Biomaterials, 2004; 25: [15] Wei G., Ma P. X., Macroporous and nanofibrous polymer scaffolds and polymer/bone-like apatite composite scaffolds generated by sugar spheres, J Biomed Mater Res, 2006; 78A: [16] Ma P. X., Zhang R., Xiao G., Franceschi R., Engineering new bone tissue in vitro on highly porous poly (α- hydroxyl acids)/hydroxyapatite composite scaffolds, J Biomed Mater Res, 2001; 54: [17] Papenburg B.J., Vogelaar L., Bolhuis-Versteeg L.A.M., Lammertink R.G.H., Tamatialis D. S., Wessling M., One-step fabrication of porous micropatterned scaffolds to control cell behavior, Biomaterials, 2007; 28: [18] Zhang R., Ma P. X., Porous poly (L- lactic acid)/apatite composites created by biomimetic process, J Biomed Mater Res, 1999; 45: [19] Chua C. K., Leong K. F., Cheah C. M. and Chua S.W., Development of a tissue engineering scaffold Structure library for rapid prototyping. Part 2: Parametric library and assembly program, Int J Adv Manuf Technol, 2003; 21: [20] Horch R. A., Shahid N., Mistry A. S., Timmer M. D., Nanoreinforcement of poly (propylene fumarate)- based networks with surface modified alumoxane nanoparticles for bone tissue engineering, Biomacromolecules, 2004; 5 (5): [21] Buckley C.T., O Kelly K.U., Regular scaffold fabrication techniques for investigations in tissue engineering, Topics in Bio-Mechanical Engineering, CHAPTER V, 2004: [22] Gong S., Dong J., Xue S.T., Wang J.Y., A novel porous natural polymer scaffold for tissue Engineering, Proceedings of the IEEE Engineering in Medicine and Biology 27th Annual Conference, 2005: [23] Ho M.H., Kuo P.Y., Hsieh H.J., Hsien T.Y., Hou L.T., Lai J.Y., Wang D.M., Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods, Biomaterials, 2004; 25: [24] Partap S., Lyons F., O Brien F.J., Biomaterials and tissue engineering, Chapter 5, Royal College of Surgeons in Ireland. Available at از سوي ديگر پليمر سهقطعهای مورد استفاده به دليل دارا بودن اجزای ا بدوست و ا بگريز مانند پل برای اتصال سلولها عمل میکند و سبب افزايش زيستسازگاری داربست میشود. از ا نجا که PLGA ا بگريز است عاملدار کردن پليمر با استفاده از افزودنیها به بهبود خواص ا ن کمک میکند. PEG به دليل زيستسازگاری بالا و حل اليت بالا در محلولهای ا بی و سم يت ناچيز پليمر مطلوبی در کاربردهای بيومواد است که به عنوان حامل دارو نيز بهکار میرود. فوماريک اسيد نيز پليمر زيستتخريبپذير ديگری است که به عنوان پليمر حساس به دما يا تزريقپذير مورد توجه قرار گرفته و قابليت ايجاد اتصال عرضی در را داراست. in situ و تغيير پليمر ترکيب اين دو موجب افزايش ا بدوستی داربست کامپوزيتی میشود. ۱۹ جزء سباکويل کلرايد نيز موجب افزايش استحکام و تحريک چسبندگی سلولی میشود ضمن اينکه داربست ما حاوی گروههای OH ا زاد بيشتری خواهد شد. نتايج اين مطالعه نشان میدهد داربستهای ساخته شده هم از نظر اندازه و ميزان تخلخل و هم از نظر نوع روکش به کار رفته انتخاب مناسبی برای مهندسی بافت هستند. به هر حال در ادامه اين تحقيق بررسي خواص مكانيكي نمونهها و تمايز سلولي به سلولهاي استخواني نياز است. مراجع [1] Vindigni V., Cortivo R., Iacobellis L., Abatangelo G. and Zavan B., Hyaluronan benzyl ester as a scaffold for tissue engineering, Int. J. Mol. Sci., 2009; 10: [2] Mistry A.S., Mikos A.G., Tissue engineering Strategies for bone regeneration, Adv Biochem Engin/ Biotechnol, 2005; 94: [3] Tan Q., Steiner R., Hoerstrup S.P., Weder W., Tissueengineered trachea: History, problems and the future, European