ا ي ا ت ا م streptokinase ا ز ا ت ا

Transcript

1 ا ي ا ت ا م streptokinase ا ز ا ت ا : الخلاصة إس ارء غانم هادي إیمان محمد جار االله جامعة بابل كلیة العلوم تم عزل 61 عزلة بكتریا sp. Streptococcus من مسحات بلعوم مرضى الجهاز التنفسي في مستشفیات مدینة الحله للفترة من تشرین الثاني 2010 آذار نقیت العزلات البكتیریة بطریقة الزرع الثانوي على وسط نقیع القلب والدماغ الصلب مع الدم لعدة م ارت. وبعد الحصول على المستعم ارت النقیة شخصت العزلات البكتیریة اعتمادا على الصفات الزرعیة والفحوصات البایوكیمیاي یه. وقد بینت النتاي ج أن هذه العزلات كانت تابعة لخمسة أنواع من المسبحیات وهي S.pyogenes و S.mitis و S.equisimilis و S.salivarius و. S.suis وقد اختیر النوع S.pyogenes المحلل للدم نوع بیتا لغرض د ارسة إنتاجیتها لا نزیم الستربتوكاینیز المستخدم سریریا في علاج الخثرة الدمویة. وقد درست الفعالیة الا نزیمیة للا نزیم الخام وقورنت مع فعالیته بعد ترسیبه با ملاح كبریتات الامونیوم بنسبة إشباع %80 مع الدیلزه. وقد ازدادت الفعالیة بعد التنقیة حیث بلغت /U ml مقارنتا مع الفعالیة قبل التنقیة حیث بلغت /U ml Abstract Sixty one Streptococcus sp. Bacterial species were isolated from throat swabs of respiratory tract patients in Hilla hospitals during the period from November 2010 to March These isolates were purified by subculture method on brain heart infusion agar medium for many times. The isolated colonies were identified according to cultural properties and biochemical tests. The results showed that the isolates were belonged to five species of Streptococcus which were S. pyogenes, S. suis, S. salivarius, S. equisimitis and S. mitis. Beta hemolytic species S. pyogenes war tested for streptokinase production ( fibrinolytic clinically used enzyme. Enzymatic activity of crude enzyme was studied and compared with their activity after precipitation by ammonium sulfate precipitation at 80% saturation percentage with dialysis. The activity was increased after purification to reach U/ml compared with U/ml before it. المقدمة : Introduction نظ ار للتغی ارت الكبیرة الحاصلة في أنماط الحیاة الاجتماعیة والاقتصادیة في العالم بشكل عام والع ارق بشكل خاص فقد ازدادت معدلات الاصابة بالكثیر من الام ارض القلبیة التاجیة الناجمة عن تخثر الدم في الش اریین القلبیة والتي قد تؤدي الى الموت. لذلك اصبح من الضروري إنتاج عقاقیر تعمل على خفض نسب تخثر الدم في الاوعیة الدمویة 2008, Salarifar (. Streptokinase والمتمثلة بالا فاعي هنالك العدید من الكاي نات التي تقوم با نتاج أنزیم الستربتوكاینیز Snake ودیدان الا رض Earthworm والفطریات Fungi مثل Fusarium oxysporum والعدید من الا نواع البكتیریة منها و Mucor sp. وكذلك تقوم با نتاجه الاكتینومایسیتات Acitnomycetes Aeromonas hydrophilia و Serratia E15 و B.natto و B.amyloliquefacens وبكتریا المسبحیات المحللة للدم نوع β B- hemolytic Streptococci (2003,. etal Jian sha وسنقتصر في هذا البحث على أنتاج إنزیم الستربتوكاینیز Streptokinase من قبل المسبحیات المقیحة Streptococcus pyogenes لهذا الا نزیم عام 1874 م من قبل الا شخاص المصابین بالحمى القرمزیة تصنیف بكتریا المسبحیاتStreptococci حیث كان أول تشخیص لبكتریا المسبحیات المنتجة Billroth في الجروح المصابة فیما بعد أظهرت الد ارسات با ن دماء Scarlet fever تحتوي على نفس البكتریا وفي عام 1919 م تم إلى مجامیع متباینة هي ألفا بیتا كاما ( بالاعتماد على نوع ١٣١٦

2 Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(4/ Vol.(21: 2013 التحلل وفي عام المجامیع 1933 م قسم سیرولوجیا Lancefield البكتریا المحللة للدم نوع بیتا من A إلى O ووجد أن A, C, G هي أكثر المجامیع إنتاجا للا نزیم وان المجموعة C هي أفضل المجامیع في أنتاج الا نزیم. أن إنزیم الستربتوكاینیز هو بروتین إف ارزي ذو وزن جزیي ي 46 كیلو دالتون ینتج من سلالات محددة من بكتریا المسبحیات المحللة للدم نوع بیتا A, C, G ویعمل هذا الا نزیم على تنشیط مولد البلازمین plasminogen وتحویله إلى بلازمین فعال من خلال ربطه ببروتین مشابه للبروتین ( Ben Nasr et al.,1994 M ویعد عامل انتشارfactor spreading یسهم في انتشار البكتریا وتسهیل غزوها للانسجه من خلال قدرته على تحویل مولد البلازمین إلى بلازمین فعال al.,1992 (Kauuslla et ویعمل الا نزیم على حل الخثره الدمویة من خلال موقع ارتباط خاص ولذلك یستخدم كعقار حال للخثره الدمویة( al.,2009 Mohammad تتكون et جزیي ه هذا الا نزیم من ثلاث مقاطعات Domins لا نزیم ستافلوكاینیز Staphylokinase بالبلازمین تكون عشرة أضعاف قدرة ستافلوكاینیز المفرز من العنقودیات تتا لف الا ولى من Staphylococci 147 حامض أمیني وتكون مشابهه إلا أن قدرته على الارتباط al.,1998 ( Arai et وتعمل هذه المقاطعة كمنظم ( egulator لفعالیة بقیة الجزیي ة أما المقاطعتین الثانیة والثالثة فتكون ضروریة لتنشیط مولد البلازمین وتحویله إلى بلازمین فعا ل الا ولى للا نزیم المنتج من قبل المجامیع مفقودة في الا نزیم المنتج من العنقودیات والمجموعة al.,1995 ( Parrado et al.,1996, odrignez et تحتوي المقاطعة A C, للمسبحیات عروه مكونة من (ecognition الا نزیمي على مولد البلازمین إذ أن إ ازلة في كمیة البلازمین المنشطة بفعل الا نزیم أستخدم إنزیم الستربتوكاینیز في علاج مرض الخثار الا كلیلي 25 حامض أمیني في حین تكون G من المسبحیات وتكون ضروریة في عملیة التعرف 12 حامض أمیني منها تؤدي إلى انخفاض كبیر al.,2002 ( Wake hann et أما في مجال الطب ألسریري فقد Coronary thrombosis ( Ko et al.,1995 al.,2004 ( Banerjee et كما أستخدم في علاج الفشل القلبي الحاد Acute Sherry أما and Marder,1991myocardial infraction الاستخدام الا كثر شیوعا لهذا الا نزیم فهو علاج الخثره ألدمویه( Dey,2000 (Chitte and. الهدف من البحث : یهدف البحث إلى عزل وتشخیص أنواع بكتیریة تعود إلى الجنس Streptococcus منتجة لا نزیم الستربتوكاینیز من عینات مرضى مصابین با مر اض الجهاز التنفسي من مستشفیات مدینة ألحله ود ارسة الفعالیة الا نزیمیة لهذا الا نزیم قبل وبعد عملیة التنقیة الجزي یة. المواد وطرق العمل عزل البكتریا : Bacterial isolation : Materials and Method أخذت 61 مسحة بلعوم من المرضى المصابین با م ارض الجهاز التنفسي العلوي (التهاب الحنجرة واللوزتین ( من كلا الجنسین وبا عمار مختلفة من شهر كانون الا ول 2010 ولغایة شهر آذار زرعت المسحات مباشرة في وسط مرق تربتون الصویا مع الا ازید والبنفسج البلوري وحضنت عند درجة ح اررة 37 م لمدة ساعة. بعد ذلك أخذ ملي الناقل من النمو وخطط على وسط نقیع القلب والدماغ الصلب مع الدم للحصول على مستعم ارت مفردة وحضنت الا طباق عند درجة ح اررة 37 م لمدة 24 ساعة ثم فحصت الا طباق للتحري عن المستعم ارت النموذجیة للمسبحیات ولوحظ كل من نوع التحلل وصفات المستعمرة. ١٣١٧

3 تشخیص العزلات البكتیریة : Bacterial isolates idemtification شخصت المسبحیات بالاعتماد على صفاتها الزرعیة و المجهریة والفحوصات الكیموحیویة بالاعتماد على. ( 2000 الط اري ق التي ذكرها Macfaddin التحري عن قابلیة البكتریا على إنتاج إنزیم الستربتوكاینیز : اخذ ملي عروة الناقل من مزروع بعمر 18 ساعة نامي على وسط نقیع القلب والدماغ الصلب مع الدم واستعمل 0.1 لتلقیح 10 مل من وسط نقیع القلب والدماغ الساي ل عند درجة ح اررة م لمدة ساعة بعدها أخذ مل من الا خیر واستعمل لتلقیح 10 مل من الوسط نفسه وحضن بالظروف نفسها ثم نقل 0.5 مل من المزروع المنشط وأضیف إلى أنبوبة اختبار معقمة حاویة على 0.2 مل من البلازما البشري 0.8 مل من المحلول الملحي الفسیولوجي و 0.25 مل من محلول كلورید الكالسیوم وحضن عند درجة ح اررة 37 م لمدة 24 ساعة وقورن مع أنبوبة السیطرة الحاویة على 0.5 مل من الوسط المعقم والمعاملة تحت نفس الظروف. النتیجة الموجبة تكون بعدم تكون خثره في أنبوبة الاختبار أو بتكون خثره خفیفة بالمقارنة مع أنبوبة. ( Sanderson et al., 2006 السیطرة أنتاج الا نزیم الخام : Enzyme production تم تنمیة بكتریا ال Streptococcus pyogenes بواسطة تربتون الصویا أو الوسط قید الد ارسة وحضنت بالحاضنة اله اززة لمدة 3 أیام. ثم بعد ذلك أخذ (5 مل من المزرعة البكتیریة الساي لة ونبذ بجهاز المنبذ المبرد بسرعة 5000 دورة/دقیقة لمدة 5 دقاي ق بدرجة 4 م ومن ثم أهمل ال ارسب وأخذ ال ارشح بعدها تم تعقیم ال ارشح. ( Kunamneni et al., 2007 بالمرشحات الدقیقة Millipore filter 0.45 قیاس الفعالیة الا نزیمیة : Enzyme activity assay 2.5 مل تم قیاس الفعالیة الا نزیمیة بطریقة Fibrin plate method والمتضمنة مزج محلول الكا ازي ین ( Sodium Phosphate buffer, ph 7.4 مع 2 مل من من w/v ( 2% في محلول فوسفات الصودیوم المصل البشري لیتصلب لمدة Human serum بعد التعقیم واضافتها إلى الا كاروز. بعد ذلك صب المزیج في أطباق وترك 30 دقیقة في درجة ح اررة الغرفة ثم عمل ثلاثة حفر في كل طبق بسمك 0.5 سم وأضیف له مایكرو لتر من المحلول الا نزیمي في كل حفرة وحضن في درجة 37 م. بعد ذلك تم قیاس إبعاد 50 منطقة التحلل ومنه حدد عدد الوحدات الا نزیمیة. حیث أن الوحدة الواحدة من الفعالیة الا نزیمیة تعرف على إنها كمیة الا نزیم في 25 مایكرو لتر من المحلول الا نزیمي والتي تنتج منطقة تحلل مساحتها 2 1 ملم عند درجة. حموضة ph 7.7 في 35 م لمدة 18 ساعة 2005, Johanston ( Lizano and تنقیة إنزیم الستربتوكاینیز : Streptokinase purification الترسیب بكبریتات الامونیوم : Ammonium sulfate precipitation أ. الترسیب بكبریتات الامونیوم بنسبة إشباع 80% : تم إضافة 52.3 غ ارم من كبریتات الامونیوم تدریجیا إلى 100 مل من محلول الا نزیم الخام مع التحریك المستمر باستخدام المحرك المغناطیسي 7000 دورة / دقیقة في 4 م لمدة ( Magneticstirrer وفي درجة ح اررة 60 دقیقة نبذ المحلول بسرعة 7 بعدها درجة 4 م لمدة ساعة واحدة ثم أذیب ال ارسب ب قدرت الفعالیة الا نزیمیة في ال ارسب وال ارشح. 10 مل من دارئ الفوسفات ذو الا س الهیدروجیني 6.8 و 16.6 ب. التجزي ة بملح كبریتات الامونیوم : أضیف 5.7 و 5.9 و 6.1 و 6.3 و 6.6 و غم من كبریتات الامونیوم حیث أضیف الوزن الا ول تدریجیا إلى 100 مل من المستخلص الخام مع التحریك ١٣١٨

4 Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(4/ Vol.(21: 2013 المستمر باستخدام المحرك المغناطیسي إشباع من منه Magnetic stirrer 30-0 نبذ المحلول بسرعة 7000 دورة \ دقیقة في درجة وفي درجة ح اررة 4 م للحصول على نسبة 4 م فصل المحلول ال اري ق وأخذ 100 مل أضیف إلیه الوزن الا خر من كبریتات الامونیوم للحصول على نسبة الا شباع التالیة وهكذا أعیدت العملیة للتشبعات الا خرى للحصول على نسب إشباع % ( 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 قدرت الفعالیة الا نزیمیة للرواسب لكل خطوة بعد إذابتها ب الهیدروجیني. ( Harris, مل من محلول دارئ الفوسفات ذو الرقم ج. الدیلزة : تمت إ ازلة الا ملاح من المحلول الا نزیمي بعد الترسیب بكبریتات الامونیوم حیث وضع 6 مل من ال ارسب في أنبوبة الدیلزة واحكم إغلاقها ثم وضع في حوض یحتوي على محلول دارئ الفوسفات ذو أس هیدروجیني 7 ( ثم وضع في الثلاجة لمدة 24 ساعة ثم تم قیاس الفعالیه الا نزیمیة Sanderson. ( et al., 2006 النتاي ج والمناقشة : esults and Discussion العزل والتشخیص: 61 تم عزل مسحة بلعوم من مرضى مصابین با م ارض الجهاز التنفسي العلوي (التهاب الحنجرة واللوزتینلكلا الجنسین وبمختلف الا عمار للمدة من 2010/12/15 ولغایة. 2011/3/17 جدول رقم (1 توزیع العزلات البكتیریة. الجنس أنثى الفي ة العمریة العدد النسبة % ذكر % المجموع زرعت المسحات مباشرة في مرق تربتون الصویا مع الا ازید والبنفسج البلوري لتثبیط نمو كل من البكتریا ألسالبه لصبغة غ ارم والفطریات والمكو ارت العنقودیة المتواجدة في التجویف التنفسي للا نسان ونمیت على وسط نقیع القلب والدماغ الصلب مع الدم للتحري عن المستعم ارت النموذجیة للمسبحیات وملاحظة نوع التحلل Blood. hemolysis أظهرت نتاي ج التشخیص البكتیري أن العزلات تعود إلى خمسة أنواع بكتیریة ضمن جنس Streptococcus بالاعتماد على الصفات المظهریة والزرعیة وهذه الا نواع مبینة في جدول رقم (2. وقد أظهر نوعان فقط تحلل الدم نوع بیتا أما الا نواع الا خرى فقد أظهرت تحللا من نوع ألفا. تم الحصول على عزلتین من المسبحیات المحللة للدم نوع بیتا أي بنسبة % 3.3 وهذا اقل مما حصل علیه العاني( 2001 حیث ١٣١٩

5 تمكن من الحصول على 12 %عزله من المسبحیات الحالة للدم نوع بیتا من مسحات اللوزتین. وقد یعود اختلاف نسبة عزل المسبحیات المحللة للدم إلى اختلاف المواقع الجغ ارفیة للعزل واختلاف الط اري ق والتقنیات المستخدمة في العزل وفي هذا البحث تم اختیار وسط مرق تربتون الصویا مع إضافة الا ازید والبنفسج البلوري لتحویله إلى وسط انتقاي ي( media Selective بالاعتماد على ماتوصلت إلیه الشبیب( 1977 من أن وسط تربتون الصویا هو الا فضل لعزل المسبحیات من مصدري الحنجرة واللعاب إذ تبلغ النسبة الایجابیة له 93% و 96% على التوالي وهي أعلى من بقیة الا وساط. تم التحري عن قابلیة المسبحیات على إنتاج الستربتوكاینیز وأظهرت جمیع العزلات التابعة للنوعینS.pyogenes و S.equi القدرة على إنتاج هذا الا نزیم في حین لم تتمكن أي من العزلات التابعة للا نواع الا خرى من أنتاجه. وبذلك تكون نسبة بكتریا S.pyogenes و S.equi المنتجة للا نزیم % 100 وهذا ماتوصلت إلیه البغدادي 2006 ( وهي أعلى من النسبة التي حصلت علیها الشبیب 1977 ( والتي وجدت با ن % 86 من المسبحیات التابعة للنوع S.pyogenes % من المسبحیات المحللة للدم بیتا المعزولة من الا طفال منتجة للا نزیم وعیسى 2000 ( التي وجدت با ن % من العزلات المعزولة من البلعوم منتجة للا نزیم. جدول 2 ( أعداد ونسب المسبحیات المعزولة من اخماج الجهاز التنفسي العلوي. النوع S.pyogenes S.mitis S.equisimilis S.suis S.salivarius المجموع العدد النسبة المي ویة % % 100 جدول 3 ( التوصیف الكیموحیوي للمسبحیات المعزولة من اخماج الجهاز التنفسي العلوي. S.suis S.salivarius S.equi S.mitis S.pyogenes الاختبار α α β α نوع تحلل الدم β فحص الكتلیز اخت ازل النت ارت النمو بوجود CO2 النمو الاهواي ي الحساسیة للبست ارسین S S S S S الحساسیة ل SXT الحساسیة للاوبتوكین النمو بدرجة 10 م النمو بدرجة 45 م تحمل الملوحة ١٣٢٠

6 Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(4/ Vol.(21: 2013 النمو في أملاح الصف ارء بتركیز 40% تخمر اللاكتو ز تخمر الانیولین تخمر المانتول / تخمر ال ارفینوز / تخمر ال اریبوز تخمر السالسین تخمر السوربتول تخمر التریهالوز فحص أنتاج الا سیتون S حساس نتیجة الفحص سالبة مقاوم. β وα نوع التحلل الدموي نتیجة الفحص موجبة تنقیة إنزیم الستربتوكاینیز : حیث تم ترسیب الا نزیم بكبریتات الامونیوم بنسبة إشباع % 80 ولم تكن هذه الطریقة مجدیة في تركیز الا نزیم أما عند التجزي ة بكبریتات الامونیوم بنسب إشباع مختلفة ت اروحت من % فقد أعطى الا نزیم أعلى % بلغت % بلغت U/ml ( تلتها النسبة من فعالیة عند النسبة من فعالیتها U/ml أما النسبة % بلغت فعالیتها( (28.26U/ml أما بقیة التشبعات لم تعطي فعالیة تذكر و من النتاي ج التي حصلنا علیها نجد انه من الافضل ان تبدا عملیة الترسیب التجزیي ي عند % 20 ثم عند % 40 لترسب معظم الا نزیم. 300 الفعالیة الا نزیمیة U/ml نسبة الا شباع % شكل 1 ( الفعالیة الا نزیمیة بعد التنقیة بكبریتات الا مونیوم لبكتریا S.pyogenes ١٣٢١

7 250 الفعالیة الا نزیمیة U/ml نسبة الاشباع % شكل 2 ( الفعالیة الا نزیمیة بعد التنقیة بكبریتات الامونیوم لبكتریا S.eqisilimilis یجرى عادة تركیز الا نزیمات في خطوات التركیز الا ولى للتخلص من نسبة كبیرة من الماء وللحصول على درجة من النقاوة وتستخدم الا ملاح عموما لهذا الغرض كا ملاح الا مونیوم والصودیوم في شكل كبریتات أو كلوریدات في الغالب أو المذیبات العضویة كالكحول الاثیلي والا سیتون ویحدث الترسیب بالا ملاح بسبب معادلة الشحنات الموجودة على سطح البروتین بفعل الملح والا خلال بطبقة الماء المحیطة بجزیي ات البروتین ویؤدي ذلك إلى انخفاض ذاي بیة البروتین وترسبه وتسمى هذه العملیة التملیح الخارجي out (Salting. كما و یعتمد تركیز الملح الذي یودي إلى ترسیب البروتین على عدد وتوزیع شحنات البروتین والمجامیع الكارهة للماء كما ویوثر حجم البروتین وشكله ووجود مركبات أخرى معه في ذاي بیته al.,1973 (White et. إن قلة الفعالیة الا نزیمیة عند الترسیب بتشبع %80 قد یكون ناتجا من ترسب بروتینات أو مواد أخرى قد أدت بشكل أو با خر إلى فقدان الفعالیة الا نزیمیة. هذا ما تؤكده نتاي ج الترسیب ألتجزیي ي إذ تبین إن حوالي %77 من البروتینات الكلیة الموجودة في ال ارشح الا نزیمي الخام قد ترسبت بنسب التشبع %. هذا بدوره قد أدى إلى زیادة كبیرة في الفعالیة النوعیة للا نزیم ونقاوته بالمقارن مع الترسیب بالتشبع %80. كما أن ترسب الا نزیم بالتشبعات العالیة سطحه الخارجي.(Harris,1989 % دون النسب الواطي ة قد یكون بسبب احتواي ه على مجامیع كارهة للماء قلیلة نسبیا على وتعد هذه العملیة أفضل من إ ازلة الا ملاح بواسطة هلام أما إ ازلة الا ملاح من المحلول الا نزیمي فتمت بعملیة الدیلزة Dialysis Sephadex G25 حیث یعد تخفیف العینة احد مساوئ إ ازلة الا ملاح بالترشیح الهلامي (1989 Harris فقد بلغ قیاس الفعالیة الا نزیمیة بعد عملیة الدیلزة Dubey et al ( 2011 ( وتتفق هذه النتاي ج مع ماتوصل إلیه U/ml الا نزیم المعزول من S.eqsimilis وكانت فعالیته U/ml ( حیث درس فعالیة ١٣٢٢

8 Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences/ No.(4/ Vol.(21: 2013 المصادر البغدادي إس ارء عدنان 2006 (. د ارسة بكتریولوجیة وو ارثیة للمسبحیات المعزولة من أخماج الجهاز التنفسي العلوي. رسالة ماجستیر كلیة العلوم جامعة بابل. الشبیب أسفار شهاب 1977 (. د ارسة بكتیریة و ارثیة عن Streptococcus pyogenes المعزولة من Streptococcus حناجر ولعاب الا طفال في الع ارق. رسالة ماجستیر كلیة العلوم جامعة بغداد. العاني ندى عربي حمدو 2001 (. د ارسة المستضد الخارق المنتج من بكتریا pyogenes المعزولة من الا طفال على بعض الخلایا المناعیة. رسالة ماجستیر كلیة العلوم جامعة بغداد عیسى مي طالب فلیح 2000 (. د ارسة على إنزیم ال Cystein protease المنتج من بكتریا.Streptococcus pyogenes أطروحة دكتو اره كلیة العلوم جامعة بغداد. Adinarayana K. Bhavani D. and Vinjamuri S. ( Urokinase strong plasminogen activator. Biotecnol. Mol. ev. 3: Banerjee, A., Chistic, Y. and Banerjee, U. C. ( Streptokinase. aclinically useful thrombolytic agent. Biotechnol. Adv. 22: Ben Nasr, A., Wistedt, A., ingdahl, U., and Sjobringu. ( Streptokinase activates plasminogen bound to human group C and G streptococci through M like proteins. Eur. J Biochem, 222: Chitte,., and Dey S. ( potent fibrinolytic enzyme from a thermophilic Streptomyces megasporus strain St 5. Lett. Appl. Microbiol. 31: Dubey,., Kumar, J., Agrawala, T., Pusb, P,. ( Isolation, Production, Purification, Assay and characterization of fibrinolytic enzymes ( Nattokmace, Streptokinase and Urokinase from bacterial sources. Afr. J Biotechnol. 10: Harris, E., L. V,. ( Concentration of the extract. In " Protein durification methods. E. L. V. Harris, and S. Angal, edt. ". Oxford Uni. Press. 154: Jian, Cl., Galindo, V., Pancholi, V. L, Popov, Y., Zhao, C., Chopra, A., (2003. Differential expression of the enolase gene under in vivo versus in vitro growth condition of Aeromonas hydrophila. Microbial pathogenesis. 34: Kumar, S., Thamura, K., and Nie, M. ( Effect of human plasminogen by streptokinase. J. Biol. Chem. 2: Ko, D., Kim, I., Lee, S. and Byun, S. ( High level expression and secretion of streptokinase in Escherichia coli. Biotechnol Lett. 17: Kauusella, P., Ullberg, M., Sakela, O. and Kronvall, G., ( Tissue type plasmogen activator mediated activation of plasminogen on the surface of group A, C, G streptococci. Infect. Immun. 60: Kumanmneni, A., Abdergham, T., and Elliaiah, P. ( Streptokinase-the rug of choice for thrombolytic therapy. J. Thromb. Thrombolylysis. 23:9-23. Lizano, S. and Johnston, K. ( Structural diversity of streptokinase and activation of human plasminogen. Infect. Immun. 73: Mohammad B, Hossain M, and Mohammad,. ( Production and purification of streptokinase by protected affinity chromatography. Avicenna J. Med. Biotecnol. 1:47-58 ١٣٢٣

9 Macfaddin, J. F. ( Biochemical Tests For Identification of Medical Bacteria. 3 rd edition. The Williams and Wilkins. Baltimor, USA. Parrado J, Conejero Lara F, Smith. A. J., Marshall J. M., Ponting C. P. and Dobson C. M. ( The domain organization of streptokinase nuclear magnetic resonance, circular dichroism, and functional characterization of protealytic fragments. Protein Sci. 5: odriguez, P, Fuentes, P, Barro, M., Alvarez, G., Munoz, E, Collen, D. and Lijnen,., ( Structural with plasmimogen. Eur. J Biochem. 229: Sanderson, M., Batzolf, M., Dowton, K., and anson J. ( Divergence in the plasminogen-binding group a streptococcal M protein family. J. Biol. Chem. 231: Sherry, S. and Marder, B. ( Streptokinase and recombinant tissue plasminogen activator ( rt PA are equally effective in treating acute myocardial infarction. 114: Stukus, P, E. ( Investigating microbiology a laboratory manual for general microbiology. Harcout Brace and companes Wakeham N, Terzyan S, Loy J. A. Tang J. Zhang X. C. ( 2002 Effect of deletion of streptokinase residues on plasminogen activation. Protein Engineering. 15: White, A., Handler, P., and Smith, E., ( Principles of biochemistry. 2ed. ed Mc Grow Hill Book Company, Ablakiston Publication, New York. ١٣٢٤