Journal of Cardio-thoracic Surgery, 2006; 30: [4] Liu X. and Ma P.X., Polymeric scaffolds for bone tissue engineering, Annals of Biomedical Engineering, 2004; 32 (3): [5] Tabata Y., Recent progress in tissue engineering, DDT, 2001; 6 (1): [6] Mikos A.G., Temenoff J.S., Formation of highly porous biodegradable scaffolds for tissue engineering, EJB Electronic Journal of Biotechnology, 2000; 3 (2). [7] Chen G., Ushida T., Tateishi T., Development of biodegradable porous scaffolds for tissue engineering, Materials Science and Engineering C, 2001; 17: Sebacoil chloride

8 ۹۷ [32] Heo S.J., Kim S.E., Hyun Y.T., Kim D.H., Kim J. H., Lee Y.J., Kim Y.J., Shin J.W., Hwang Y.M. and Shin J.W., Fabrication of porous scaffolds for bone tissue engineering using a 3-D Robotic system: comparison with conventional scaffolds fabricated by particulate leaching, MCB, 2006; 3 (4): [33] Kazemzadeh Narbat M., Orang F., Solati Hashtjin M. and Goudarzi A., Fabrication of porous hydroxyapatite-gelatin composite scaffolds for bone tissue engineering, Iranian Biomedical Journal, 2006; 10 (4): [34] Duarte A.R.C., Mano J.F., Reis R.L., Preparation of starch-based scaffolds for tissue engineering by supercritical immersion precipitation, J. of Supercritical Fluids, 2009; 49: [35] Metcalfe A.D. and Ferguson M.W.J., Tissue engineering of replacement skin: the crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration, J. R. Soc. Interface, 2007; 4: [36] Hosseinkhani H. and Hosseinkhani M., Tissue engineered scaffolds for stem cells and regenerative medicine, Trende in Stem Cell Biology and Technology, Humana Press, 2009: [37] Najafi F., Sarbolouki M.N., Synthesis and characterization of block copolymers from aromatic diols, fumaric acid, sebacic acid and PEG, J Appl Polym Sci, 2003; 90: [38] Najafi F., Sarbolouki M.N., Biodegradable micelles/ polymer somes from fumaric/sebacic acids and poly (ethylene glycol), Biomaterials, 2003; 24: مجله مهندسی پزشکی زيستی دوره سوم شماره ۴ زمستان ۹۸-۹۱ ۱۳۸۸ jspui/bitstream/2262//3/5.1_scaffoldssurfaces_final.doc [25] Zhang R., Ma P. X., Poly (α- hydroxyl acids) /hydroxyapatite porous composites for bone tissue engineering. І. Preparation and morphology, J Biomed Mater Res, 1999; 44: [26] Neumann M., Epple M., Composites of calcium phosphate and polymers as bone substitution materials, European Journal of Trauma, 2006; 32: [27] Marcelle Mathieua L., Muellerb T.L., Bourbana P.E., Pioletti D.P., llerb R.M., Ma nson J.A.E., Architecture and properties of anisotropic polymer composite scaffolds for bone tissue engineering, Biomaterials, 2006; 27: [28] Kim S., Park M.S., Jeon O., Choi C.Y., Kim B., Poly (lactide-co-glycolide)/ hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering, Biomaterials, 2006; 27: [۹] کاظمزاده مهدي ساخت داربستهای مهندسی بافت به روش گاز فومينگ ۱۳۸۸ قابل مشاهده در: fault.aspx [30] Thompson J.B., Kindt J H., Drake B., Hansma H.G., Morse D.E., Hansma P.K., Bone indentation recovery time correlates with bond reforming time, Letters to nature, Nature, 2001; 414 (13): [31] Mano J.F., Sousa R.A., Boesel L.F., Neves N.M., Reis R.L., Bioinert, biodegradable and injectable polymeric matrix composites for hard tissue replacement: state of the art and recent developments, Composites Science and Technology, 2004; 64: