Παρουσία και Επιδημιολογική διερεύνηση και μελέτη της διασποράς της Λεγιονέλλας στη Δυτική Ελλάδα

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ EΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ- ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ» Παρουσία και Επιδημιολογική διερεύνηση και μελέτη της διασποράς της Λεγιονέλλας στη Δυτική Ελλάδα Διδακτορική Διατριβή Κατερίνα Βασιλείου Φράγκου (M.Sc) ΠΑΤΡΑ 2012

2 1

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ EΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ- ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ» Θέμα: «Παρουσία και Επιδημιολογική διερεύνηση και μελέτη της διασποράς της Λεγιονέλλας στη Δυτική Ελλάδα» ΤΗΣ ΥΠΟΨΗΦΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΑ Κατερίνα Βασιλείου Φράγκου (Α.Μ.1072) Χημικός (M.Sc) Πάτρα

4 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ιωάννης Αλαμάνος Αναπληρωτής Καθηγητής Εργαστήριο Υγιεινής και Επιδημιολογίας Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Απόστολος Βανταράκης Επίκουρος Καθηγητής Εργαστήριο Υγιεινής και Επιδημιολογίας Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πάτρας Χαράλαμπος Γώγος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πάτρας 3

5 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ιωάννης Αλαμάνος, Αναπληρωτής Καθηγητής Απόστολος Βανταράκης, Επίκουρος Καθηγητής Χαράλαμπος Γώγος, Καθηγητής Μουζάκη Αθανασία, Καθηγήτρια Ζαρκάδης Ιωάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής Δημολιάτης Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία, Επίκουρη Καθηγήτρια 4

6 Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας του Εργαστηρίου Υγιεινής, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια των Μεταπτυχιακών Σπουδών, υπό την επίβλεψη του κ.αλαμάνου Ιωάννη, σε συνεργασία με τον κ.βανταράκη Απόστολο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς για την βοήθεια τους. Επιπλέον ευχαριστώ το εργαστήριο Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας του Εργαστηρίου Υγιεινής, της Ιατρικής Σχολής και το Εργαστήριο Αιματολογίας της κ.μουζάκη. Ιδιαίτερη ευγνωμοσύνη χρωστώ στον κ.δετοράκη Ιωάννη για την πολύτιμη καθημερινή στήριξη του. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου, τον Παναγούλια Ιωάννη, την Σμαίλη Μαίρη και τον Πανδή Σπύρο για την βοήθεια τους και την απέραντη υπομονή τους κατά της διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου και όλους τους φίλους μου και ιδιαίτερα την Σακελαράκη Γιώτα, την Νικολία Σύφαντου την Αλεξανδανδράτου Νικολία και τον Κατσιώλη Άρη που άντεχαν να ακούν τα παράπονα μου και με έκαναν να χαμογελώ. Τέλος ευχαριστώ και τον άντρα μου, για την υπομονή και την σιωπή του, ιδιαίτερα κατά την διάρκεια της συγγραφής της διατριβής μου. 5

7 Στον μπέμπη μου στον Παναγιώτη μου και σε όσους με παίδεψαν σε αυτό το ταξίδι μου 6

8 7

9 Περιεχόμενα I.ΕΙΣΑΓΩΓΗ I.3. Δημοσίευση σε ξένο περιοδικό I.4. Δημοσίευση σε ελληνικό περιοδικό I.5. Ομιλίες ως προσκεκλημένος ομιλητής II.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ II.1. Ιστορική Αναδρομή II.2. Ταξινόμηση II.3. Μορφολογία και Μικροβιολογία II.4. Κύκλος ζωής II.5. Μοριακή Γενετική II.6. Οικολογία -Γενικά II.7. Επίδραση θερμοκρασίας II.8. Παρασιτισμός II.9. Συμβιωτικοί Οργανισμοί II.10. Βιομεμβράνη II.11. Άλλοι παράγοντες II.12. Κλινική Εμφάνιση-Γενικά II Νόσος των Λεγεωνάριων II Pontiac Πυρετός II Εξωπνευμονικό σύνδρομο II.13. Μέθοδοι Ανίχνευσης-Γενικά II Καλλιεργητική μέθοδος II Μοριακές Μέθοδοι II Άλλες μέθοδοι II.14. Μετάδοση της Νόσου των Λεγεωνάριων II.15. Παρουσία του βακτηρίου σε υπόγεια ύδατα II.16. Παρουσία του βακτηρίου σε αέρα II.17. Παρουσία του βακτηρίου σε χώμα II.18. Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της Νόσου II.19. Λοιμοτοξικότητα-Βαρύτητα κρουσμάτων II.20. Λοιμογόνος δράση Παθογένεια II.21. Μεταδοτικότητα II.22. Πνευμονία κοινότητας II.23. Νοσοκομειακές λοιμώξεις

10 II.24. Σποραδικές περιπτώσεις πνευμονίας II.25. Περιστατικά σε ταξιδιώτες II.26. Θνητότητα II.27. Επίπτωση II.29. Εκτίμηση Κινδύνου ανάπτυξης και μετάδοσης της Νόσου II.30. Παρακολούθηση Συστήματος II.31. Σύστημα Επιτήρησης Σκοπός Εργασίας III.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ III.1. Μέθοδος III.1.1. Δειγματοληψία-Γενικά III.1.2. Σημεία Δειγματοληψίας III.1.3. Διαδικασία Δειγματοληψίας III.1.4. Αριθμός δειγμάτων III.1.5. Πύργος Ψύξης και Δειγματοληψία III.1.6. Καταγραφή κρουσμάτων πνευμονίας III.2. Υλικά και εργαστηριακές μέθοδοι III.2.1.Καλλιεργητική Μέθοδος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Pseudomonas aeruginosa III.2.1.A. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος Pseudomonas Selective Agar III.2.1.Β. Παρασκευή ζωμoύ ακεταμιδίου, Acetamide Nutrient Broth III.2.1.Γ. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος Nutrient Agar III.2.1.Δ. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος King s Agar B Medium III.2.1.Ε. Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης της Pseudomonas aeruginosa III.2.2. Καλλιεργητική Μέθοδος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας(ΟΜΧ) στους 22 ο C και στους 37 ο C III.5.2.Α. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας (Total Count) στους 22 C και στους 37 C III.5.2.Β. Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης τηςολικής μεσόφιλης Χλωρίδας III.5.3. Καλλιεργητική Μέθοδος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Legionella spp III.5.3. Α. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Legionella spp III.5.3.Β.Καλλιεργητική Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης της Legionella spp. (Πρωτόκολλο HPA, National Standard Method, W12: Detection and enumeration of Legionella species by filtration and centrifugation) III.5.3.Γ.Καλλιεργητική Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης της Legionella spp. (Πρωτόκολλο ISO 11731: Water quality-detection and enumeration of Legionella ) III.Α.Μοριακές Μέθοδοι για την ανίχνευση της L.pneumophila III.A.1. Εισαγωγή στην τεχνική PCR (Polymerase Chain Reaction)

11 III.A.2. Εισαγωγή στην Ηλεκτροφόρηση σε Πήκτωμα Αγαρόζης (gel agarose) ΙΙΙ.Β. Ταυτοποίηση της L.pneumophila από αποικίες με τη Μοριακή Μέθοδο της PCR III.B.2. Μέθοδος απομόνωσης αποικιών Legionella spp III.B.3. Εκκινητές (Primers) για την Μοριακή Τεχνική PCR III.B.4. Μέθοδος αντίδρασης PCR III.B.5. PCR για το γονίδιο mip ΙΙΙ.Γ. Ταυτοποίηση της L.pneumophila με Αλληλούχιση (Sequence analysis) III.Γ.1. Εισαγωγή στην Ανάλυση Αλληλουχίας (Sequence analysis) III.Γ.2. Αλληλούχιση και Φυλογενετική Ανάλυση (Phylogenetic Tree Analysis) III.Γ.3. Στατιστική Επεξεργασία αποτελεσμάτων ΙV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ IV.1. Αριθμός και προέλευση δειγμάτων IV.2. Αποτελέσματα Φυσικοχημικών και Μικροβιολογικών παραμέτρων IV.3. Στατιστική Ανάλυση των Εργαστηριακών Αποτελεσμάτων IV.3.α. Legionella και Υπολειπόμενο Χλώριο IV.3.β. Legionella και ph IV.3.γ. Legionella και Aγωγιμότητα IV.3.δ. Legionella και Θερμοκρασία IV.3.ε. Legionella και Pseudomonas aeruginosa IV.3.στ. Legionella και Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 22 0 C IV.3.ζ. Legionella και Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C IV.3.η. Legionella και Σημεία Δειγματοληψίας IV.3.ι. Legionella και δείγματα ζεστού και κρύου νερού IV.4.1. Αποτελέσματα της αντίδρασης PCR για το γονίδιο mip IV.4.2. Αποτελέσματα της αντίδρασης PCR για το γονίδιο flaa IV.5. Αποτελέσματα της Αλληλούχισης και Φυλογενετικής ανάλυσης (Phylogenetic tree analysis) IV.6. Καταγραφή κρουσμάτων πνευμονίας V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ VI.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Περίληψη Abstract Παράρτημα Παράρτημα Παράρτημα Παράρτημα ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

12 11

13 I.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 12

14 I.3. Δημοσίευση σε ξένο περιοδικό 13

15 I.4. Δημοσίευση σε ελληνικό περιοδικό Λεγιονέλλα. Ένα αναδυόμενο υδατογενές παθογόνο;, Α. Φράγκου, Ι. Αλαμάνος, Α. Βανταράκης, περιοδικό Ιατρική, 98:40-52, Λεγιονέλλα : ένα αναδυόμενο υδατογενές παθογόνο; Α. Φράγκου, Ι. Αλαμάνος και Α. Βανταράκης Εργ. Υγιεινής, Ιατρική Σχολή, Παν/μιο Πατρών Υπεύθυνος αλληλογραφίας: Α. Βανταράκης, Εργ. Υγιεινής, Ιατρική Σχολή, Παν/μιο Πατρών, Τηλ/Fax: , avantar@med.upatras.gr ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Λεγιονέλλωση είναι μια λοιμώδης νόσος που αναγνωρίσθηκε το δεύτερο μισό του 20ου αιώνα. Προκαλείται από το βακτήριο Legionella με πιο συχνά απομονωμένο το βακτήριο Legionella pneumophila. Η σοβαρότητα της νόσου ποικίλει από μια ήπια εμπύρετη ασθένεια (Pontiac fever) μέχρι σοβαρής μορφής πνευμονία (Νόσος των Λεγεωνάριων) με σημαντική θνητότητα. Ομάδες υψηλού κινδύνου αποτελούν οι ηλικιωμένοι άνδρες, οι καπνιστές και οι ανοσοκατασταλμένοι. Το υδάτινο περιβάλλον αποτελεί την κυριότερη πηγή μόλυνσης. Η Λεγιονέλλα έχει ανιχνευθεί σε πολλά διαφορετικά φυσικά και τεχνητά υδάτινα περιβάλλοντα όπως σε πύργους ψύξης, στο δίκτυο πόσιμου νερού, σε ξενοδοχεία, σε νοσοκομεία, σε σπίτια, σε υδατόλουτρα, σε εργοστάσια, σε πλοία, σε συστήματα αναπνευστικής υποστήριξης, σε σιντριβάνια. Επίσης περίπου το 20% των περιστατικών Λεγιονέλλωσης που αναφέρονται στην Ευρώπη συσχετίζονται με τα ταξίδια. Η Λεγιονέλλα ανιχνεύεται ευρέως στο υδάτινο περιβάλλον και είναι απαραίτητος ο έλεγχος των δικτύων χρήσης ή της παροχής νερού για την πρόληψη της εμφάνισης επιδημιών της Νόσου των Λεγεωνάριων. Λέξεις ευρετηρίου: Λεγιονέλλα, υδατοσταγονίδια, επιδημιολογία, πνευμονία 14

16 I.5. Ομιλίες ως προσκεκλημένος ομιλητής Παρουσία και Επιδημιολογική διερεύνηση και μελέτη της διασποράς της Λεγιονέλλας στη Δυτική Ελλάδα, Αχαϊκές Ημέρες Παθολογίας 2011, 2-3 Απριλίου 2011, Συνεδριακό και Πολιτιστικό Κέντρο Πανεπιστημίου Πατρών. Διοργάνωση: Ιατρική Εταιρεία Δυτικής Ελλάδας Πελοποννήσου, ΙΕΔΕΠ. Επιδημιολογική διερεύνηση και μελέτη της διασποράς της Λεγιονέλλας στη Δυτική Ελλάδα, 1 ο Πανελλήνιο Συνέδριο του Φόρουμ Δημόσιας Υγείας & Κοινωνικής Ιατρικής, Νοεμβρίου Έλεγχος υδάτινων συστημάτων σε νοσοκομεία της Δυτικής Ελλάδας για ανίχνευση Λεγιονέλλας, Ελεύθερη ανακοίνωση, 9 0 Παμπελοποννησιακό Συνέδριο, Θέσεις και αντιθέσεις στην Ιατρική, Συνεδριακό και Πολιτιστικό Κέντρο Πανεπιστημίου Πατρών, Οκτωβρίου 2010, Πάτρα. 15 th Health Related Water Microbiology Symposium, Naxos Conference Center (Ecole d Ursulines) May 31- June , Naxos, Greece. Legionella spp: Νεοαναδυόμενο παθογόνο. Πρακτικό-θεωρητικό σεμινάριο: Μέθοδοι μικροβιολογικής ανάλυσης νερών,9-11 Νοεμβρίου 2009 και 6-8 Δεκεμβρίου 2010, Πάτρα. Διοργάνωση: Εταιρεία Μελέτης Μικροβιολογικής Ποιότητας Υδάτων, Εργαστήριο Υγιεινής, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών, Διεύθυνση Υγείας, Νομαρχιακή Αυτοδιοίκηση Αχαΐας. Legionella spp. Ημερίδα με θέμα: «Υγιεινή Ξενοδοχειακών Μονάδων», 8 Φεβρουαρίου 2009, Εθνικό Αθλητικό Κέντρο Πατρών Ολυμπιονίκης Δημήτριος Τόφαλος. Διοργάνωση: Ένωση Ξενοδόχων Νομού Αχαΐας, Εργαστήριο Υγιεινής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. Υπό την αιγίδα της Νομαρχιακής Αυτοδιοίκησης Αχαΐας και τη στήριξη του ΕΦΕΤ. «Legionella και απαιτήσεις των tour-operators». Ημερίδα με θέμα: «Τουρισμός και Υγιεινή. Απαραίτητη προϋπόθεση λειτουργίας Ένα εργαλείο επιτυχούς προβολής». Διοργάνωση: Περιφέρεια Δυτικής Ελλάδος, Εργαστήριο Υγιεινής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. Διαπιστευμένη αναλύτρια μικροβιολογικών αναλύσεων νερών και τροφίμων από το Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης, Ε.ΣΥ.Δ (Αρ.550). 15

17 II.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 16

18 II.1. Ιστορική Αναδρομή Η Legionella εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 1977 από το Κέντρο Πρόληψης και Ελέγχου ασθενειών (CDC), μετά από επιδημία πνευμονίας, που παρουσίασε μεγάλος αριθμός βετεράνων της Αμερικανικής Λεγεώνας, κατά την διάρκεια παρακολούθησης συνεδρίου το έτος 1976, στο ξενοδοχείο Bellevue Stratford στην Φιλαδέλφεια της Πενσυλβάνιας στις Η.Π.Α (Fraser et al 1977). Αναφέρθηκαν 221 κρούσματα πνευμονίας, εκ των οποίων 34 κατέληξαν σε θάνατο. Η επιδημιολογική διερεύνηση των κρουσμάτων κατέληξε στο συμπέρασμα πως ένα βακτήριο ήταν υπεύθυνο για την επιδημία, που αργότερα ονομάστηκε Legionella pneumophila (AWT 2003). Το όνομα Legionella το πήρε προς τιμήν των βετεράνων της Αμερικάνικης Λεγεώνας που επλήγησαν, ενώ το όνομα pneumophila έχει ελληνική ρίζα, που σημαίνει προτίμηση στους πνεύμονες. Ετεροχρονισμένα, ανασύροντας από την τράπεζα κατεψυγμένων ορών, δείγματα ιστών 50 ετών από αρρώστους με την ίδια συμπτωματολογία, αποκαλύφθηκε πως και τότε ο αιτιολογικός παράγοντας ήταν η Legionella, ενώ περαιτέρω ανάλυση των δειγμάτων οδήγησε στην ταυτοποίηση των υποομάδων Legionella, όπως Legionella micdadei, Legionella pneumophila και Legionella bozemanii (McDade 2002). Η Νόσος των Λεγεωνάριων μέχρι εκείνη την χρονική στιγμή ήταν άγνωστη, οπότε επρόκειτο για μια παλιά ασθένεια που όμως αναγνωρίσθηκε μόλις το 1976 (Fang et al 1989). Πραγματοποιήθηκαν συμπληρωματικές έρευνες, για να εξακριβωθεί η αιτία κάποιων επιδημιών που μέχρι τότε παρέμενε άγνωστη. Η πρώτη επιδημία πνευμονίας, με 81 ασθενείς και 14 θανάτους, κατά την οποία τα κρούσματα είχαν μολυνθεί με το βακτήριο Legionella pneumophila εμφανίστηκε το 1965 στο νοσοκομείο St.Elizabeth στην Ουάσιγκτον (Lowry et al 1993). Η δεύτερη ανεξακρίβωτη επιδημία πνευμονίας ήταν στην Ισπανία το 1973 και η τρίτη το 1974 στο ίδιο ξενοδοχείο της Φιλαδέλφειας που είχε ξεσπάσει το 1976 και η επιδημία της Αμερικάνικης Λεγεώνας. Κάποια σποραδικά κρούσματα της νόσου είχαν εμφανιστεί την χρονιά του 1943, του 1947 και του 1959 (Brenner 1987). Η Legionella είναι ένα Gram αρνητικό αερόβιο βακτήριο το οποίο ανιχνεύεται στο υδάτινο περιβάλλον (Fields et al 2002). Ο όρος «Νόσος των Λεγεωνάριων» καθορίζει την πνευμονία που προκαλούν τα είδη της Legionella, ενώ ο όρος Legionellosis αναφέρεται στα κλινικά σύνδρομα που προκαλούνται από το βακτήριο του γένους Legionella. Ο πυρετός Pontiac αναφέρεται σε μια ήπιας μορφής τύπου γρίπης, βραχείας διάρκειας. Η Legionella προκαλεί οξεία βακτηριακή λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος με θνητότητα 10-15% (EWGLI 2003). 17

19 II.2. Ταξινόμηση Από τότε που αναγνωρίστηκε η Νόσος των Λεγεωνάριων, ο χαρακτηρισμός των στελεχών που απομονώθηκαν από διάφορους ασθενείς οδήγησε στην δημιουργία ενός νέου βακτηριακού γένους, Legionella, το οποίο ανήκει στην οικογένεια Legionellaceae (Brenner et al 1979). Ορισμένοι ερευνητές είχαν προτείνει την κατάταξη της σε τρία ξεχωριστά είδη, Legionella, Fluoribacter και Tatlockia, βασιζόμενοι της μειωμένης ικανότητας υβριδοποίησης DNA μεταξύ κάποιων στελεχών Legionella (Fox&Brown 1993). Περαιτέρω αναλύσεις απέδειξαν πως αποτελεί μοναδική οικογένεια, διότι ο βαθμός συσχέτισης των ειδών Legionellae είναι μεγαλύτερος του 95% (Fry et al 1991). Πίνακας II.2.1: Φυλογενετική Ταξινόμηση (Πηγή: Brenner et al 1979) Βασίλειο Φύλο Ομοταξία Υφομοταξία Οικογένεια Γένος Είδη Φυλογενετική Ταξινόμηση Βακτήρια Πρωτεοβακτήρια γ- Πρωτεοβακήρια Legionellales Legionellaceae Legionella pneumophila, bozenanii κτλ. Η συγγένεια του DNA μεταξύ των στελεχών του είδους, στο γένος Legionella, είναι ασυνήθιστα υψηλή (>90%), ενώ η συγγένεια του DNA μεταξύ ενός είδους με άλλο, είναι μικρότερη του 70% (Brenner 1986). Η ολοκληρωμένη χρήση των φυλογενετικών και φαινοτυπικών χαρακτήρων είναι απαραίτητη για την οριοθέτηση των βακτηριακών taxa σε όλα τα επίπεδα (Murray et al 1990). Φυλογενετικά, το είδος που σχετίζεται με την οικογένεια Legionellaceae είναι το Coxiella burnettii, που είναι ο αιτιολογικός παράγοντας του Πυρετού Q (Swanson et al 2000). Η οικογένεια Legionellaceae και η Coxiella burnettii, έχουν παρόμοιους ενδοκυτταρικούς κύκλους ζωής και ίσως έχουν κοινά γονίδια που σχετίζονται με την διαδικασία μόλυνσης των ξενιστών τους. Με την πάροδο του χρόνου, ο αριθμός των ειδών και των υποομάδων της οικογένειας Legionellaceae συνεχώς αυξάνεται. Το πιο αντιπροσωπευτικό είδος του γένους Legionella είναι η Legionella pneumophila, διότι ήταν από τα πρώτα είδη που χαρακτηρίστηκαν. Μέχρι στιγμής, το γένος Legionella περιλαμβάνει τουλάχιστον 50 είδη, τα οποία περιλαμβάνουν 70 ξεχωριστές 18

20 υποομάδες (Drozanski 1991, Hookey et al 1996, Fields et al 2002, La Scola et al 2004). Συγκεκριμένα η L.pneumophila περιλαμβάνει 16 υποομάδες, τις περισσότερες συγκριτικά με τα άλλα είδη. Tα είδη L.bozemanii, L.longbeachae, L.feeleii, L.hackeliae, L.sainthelensi, L.spiritensis, L.erythra, και L.quinlivanii περιλαμβάνουν δύο υποομάδες το καθένα, ενώ τα υπόλοιπα είδη περιλαμβάνουν από μία υποομάδα το καθένα. Τα είδη και οι υποομάδες τους, που σχετίζονται με κλινικά περιστατικά αναφέρονται στον πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας II.2.2: Τα είδη Legionella και οι υποομάδες που σχετίζονται με κλινικά περιστατικά Είδη Legionella Υποομάδες Συσχέτιση με κλινικά Βιβλιογραφία (Legionella spp.) περιστατικά L. adelaidensis 1 Άγνωστη Benson et al 1996, Benson & Fields 1998 L. anisa 1 Ναι Bornstein et al 1989a, Fenstersheib et al 1990, Thacker et al 1990 L. beliardensis 1 Άγνωστη Lo Presti et al 2001 L. birminghamensis 1 Ναι Wilkinson et al 1987 L. bozemanii 2 Ναι Boldur et al 1985, Bornstein et al 1987, Bazovska & Spalekova 1994 L. brunensis 1 Άγνωστη Wilkinson et al 1988 L. busanensis 1 Άγνωστη Park et al 2003 L. cherrii 1 Άγνωστη Brenner et al 1985, Edelstein & Edelstein 1989 L. cincinnatiensis 1 Ναι Thacker et al 1988, Jernigan et al 1994, Spieker et al 1998 L. drozanskii 1 Άγνωστη Adeleke et al 2001 L. dumoffii 1 Ναι Edelstein & Pryor 1985, Fang et al 1989 L. drancourtii 1 Άγνωστη La Scola et al 2004 L. erythra 2 Ναι Brenner et al 1985, Saunders et al 1992, Fields et al 2002 L. fairfieldensis 1 Άγνωστη Thacker et al 1991 L. fallonii 1 Άγνωστη Adeleke et al 2001 L. feeleii 1 Ναι Herwaldt et al 1984 L. geestiana 1 Άγνωστη Dennis et al

21 Είδη Legionella Υποομάδες Συσχέτιση με κλινικά Βιβλιογραφία (Legionella spp.) περιστατικά L. genomospecies 1 1 Άγνωστη Benson et al 1996a L. gormanii 1 Ναι Lode et al 1987, Griffith et al 1988 L. gratiana 1 Άγνωστη Bornstein et al 1989b L. gresilensis 1 Άγνωστη Lo Presti et al 2001 L. hackeliae 2 Ναι Wilkinson et al 1985, Brenner et al 1985 L. israelensis 1 Άγνωστη Bercovier et al 1986, Sonesson et al 1994 L. jamestowniensis 1 Άγνωστη Wilkinson et al 1990, Brenner et al 1985 L. jordanis 1 Ναι Cherry et al 1982 L. lansingensis 1 Ναι Thacker et al 1992 L. londiniensis 2 Άγνωστη Dennis et al 1993 L. longbeachae 2 Ναι McKinney et al 1981, Boldur et al 1985, Chereshsky & Bettelheim 1986, Eitrem, et al 1987, Lode et al 1987 L. lytica (comb. nov.) 1 Άγνωστη Birtles et al 1996 L. maceachernii 1 Ναι Brenner et al 1985, Merrell et al 1991 L. micdadei 1 Ναι Hebert et al 1980 L. moravica 1 Άγνωστη Wilkinson et al 1988 L. nautarum 1 Άγνωστη Dennis et al 1993 L. oakridgensis 1 Ναι Orrison et al 1983, Tang et al 1985 L. parisiensis 1 Ναι Lo Presti et al 1997 L. pneumophila 16 Ναι Brenner et al 1985, Yu 2000 L. quateirensis 1 Άγνωστη Dennis et al 1993 L. quinlivanii 2 Άγνωστη Benson et al., 1989; Birtles et al 1991, Wilkinson et al 1990 L.rowbothamii 1 Άγνωστη Adeleke et al 2001 L. rubrilucens 1 Άγνωστη Brenner et al., 1985; Saunders, Doshi & Harrison, 1992 L. sainthelensi 2 Ναι Benson et al 1990 L. santicrucis 1 Άγνωστη Brenner et al 1985, Lee et al., 1993 L. shakespearei 1 Άγνωστη Verma et al 1992 L. spiritensis 2 Άγνωστη Brenner et al 1985, L. steigerwaltii 1 Άγνωστη Brenner et al 1985, Edelstein & Edelstein, 1989 L. taurinensis 1 Άγνωστη Lo Presti et al., 1999 L. tusconensis 1 Ναι Thacker et al 1989 L. wadsworthii 1 Ναι Edelstein, 1982 L. waltersii 1 Άγνωστη Benson et al 1996b L. worsleiensis 1 Άγνωστη Dennis et al

22 Στην Ευρώπη, η L.pneumophila υποομάδα 1 (sg1), προκαλεί περίπου το 70% των λοιμώξεων από το βακτήριο, ενώ το 20-30% προκαλούνται από άλλες υποομάδες. Ένα μικρό ποσοστό 5-10% προκαλούνται από μη pneumophila είδη Legionella (Joseph 2002a). Οι περισσότερες λοιμώξεις που οφείλονται σε άλλα είδη Legionella εκτός της L. pneumophila είναι πνευμονικής φύσεως και εμφανίζονται μετά από έκθεση του ανθρώπινου οργανισμού στο βακτήριο (Fang et al 1989). Αναφορές δείχνουν πως η μόλυνση οφείλεται σε 60% στην L.micdadei, σε 15% L.bozemanii, σε 10% στην L.dumoffi, σε 5% στην L.longbeachae και σε 10% σε άλλα είδη Legionella (Reingold et al 1984, Fang et al 1989). Υπό κατάλληλες συνθήκες τα περισσότερα είδη Legionella, που μπορούν να αναπτυχθούν σε θερμοκρασία σώματος, είναι σε θέση να προκαλέσουν λοιμώξεις στον ανθρώπινο οργανισμό (Fields 1996). Λόγω έλλειψης των κατάλληλων διαγνωστικών μεθόδων, οι λοιμώξεις που οφείλονται σε άλλα είδη, εκτός της L.pneumophila, δεν μπορούν να ανιχνευθούν πλήρως (Fields et al 2002). Υπάρχουν ορισμένα βακτήρια που αναπτύσσονται μόνο στο εσωτερικό των αμοιβάδων, συνδέονται φυλογενετικά με είδη Legionella και ονομάζονται Legionella-like amoebal pathogens (LLAPs). Οι εν λόγω οργανισμοί έχουν απομονωθεί και χαρακτηρισθεί. Ο ρόλος αυτών των βακτηρίων, ως παθογόνο, στον ανθρώπινο οργανισμό είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Στο παρελθόν απομονώθηκε οργανισμός LLAPs από τα πτύελα ασθενούς με πνευμονία και θεωρήθηκε ανθρώπινο παθογόνο (Fry et al 1999, Marrie et al 2001). Η απομόνωση τέτοιων οργανισμών είναι αρκετά δύσκολη, διότι δεν μπορούν να καλλιεργηθούν με τις συνήθεις καλλιεργητικές μεθόδους του βακτηρίου Legionella με αποτέλεσμα να υπάρχουν και άλλα παθογόνα στελέχη LLAPs. Μετά από μελέτες, τρία στελέχη LLAPs, ονομάστηκαν είδη Legionella (Adeleke et al 2001, La Scola et al 2004). II.3. Μορφολογία και Μικροβιολογία Όλα τα είδη της Legionella είναι ραδβόμορφα, Gram αρνητικά βακτήρια (Εικόνα II.3.1). Πρόκειται για βακτήρια που δεν έχουν κάψουλα και δεν σχηματίζουν σπόρια, με φυσικές διαστάσεις, πλάτος 0,3-0,9μm και μήκος 2-20μm. Σε κάποιες περιπτώσεις, όπως σε πρόσφατα ανεπτυγμένες καλλιέργειες παράγουν κοκκοβάκιλους, μήκους περίπου 2-6 μm και σε πιο ώριμες καλλιέργειες μπορούν να παράγουν νηματοειδής μορφές μήκους πάνω από 20 μm. Πρόκειται για αερόβια, ετεροτροφικά βακτήρια που δίνουν αρνητική αντίδραση ουρεάσης και θετική αντίδραση καταλάσης. Τα βακτήρια της Legionella χρησιμοποιούν τα αμινοξέα, τον άνθρακα, 21

23 και οργανικές χημικές ουσίες για ενέργεια, ενώ δεν οξειδώνουν και δεν ζυμώνουν τους υδατάνθρακες (Garrity 2005). Η L.pneumophila έχει συνήθως περιορισμένη κινητικότητα και ορισμένα στελέχη είναι απολύτως μη κινητικά (Harrizon&Taylor 1988). Τα περισσότερα είδη εμφανίζουν κινητικότητα μέσω ενός η περισσοτέρων πολικών ή πλευρικών βλεφαρίδων Το βακτήριο L.pneumophila έχει ένα ή δύο πολικές βλεφαρίδες και η παρουσία βλεφαριδοφόρων βακτηρίων εξαρτάται από την θερμοκρασία. Σε θερμοκρασίες από 30 C έως 37 C ή σε θερμοκρασία 41 C παρατηρείται μείωση του ποσοστού παρουσίας βλεφαριδοφόρων βακτηρίων Legionella, στο συνολικό πληθυσμό βακτηρίων (Ott et al 1991). Εικόνα II.3.1: Σχηματική περιγραφή βακτηρίου Legionella Σε αντίθεση με άλλα υδρόβια βακτήρια, η Legionella pneumophila χρειάζεται άλατα σιδήρου και το αμινοξύ L-κυστείνη για να αναπτυχθεί εργαστηριακά σε θρεπτικά υλικά. Σε κάποιες περιπτώσεις, απομονωμένα κλινικά στελέχη τριών ειδών Legionella, (L.jordanis, L.akridgensis και L.spiritensis), μπορούν να αναπτυχθούν και χωρίς την παρουσία του αμινοξέος L-κυστείνη (Orrizon et al 1983). Η ιδιότητα αυτή αναπτύσσεται όταν ένα βακτήριο, που έχει απελευθερωθεί από ένα μολυσμένο ξενιστή, μολύνει έναν δεύτερο ξενιστή. Αυτό συμβαίνει λόγω μιας μετάλλαξης των γονιδίων του βακτηρίου, απαραίτητη για την επιβίωσή της. Ωστόσο, ακόμα και τα βακτήρια που δεν εξαρτώνται από την παρουσία L-κυστείνης για την ανάπτυξη τους, αναπτύσσονται καλύτερα σε θρεπτικά υλικά που περιέχουν το αμινοξύ. Όπως έχει αναφερθεί, πρόκειται για Gram αρνητικά (-) βακτήρια με λεπτό κυτταρικό τοίχωμα (Εικόνα II.3.2). Κατά την διαδικασία χρώσης παρατηρείται ελαφριά χρώση αν χρησιμοποιηθεί σαφρανίνη. Κατά πάσα πιθανότητα η χαρακτηριστική αυτή ιδιότητα, οφείλεται 22

24 στην σύσταση του κυτταρικού τοιχώματος, το οποίο αποτελείται από μεγάλο αριθμό διακλαδισμένων λιπαρών οξέων και από ουβικινόνες με πλευρικές αλυσίδες 9-14 μονάδων ισοπροπενίου (Moss et al 1977, Lambert&Moss 1989). Η Gram χρώση, από μόνης της είναι ασαφής ακόμα και όταν χρησιμοποιείται σε δείγματα προερχόμενα από στείρες περιοχές όπως βρογχικές εκκρίσεις, βιοψίες από πνεύμονα και πλευρικά υγρά. Τα βακτήρια σε αυτές τις εκκρίσεις, όταν χρησιμοποιείται φουκίνη για την χρώση, εμφανίζονται ως μικροί Gram αρνητικά, ράβδοι διαφόρων διαστάσεων. Εικόνα II.3.2: Αριστερά, τρισδιάστατη απεικόνιση του βακτηρίου Legionella. Δεξιά, Χρώση Gram της Legionella pneumophila II.4. Κύκλος ζωής Πολλές μελέτες έχουν δείξει πως ο βαθμός παθογένειας του βακτηρίου είναι άμεσα συνδεδεμένος με την οικολογία του. Πρώτος ο Rowbotham απέδειξε πως η L.pneumophila μπορεί να μολύνει αμοιβάδα και ο Horwitz s με κλασσικές τεχνικές απέδειξε πως μπορεί επίσης να πολλαπλασιαστεί ενδοκυτταρικά σε μακροφάγα (Rowbotham 1980, Horwitz 1983). Ο κύκλος ζωής της Legionella είναι παρόμοιος σε πρωτόζωα και σε μακροφάγα. Βέβαια υπάρχουν κάποιες διαφορές όσο αναφορά τον μηχανισμό εισόδου και εξόδου του βακτηρίου από το αντίστοιχο είδος κυττάρου-ξενιστή. Αυτές οι διαφορές αναφέρονται περιληπτικά στην εικόνα II.4.1. Έχει διαπιστωθεί από μελέτες πως δεν μπορούν όλα τα είδη να μολύνουν τα μακροφάγα. Ωστόσο η L.pneumophila, διαθέτοντας τους παράγοντες τοξικότητας, μπορεί να μολύνει και να αναπαραχθεί σε διάφορα πρωτόζωα, που βρίσκονται στο χώμα και στο νερό (Cianciotto 2001). 23

25 Εικόνα II.4.1: Ο κύκλος ζωής του βακτηρίου L.pneumophila σε πρωτόζωα και σε μακροφάγα (Πηγή: Fields et al 2002) Ο κύκλος ζωής του βακτηρίου έχει δύο ξεχωριστές φάσεις. Μία κυτταρική φάση, κατά την οποία τα βακτήρια έχουν χαμηλή ή ανύπαρκτη τοξικότητα, χωρίς κινητικότητα και μία φάση μετάδοσης. Η μολυσματική φάση συμβαίνει μετά από ένα μετασχηματισμό του βακτηρίου κατά τον οποίο τα βακτήρια μορφολογικά είναι παχύ, κοντοί βλεφαριδοφόροι ράβδοι, ευαίσθητα στο νάτριο, ανθεκτικά και δεν διαθέτουν την ικανότητα να αναπαραχθούν (Steinert et al 2002, Swanson 2007). Σε αυτό το στάδιο είναι κινητικά λόγω της αύξησης των μαστίγιων και εμφανίζουν και τοξικότητα στον ξενιστή τους. Όταν βρίσκονται σε αυτό το στάδιο αναζητούν κάποιο κύτταρο ξενιστή προκειμένου να το μολύνουν. Όταν τα βακτήρια βρουν κάποιο κύτταρο ξενιστή εισέρχονται στο φαγόσωμα με την διαδικασία της φαγοκυττάρωσης (McCoy 2005). Ωστόσο, μόνο τα μολυσματικά στελέχη μπορούν να πολλαπλασιαστούν στο εσωτερικό των φαγοκυττάρων, αναστέλλοντας επίσης την σύντηξη του φαγοσώματος με το λυσόσωμα (Horwitz 1993). Αυτό οδηγεί στον θάνατο των μακροφάγων και στην απελευθέρωση από το κύτταρο, μεγάλου αριθμού βακτηρίων Legionella. Στην συνέχεια τα βακτήρια μπορούν να μολύνουν άλλα μακροφάγα. 24

26 Με αυτό τον τρόπο τα βακτήρια εμποδίζουν την βακτηριοκτόνο δράση των φαγοκυττάρων και μετατρέπουν το φαγόσωμα σε τόπο κατάλληλο για την αναπαραγωγή τους (Stout&Yu 1997, Fields et al 2002). Ο συνολικός χρόνος πολλαπλασιασμού στο κύτταρο ξενιστή είναι μόλις 48 ώρες (McCoy 2005). Τα βακτήρια μπορούν να αφήσουν το κύτταρο ξενιστή αφού έχουν αναπαραχθεί και έχουν προκαλέσει την λύση του κυττάρου (Molmeret&Abu Kwaik 2002) ή μπορούν να παραμείνουν στο εσωτερικό της αμοιβάδας (Rowbotham 1986). Εικόνα II.4.2: Στάδιο αντιγραφής του γενετικού υλικού του βακτηρίου Legionella pneumophila Η Legionella μπορεί να μολύνει μεγάλο αριθμό πρωταρχικών κυττάρων ξενιστών, πιο αναλυτικά, 14 είδη αμοιβάδας, 2 είδη βλεφαριδοφόρων πρωτόζωων και ένα είδος μύκητα (Fields et al 2002). Μερικά κύτταρα ξενιστές που φιλοξενούν το βακτήριο μπορούν να προκαλούν μολύνσεις, όπως το Acanthamoebae που προκαλεί κερατίτιδα και το Naegleria fowleri που προκαλεί θανατηφόρο μηνιγγοεγκεφαλίτιδα (Wynter-Allison et al 2005, CDC 1992a, CDC 2003, Cogo et al 2004, CDC 1986, CDC 1987). Η παθογένεια της Legionella pneumophila έχει δευκρινιστεί με την ταυτοποίηση των γονιδίων εκείνων που επιτρέπουν στο βακτήριο να παρακάμψει τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια των μακροφάγων και πρωτόζωων. Οι μελέτες έδειξαν πως δεν διαθέτουν όλα τα είδη αυτή την ικανότητα. Μελετώντας τον κύκλο ζωής 6 είδων Legionella σε κυτταρικές σειρές Αφρικάνικων πράσινων ποντικιών, διαπιστώθηκε πως όλα τα είδη διέφεραν μορφολογικά, που σημαίνει πως τα διάφορα είδη του βακτηρίου μπορεί να διαφέρουν στον τρόπο λειτουργίας κατά την ενδοκυτταρική αναπαραγωγή (Ogawa et al 2001). 25

27 Εικόνα II.4.3: Ο κύκλος ζωής του βακτηρίου L.pneumophila II.5. Μοριακή Γενετική Μέχρι σήμερα, τέσσερις τύποι γονιδιωμάτων διαφορετικών στελεχών του είδους L.pneumophila έχουν δημοσιευθεί, η L.pneumophila στελέχη Paris και Lens (Cazalet et al 2004), L.pneumophila στέλεχος Philadelphia (Chien et al 2004) και L.pneumophila στέλεχος Corby (Steinert et al 2007). Έχει διαπιστωθεί πως το στέλεχος Paris προκαλεί σε παγκόσμια κλίμακα επιδημία και σποραδικές περιπτώσεις της Νόσου των Λεγεωνάριων (Cazalet et al 2008). Το στέλεχος Lens είναι ένα επιδημικό στέλεχος υπεύθυνο για την επιδημία της Γαλλίας το 2004, με 87 περιστατικά και 17 θανάτους (Nhu Nguyen et al 2006). Το στέλεχος Philadelphia απομονώθηκε και αναγνωρίσθηκε από την πρώτη επιδημία πνευμονίας το 1976 στην Philadelphia (McDade et al 1977). Η απομόνωση του στελέχους Corby, έγινε από μια περίπτωση πνευμονίας και αποτελεί λοιμογόνο στέλεχος (Jepras et al 1985). Οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των στελεχών έχουν μελετηθεί,ώστε να γίνεται γνωστό πότε οι αλληλουχίες ανήκουν ή όχι σε συγγενικά στελέχη. Παρατηρήθηκαν δύο φυλογενετικές ομάδες, η μία περιλαμβάνει τα στελέχη Corby και Paris ενώ η άλλη περιλαμβάνει τα στελέχη Philadelphia και Lens. Το γονιδίωμα των 4 στελεχών της L.pneumophila που αλληλουχήθηκε, 26

28 περιλαμβάνει ένα ενιαίο κυκλικό χρωμόσωμα, ενώ τα στελέχη Paris και Lens περιλαμβάνουν ένα πλασμίδιο επιπλέον. Τα γενικά χαρακτηριστικά αυτών των γονιδιωμάτων, (Πίνακας II.5.1), αποκαλύπτουν πολύ παρόμοιο μέγεθος μεταξύ των στελεχών της τάξης των 3,3 Mb (για το στέλεχος Lens) έως 3,5 Mb (για τα στελέχη του Paris και Corby). Συγκριτικά με άλλα ενδοκυτταρικά παθογόνα, όπως η Bartonella, Rickettsia ή Chlamydia spp. το γονιδίωμα της L.pneumophila, είναι αρκετά μεγάλο συγκριτικά με άλλα, γεγονός που σημαίνει και μεγαλύτερο αριθμό γονιδίων, αντικατοπτρίζοντας την ικανότητα της να επιβιώνει σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες και σε διαφορετικούς ξενιστές (Saenz et al 2007, Thomson et al 2008). Είναι αξιοσημείωτο ότι και στα 4 στελέχη υπάρχουν οι χρωμοσωμικές περιοχές, οι οποίες μπορούν είτε να αποκοπούν είτε να διατηρηθούν σαν πλασμίδια (Cazalet et al 2004, Chien et al 2004, Glockner et al 2008). Τα κύρια χαρακτηριστικά από την ανάλυση του γονιδιώματος είναι τα παρακάτω. α) υψηλή πλαστικότητα των γονιδιωμάτων, καθώς έχουν αναγνωρισθεί αρκετά μεταθετά στοιχεία, μεταθετά γονίδια και παθογενετικές νησίδες (pathogenecity islands). β) έχει αναγνωρισθεί μια μεγάλη ομάδα πρωτεϊνών με υψηλή ομοιότητα με τις πρωτεΐνες των ευκαρυωτικών κυττάρων (ELPs-eukaryotic like proteins) ή πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν περιοχές, τυπικές για του ευκαρυωτικούς οργανισμούς (EDPs-eukaryotic domain proteins). To γεγονός ότι τα ELPs και EDPs είναι παρόντα και διατηρημένα και στα 4 στελέχη του βακτηρίου οδηγεί στο συμπέρασμα ότι είναι σημαντικά για τον κύκλο ζωής της Legionella pneumophila καθώς και για την εξέλιξή της (Albert-Weissenberger et al 2007).. 27

29 Εικόνα II.5.1: Φυλογενετικές σχέσεις των στελεχών Legionella, σύμφωνα με την ανάλυση Bayesian με συνδυασμό των rnpb, mip, 16S rrna και rpob γονιδιακών αλληλουχιών (Rubin et al 2005) 28

30 Πίνακας II.5.1: Γενικά χαρακτηριστικά του γονιδιώματος της L.pneumophila (τα στοιχεία της παρένθεσης αντιπροσωπεύουν το γενετικό υλικό των πλασμιδίων ) ( Πηγή : Gomez Valero L. et al 2009) Paris Lens Philadelphia Corby Chromozone size (Kb) 3504 (0.131) 3345 (0.060) G + C content (%) 38.3 (37.4) 38.4 (38) G + C content of SDS (%) No. of genes a 3136 (142) 3001 (57) No. of protein coding genes a 3027 (139) (56) Percentage of CDS (pb) Average length of CDS (pb) No. of 16S/23S/5S 3/3/3 3/3/3 3/3/3 3/3/3 No. Transfer RNA Plasmids a Updated annotation; CDS= coding sequence II.6. Οικολογία -Γενικά Η μελέτη της οικολογίας της Legionella, δηλαδή του τρόπου που αλληλεπιδρά με το φυσικό περιβάλλον και με άλλα είδη, βοηθά στην κατανόηση των παραγόντων εκείνων που ευνοούν την ανάπτυξη και την επιβίωση του βακτηρίου σε τεχνητά συστήματα νερού. Η Legionella βρίσκεται παντού στο φυσικό υδάτινο περιβάλλον αλλά και στα τεχνητά συστήματα νερού. Μπορεί να επιβιώσει σε ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών συνθηκών (Fliermans et al 1981). Τα βακτήρια είναι ανθεκτικά σε όξινες συνθήκες και μπορούν να αντέξουν για μικρά χρονικά διαστήματα σε ph 2.0. Το βακτήριο έχει απομονωθεί στο περιβάλλον σε συνθήκες ph, που κυμαίνεται από 2.7 έως 8.3 (Anand et al 1983, Sheehan et al 2005). Η Legionella έχει βρεθεί σε ποικίλες υδάτινες πηγές, σε υπόγεια νερά,στα φυτά σε τροπικά δάση, ακόμα και σε θαλασσινό νερό (Riffard et al 2001, Brooks et al 2004, Ortiz- Roque&Hazen 1987). Το βακτήριο επιβιώνει ακόμα και σε τεχνητά συστήματα αλμυρού νερού (Heller et al 1998). Σε κάποιες ξεχωριστές περιπτώσεις, όπως σε υπόγεια νερά θερμοκρασίας χαμηλότερης των 20 0 C, το βακτήριο μπορεί να βρίσκεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις και η ανίχνευση του είναι δύσκολη με τις καλλιεργητικές μεθόδους. 29

31 II.7. Επίδραση θερμοκρασίας Η επίδραση της θερμοκρασίας στην επιβίωση του βακτηρίου είναι σημαντική. Έχει απομονωθεί σε συστήματα ζεστού νερού θερμοκρασίας έως και 66 0 C. Σε θερμοκρασίες πάνω από 70 C τα βακτήρια καταστρέφονται σχεδόν ακαριαία (Dennis et al 1984, Dennis, 1988b). Μελέτες απέδειξαν πως μειώθηκε ο πληθυσμός των βακτηρίων σε θερμοκρασίες πάνω από 44 0 C-45 0 C, ενώ η θερμοκρασία των C με C αποτελεί την ανώτερη θερμοκρασία ανάπτυξης του βακτηρίου (Kusnetsov et al 1996). Διάφορες μελέτες των στελεχών του βακτηρίου L.pneumophila έδειξαν πως ο χρόνος που απαιτείται για να σκοτωθεί το 90% του πληθυσμού των βακτηρίων σε μια σταθερή θερμοκρασία και υπό σταθερές συνθήκες, είναι λεπτά στην θερμοκρασία των 50 C και 2 λεπτά στους 60ºC (Dennis et al 1984, Schulze-Robbecke at al 1987). Τονίζεται ιδιαίτερα πως η θερμοκρασία του νερού αποτελεί έναν κρίσιμο παράγοντα στον αποικισμό, στον πολλαπλασιασμό και στον κίνδυνο μόλυνσης. του βακτηρίου στα συστήματα νερού. Είναι σχετικά εύκολο να απομονωθούν περιβαλλοντικά στελέχη από πολλές υδάτινες πηγές σε θερμοκρασίες μεταξύ 30 C και 70 C (Fliermans 1984). Για παράδειγμα, έχουν απομονωθεί στελέχη βακτηρίου από παγωμένα ποτάμια, λίμνες, θερμικές πηγές, ακόμα και από πηγές που βρίσκονται κοντά σε ηφαίστειο (Tison&Seidler 1983). Η L.pneumophila επιβιώνει και αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες μεταξύ 25 C και 45ºC και η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης είναι μεταξύ 32ºC-42ºC (Yee 1982). Οι μελέτες έδειξαν πως η πιο συχνή θερμοκρασία απομόνωσης στελεχών Legionella ήταν μεταξύ 35ºC και 45ºC, ενώ η μεγαλύτερη ανάπτυξη των βακτηρίων παρατηρήθηκε στις θερμοκρασίες μεταξύ 37ºC και 42 C (Wadowsky&Yee 1983, Schulze-Robbecke et al 1987). Καθώς η θερμοκρασία πέφτει κάτω από τους 37ºC μειώνεται ο ρυθμός αναπαραγωγής των βακτηρίων και κάτω από τους 20ºC υπάρχει μικρή ή καθόλου αύξηση των βακτηρίων. Τα βακτήρια μπορούν να επιβιώσουν για μεγάλο χρονικό διάστημα σε χαμηλές θερμοκρασίες και αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται όταν η θερμοκρασία αυξάνεται. Η L.pneumophila είναι αρκετά θερμοανθεκτική και είναι ικανή να επιβιώσει για αρκετές ώρες σε θερμοκρασίες της τάξης των 50 C (Yu 2000). Η ανάπτυξή του βακτηρίου μπορεί να ενισχυθεί με την παρουσία CO 2 συγκέντρωσης 2.5%-5%, ενώ σε συγκεντρώσεις CO 2 πάνω από 10% προκαλείται αναστολή ανάπτυξης του βακτηρίου (EPA 1985, Winn 1993). 30

32 II.8. Παρασιτισμός Πρόκειται για προαιρετικά ενδοκυττάρια παράσιτα και πρώτος ο Rowbotham ανέφερε την σχέση μεταξύ αμοιβάδας και L.pneumophila (Rowbotham 1980). In vitro μελέτες, έχουν επανειλημμένα δείξει ενδοκυττάριο πολλαπλασιασμό των βακτηρίων L.pneumophila στο εσωτερικό αμοιβάδων (Acanthamoeba, Echinamoeba, Hartmannella, Naegleria, Vahlkampfia, Dictyostelium) και σε βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα (Tetrahymena) (Πίνακας II.8.1) (Fields 1996 Fields et al 1984, Hägele et al 2000, Rowbotham 1980a). Το παθογόνο αναπτύσσεται επίσης σε συνδυασμό με ορισμένα κυανοβακτήρια (Tison et al 1980, Wadowsky&Yee 1983). Τα πρωτόζωα αποτελούν σημαντικούς φορείς για την επιβίωση και την ανάπτυξη του βακτηρίου σε φυσικά και τεχνητά συστήματα, ενώ έχουν ανιχνευθεί σε περιβάλλον που αποτελεί κύρια πηγή της νόσου. Ωστόσο, δεν μπορούν να γίνουν όλα τα είδη αμοιβάδας ξενιστές του βακτηρίου, γεγονός που αποδεικνύει πως εμπλέκεται ένας βαθμός εξειδίκευσης του ξενιστή. Η L.pneumophila στο φυσικό περιβάλλον πολλαπλασιάζεται ενδοκυττάρια στο εσωτερικό ορισμένων πρωτόζωων, πιθανώς παράγοντας πρωτεάσες με κυτταροτοξική δράση και προκαλώντας έτσι τοπική καταστροφή των ιστών (Quinn et al 1989). Από την στιγμή που έχει προσληφθεί από μία αμοιβάδα, η επιβίωση της L.pneumophila εξαρτάται από την θερμοκρασία του νερού. Σε θερμοκρασία 22 C, αφομοιώνονται από την αμοιβάδα και σε θερμοκρασία 35 C μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέσα σε αυτήν (Nagington&Smith 1980, Rowbotham 1980). Η παρουσία φλεβαρίδων έχει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια πολλών μικροοργανισμών συμπεριλαμβάνοντας και τα βακτήρια, Pseudomonas aeruginosa και Salmonella. Έχει διαπιστωθεί πως τα βακτήρια της Legionella τα οποία δεν έχουν βλεφαρίδες είναι λιγότερο ικανά στο να μολύνουν πρωτόζωα και μακροφάγα από ότι τα βλεφαριδοφόρα βακτήρια (Heuner&Steinert 2003). Τα διάφορα πρωτόζωα επίσης προστατεύουν την Legionella από την επίδραση των βιοκτόνων ουσιών και από την θερμική απολύμανση (Barker et al 1992, Storey et al 2004a). Αυτή η προστασία που παρέχουν τα πρωτόζωα, ίσως αποτελεί έναν μηχανισμό με τον οποίο η L.pneumophila μπορεί να επιβιώσει σε δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες και σε αερολύματα (Berendt 1980, Hambleton et al 1983, Tully 1991). 31

33 II.9. Συμβιωτικοί Οργανισμοί Από μελέτες σε καλλιεργητικά θρεπτικά υλικά, έχει γίνει γνωστό η συμβιωτική σχέση της Legionella με πολλά άλλα βακτήρια. Τα βακτήρια, Flavobacterium breve, Aeromonas, Pseudomonas vesicularis, P.paucimobilis, P.maltophilia, και Vibrio fluvalis ενισχύουν την ανάπτυξη της Legionella παρέχοντας το απαραίτητο αμινοξύ (κυστείνη) (Wadowsky&Yee 1983, Toze et al 1990). Έχει διαπιστωθεί πως η ανάπτυξη της Legionella σε καλλιεργητικά θρεπτικά υλικά αναστέλλεται από κάποια βακτήρια όπως, Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Flavobacterium meningosepticum, Pseudomonas aeruginosa και κάποια είδη των Staphylococcus and Bacillus (Paszko-Kolva et al 1993, Rowbotham 1983). Βέβαια, άλλες μελέτες δείχνουν πως τα φύκη, τα φλαβοβακτήρια και η Pseudomonas παρέχουν τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη της Legionella και πιο συγκεκριμένα η Pseudomonas aeruginosa ενισχύει τον πολλαπλασιασμό της Legionella pneumophila στο εσωτερικό των Naegleria lovaniensis και Acanthamoeba castellanii (Declerck et al 2005). Βέβαια υπάρχει και η αντίθετη άποψη, πως η Pseudomonas aeruginosa ανταγωνίζεται την Legionella για το ποια θα αναπτυχθεί. Παρά το γεγονός πως διάφορα βακτήρια ανταγωνίζονται την Legionella για τα θρεπτικά συστατικά, δεν έχει βρεθεί κάποιο βακτήριο που να την ανταγωνίζεται όσο αναφορά την εισαγωγή της σε κύτταρα ξενιστές (Declerck et al 2005). Πίνακας II.8.1: Πρωτόζωα, για τα οποία έχει αναφερθεί ενδοκυττάριος πολλαπλασιασμός του βακτηρίου Legionella spp. Κατηγορία Είδη Βιβλιογραφία Αμοιβάδα Βλεφαριδοφόρα Acantbamoeba castelanii Acantbamoeba culbestoni Acantbamoeba palestensis Acantbamoeba polyphaga Acantbamoeba royreba Balamuthia mandrillaris Echinamoeba exudans Hartmannella cantabrigiensis Hartmannella vermiformis Naegleria fowleri Naegleria gruberi Naegleria jadini Naegleria lovaniensis Vahlkampfia jugosa Tetrabymena pyriformis Tetrabymena thermophila Tetrabymena vorax Rowbotham, 1980 Miyamoto et al 2003 Anand et al.1983 Rowbotham 1980 Tyndall & Domingue 1982 Shadrach et al., 2005 Fields et al., 1989 Rowbotham, 1986 Rowbotham, 1986 Newsome et al 1985 Rowbotham 1980 Rowbotham 1980 Tyndall &Domingue 1982 Rowbotham 1986 Fields et al 1984 Kikuhara et al 1994 Smith-Somerville et al 1991 Μύκητες Dictyostelium discoedeum Hagele et al., 2000, Solomon et al

34 II.10. Βιομεμβράνη Είναι ήδη γνωστό πως σε οποιαδήποτε υγρή επιφάνεια και γενικά σε επιφάνειες που βρίσκονται σε άμεση επαφή με το νερό ή άλλα υγρά αναπτύσσεται μια λεπτή μεμβράνη, γνωστή ως βιομεμβράνη (biofilm). Η βιομεμβράνη βρίσκεται σε όλα τα τεχνητά και φυσικά συστήματα και σχηματίζεται με την εναπόθεση οργανικών και ανόργανων ουσιών στις επιφάνειες των σωληνώσεων και των τοιχωμάτων. Οι παράγοντες που ευνοούν την ανάπτυξη της βιομεμβράνης είναι η χημική σύσταση του νερού και των υλικών του συστήματος, η μεγάλη περιεκτικότητα του νερού σε άλατα, η παρουσία μικροβίων, η στασιμότητα ή η χαμηλή ροή του νερού, η θερμοκρασία και τέλος η ελλιπής συντήρηση του συστήματος. Σε οποιοδήποτε στάδιο δημιουργίας της μεμβράνης στο εσωτερικό των σωληνώσεων είναι δυνατόν με τις απότομες αλλαγές της πίεσης του νερού να αποκολληθεί τμήμα της μεμβράνης και να εξαπλωθεί σε άλλο σημείο του κυκλώματος του δικτύου (Εικόνα II.10.1). Το 1984 ανιχνεύθηκε η παρουσία της L.pneumophila στο εσωτερικό της βιομεμβράνης που βρίσκονταν σε συστήματα νερού από καουτσούκ (Colbourne et al 1984). Αργότερα αποδείχθηκε πως όντως η βιομεμβράνη αποτελεί την πιο προτιμώμενη εξωκυττάρια κατοικία της L.pneumophila (Armon et al 1997, Rogers&Keevil 1992). Διάφοροι μικροοργανισμοί όπως η Legionella και άλλα βακτήρια ενσωματώνονται στη βιομεμβράνη, όπου αναπτύσσεται με ταχύτατο ρυθμό. Αυτό αποτελεί ένα μηχανισμό με τον οποίο επιβιώνουν έναντι των αντίξοων συνθηκών, όπως η έλλειψη θρεπτικών συστατικών και οι ακραίες θερμοκρασίες, ενώ παράλληλα προστατεύονται από τις βιοκτόνες ουσίες. Οι περισσότερες μελέτες εστιάζουν στον πληθυσμό των οργανισμών που ζουν στο εσωτερικό της βιομεμβράνης (Colbourne et al 1984 Colbourne&Dennis 1985, Verissimo et al 1990, Storey et al 2004). Ωστόσο δεν έχουν προσδιοριστεί ακόμα, ορισμένοι οργανισμοί που ζουν στο εσωτερικό της καθώς επίσης παραμένει άγνωστη και η συμβολή αυτών των οργανισμών στην ανάπτυξη και στον πολλαπλασιασμό της Legionella. Τα είδη Legionella που αναπτύσσονται στην βιομεμβράνη είναι πιο ανθεκτικά από τα ίδια είδη που αναπτύσσεται στην υδάτινη φάση του συστήματος (Barker et al 1992, Cargill et al 1992, Surman et al 1993, Santegoeds et al 1998). Η διαθεσιμότητα των θρεπτικών ουσιών που παρέχονται στο εσωτερικό της βιομεμβράνης οδήγησε τους ερευνητές στο συμπέρασμα πως η βιομεμβράνη ενισχύει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό της Legionella έξω από το κύτταρο ξενιστή (Rogers&Keevil 1992, Surman et al 2002). Τα υψηλότερα ποσοστά ανάπτυξης στο εσωτερικό της βιομβράνης παρατηρήθηκαν για τα είδη L.pneumophila και L.longdeachae (Karpova 2008). Οι ερευνητές 33

35 χρησιμοποιώντας κάποια μοντέλα βιομεμβράνης προσπάθησαν να ανιχνεύσουν εξωκυτταρική ανάπτυξη της L.pneumophila, ωστόσο παρατηρήθηκε πως το βακτήριο δεν πολλαπλασιάζεται σε περίπτωση απουσίας αμοιβάδας (Murga et al 2001). Η πρόληψη της δημιουργίας βιομεμβράνης σε συστήματα είναι σημαντική, ενώ είναι απαραίτητη η αφαίρεση της από τα περίπλοκα συστήματα σωληνώσεων, έτσι ώστε να αποφευχθεί η μετάδοση της Legionella. Εικόνα II.10.1.: Διάγραμμα σχηματισμού και ανάπτυξης της βιομεμβράνης (Πηγή: Susanne Surman-Lee et al 2002 ) II.11. Άλλοι παράγοντες Αν και μέχρι στιγμής φαίνεται ξεκάθαρα πως η θερμοκρασία του νερού και η αλληλεπίδραση με άλλους μικροοργανισμούς, αποτελούν τους πιο σημαντικούς παράγοντες για την επιβίωση και την ανάπτυξη του βακτηρίου, υπάρχουν και κάποιοι άλλοι παράγοντες, όπως η παρουσία μετάλλων και ιζημάτων. Έχει διαπιστωθεί πως όταν ο πληθυσμός των βακτηρίων L.pneumophila αυξάνεται παράλληλα με την αύξηση της ποσότητας ιζήματος. Αυτό συμβαίνει διότι τα συστατικά του ιζήματος αποτελούν πηγή θρεπτικών συστατικών, που χρησιμοποιούνται ως τροφή από τα βακτήρια (Stout et al 1985). Η συγκέντρωση του ολικού οργανικού άνθρακα και η θολότητα αποτελούν επίσης παράγοντες που ενισχύουν την ανάπτυξη της Legionella. Η ύπαρξη ιζήματος σε ένα σύστημα νερού αποτελεί καταφύγιο για το βακτήριο, ενισχύει την ανάπτυξη μικροχλωρίδας και παρέχει 34

36 τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη του βακτηρίου (Vickers et al 1987). Απότομες αλλαγές της πίεσης του νερού στο δίκτυο ή αλλαγή του ρυθμού ροής προκαλεί αποκόλληση της βιομεμβράνης στο εσωτερικό των σωληνώσεων, εξάπλωση σε άλλο σημείο του δικτύου και αύξηση της συγκέντρωσης της Legionella στο σύστημα (Kramer&Ford 1994). Τα διάφορα άλατα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της καθώς επίσης και η παρουσία μεταλλικών κατιόντων, ασβεστίου και μαγνησίου (Vickers et al 1987). Τα χαμηλά επίπεδα σιδήρου, ψευδαργύρου και βαναδίου ίσως προκαλούν τον πολλαπλασιασμό της Legionella (Kusnetsov 1993, Stout et al 1992), ενώ αντίθετα υψηλά επίπεδα μετάλλων όπως χαλκού, σιδήρου, μαγγανίου και ψευδαργύρου μπορούν να καταστούν τοξικά για την ανάπτυξη της (Kusnetsov 1993). Το νερό από μόνο του, είναι ανεπαρκές για τον πολλαπλασιασμό της L.pneumophila και από μελέτες έχει αποδειχθεί πως σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό και σε αποστειρωμένο νερό βρύσης η L.pneumophila μπορεί να επιβιώσει για μεγάλο χρονικό διάστημα αλλά δεν μπορεί να πολλαπλασιαστεί (Skaliy&McEachern 1979, Fields et al 1984). Επομένως η ανάπτυξη του βακτηρίου απαιτεί διάφορα θρεπτικά συστατικά που υπάρχουν στο νερό της βρύσης. Αυτά τα συστατικά παρέχονται έμμεσα ή άμεσα από άλλους μικροοργανισμούς ή βακτήρια με την μορφή διαλυμένων οργανικών συστατικών ή μέσω διάσπασης των μικροοργανισμών (Tesh&Miller 1981, Yee&Wadowsky 1982, Stout et al 1985). Επομένως τα αμινοξέα αποτελούν τα κύρια θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη της L pneumophila (Pine et al 1979). II.12. Κλινική Εμφάνιση-Γενικά Η ασθένεια της Legionellosis παρουσιάζεται με δύο διαφορετικές μορφές: Η πρώτη μορφή και η πιο σοβαρή είναι η Νόσος των Λεγεωνάριων, που προκαλείται συνήθως από το βακτήριο Legionella pneumophila και εκδηλώνεται με οξεία εμπύρετη συνδρομή και αναπνευστική ανεπάρκεια. Η βαρύτητα της ασθένειας ποικίλει από ήπια έως και θανατηφόρα έκβαση. Η θνητότητα σε άτομα χωρίς ανοσοκαταστολή να κυμαίνεται από 5% έως 25%. Η δεύτερη μορφή είναι η ασθένεια τύπου γρίπης που ονομάζεται Pontiac πυρετός (Glick et al 1978). Συχνά η μόλυνση μπορεί να συνέβη ασυμπτωματικά διότι πολλά άτομα εμφανίζουν αντισώματα έναντι του βακτηρίου χωρίς ιστορικό νόσου (Boshuizen et al 2001). 35

37 II Νόσος των Λεγεωνάριων Η Νόσος των Λεγεωνάριων δεν παρουσιάζει κάποια χαρακτηριστικά συμπτώματα και πρόκειται για μία άτυπη μορφή συνδρόμου. Οποιοσδήποτε που εκτίθεται στο μικρόβιο θα εμφανίσει τα συμπτώματα της νόσου (Yu et al 1982, Macfarlane et al 1984, Roig et al 1991, Sopena et al., 1998, Ruiz et al 1999, Gupta et al 2001). Ωστόσο υπάρχουν κάποια κλινικά συμπτώματα που σχετίζονται περισσότερο με την Νόσο των Λεγεωνάριων. Στον παρακάτω πίνακα καταγράφονται τα πιο κοινά συμπτώματα της Νόσου των Λεγεωνάριων και του Pontiac πυρετού (Πίνακας II.12.1). Πίνακας II.12.1: Κύρια χαρακτηριστικά συμπτώματα της Νόσου των Λεγεωνάριων και του Pontiac πυρετού. (Πηγή : Woodhead & Macfarlane 1987, Stout&Yu 1997, Yu 2000, Akbas&Yu 2001, Mülazimoglu&Yu, 2001) Χαρακτηριστικά Νόσος των Λεγεωνάριων Pontiac Πυρετός Περίοδος Επώασης 2-10 ημέρες Σπάνια μέχρι και 20 ημέρες 5 ώρες-3 ημέρες ( Συνήθως ώρες ) Χρονική Διάρκεια Εβδομάδες 2-5 ημέρες Περιστατικά Θνητότητα Μεταβλητή, ανάλογα με την επιδεκτικότητα, 40-80% σε Ενδονοσοκομειακά περιστατικά Καθόλου Θάνατοι Επίπτωση Συμπτώματα 0,1-5% στον γενικό πληθυσμό 0,4-14% σε Νοσοκομεία Συχνά μη συγκεκριμένα Υψηλός Πυρετός Αδυναμία Πονοκέφαλος Βήχας μη παραγωγικός Ρίγη Μυϊκός πόνος Αιμόπτυση, ορισμένες φορές Κοιλιακά άλγη Διάρροια (25-50% των περιπτώσεων) Δυσκολία στην αναπνοή Πόνο στο στήθος Εμετός, ναυτία (10-30% των περιπτώσεων) Παραλήρημα, σύγχυση ( 50% των περιπτώσεων) Νεφρική ανεπάρκεια Γαλακτική αφυδρογονάση >700units /ml Υπονατριαιμία Αποτυχία ανταπόκρισης σε αντιβιοτικά, αμινογλυκοσίδες ή β-λακτάμες >95% Γριππώδης συνδρομή Απώλεια δύναμης Κόπωση Υψηλός Πυρετός Ρίγη Μυαλγία, Αρθαλγία Πονοκέφαλος Διάρροια Εμετός, ναυτία (σε μικρό ποσοστό Ξηρός Βήχας Δύσπνοια Προκαλείται συνήθως από το είδος Legionella pneumophila, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να εμπλέκονται ένας ή περισσότεροι οργανισμοί, καταλήγοντας σε μια 36

38 πολλαπλής μορφή μικροβιακής λοίμωξη. Οι εμπλεκόμενοι οργανισμοί περιλαμβάνουν αερόβια και αναερόβια βακτήρια, ιούς και μύκητες (Roig&Rello 2003). Η μέση περίοδος επώασης της Νόσου των Λεγεωνάριων είναι 2-10 ημερών (WHO 2004). Βέβαια σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να επεκταθεί ξεπερνώντας και τις 10 ημέρες, όπως για παράδειγμα, σε μια επιδημιολογική μελέτη της νόσου στην Ολλανδία, με το 16% των περιπτώσεων να έχουν χρόνο επώασης μεγαλύτερο από 10 ημέρες, με μέσο όρο 7 ημέρες (Den Boer et al 2002, Lettinga et al 2002). Σε γενικές γραμμές ο καθένας μπορεί να προσβληθεί από την ασθένεια. Ωστόσο οι ομάδες υψηλού κινδύνου όπως τα ανοσοκατασταλμένα άτομα, τα νεογνά, οι ηλικιωμένοι, οι ασθενείς με χρόνιες παθήσεις του πνεύμονα, άτομα με εξασθενημένο ανοσοποιητικό σύστημα κινδυνεύουν περισσότερο από τη νόσο και τις επιπλοκές της. Έχει διαπιστωθεί πως άτομα ηλικίας 50 ετών και άνω, κυρίως άνδρες, καπνιστές και άτομα που βρίσκονται υπό αγωγή με κορτικοστεροειδή, όσοι πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη ή χρόνια πνευμονοπάθεια, νεοπλασματικά νοσήματα, νεφρική ανεπάρκεια και άτομα που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση οργάνων, υπάγονται στις ομάδες υψηλού κινδύνου να προσβληθούν από την Νόσο (Kourea-Kremastinou et al 2004). Επειδή η ακτινογραφία στους πνεύμονες δεν μπορεί να διαχωρίσει αν ο ασθενής έχει προσβληθεί από την Νόσο των Λεγεωνάριων ή από άλλες μορφές πνευμονίας, ο εργαστηριακός έλεγχος είναι απαραίτητος για τη διάγνωση ιδιαίτερα σε ομάδες υψηλού κινδύνου (Mülazimoglu&Yu 2001). Στην ακτινογραφία θώρακος μπορεί να συνεχίζουν να απεικονίζονται κάποιες ανωμαλίες για μεγάλο χρονικό διάστημα, ακόμα και όταν ο ασθενής εμφανίζει σημαντική βελτίωση της κλινικής εικόνας του. Αναφορές δείχνουν πως σε χρονικό διάστημα δώδεκα εβδομάδων εμφανίζεται καθαρή ακτινολογική εικόνα σε ποσοστό 60% (Macfarlane et al 1984, Stout&Yu 1997, Yu 2002). Η Νόσος των Λεγεωνάριων εάν δεν αντιμετωπιστεί άμεσα, μπορεί να επιδεινωθεί κατά την διάρκεια της πρώτης εβδομάδας και να αποβεί ακόμα και μοιραία. Οι συχνότερες επιπλοκές που μπορεί να δημιουργήσει στον ανθρώπινο οργανισμό είναι αναπνευστική ανεπάρκεια, οξεία νεφρική ανεπάρκεια, σοκ και πολλαπλή ανεπάρκεια οργάνων. Με την έγκαιρη θεραπεία, επέρχεται πλήρης αποκατάσταση του ασθενούς. Σε σοβαρές λοιμώξεις, υπάρχουν συχνά δευτερεύοντα συμπτώματα, όπως αδυναμία, κακή μνήμη και κόπωση, που μπορούν να διαρκέσουν για αρκετούς μήνες. Άλλα συμπτώματα, νευρολογικής φύσεως που μπορεί να προκύψουν είναι η υπολειπόμενη παρεγκεφαλική δυσλειτουργία με το συχνότερο σύμπτωμα, την παλινδρομική αμνησία (Baker et al 1981, Edelstein&Meyer 1984). 37

39 Τα πρώτα χαρακτηριστικά συμπτώματα της Νόσου είναι ανορεξία, αδιαθεσία και λήθαργος. Συχνά, οι ασθενείς μπορεί να αναπτύξουν και ένα μη παραγωγικό βήχα ήπιας μορφής. Περίπου το ήμισυ των ασθενών εμφανίζει πυώδη πτύελα και οξεία διάρροια και το περίπου το 1/3 των ασθενών εμφανίζουν αιμόπτυση. Ο πόνος στον θώρακα, πλευριτικός ή μη, είναι χαρακτηριστικό σύμπτωμα στο 30% των ασθενών και όταν συνδέεται με αιμόπτυση, ενδέχεται να εκληφθεί ως θρόμβοι αίματος στους πνεύμονες. Ο πυρετός εμφανίζεται σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις, ενώ ρίγη με πυρετό εμφανίζεται συνήθως από την πρώτη μέρα της νόσου. Σχεδόν το ήμισυ των ασθενών εμφανίζουν διαταραχές του νευρικού συστήματος όπως σύγχυση, παραλήρημα, κατάθλιψη, αποπροσανατολισμός και παραισθήσεις, που μπορεί να εμφανιστούν ακόμα κατά την πρώτη εβδομάδα της νόσου (Woodhead&Macfarlane1987, Stout&Yu 1997, Yu, 2000, Akbas&Yu 2001, Mülazimoglu&Yu 2001). Η πρόγνωση της νόσου εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την έγκαιρη και αξιόπιστη μικροβιολογική διάγνωση. Οι ερευνητές κατέληξαν πως δεν υπάρχει μια σαφής κλινική εμφάνιση της νόσου. Με βάση μόνο την κλινική εικόνα, είναι αδύνατο να διαχωριστεί το είδος πνευμονίας που προκαλείται από το βακτήριο Legionella, από την πνευμονία που προκαλείται από άλλους αιτιολογικούς παράγοντες (Edelstein 1993, Kourea-Kremastinou et al 2004). Το γεγονός αυτό καθιστά απαραίτητη την σαφή γνώση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των μεθόδων που χρησιμοποιούνται καθώς και του χρόνου που απαιτείται. Η θεραπεία της νόσου βασίζεται στην έγκαιρη χορήγηση των αντιβιοτικών που είναι αποτελεσματικά για την αντιμετώπιση του βακτηρίου. Η Legionella είναι ευαίσθητη σε ένα ευρύ φάσμα αντιμικροβιακών παραγόντων, αυτό βέβαια συμβαίνει όταν βρίσκεται εξωκυτταρικά. Ωστόσο, όταν ο μικροοργανισμός βρίσκεται στο εσωτερικό του κυττάρου ξενιστή, ο αντιμικροβιακός παράγοντας που είναι κλινικά χρήσιμος είναι αυτός που επιτυγχάνει υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις. Ως εκ τούτου, τα νέα φάρμακα πρέπει να εκτιμώνται βάση των παρακάτω: 1. Η ελάχιστη τιμή συγκέντρωσης ανασταλτικής δράσης έναντι των ειδών Legionella 2. Η δραστικότητα τους σε κυτταρικές καλλιέργειες 3. Μελέτες της δραστικότητας τους σε ζώα 4. Το κλινικό πλαίσιο Μέχρι σήμερα, έχει ολοκληρωθεί ένας μικρός αριθμός ελεγχόμενων κλινικών μελετών όσο αναφορά την θεραπεία της Νόσου των Λεγεωνάριων (Thornsberry et al 1978, Yoo et al 2004, Yu et al 2004). Μία μικρή κλινική μελέτη έδειξε ότι η θεραπεία με τα αντιβιοτικά fluoroquinolone pefloxacin παρέχει στους ασθενείς ένα υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης από ό, τι 38

40 η θεραπεία με ερυθρομυκίνη (Dournon et al 1990). Συνήθως χρησιμοποιούνται αντιβιοτικά που ανήκουν στην οικογένεια των κινολονών και στην οικογένεια των μακρολίδων. Η νέα κατηγορία αντιβιοτικών που ανήκουν στην κατηγορία των μακρολίδων, όπως η κλαριθρομυκίνη (clarithromycin) και αζιθρομυκίνη (azithromycin), παρουσιάζουν in-vitro δραστικότερη αποτελεσματικότητα και καλύτερη ενδοκυτταρική, διεισδυτική ικανότητα στους ιστούς από ότι η ερυθρομυκίνη. Η επίδραση των αντιβιοτικών που ανήκουν στην κατηγορία των κινολονών είναι ελάχιστα ευνοϊκότερη σε σύγκριση με την κατηγορία των μακρολίδων, αλλά το αποτέλεσμα είναι παρόμοιο (Pedro-Botet et al 2009). Αντιθέτως τα αντιβιοτικά που ανήκουν στην κατηγορία της β-λακτάμης, αν και είναι η πρώτη επιλογή για την θεραπεία της πνευμονιοκοκκικής πνευμονίας, δεν είναι αποτελεσματικά κατά της Νόσου των Λεγεωνάριων. Επίσης χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τα αντιβιοτικά που ανήκουν στην κατηγορία των μακρολίδων για την θεραπεία των ασθενών με σοβαρή πνευμονία. Η ριφαμπικίνη χορηγείται σε περιπτώσεις αντοχής στα άλλα αντιβιοτικά (NaTHNaC 2008). Στην περίπτωση που δεν χρησιμοποιούνται τα κατάλληλα διαγνωστικά τεστ για την Νόσο των Λεγεωνάριων, εφαρμόζεται άμεσα η συνδυαστική θεραπεία με τα αντιβιοτικά που ανήκουν στη οικογένεια των μακρολίδων και β-λακτάμη. Αυτό συμβαίνει διότι η καθυστέρηση για την εφαρμογή της κατάλληλης θεραπείας για την πνευμονία που προκαλείται από το βακτήριο Legionella, αυξάνει σημαντικά την θνησιμότητα (Stout&Yu 1997). II Pontiac Πυρετός Ο Pontiac πυρετός είναι μια οξεία, αυτοπεριοριζόμενη, γριππώδης συνδρομή και χαρακτηρίζεται ως μια μη πνευμονική συνδρομή με μηδενική θνητότητα (Alexiou 1990). Σε αντίθεση με την Νόσο των Λεγεωνάριων, ο Pontiac πυρετός έχει υψηλότερο ποσοστό προσβολής, φθάνοντας μέχρι και το 95% των εκτιθέμενων ατόμων (Glick et al 1978). Τα κύρια συμπτώματα των ασθενών είναι πυρετός (38 0 C-39 0 C) και μυαλγία (Πίνακας II.12.1). Ο χρόνος επώασης είναι ώρες και ο εργαστηριακός έλεγχος είναι φυσιολογικός. Οι ασθενείς, συνήθως σε μια εβδομάδα αναρρώνουν πλήρως, χωρίς να υποβληθούν σε θεραπεία. Ο Pontiac πυρετός έχει συσχετιστεί με είδη Legionella όπως η L.pneumophila, L.midadei, L.feeleii, L.anisa (Kourea- Kremastinou et al 2004). 39

41 II Εξωπνευμονικό σύνδρομο Η L.pneumophila μπορεί να εξαπλωθεί από το αναπνευστικό σύστημα σε όλο το ανθρώπινο σώμα μέσω της αιματογενούς διασποράς των βακτηρίων από τους πνεύμονες. Το βακτήριο της Legionella, από διάφορες νεκροτομικές μελέτες έχει ανιχνευθεί στο σπλήνα, το ήπαρ, τους νεφρούς, μυοκάρδιο, στον πεπτικό σωλήνα, στα οστά και στο μυελό των οστών, στις αρθρώσεις και στους λεμφαδένες στην βουβωνική περιοχή και κατά μήκος της θωρακικής κοιλότητας (Lowry&Tompkins 1993). Το βακτήριο εμπλέκεται σε περιπτώσεις φλεγμονών, παγκρεατίτιδας, περιτονίτιδας, και πυεολονεφρίτιδας, βέβαια εμφανίζεται συχνότερα σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς (Eitrem et al 1987, Stout&Yu 1997). Οι περιοχές που προσβάλλονται συχνότερα είναι η καρδιά. Η περίπτωση ενδοκαρδίτιδας από μόλυνση Legionella έχει αναφερθεί σπάνια, καθώς σε όλες τις αναφερόμενες περιπτώσεις οι ασθενείς είχαν μια προσθετική βαλβίδα (McCabe et al 1984, Chen et al 1996). Η Legionella σπάνια εξαπλώνεται στο νευρικό σύστημα (Shelburne et al 2004). Η εξέταση για ανίχνευση του βακτηρίου Legionella είναι απαραίτητη κατά την διάγνωση ασθενών που παρουσιάζουν ένα συνδυασμό νευρολογικών, καρδιολογικών και γαστρεντερικών συμπτωμάτων και κυρίως σε ασθενείς με πνευμονία (Shelburne et al 2004). Τα 4 είδη Legionella που ευθύνονται για την εκδήλωση εξωπνευμονικών λοιμώξεων είναι η L.micdadei, η L.jordanis, η L.dumoffiκαι και η L.pneumophila, η οποία αποτελεί το συχνότερο απομονωμένο βακτήριο (Lowry&Tompkins 1993). II.13. Μέθοδοι Ανίχνευσης-Γενικά Η μικροβιολογική διάγνωση της νόσου περιλαμβάνει μεγάλο φάσμα μεθόδων με ποικίλη ευαισθησία. Προκειμένου να βελτιωθούν οι διαγνωστικές μέθοδοι, κρίνεται απαραίτητη η διεξαγωγή εργαστηριακών κλινικών δοκιμών, από τα κατάλληλα μικροβιολογικά εργαστήρια. Παρά τις δυνατότητες των ανοσολογικών και μοριακών γενετικών μεθόδων, η διάγνωση της Νόσου των Λεγεωνάριων είναι κυρίως αποτελεσματική μόνο για την ανίχνευση της L.pneumophila υποομάδα 1 (sg1). Η εξειδίκευση και η ευαισθησία των διάφορων διαγνωστικών μεθόδων για τα υπόλοιπα είδη Legionella απέχει πολύ από την τελειότητα (Tartakovsky 2001). Βέβαια τα διαγνωστικά τεστ από το 1995 έως σήμερα, έχουν εξελιχθεί σε μεγάλο βαθμό. Η επιλογή της διαγνωστικής μεθόδου κάθε φορά και η αξιολόγηση των εξετάσεων απαιτεί συγκεκριμένες γνώσεις ενώ απαραίτητη κρίνεται η γνώση των μειονεκτημάτων και 40

42 πλεονεκτημάτων σε κάθε μια από αυτές. Τα δείγματα που απομονώνονται συχνότερα είναι αυτά που προέρχονται από την αναπνευστική οδό. Τα δείγματα από βιοψίες πνεύμονα, έχουν την μεγαλύτερη διαγνωστική απόδοση αλλά είναι και τα σπανιότερα. Βρογχοσκοπικά δείγματα έχουν μεγαλύτερη διαγνωστική απόδοση από τα δείγματα πτυέλων. Στα περισσότερα δείγματα χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα για την ανίχνευση πιθανών βακτηρίων L.pneumophila και L.longbeachae. II Καλλιεργητική μέθοδος Στο παρελθόν, πριν από την ανάπτυξη καλλιεργητικών υλικών in vitro, τα βακτήρια της Legionella, μπορούσαν να αναπτυχθούν από την απομόνωση τους από ινδικά χοιρίδια και αυγά ορνίθων (McDade et al 1977, Morris et al 1979). Η καλλιεργητική μέθοδος θεωρείται ως «ο χρυσός κανόνας» για την διάγνωση λόγω της μεγάλης ειδικότητας που παρουσιάζει η μέθοδος στην απομόνωση των ειδών Legionella. Η πρωτογενής απομόνωση του βακτηρίου πραγματοποιείται σε συγκεκριμένο είδος καλλιεργητικού υλικού, BCYE άγαρ (buffered charcoal yeast extract), που περιέχει το αμινοξύ L-κυστείνη. Στο υλικό αυτό μπορούν να προστεθούν διάφορα συμπληρώματα που μειώνουν την βακτηριακή χλωρίδα και τους μύκητες, αυξάνοντας έτσι την εκλεκτικότητα του έναντι των ειδών Legionella. Τα συμπληρώματα περιλαμβάνουν, BCYE-άγαρ με anisomycin (Dournon 1988), καλλιεργητικό υλικό BMPAα με cefamandole, polymixin Β, ή anisomycin (Edelstein 1981). Το εκλεκτικό συμπλήρωμα που χρησιμοποιείται περισσότερο από τα μικροβιολογικά εργαστήρια είναι το BCYE-άγαρ. Τα έμπειρα μικροβιολογικά εργαστήρια χρησιμοποιούν πολλαπλά καλλιεργητικά υλικά έτσι ώστε να επιτύχουν την καλύτερη απόδοση στην ανάπτυξη των βακτηρίων. Τα καλλιεργητικά τρυβλία επωάζονται σε θερμοκρασία 36 C (±1 0 C) για χρονικό διάστημα 14 ημερών και εξετάζονται κάθε δύο ή τρεις ημέρες. Η ανίχνευση μίας η περισσοτέρων αποικιών είναι αρκετή για την επιβεβαίωση της διάγνωσης. Στην περίπτωση όμως που οι ασθενείς έχουν λάβει αντιβιοτικά ή εάν το δείγμα προς ανάλυση είναι μολυσμένο με άλλους μικροοργανισμούς, τότε η εμφάνιση των αποικιών Legionella στο καλλιεργητικό υλικό μπορεί να καθυστερήσει (Stout&Yu 1997, Luck et al 2002). Βέβαια το βακτήριο έχει απομονωθεί καλλιεργητικά από δείγματα αίματος του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος ασθενούς μετά από αρκετές μέρες θεραπείας με ερυθρομυκίνη (Ingram&Plouffe 1994). Αξιοσημείωτο είναι πως στην πρώιμη φάση της Νόσου των Λεγωνάριων, ο μικρός αριθμός βακτηρίων που ζουν εκτός πνεύμονα και η 41

43 ανασταλτική επίδραση της χλωρίδας του στοματικής κοιλότητας, μειώνουν την ευαισθησία της καλλιεργητικής μεθόδου. Από την άλλη όμως, το σημαντικότερο πλεονέκτημα της καλλιεργητικής μεθόδου είναι η ικανότητα ανίχνευσης όλων των ειδών Legionella. Πρακτικά η αξία της μεθόδου υποβαθμίζεται λόγω του μεγάλου χρόνου επώασης (8-10 μέρες), της ειδικής εμπειρίας που απαιτεί και της χρήσης εκλεκτικών υλικών (Stout 2000, Yu et al 1992, Stout&Yu 1997, Waterer 2001). Η διαγνωστική ευαισθησία της καλλιεργητικής μεθόδου εξαρτάται από την σοβαρότητα της ασθένειας. Σε ήπιες περιπτώσεις πνευμονίας φθάνει το 15%-25%, ενώ σε περιπτώσεις σοβαρής πνευμονίας ακολουθουμένη με αναπνευστική ανεπάρκεια, μπορεί να φθάσει και το 95%. Η καλλιεργητική μέθοδος είναι σημαντική για την διάγνωση της νόσου ιδιαίτερα σε νοσοκομειακές λοιμώξεις, σε ανοσοκοτατασταλμένους ασθενείς, σε περιπτώσεις που η νόσος οφείλεται σε άλλα είδη Legionella, εκτός της L.pneumophila υποομάδα 1 (sg1) και σε ασθενείς με σοβαρή πνευμονία. II Μοριακές Μέθοδοι Διάφορες μοριακές μέθοδοι είναι διαθέσιμες για γονοτυπικές αναλύσεις των κλινικών και των περιβαλλοντικών στελεχών Legionella. Οι κυρίως χρησιμοποιούμενες τεχνικές είναι η AFLP (Amplified fragment length polymorphism), PFGE (Pulsed field gel electrophoresis), Mab (monoclonal antibody typing), RFLP (Restriction fragment length polymorphism) και MLST (Multilocus sequence typing). Η επιλογή της μεθόδου εξαρτάται κάθε φορά από το δυναμικό του εργαστηρίου. Σε σύγκριση με τις μεθόδους DNA based-fragment (π.χ AFLP, PFGE, ή RFLP), η μέθοδος που στηρίζεται στην αλληλουχία DNA (όπως η τεχνική MLST), είναι πιο ισχυρή, αυτοδύναμη και παρέχει την δυνατότητα αναπαραγωγής των αποτελεσμάτων επιτρέποντας στα εργαστήρια να ανταλλάσουν μεταξύ τους πληροφορίες (Kourea-Kremastinou et al 2004, Scaturro 2005). Επιπλέον ο συνδυασμός δύο ή και περισσότερων τεχνικών αυξάνει την διακριτική ικανότητα. Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, γνωστή ως αντίδραση PCR, χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του DNA του βακτηρίου σε πτύελα, αίμα και ούρα. Αποτελεί ένα καλό εργαλείο για την ανίχνευση λοιμώξεων που προκαλούνται από τα γνωστά είδη Legionella. Διάφορες δοκιμές PCR έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση του βακτηρίου, χρησιμοποιώντας ειδικές DNA αλληλουχίες για την Legionella pneumophila, (Starnbach et al 1989), όπως το γονίδιο 5S rrna (MacDonell&Colwell 1987, Mahbubani et al 1990), το γονίδιο 16S rrna (Lisby&Dessau 42

44 1994, Miyamoto et al 1997), ή το γονίδιο mip (Engleberg et al 1989, Mahbubani et al 1990, Ramirez et al 1996). Η ανίχνευση του DNA του βακτηρίου μπορεί να γίνει και σε άλλα δείγματα αλλά με χαμηλότερη ευαισθησία (30%-86%). Η ευαισθησία της μεθόδου σε κλινικά δείγματα από το κατώτερο αναπνευστικό σύστημα είναι ίση ή μεγαλύτερη με εκείνη της καλλιεργητικής μεθόδου. Η μέθοδος παρέχει αποτελέσματα σε σύντομο χρονικό διάστημα και ανιχνεύει όλα τα είδη και υποομάδες του βακτηρίου Legionella. Έχουν αναφερθεί ψευδώς θετικά αποτελέσματα τόσο σε in-house μεθόδους όσο και σε εμπορικές μεθόδους. Αρκετές έρευνες αναφέρουν την χρήση της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης σε Πραγματικό Χρόνο (Real Time PCR), για την ταχεία ανίχνευση των ειδών Legionella σε κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα (Herpers et al 2003, Yanez et al 2005). Η ταχύτητα και η άμεση ποσοτικοποίηση της μεθόδου Real Time PCR μπορεί να προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι της καλλιεργητικής και άλλων μοριακών τεχνικών. Ωστόσο η καλλιεργητική μέθοδος υπήρξε η καλύτερη μέθοδος ανίχνευσης πολλαπλών ειδών Legionella σε ιστό πνευμόνων (Hayden et al 2001). Βέβαια από την άλλη πλευρά η τεχνική της Real Time PCR σε συνδυασμό με την τεχνική ανοσομαγνητικού διαχωρισμού αποτελεί μια ακριβή και ευαίσθητη μέθοδο για την ταχεία ποσοτικοποίηση της Legionella pneumophila σε δείγματα νερού (Yanez et al 2005). Η μέθοδος Real Time PCR είναι αρκετά ευαίσθητη και μπορεί να αποτελέσει την καλύτερη μέθοδο ανίχνευσης του βακτηρίου σε περιβαλλοντικά δείγματα και σε δείγματα από τεχνητά συστήματα νερού δεδομένου ότι δεν υπάρχουν άλλα βακτήρια που να παρεμβαίνουν στην ανίχνευση του βακτηρίου στόχου. II Άλλες μέθοδοι Η μικροσκοπική μέθοδος του άμεσου ανοσοφθορισμού DFA, (Direct Immunofluorescence Assay), είναι μια ταχεία μέθοδος ανίχνευσης του βακτηρίου σε βρογχικές εκκρίσεις και σε ιστολογικά δείγματα. Παρόλο που είναι γρήγορη, έχει περιορισμένη ευαισθησία και απαιτεί μεγάλο αριθμό βακτηρίων για την απεικόνιση. Η ευαισθησία της μεθόδου ποικίλλει αλλά είναι σταθερά μικρότερη από εκείνη της καλλιεργητικής. Επιπλέον απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό με ειδική εμπειρία. Η μέθοδος ανίχνευσης του άμεσου ανοσοφθορισμού μπορεί να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω των διασταυρούμενων αντιδράσεων με άλλα βακτήρια και μύκητες. Τα περισσότερα εργαστήρια έχουν περιορίσει την χρήση της μεθόδου DFA λόγω των προβλημάτων που παρουσιάζει (Edelstein 2007, Murdoch 2003). 43

45 H πιο αξιόλογη εναλλακτική μέθοδος όσο αφορά την μικροβιολογική διάγνωση της νόσου αποτελεί η μέθοδος ταχείας ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης (ICT, Binax Now Legionella Urinary Antigen) κατά την οποία πραγματοποιείται η ανίχνευση του αντιγόνου τoυ βακτηρίου Legionella υποομάδα 1 στα ούρα. Τα αντιγόνα που ανιχνεύονται στα ούρα αποτελούν συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου της Legionella και ανιχνεύονται ήδη από την πρώτη ημέρα μετά την έναρξη των συμπτωμάτων και μπορεί να παραμείνουν για μήνες παρά την θεραπευτική αγωγή. Τα δύο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα τεστ που έχουν εξαιρετική ευαισθησία και ειδικότητα όσο αναφορά την L.pneumophila υποομάδας 1 (sg1), είναι το ICT Binax Now Legionella Urinary Antigen και το EIA Binax Legionella Urinary Antigen EIA. Η ευαισθησία της μεθόδου EIA Binax φθάνει το 70%-90%, ενώ η ειδικότητά της μπορεί να φθάσει και το 100% για την ανίχνευση L.pneumophila (sg1) (Murdoch 2003, Stout&Yu 1997, Yzerman 2002). Η μέθοδος ICT Binax είναι απλή, δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό, ούτε ιδιαίτερη εμπειρία, ενώ έχει παρόμοια ευαισθησία και ειδικότητα με αυτή της EIA Binax. Η μέθοδος ICT Binax δίνει αποτελέσματα εντός 15 λεπτών και η μέθοδος EIA Binax εντός 3 λεπτών. Σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου είναι πως το αποτέλεσμα δεν επηρεάζεται από τη λήψη αντιβιοτικών. Βασικό μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί το γεγονός ότι αφορά αποκλειστικά τη L.pneumophila υποομάδας 1 (sg1), καθώς η ευαισθησία για τα είδη εκτός από τους L.pneumophila υποομάδας 1 φθάνει μόλις το 29-31%. Ειδικότερα, δεν έχει εμπορική διαθεσιμότητα για την αξιόπιστη ανίχνευση της L.longbeachae στα ούρα. Το μειονέκτημα αυτό δεν υποβαθμίζει την αξία της μεθόδου, δεδομένου πως η L.pneumophila υποομάδας 1 (sg1), ευθύνεται για το 90% των περιπτώσεων (Stout 2000, Yu et al 1992). Στην διεθνή βιβλιογραφία δεν υπάρχουν αναφορές, όσο αναφορά την εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα άλλα εκτός των ούρων. Εξαίρεση αποτελούν δύο αναφορές, μία για ανίχνευση αντιγόνου Legionella σε βρογχικές κρίσεις άνδρα θετικού για HIV και μία παλαιότερη περίπτωση ανίχνευσης αντιγόνου σε πλευριτικό υγρό με ραδιομετρική μέθοδο. Η ευρύτερη χρησιμοποιούμενη μέθοδος αποτελεί ο ορολογικός έλεγχος με προσδιορισμό των αντισωμάτων IgG και IgM. Η τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού IFA (Indirect immunofluorescent assays) και η τεχνική ELISA ή EIA (enzyme-linked immunosorbent assays), αποτελούν τις συχνότερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές για τον ορολογικό έλεγχο ανίχνευσης του βακτηρίου. Η IFA αποτελεί πρότυπη δοκιμή αναφοράς και είναι έγκυρη για την L.pneumophila και την L.longbeachae. Η μέθοδος βασίζεται στην ορομεταστροφή, με τετραπλασιασμό του τίτλου αντισωμάτων. Όταν ο τίτλος αντισωμάτων είναι 1/128 δείχνει πρόσφατη ή παρελθούσα μόλυνση. Τίτλος 44

46 αντισωμάτων ίσος ή μεγαλύτερος με 1/152 είτε για L.pneumophila είτε για την L.longbeachae αποτελεί δείκτη ευαισθησίας της μεθόδου, αλλά βέβαια μπορεί να αποτελέσει και παρελθούσα μόλυνση ή σε σπάνιες περιπτώσεις μόλυνση από κάποια άλλα είδη. Η αξία της μεθόδου είναι αναδρομική λόγω του μεγάλου χρονικού διαστήματος (3-10 εβδομάδες). Ο προσδιορισμός τόσο των αντισωμάτων IgG και όσο και των IgM είναι απαραίτητος για την χρήση της μεθόδου, ενώ επίσης ένα σημαντικό ποσοστό (13%-40%) των ασθενών με αποδεδειγμένη λοίμωξη δεν αναπτύσσουν ανιχνεύσιμα αντισώματα. Πίνακας II.13.1: Σύγκριση διάφορων διαγνωστικών μεθόδων για την ανίχνευση του βακτηρίου Legionella (Πηγή: Murdoch 2003) Διαγνωστικά τεστ Προέλευση Δείγματος Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%) Εργαστηριακός Χρόνος Σχόλια Καλλιεργητική Μέθοδος Αναπνευστικό σύστημα (Πτύελα& Βρογχικές εκκρίσεις ) <10-80 * ημέρες Ανιχνεύει όλα τα είδη και τις υποομάδες. Είδη (εκτός L.pneumophila) ανιχνεύεται μετά από 10 ημέρες επώασης. Μέθοδος Άμεσου Ανοσοφθορισμού (DFA) Αναπνευστικό σύστημα (Πτύελα& Βρογχικές εκκρίσεις ) * >95 <4 ώρες Τεχνική Υψηλών Απαιτήσεων Λιγότερη Ευαισθησία σε καλλιέργεια Ανίχνευση Αντιγόνου (EIA, ICT) Ούρα >95 <3 ώρες Αξιόπιστη μόνο για την ανίχνευση της L.pneumophila sg 1 ) PCR (Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης) PCR (Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης) Αναπνευστικό σύστημα (Πτύελα& Βρογχικές εκκρίσεις ) Ορός Ούρα >90 <4 ώρες Ανίχνευση όλων των ειδών και υποομάδων >90 >90 Ορολογική Εξέταση Ορός > εβδομάδες Εξέταση δειγμάτων (από ασθενείς με οξεία φλεγμονή ασθενείς που έχουν αναρρώσει) Παραπλανητική ερμηνεία ενός μόνο δείγματος * Εξαρτάται από την σοβαρότητα της νόσου 45

47 II.14. Μετάδοση της Νόσου των Λεγεωνάριων Τα πιο πολλά στοιχεία που αναφέρονται για τη μετάδοση της νόσου προκύπτουν κυρίως από διάφορες επιδημιολογικές μελέτες. Το βακτήριο της Legionella μεταφέρεται από το περιβάλλον στον ανθρώπινο οργανισμό. Μια οποιαδήποτε υδάτινη πηγή, όπως ένα σιντριβάνι, η οποία είναι μολυσμένη με το βακτήριο μπορεί να δημιουργήσει μικρά υδατοσταγονίδια (διαμέτρου 1-5μm), που συνήθως αναφέρονται ως αερολύματα. Τα αερομεταφερόμενα υδατοσταγονίδια είναι αρκετά μικρά, με αποτέλεσμα να εισπνέονται από κάποιον ευαίσθητο ξενιστή. Σωματίδια που έχουν διάμετρο μικρότερη από 5μm, εισπνέονται σε βάθος στο αναπνευστικό σύστημα και εισέρχονται στους αναπνευστικούς αεραγωγούς προκαλώντας Legionellosis (Fitzgeorge et al 1983). Επίσης το βακτήριο μπορεί να κατατεθεί σε ανώτερες αναπνευστικές οδούς και στην συνέχεια να αναρροφηθεί σε κατώτερα τμήματα του πνεύμονα. Οι ερευνητές, με πολλές αντιπαραθέσεις, δείχνουν μεγάλο ενδιαφέρουν στον μηχανισμό με τον οποίο το βακτήριο φθάνει στο κατώτερο αναπνευστικό σύστημα του ανθρώπου, όπου εκεί ξεκινά η παθολογική διαδικασία μόλυνσης του βακτηρίου. Συχνά, επικρατεί η εσφαλμένη αντίληψη ότι οι καταιονιστήρες (ντουζιέρες) είναι η μοναδική πηγή για την πρόκληση ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων. Ωστόσο διάφορες εκροές συστημάτων νερού, οι υγραντήρες και οι συσκευές αναπνευστικής υποστήριξης, μπορούν να διασπείρουν τα βακτήρια της Legionella και έχουν αναφερθεί ως η πηγή της μόλυνσης σε αρκετές περιπτώσεις (Arnow et al 1982, Moiraghi et al 1987, Brady 1989, Mastro et al 1991, Woo et al 1992). Οι μεγαλύτερες επιδημίες της Νόσου έχουν συσχετισθεί με την εισπνοή αερολυμάτων προερχόμενα από πύργους ψύξης, βιομηχανικούς εξοπλισμούς εσωτερικά θεάματα με νερό όπως συντριβάνια και βρύσες ζεστού νερού (Den Boer et al 2002, Garcia-Fulgueiras et al 2003, Greig et al 2004). Έχουν αναφερθεί και άλλα συστήματα που εμπλέκονται στην μετάδοση της νόσου μέσω αερολυμάτων, όπως τα οικιακά συστήματα ύδρευσης, οι φυσικές ιαματικές πηγές, οι πισίνες υδρομαλάξεων (spa) ακόμα και συσκευές δημιουργίας υδατοσταγονιδίων σε επιδείξεις τροφίμων (Singh et al 2002, WHO 2004, Mahoney et al 1992, Sommese et al 1996, Alim et al 2002, Brady 1989, Martinelli et al 2001, Vogiannis et al 2004). Διάφορες μελέτες με ρινογαστρική διασωλήνωση σε περιστατικά ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων έδειξαν πως για την λοίμωξη ευθύνεται το μολυσμένο, με βακτήρια Legionella, νερό που είχε εισέρθει στο εσωτερικό του ασθενούς (Marrie et al 1991, Blatt et al 1994, Stout&Yu 1997). Ωστόσο σε μια άλλη περίπτωση ενδονοσοκομειακής λοίμωξης δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο κατά μήκος του οισοφαγικού σωλήνα (Pedro-Botet et al 2002). Οι ασθενείς που πάσχουν από ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις 46

48 της Νόσου των Λεγεωνάριων είναι πολύ πιο πιθανό να είχαν υποστεί διασωλήνωση για μεγάλο χρονικό διάστημα ή να είχαν υποστεί τοποθέτηση ενδοτραχειακού σωλήνα (Strebel et al 1988, Kool et al 1998, Winston 1998). II.15. Παρουσία του βακτηρίου σε υπόγεια ύδατα Το υδάτινο περιβάλλον αποτελεί το φυσικό περιβάλλον επιβίωσης και ανάπτυξης του βακτηρίου. Παρά το γεγονός ότι η παροχή νερού πολλών εκατομμυρίων ανθρώπων σε όλο τον κόσμο στηρίζεται σε υπόγειους υδρόφορους ορίζοντες, λίγα είναι γνωστά για την παρουσία του βακτηρίου της Legionella σε αυτά. Τα ευρήματα από δείγματα νερού και βιομεμβράνης που ελήφθησαν από διάφορες πηγές υπόγειων υδάτων έδειξαν παρουσία του βακτηρίου, αν και ο αριθμός των αποικιών παρουσίασε μεγάλες διακυμάνσεις (Riffard et al 2001). Τα είδη Legionella που απομονώθηκαν από υπόγεια νερά, σύμφωνα με μια μελέτη επτά ετών ήταν η L.pneumophila, η L.oakridgensis, η L.sainthelensi και η L.londiniensis (Costa et al 2005). Πρόσφατη έρευνα σε Καναδά και Η.Π.Α απομόνωσε το βακτήριο Legionella από νερό και βιομεμβράνη (29,1% και 28,2% αντίστοιχα) προερχόμενα από υπόγεια ύδατα, χωρίς όμως να είναι γνωστό ότι υπήρχε άμεση συσχέτιση με επιφανειακά ύδατα. Το βακτήριο απομονώθηκε από κρύα και ζεστά υπόγεια νερά, με τα περισσότερα στελέχη να επωάζονται σε θερμοκρασία 30 0 C από την συνηθισμένη θερμοκρασία ανάπτυξης των 35 0 C. Τα είδη της Legionella που εντοπίστηκαν περιλαμβάνουν γνωστά παθογόνα είδη του βακτηρίου αλλά και είδη που δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί ως ανθρώπινα παθογόνα. Το βακτήριο είναι ευρέως διαδεδομένο στα υπόγεια ύδατα και έχει την δυνατότητα διασποράς σε δημόσια συστήματα παροχής νερού. (Brooks et al 2004). Σε αντίθεση με μελέτες και αναφορές που αποδεικνύουν την παρουσία του βακτηρίου σε υπόγεια ύδατα, υπάρχουν και μελέτες που δεν ανίχνευσαν το βακτήριο σε υπόγεια νερά. Παράδειγμα αποτελεί μια παλιά μελέτη σε δείγματα νερού προερχόμενα από πηγάδια, στα οποία δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο της Legionella (Campo et al 1988). II.16. Παρουσία του βακτηρίου σε αέρα Η παρουσία του βακτηρίου εκτός από το υδάτινο περιβάλλον είναι γνωστή και στον αέρα με την μορφή αερολύματος (Fields et al 2002, Taylor et al 2009, Alexiou 1990). Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις κατά τις οποίες η πηγή της μόλυνσης ήταν αερόλυμα μολυσμένο με το βακτήριο, το 47

49 οποίο προέρχονταν από απόσταση 200 μέτρων. Βέβαια έχει αναφερθεί και περίπτωση που η απόσταση του αερολύματος έφθανε ακόμα και τα 3,2 χιλιόμετρα.. Επίσης έχει διαπιστωθεί πως οι μετεωρολογικές συνθήκες που επικρατούν στο περιβάλλον, όπως υγρασία, συννεφιά ομίχλη, παίζουν σπουδαίο ρόλο στην μεταφορά του αερολύματος. Κάποιες φορές οι συνθήκες αυτές μπορεί να ευνοήσουν την διασπορά του αερολύματος σε μεγάλες αποστάσεις (Taylor et al 2009). II.17. Παρουσία του βακτηρίου σε χώμα Αναφορές έδειξαν πως το νερό δεν αποτελεί την μοναδική κατοικία του βακτηρίου καθώς έχει απομονωθεί από λάσπη σε αμμώδες και υγρό έδαφος, από ανοιχτόχρωμη άμμο, επίσης και από υγρό χώμα που βρίσκεται στις παρυφές ποταμών. Ο οργανισμός προστασίας του περιβάλλοντος των Ηνωμένων Πολιτειών (EPA), το 1985 ανέφερε πως το βακτήριο της Legionella μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο από λάσπη και από υγρό έδαφος. Είναι γνωστό πως οι γλάστρες έχουν ως συστατικά διάφορα προϊόντα, όπως προϊόντα αποβλήτων σε μορφή λιπάσματος, πριονίδια και τύρφη. Επισημαίνεται πως η χρήση διαφορετικών προϊόντων χώματος προερχόμενα από ξύλο, διευκολύνει την εμφάνιση βακτηρίων Legionella σε χώμα που χρησιμοποιείται στις γλάστρες. Κάποιες μελέτες έδειξαν παρουσία Legionella spp.σε χώμα καλλωπιστικών φυτών που περιέχει βρύα τύρφης (Casati et al 2009). Έχει απoδειχθεί πως το είδος L.longbeachae μπορούσε να επιβιώσει και να αναπτυχθεί στο χώμα (Steele et al 1990). Σε μια έρευνα που περιλάμβανε αναλύσεις σε χώμα εδάφους στην Αυστραλία, ανιχνεύθηκε το βακτήριο Legionella σε 33 από τις 45 γλάστρες που εξετάστηκαν, ενώ σε ποσοστό 79% ανιχνεύθηκε το είδος L.longbeachae (Steele et al 1990). Οι ερευνητές κατέληξαν στο συμπέρασμα πως το συγκεκριμένο είδος προτιμά να επιβιώνει στο χώμα περισσότερο από ότι στο νερό και ίσως αποτελεί πηγή μόλυνσης για τον ανθρώπινο οργανισμό (Rogers et al 1994). Πολλά είδη του βακτηρίου έχουν απομονωθεί επίσης από κοπριές ζώων, μείγματα λαχανικών και φυτών που έχουν μετατραπεί σε λίπασμα και από πολλά μείγματα χώματος σε γλάστρες καλλωπιστικών φυτών (Broadbent 1996). Το βακτήριο απομονώθηκε επίσης από χώμα που χρησιμοποιείται στην κηπουρική, για καλλωπιστικά φυτά και στην καλλιέργεια κηπευτικών, ενώ έχει διευκρινιστεί πως το είδος L.pneumophila δεν μπορεί να επιζήσει σε ξηρό περιβάλλον (Rogers et al 1994, Karpova et al 2008). Υπάρχουν και κάποιες τεκμηριωμένες περιπτώσεις της νόσου, στις οποίες δεν εμπλέκεται, ως πηγή μόλυνσης, κάποια υδάτινη πηγή. Σε αυτές τις περιπτώσεις έχουν ενοχοποιηθεί το χώμα καλλωπιστικών φυτών και διάφορα υλικά που προστίθεται στο έδαφος για 48

50 τη βελτίωση της ανάπτυξης των φυτών. Ο τρόπος μετάδοσης του βακτηρίου από αυτές τις πηγές δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Αναφορές από μελέτες σε χώμα από το 1990, δείχνουν πως το βακτήριο L.longbeachae, αποτελεί πηγή μόλυνσης της νόσου (Steele et al 1990, Steele&Moore et al 1990, Koide et al 1999). Κάποιες ανεπίσημες αναφορές υποδηλώνουν ενδεχόμενη συσχέτιση κάποιων κρουσμάτων της νόσου με χωματουργικές εργασίες σε κτίρια, που ίσως οφείλεται σε διασπορά της σκόνης που εισέρχεται σε πύργους ψύξης και ενισχύει την ανάπτυξη του βακτηρίου Legionella (Miragliotta et al 1992, Mermel et al 1995). II.18. Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της Νόσου Η Νόσος των Λεγεωνάριων έχει καταγραφεί σχεδόν παγκοσμίως, στην Νότια και Βόρεια Αμερική, Ασία, Αυστραλία, Ν.Ζηλανδία, Ευρώπη και Αφρική (Bhopal 1993). Είναι αξιοσημείωτο, πως παρόλο που είναι ευρέως διαδεδομένη γεωγραφικά σε ολόκληρο τον κόσμο, τα περισσότερα περιστατικά έχουν αναφερθεί σε βιομηχανικές περιοχές. Ωστόσο, υπάρχει η πιθανότητα η μεγάλη διακύμανση στην συχνότητα εμφάνισης του βακτηρίου σε διάφορες χώρες να μην είναι ανταποκρίνεται στην πραγματικότητα, λόγω των διαφορετικών μεθόδων στον προσδιορισμό κρουσμάτων, στις διαγνωστικές μεθόδους, στα συστήματα επιτήρησης και στην παρουσίαση αναφορών της κάθε χώρας. Μετά την ανακάλυψη του βακτηρίου της Legionella, πολλές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με την επιδημιολογία της οικογένειας Legionellaceae. Από τα 50 είδη που έχουν χαρακτηρισθεί έως σήμερα, μόνο τα 19 από αυτά έχουν συσχετισθεί με λοιμώδη νοσήματα (Joseph&Ricketts 2008). Η L.pneumophila αποτελεί το πιο συχνό είδος που προκαλεί ασθένεια και από τις 16 υποομάδες που περιέχει, η πλειοψηφία των ασθενειών (84% σε παγκόσμιο επίπεδο, 95% στην Ευρώπη) προκαλείται από την L.pneumophila υποομάδα 1 (sg1) (Harrison et al 2007, Yu et al 2002). II.19. Λοιμοτοξικότητα-Βαρύτητα κρουσμάτων Η L.pneumophila είναι ευρέως διαδεδομένη στο περιβάλλον, ωστόσο δεν είναι τόσο κυρίαρχη όσο στην πρόκληση μόλυνσης στον ανθρώπινο οργανισμό. Σε μια μελέτη στη Γαλλία, διαπιστώθηκε πως το ποσοστό της L.pneumophila υποομάδα 1 (sg1), που ανιχνεύθηκε σε 49

51 περιβαλλοντικά δείγματα κυμαίνεται στο 28%, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό σε κλινικά δείγματα κυμαίνεται στο 95,4%, γεγονός που υποδηλώνει πως η κατανομή των ειδών και υπoομάδων του βακτηρίου σε κλινικά δείγματα δεν αντιστοιχεί με την περιβαλλοντική κατανομή του βακτηρίου (Doleans et al 2004). Φαίνεται λοιπόν πως το υψηλό ποσοστό της L.pneumophila υποομάδα 1 (Sg1) που προκαλεί ασθένεια δεν οφείλεται στην επικράτηση της υποομάδας στο περιβάλλον, αλλά συνδέεται με την μεγάλη μολυσματικότητα του στον ανθρώπινο οργανισμό (Gomez- Valero et al 2009). Επιπλέον κάποια άλλα είδη του βακτηρίου όπως η L.anisa, L.dumoffi ή L.feeleii παρόλο που αποικίζουν στο δίκτυο ύδρευσης και σε υδάτινα συστήματα, σε μεγάλη συχνότητα, σπάνια έχουν συσχετιστεί με πρόκληση ασθενειών. Τα είδη αυτά, κατά κύριο λόγο, συσχετίζονται με μολύνσεις σε άτομα που έχουν υποστεί ανοσοκαταστολή σε νοσοκομεία (Doleans et al 2004, Muder&Yu 2002, Yu et al 2002). Εξαίρεση στα παραπάνω, αποτελούν οι χώρες της Αυστραλίας και της Ν.Ζηλανδίας στις οποίες το 50% των περιστατικών οφείλονται στο είδος L.pneumophila, ενώ το 30% των κρουσμάτων οφείλονται στο είδος L.longbeachae (Yu et al 2002). Είναι ξεκάθαρο πως τα είδη που έχουν κυρίαρχη θέση στη πρόκληση ανθρώπινης ασθένειας είναι η L.pneumophila και η L.longbeachae (Gomez-Valero et al 2009). Στο μέλλον με την χρήση καινούριων τεχνικών θα γίνει πλήρως κατανοητό η ικανότητα της L.pneumophila να προκαλεί την Νόσο σε μεγαλύτερο ποσοστό από τα άλλα είδη. Μια σαφής διαφοροποίηση των περιβαλλοντικών και κλινικών στελεχών της L.pneumophila δεν είναι δυνατή, παρά την εφαρμογή πολλών διαφορετικών μεθόδων (Aurell et al 2005, Bumbaugh et al 2002). Ωστόσο, έχει παρατηρηθεί ότι μεταξύ των κλινικών στελεχών L.pneumophila υπάρχει λιγότερη διαφοροποίηση από ότι μεταξύ περιβαλλοντικών στελεχών (Harrison et al 2007). Δεν έχει παρατηρηθεί συσχέτιση μεταξύ των γενετικών χαρακτηριστικών και της εστίας απομόνωσης του βακτηρίου. Ωστόσο, πρόσφατα, αναγνωρίσθηκε η παγκόσμια εξάπλωση ενός κλώνου της L.pneumophila στέλεχος Paris (τύπος αλληλουχίας 1, ST1:1,4,3,1,1,1), προκαλώντας επιδημίες και σποραδικές περιπτώσεις της Νόσου (Cazalet et al 2008). Η ύπαρξη επιδημιολογικών και ενδημικών στοιχείων αποδεικνύει την παρουσία των στελεχών L.pneumophila σε όλο τον κόσμο, φαίνεται όμως ότι κυρίως ορισμένοι κλώνοι του είδους προκαλούν ασθένειες (Aurell et al 2003, Cazalet et al 2008, Ginevra et al 2008). 50

52 II.20. Λοιμογόνος δράση Παθογένεια Όπως ήδη έχουμε αναφερθεί η L.pneumophila βρίσκεται σε ύδατα και στο εσωτερικό των βιομεμβράνων. Επιπλέον, αυτό το παθογόνο παρασιτεί, όπως στο εσωτερικό των πρωτόζωων και των ανθρώπινων κυττάρων, μια διαδικασία η οποία απαιτεί πρόσφυση, εισβολή, και διάφορες αλληλεπιδράσεις μέσα στο φαγόσωμα του βακτηρίου. Σύμφωνα με όλες αυτές τις συνθήκες, το βακτηριακό κύτταρο φάκελος του βακτηρίου είναι η πρωταρχική δομή μέσω της οποίας η L.pneumophila αλληλεπιδρά με αυτά τα διαφορετικά περιβάλλοντα. Παρόλο που οι ιδιότητες του κυτταρικού φακέλου καθορίζονται τελικά από το γονιδίωμα του βακτηρίου, γίνεται όλο και περισσότερο εμφανές, ότι η μοριακή ταυτότητα, οι χωρικές κατανομές και οι βιοχημικές δραστηριότητες πολλών συστατικών του κυτταρικού φακέλου του βακτηρίου, είναι ιδιαίτερα δυναμικές και ποικίλλουν ανάλογα με τις φάσεις ανάπτυξης της L.pneumophila, (διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες διαφοροποίησης), καθώς και κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης του παθογόνου με το ξενιστή. Ως εκ τούτου, η έρευνα των φαινοτυπικών αλλαγών, οι οποίες λαμβάνουν χώρα, καθώς τα βακτήρια προσαρμόζονται στις διαφορετικές συνθήκες, υπόσχεται πολλά για την κατανόηση αυτού του παθογόνου. Πρωτεΐνες, υδατάνθρακες και λιπίδια στο κυτταρικό φάκελο του βακτηρίου εξυπηρετούν ρόλους σήμανσης και διάρθρωσης, ενώ μέχρι πρόσφατα ο κύριος στόχος της βιοϊατρικής έρευνας ήταν η ταυτοποίηση και η ανάλυση των πρωτεϊνών. Δια του παρόντος έχουμε μάθει ότι ήδη χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες μπορεί να έχουν απροσδόκητες λειτουργίες, γεγονός που υποδηλώνει την ανάγκη για πιο ενδελεχείς έρευνες. Με βάση την τρέχουσα πληροφόρηση, υπάρχει επίσης αυξημένη συνειδητοποίηση ότι λιπίδια, τόσο της υποδοχής του ξενιστή και του βακτηρίου, επιβλέπουν την κίνηση ή τον προγραμματισμό της κίνησης του παθογόνου και την ευαισθησία του κάθε ξενιστή σε μόλυνση. Έτσι, η αναγνώριση αυτών των μοναδικών λιπιδίων καθώς και των βιολογικών τους δραστηριοτήτων, αντιπροσωπεύουν ελπιδοφόρους ορίζοντες στην κατανόηση της βιολογίας της μόλυνσης της L. pneumophila. Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός παραγόντων που συμβάλουν στην παθογένεια της L.pneumophila, συμπεριλαμβανομένου τα συστήματα απέκκρισης τύπου II και IV, το σύστημα IV pili και άλλα τα οποία βρίσκονται υπό διερεύνηση. Υπάρχουν ομοιότητες της παθογένειας της L.pneumophila, σε κάποια σημεία με την παθογένεια του Mycobacterium, Toxoplasma, Leishmania και της Coxiella. Ο μηχανισμός της παθογένειας του βακτηρίου, μπορεί να προτείνει νέες στρατηγικές για την αντιμετώπιση πολλών μολυσματικών ασθενειών (Swanson&Hammer 2000). Ως εκ τούτου, η λοιμογόνος δύναμη της L.pneumophila καθορίζεται επιλεκτική από τις 51

53 πιέσεις του περιβάλλοντος, όπου ο αποικισμός σε αμοιβάδες και η διαβίβαση της σε νέο εξειδικευμένο πολλαπλασιασμό, είναι υψίστης σημασίας (Hammer et al 2002). Υπάρχουν στοιχεία ότι η λοιμογόνος δύναμη (τοξικότητα) αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την επιβίωση της Legionella σε αερολύματα, με τα πιο λοιμογόνα στελέχη να επιβιώνουν περισσότερο από τα λιγότερο λοιμογόνα ομόλογα στελέχη τους (Dennis&Lee 1988). Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει ένδειξη μετάδοσης της Νόσου των Λεγεωνάριων ή του Pontiac πυρετού, από άνθρωπο σε άνθρωπο (WHO 2004). Κάθε φορά δεν είναι εφικτό, να προβλεφθεί αν μια πηγή θα προκαλέσει την Νόσο των Λεγεωνάριων. Ως εκ τούτου η πιθανότητα ότι μια πηγή θα προκαλέσει λοίμωξη εξαρτάται από των μικροβιακό φορτίο των βακτηρίων, τον τρόπο πολλαπλασιασμού, την ικανότητα σχηματισμού αερολύματος και από την αποτελεσματικότητα της διάδοσης. Τα συστήματα που σχηματίζουν αερολύματα και εμπλέκονται στην μετάδοση της Νόσου είναι οι πύργοι ψύξης τα συστήματα ύδρευσης μεγάλων κτιριακών συγκροτημάτων, οι αναπνευστικές συσκευές και οι βρύσες ζεστού νερού. II.21. Μεταδοτικότητα Η Legionella pneumophila είναι ένα ευρέως διαδεδομένο gram-αρνητικό βακτήριο που παρασιτεί σε πρωτόζωα υδάτινων περιβάλλοντων. Όταν L.pneumophila εισέρχεται στο ανθρώπινο αναπνευστικό σύστημα μέσω της εισπνοής του μολυσμένου νερού με βακτήρια, τα βακτήρια έχουν την ικανότητα να αναπαραχθούν μέσα στα κυψελιδικά μακροφάγα (Horwitz&Silverstein 1980). Το σύστημα Dot/Icm είναι ένα είδος απέκκρισης, που απαιτείται για την ενδοκυτταρική αναπαραγωγή του βακτηρίου (Segal et al 1998). Παρά το γεγονός ότι μια σοβαρή μορφή πνευμονίας, γνωστή ως νόσος των Λεγεωνάριων, μπορεί να προκύψει από την αναπαραγωγή της L.pneumophila στα μακροφάγα κύτταρα του ξενιστή, οι περισσότερες λοιμώξεις, κατά πάσα πιθανότητα, περιέχονται και αποβάλλονται από το ανοσοποιητικό σύστημα χωρίς καμία εξέλιξη της νόσου (McDade et al 1977). Πειραματική έρευνα, δείχνει πως η L.pneumophila μετατρέπεται από μια αναπαραγωγική μορφή σε μια μεταδοτική μορφή, όταν τα θρεπτικά συστατικά περιορίζονται από το περιβάλλον (Swanson&Hammer 2000). Για να ευδοκιμήσει, το παράσιτο πρέπει να προσαρμόσει το φαινότυπο του με τον περιβάλλοντα χώρο. Όταν το βακτήριο εισπνέεται στους πνεύμονες, μια ανάλογη στρατηγική προφανώς προάγει την αποικισμό του στα κυψελιδικά μακροφάγα και την βλάβη στους ιστούς, χαρακτηριστική της Νόσου των Λεγεωνάριων (Swanson και Hammer, 2000). Επομένως το 52

54 παθογόνο ταξιδεύει στα φαγοκύτταρα για τη δημιουργία ενδοκυτταρικής αναπαραγωγής. Για να γίνει αυτό, το μικρόβιο εναλλάσσεται μεταξύ της φάσης της αντιγραφής και της μεταδοτικής φάσης (Byrne&Swanson 1998). II.22. Πνευμονία κοινότητας Ο όρος πνευμονία κοινότητας, (community acquired pneumonia, CAP) αναφέρεται σε εκείνες τις περιπτώσεις που οι πνευμονίες δεν αποδίδονται σε ταξίδια και σε υγειονομική περίθαλψη, όπως τα νοσοκομεία. Οι πνευμονίες κοινότητας έχουν ένα υψηλό ποσοστό εισαγωγής για περίθαλψη σε νοσοκομεία, ενώ σε ποσοστό λιγότερο από 1% μπορούν να αντιμετωπιστούν στο σπίτι. Σε διάφορες μελέτες, έδειξαν πως σε ποσοστό πάνω από 30% απαιτείται εισαγωγή σε μονάδα εντατικής θεραπείας (Macfarlane et al 1993). Αναλογικά το ποσοστό των σοβαρών πνευμονιών κοινότητας που οφείλονται στο βακτήριο της Legionella είναι υψηλότερο, συγκριτικά με το ποσοστό που οφείλεται σε άλλες αιτίες και ως εκ τούτου η θνητότητα είναι μεγαλύτερη (Ewig&Torres 1999). II.23. Νοσοκομειακές λοιμώξεις Η έξαρση επιδημιών της Νόσου των Λεγεωνάριων σε νοσοκομεία αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα της δημόσιας υγείας. Το μέγεθος του προβλήματος είναι δύσκολο να προσδιοριστεί κάθε φορά λόγω των πολλών εστιών μόλυνσης. Τα νοσοκομεία αποτελούν ιδανικό χώρο για την μετάδοση της νόσου λόγω των ατόμων που νοσηλεύονται και βρίσκονται στη ομάδα υψηλού κινδύνου, του μεγάλου αριθμού των ατόμων που βρίσκονται σε ένα χώρο και λόγω των παλιών εγκαταστάσεων ύδρευσης που επικρατεί στα νοσοκομεία. Το είδος Legionella pneumophila εμπλέκεται στα περισσότερα περιστατικά ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων. Σχετικά με την ταξινόμηση των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων που προκαλείται από το βακτήριο της Legionella, αναφέρονται τρεις ξεχωριστές κατηγορίες (Lee&Joseph 2002). 1. Η καθορισμένη ενδονοσοκομειακή πνευμονία, σύμφωνα με την οποία η Νόσος των Λεγεωνάριων εμφανίζεται σε ένα άτομο που βρίσκεται στο νοσοκομείο 10 ημέρες πριν την έναρξη των συμπτωμάτων. 53

55 2. Πιθανή ενδονοσοκομειακή πνευμονία, σύμφωνα με την οποία η Νόσος των Λεγεωνάριων εμφανίζεται σε ένα άτομο που έχει νοσηλευτεί 1 έως 9 ημέρες από τις 10 ημέρες πριν την έναρξη των συμπτωμάτων και η ασθένεια του, είτε συσχετίστηκε με μια προηγούμενη επιδημία της Νόσου, είτε αποδόθηκε σε κάποια απομονωμένα στελέχη του βακτηρίου που ανιχνεύθηκαν στο σύστημα ύδρευσης του νοσοκομείο την ίδια χρονική περίοδο. 3. Ενδεχόμενη ενδονοσοκομειακή πνευμονία, σύμφωνα με την οποία η Νόσος των Λεγεωνάριων εμφανίζεται σε ένα άτομο που έχει νοσηλευτεί 1 έως 9 ημέρες από τις 10 ημέρες πριν την έναρξη των συμπτωμάτων και η ασθένεια του δεν συσχετίζεται με κανένα περιστατικό της Νόσου στο νοσοκομείο και χωρίς να υπάρχει αποδεδειγμένη μικροβιολογικώς σχέση μεταξύ της λοίμωξης και του νοσοκομείου. Η διασωλήνωση, οι πρόσφατες χειρουργικές επεμβάσεις, οι συσκευές αναρρόφησης και η χρήση αναπνευστικού εξοπλισμού αποτελούν σημαντικούς παράγοντες κινδύνου για ενδονοσοκομειακή πνευμονία. Οι ρινογαστρικοί σωλήνες από διάφορες μελέτες έχουν αναγνωριστεί ως εστίες μόλυνσης της νόσου σε νοσοκομεία (Blatt et al 1994, Stout&Yu 1997). Οι ασθενείς που πάσχουν από τη Νόσο των Λεγεωνάριων είναι πολύ πιο πιθανό να έχουν υποστεί τοποθέτηση ενδοτραχειακού σωλήνα ή να έχουν διασωληνωθεί για περισσότερο χρονικό διάστημα από ασθενείς με άλλου τύπου πνευμονία (Strebel et al 1988, Kool et al 1998). Έχει παρατηρηθεί, πως μετά από εμβάπτιση των πληγών ασθενών σε μολυσμένο με Legionella νερό, προκαλείται λοίμωξη με άμεση εισχώρηση του βακτηρίου στο τραυματισμένο δέρμα (Brabender et al 1983, Lowry et al 1991). Βέβαια δεν υπάρχουν στοιχεία που να υποστηρίζουν την εκδήλωση πνευμονίας από μολυσμένο τραύμα. Παρόλο που έχουν αναφερθεί περιστατικά σε έγκυες, η εγκυμοσύνη δεν θεωρείται παράγοντας κινδύνου για την Νόσο (Roig&Rello 2003). Οι ασθενείς που βρίσκονται σε ανοσοκοκαταστολή, συμπεριλαμβανομένων των ληπτών μοσχευμάτων οργάνων και αυτών που υποβάλλονται σε θεραπεία κορτικοστεροειδών, θεωρούνται οι πιο ευπαθείς ομάδες για μόλυνση από το βακτήριο της Legionella (Arnow et al 1982, Strebel et al 1988). Το CDC προκειμένου να μειωθεί η πιθανότητα μετάδοσης της Νόσου των Λεγεωνάριων σε εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης συνιστά μια στρατηγική λήψη μέτρων με επίκεντρο την σωστή συντήρηση των υδάτινων συστημάτων σε νοσοκομεία, την καθολική χρήση διαγνωστικών τεστ στου ασθενείς με πνευμονία και την διερεύνηση των εστιών μόλυνσης (CDC 1997). 54

56 II.24. Σποραδικές περιπτώσεις πνευμονίας Οι σποραδικές περιπτώσεις πνευμονίας είναι τα απομονωμένα ή μοναδικά περιστατικά. Περιστατικά νέων ανθρώπων με καλή φυσική κατάσταση και ατόμων που δεν ανήκουν σε ομάδες υψηλού κινδύνου, έχουν αναφερθεί να έχουν νοσήσει από το βακτήριο (Falguera et al 2001). Ο ρόλος του βακτηρίου στην επιδείνωση των συμπτωμάτων της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονίας δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος (Ewig 2002). To 28% τουλάχιστον του συνόλου των σποραδικών περιπτώσεων της Νόσου οφείλεται στην μετάδοση του βακτηρίου από τους πύργους ψύξης (Bhopal 1995). II.25. Περιστατικά σε ταξιδιώτες Τα περιστατικά σε ταξιδιώτες είναι τα πιο περίεργα διότι αναφέρονται σε κατοίκους περισσότερων χωρών οι οποίοι μετακινούνται συνεχώς και δεν μπορούν να αναγνωρισθούν από το σύστημα επιτήρησης της κάθε χώρας. Οι ταξιδιώτες συνήθως είναι εκτεθειμένοι στο βακτήριο μέσω του πόσιμο νερού, των μολυσμένων υδρομασάζ (spa) και κολυμβητικών δεξαμενών, υδρόψυκτων κλιματιστικών και θεαμάτων με νερό στα ξενοδοχεία. Το Ευρωπαϊκό πρόγραμμα επιτήρησης της Νόσου των Λεγεωνάριων που συνδέεται με τα ταξίδια, (EWGLINET), αναζητεί μέσω του δικτύου περιστατικά που συνδέονται με μετακινήσεις ταξιδιωτών ευρωπαϊκές πόλεις θέτοντας σε μια κεντρική βάση δεδομένων τις μεμονωμένες περιπτώσεις και αναζητώντας παράλληλα για άλλες περιπτώσεις που συνδέονται με τον ίδιο τόπο διαμονής του ταξιδιώτη (Joseph et al 1997). Όπως και με τα νοσοκομειακά περιστατικά, έτσι και στα περιστατικά που συνδέονται με τα ταξίδια, τα πιο συχνά εμπλεκόμενα είδη του βακτηρίου είναι η L.pneumophila. Σύμφωνα με την αναφορά του EWGLINET, για το 2008 στην Ευρώπη, αναφέρθηκαν 866 περιστατικά ταξιδιωτών, με 42 θανάτους. Το 12% των περιπτώσεων σχετίζονταν με ταξίδια εκτός Ευρώπης. Αναφέρθηκαν 108 καινούρια ομαδοποιημένα περιστατικά, (clusters), ενώ 6 περιστατικά ταξιδιωτών αναφέρθηκαν στην Ισπανία. Στην αναφορά, μέσω διαδικτύου, το 2008 συμμετείχαν 60 χώρες, με 11 περιστατικά να σχετίζονται με κρουαζιερόπλοια και 62 περιστατικά να έχουν επισκεφτεί περισσότερες από μια χώρες. Οι χώρες που ανέφεραν τα περισσότερα περιστατικά λοιμώξεων της Νόσου που σχετίζονται με ταξίδια ήταν η Ιταλία (21%), η Γαλλία (17,4%), η Ισπανία (16,6%) και η Τουρκία (7,2%). Όσο αναφορά την Ελλάδα το χρονικό διάστημα από το 1987 έως το 2005 ο αριθμός των περιστατικών που σχετίζονται με 55

57 ταξίδια ανέρχεται στα 344 κρούσματα, σύμφωνα με αναφορές του EWGLINET (Mouchtouri et al 2007). Οι ταξιδιώτες είναι περισσότερο εκτεθειμένοι στο βακτήριο διότι η διαμονή τους σε μεγάλα ξενοδοχειακά συγκροτήματα εγκυμονεί κινδύνους. Τα συστήματα ύδρευσης κάποιων ξενοδοχείων είναι παλαιωμένα και πολύπλοκα και μένουν εκτός λειτουργίας για μεγάλο χρονικό διάστημα. Η θερμοκρασία του ζεστού και κρύου νερού δεν ελέγχεται σωστά λόγω του όγκου του κτιρίου και της κακής διαχείρισης, με αποτέλεσμα να τις περισσότερες φορές να είναι ιδανική για την ανάπτυξη του βακτηρίου. Το προσωπικό διαχείρισης των ξενοδοχείων συνήθως δεν είναι εκπαιδευμένο στον έλεγχο και αντιμετώπιση του βακτηρίου. Τέλος τα θεάματα με νερό που διαθέτουν τα ξενοδοχεία, οι κήποι και οι πισίνες υδρομασάζ αποτελούν εστίες μόλυνσης λόγω δημιουργίας αερολυμάτων. Γράφημα II.25.1: Περιστατικά ταξιδιωτών που συνδέονται με την Νόσο των Λεγεωνάριων και έχουν αναφερθεί στο EWGLINET, για το χρονικό διάστημα, (Πηγή: Ricketts et al 2010) II.26. Θνητότητα Η σοβαρότητα της νόσου, ο τρόπος μόλυνσης, η έγκαιρη διάγνωση, η σκοπιμότητα και το χρονοδιάγραμμα της αρχικής αντιμικροβιακής θεραπείας και κάποιοι άλλοι παράγοντες κινδύνου, παίζουν σημαντικό ρόλο στην θνητότητα (Tkatch et al 1998, Fernandez et al 2002, Garcia-Fulgueiras et al 2003, Roson et al 2004, Edelstein&Cianciotto 2005). Έχει διαπιστωθεί πως ο μέσος όρος θνητότητας είναι περίπου 15%-20% των νοσηλευόμενων περιπτώσεων (Roig&Rello 2003). 56

58 Στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής το ποσοστό φθάνει το 40% στις ενδονοσοκομειακές περιπτώσεις και το 20% στις εξωνοσοκομειακές λοιμώξεις (πνευμονίες κοινότητες), (CDC 1997). Οι πιο πρόσφατες αναφορές από Αμερική και Αυστραλία έδειξαν θνητότητα 14% στις ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις και 5-20% στις πνευμονίες κοινότητας (Benin et al 2002, Howden et al 2003). Στην Ευρώπη η συνολική θνητότητα φθάνει περίπου το 12%. Η μεγαλύτερη επιδημία που έχει καταγραφεί ποτέ υπήρξε στην Murcia της Ισπανίας, κατά την οποία αναφέρθηκαν 449 επιβεβαιωμένα περιστατικά αλλά η θνητότητα έφθανε μόλις το 1% (Garcia-Fulgueiras et al 2003). Όσο αναφορά τα παιδιά έχουν εξακριβωθεί 76 περιστατικά μόλυνσης με Legionella και το συνολικό ποσοστό θνητότητας έφθανε 33% (Greenberg et al 2006). Το έτος 1999, για πρώτη φορά αναφέρθηκε περιστατικό πνευμονίας από L.pneumophila σε νεογνό 7 ημερών. Η συχνότητα εμφάνισης της νόσου σε νεογνά είναι άγνωστη. Έχουν αναφερθεί 9 σποραδικά περιστατικά μόλυνσης από το βακτήριο σε νεογνά, ενώ 6 από αυτά είχαν θανατηφόρα κατάληξη (Levy&Rubin 1998). Η προχωρημένη ηλικία και η παρουσία πολλαπλών ασθενειών εκτός μιας πρωτογενούς λοίμωξης αποτελούν προγνωστικούς δείκτες θανάτου της Νόσου των Λεγεωνάριων (Ebiary et al 1997). Σε μια πόλη της Αγγλίας στα τέλη του 2003, 2 θάνατοι συσχετίστηκαν με την Νόσο των Λεγεωνάριων μετά από έξαρση επιδημίας (Gaia et al 2003), ενώ το 2006 σε άλλη επιδημία στην Pamploma Ισπανίας από τα 146 επιβεβαιωμένα κρούσματα της νόσου δεν υπήρχε κανένας θάνατος, λόγω της έγκαιρης και αποτελεσματικής αντιμετώπισης της νόσου (Castilla et al 2008). Στην Ιρλανδία, κατά την χρονική περίοδο , έχουν αναφερθεί 67 περιστατικά με 5 θανάτους, διαθέτοντας τα χαμηλότερα ποσοστά κρουσμάτων συγκριτικά με την υπόλοιπη Ευρώπη (EWGLI 2006). Στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής, κατά την διάρκεια της δεκαετίας του 90 τα ποσοστά θνησιμότητας για τα κρούσματα της νόσου των λεγεωνάριων είχαν μειωθεί ίσως λόγω της χρήσης αντιβιοτικών (azithromycin, fluoroquinolones) και της έγκαιρης διάγνωσης με την χρήση τεστ (Fields et al 2002). II.27. Επίπτωση Σε διαφορετικές χώρες η επίπτωση της Νόσου των Λεγεωνάριων υποεκτιμάται σε διαφορετικό βαθμό διότι δεν γίνεται διάγνωση, είτε λόγω τυφλής χορήγησης αντιβιοτικών είτε διότι σε κάποιες περιπτώσεις πνευμονίας δεν θεωρείται υπεύθυνο το βακτήριο της Legionella. Επιπλέον, λόγοι όπως το εύρος των κλινικών δειγμάτων και των διαγνωστικών τεστ, που είναι διαθέσιμα 57

59 Επίπτωση ανά κάθε φορά, τα κριτήρια για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και η διαφορετική χρονική και γεωγραφική κατανομή των περιπτώσεων, οδηγεί σε διαφορές στην επίπτωση της Νόσου. Το μεγαλύτερο ποσοστό περιστατικών (ανά εκατομμύριο) εμφανίστηκε στην Γερμανία (30.17), Κροατία (16), Δανία (14.4), Ισπανία (11.03), Ελλάδα (7.00) και Γαλλία (5.25). Ενδιαφέρον παρουσιάζει μια επιδημιολογική επιτήρηση στην Πολωνία, κατά την οποία το 2005 αναφέρθηκαν 21 περιστατικά, ενώ το 2006 αναφέρθηκαν 89 περιστατικά, με επίπτωση 0,055 και 0,23/ αντιστοίχως (Stypulkowska Misiurewicz&Pancer et al 2006). 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ΈΤΟΣ Γράφημα II.27.1: Επίπτωση της Νόσο των Λεγεωνάριων στην Ευρώπη, για το χρονικό διάστημα (Πηγή : EWGLI) Συνολικά, κρούσματα της Νόσου των Λεγεωνάριων αναφέρθηκαν στα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων από το 1990 μέχρι το Ο αριθμός των κρουσμάτων αυξήθηκε κατά 70%, από 1310 περιπτώσεις το 2002 με 2223 περιπτώσεις το 2003, με μια σταθερή αύξηση σε περιστατικών ετησίως, από το 2003 έως το Κατά τη διάρκεια του χρονικού διαστήματος, , περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων, αναφέρονται πιο συχνά σε άτομα ηλικίας ετών. Επιπλέον άτομα ηλικίας 65 χρόνων, αποτελούν το 63% του συνόλου των περιπτώσεων για το χρονικό διάστημα (Neil&Berkelman 2008). Οι αναφερόμενες περιπτώσεις της Νόσου έχουν αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια, ιδιαίτερα στο ανατολικό τμήμα των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής, αλλά και της Ευρώπης 58

60 Αριθμός κρουσμάτων και ιδιαίτερα μεταξύ των μεσήλικων. Οι λοιμώξεις από το βακτήριο της Legionella θα πρέπει να εξετάζεται σε κάθε ύποπτο κρούσμα ασθενή με πνευμονία. Οι υπεύθυνοι της δημόσιας υγείας θα πρέπει να δώσουν μεγαλύτερη προσοχή στην ανίχνευση του βακτηρίου, στην πρόληψη της Νόσου και στην συνεχόμενη αύξηση των κρουσμάτων ως σημαντικό πρόβλημα της δημόσιας υγείας (Neil&Berkelman 2008). Στο γράφημα που ακολουθεί, παρουσιάζονται τα περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων στην Ελλάδα σύμφωνα με τα επιδημιολογικά στοιχεία που αναφέρονται στο Κέντρο Ελέγχου Πρόληψης Νοσημάτων ΚΕΕΛΠΝΟ, σύμφωνα με το οποίο η Νόσος των Λεγεωνάριων αποτελεί νόσημα υποχρεωτικής δήλωσης σε χρονικό διάστημα 24 ωρών από την διάγνωση (Γράφημα II.27.2) ΈΤΟΣ Γράφημα II.27.2: Περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων στην Ελλάδα, για το χρονικό διάστημα, (Πηγή : Κέντρο Ελέγχου Πρόληψης Νοσημάτων, ΚΕΕΛΠΝΟ) Οι πνευμονίες που δεν οφείλονται σε κάποιο αιτιολογικό παράγοντα, δηλαδή οι ανεξήγητες πνευμονίες αντιπροσωπεύουν πάνω από το 50% των συνολικών πνευμονιών σε μερικά νοσοκομεία και μελέτες δείχνουν πως η Νόσος των Λεγωνάριων όχι μόνο μπορεί να αποτελεί ένα σημαντικό κομμάτι αυτών των ανεξήγητων πνευμονιών αλλά και του συνολικού αριθμού κρουσμάτων πνευμονίας στα νοσοκομεία. 59

61 Πίνακας II.27.1: Περιστατικά στην Ευρώπη, για το χρονικό διάστημα, (Πηγή: EWGLI) Κατηγορία Περιστατικών ΈΤΟΣ Ενδονοσοκομειακά περιστατικά Πνευμονία Κοινότητας Περιστατικά που συνδέονται με ταξίδια Άγνωστο Συνολικός Αριθμός II.28. Πύργος Ψύξης και Νόσος των Λεγεωνάριων Ο Πύργος Ψύξης είναι μια συσκευή μεταφορά θερμότητας μέσω εξάτμισης. Πιο συγκεκριμένα ο ατμοσφαιρικός αέρας ψύχει το ζεστό νερό με άμεση επαφή του νερού και του αέρα μέσω της εξάτμισης ενός μέρους του νερού. Ποικίλουν σε μέγεθος από μικρές μονάδες έως πολύ μεγάλες και υπάρχουν διάφορα είδη, όπως ο κυλινδρικός πύργος αντιροής με ανεμιστήρα αναρρόφησης και ο πύργος ψύξης αντιροής με ανεμιστήρα κατάθλιψης. Ουσιαστικά οι πύργοι ψύξης χρησιμοποιούνται στα υδρόψυκτα συστήματα κλιματισμού για την αποβολή θερμότητας από το ψυκτικό μηχάνημα. Οι πύργοι ψύξης κατά την λειτουργία τους, σχηματίζουν υδατοσταγονίδια τα οποία με μεταφέρονται στο περιβάλλον μέσω του απαγωγέα αέρος που βρίσκεται στον πύργο ψύξης. Με αυτό τον τρόπο, αν το νερό του πύργου ψύξης είναι μολυσμένο με το βακτήριο Legionella, τότε μπορεί να προκληθεί επιδημία με τη εισπνοή των υδατοσταγονιδίων (Kourea- Kremastinou& Hadjichristodoulou 2004). Το δίκτυο σωληνώσεων του νερού στους πύργους ψύξης εκτείνεται από τον πύργο συνήθως σε περισσότερες αντλίες, με αποτέλεσμα να καθίσταται δυσκολότερος ο καθαρισμός και η απολυμαντική δράση των απολυμαντικών ουσιών στα λεγόμενα «νεκρά σημεία» (Εικόνα II.28.1). Επιπλέον ο σχηματισμός βιομεμβράνης στο εσωτερικό των πύργων ενισχύει την ανάπτυξη των βακτηρίων και την εξάπλωση τους σε άλλο σημείο του κυκλώματος (Εικόνα II.28.1) (Kourea-Kremastinou& Hadjichristodoulou 2004). Για τον περιορισμό εξόδου σταγονιδίων προς το περιβάλλον, οι σταγονοσυλλέκτες είναι συνήθως τοποθετημένοι στην έξοδο του αέρα του πύργου ψύξης. Οι πύργοι ψύξης (Εικόνα II.28.2) τοποθετούνται στην οροφή του κτιρίου, ενώ πρέπει να απέχουν τουλάχιστον 20 μέτρα από διάφορα ανοίγματα (παράθυρα) ή αεραγωγούς των κτιρίων και να καλύπτονται με στέγαστρο. Προτείνεται η αντικατάσταση των υδρόψυκτων κλιματιστικών μηχανημάτων και η αντικατάσταση τους με αερόψυκτα. 60

62 Οι πύργοι ψύξης ευθύνονται παγκοσμίως για πολλά κρούσματα της Νόσου των Λεγεωνάριων, διότι αποτελούν πηγή διάδοσης (λόγω σχηματισμού αερολύματος), των βακτηρίων Legionella spp. Για την ελαχιστοποίηση της διάδοσης της νόσου από τα συστήματα των πύργων ψύξης θα πρέπει να τηρούνται κάποιες βασικές προϋποθέσεις: αποφυγή στασιμότητας και διαρροών νερού στο σύστημα, διατήρηση γενικής καθαριότητας (χρήση απολυμαντικών και αντιδιαβρωτικών), αποφυγή σχηματισμού βιομεμβράνης, συντήρηση και συχνός έλεγχος της μικροβιολογικής και χημικής ποιότητας του νερού στο εσωτερικό του πύργου ψύξης. Εικόνα II.28.1: Επέκταση αγωγού, «τυφλό σημείο», στο δίκτυο σωληνώσεων του πύργου ψύξης (αριστερά). Σχηματισμός βιομεμβράνης στο εσωτερικό των σωληνώσεων του πύργου ψύξης (δεξιά). (Πηγή: Kourea- Kremastinou& Hadjichristodoulou 2004) Εικόνα II.28.2: Πύργος ψύξης με σχηματισμό υδατοσταγονιδίων (αριστερά). Πύργος ψύξης αντιροής με ανεμιστήρα κατάθλιψης (δεξιά). (Πηγή:

63 II.29. Εκτίμηση Κινδύνου ανάπτυξης και μετάδοσης της Νόσου Η εκτίμηση κινδύνου αποτελεί ένα εργαλείο στα χέρια των επιστημόνων για την ποιοτική και ποσοτική σύνθεση, των διαθέσιμων πληροφοριών που δίνονται κάθε φορά προκειμένου να προσδιοριστεί η πιθανότητα των ενδεχόμενων κινδύνων για την δημόσια υγεία από την έκθεση σε τοξικές ουσίες ή σε κάποιους μολυσματικούς παράγοντες. Τα αποτελέσματα της εκτίμησης κινδύνου μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την λήψη τεκμηριωμένων αποφάσεων για την διαχείριση κινδύνου. Τα τελευταία χρόνια οι επιστήμονες έχουν αναπτύξει μεθόδους για την εκτίμηση κινδύνου από την έκθεση σε φάρμακα, τρόφιμα και σε χημικές ουσίες, ωστόσο η εκτίμηση κινδύνου από την έκθεση σε παθογόνα μικρόβια αποτελεί νεότερο πεδίο μελέτης. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (WHO,World Health Organization) έχει αναπτύξει ένα πλαίσιο εφαρμογής για ασφαλές πόσιμο νερό που μπορεί να εφαρμοστεί για την αξιολόγηση και τη διαχείριση των κινδύνων που τίθενται από το βακτήριο της Legionella. Το πλαίσιο αυτό περιλαμβάνει τις ενέργειες που ορίζονται από την αρμόδια αρχή σε κρατικό ή εθνικό επίπεδο προκειμένου να εκτιμηθεί ο κίνδυνος ανάπτυξης του βακτηρίου Legionella. Η εκτίμηση κινδύνου πρέπει να γίνεται από άτομο που διαθέτει τις απαραίτητες γνώσεις έχοντας την βοήθεια επιστημονικών φορέων (Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας) ή εταιρειών συμβούλων. Η κατάρτιση και η εμπειρία των επιθεωρητών είναι σημαντικός παράγοντας και πρέπει να έχουν επίγνωση του σχεδιασμού και της κατασκευής του συστήματος που επιβλέπουν καθώς και επίγνωση των οικολογικών παραγόντων που ενισχύουν την ανάπτυξη του βακτηρίου της Legionella. Η συγκρότηση διεπιστημονικής ομάδας θεωρείται η ιδανικότερη περίπτωση προκειμένου να αντιμετωπιστούν όλες οι πτυχές λειτουργίας συμπεριλαμβανομένου και των μικροβιολογικών παραμέτρων. Η σχολαστική έρευνα για την εκτίμηση κινδύνου περιλαμβάνει τον έλεγχο όλων των συστημάτων νερού και την εφαρμογή του σχεδίου επιτήρησης, το οποίο είναι ένα ανεξάρτητο σύστημα ελέγχου που περιλαμβάνει την λήψη προληπτικών μέτρων, εφόσον βέβαια απαιτείται. Τα σημεία ή οι ενέργειες που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την διαδικασία του ελέγχου είναι τα εξής (WHO 2004, EWGLI 2003, HSE 1999): 1. Οι πιθανές εστίες μόλυνσης του συστήματος ύδρευσης και δίοδοι μεταφοράς του βακτηρίου της Legionella, κάποια δεξαμενή αποθήκευσης, πύργος ψύξης ή κάθε άλλο σύστημα που χρησιμοποιεί νερό και μπορεί να αποτελέσει πηγή μόλυνσης. 62

64 2. Τα χαρακτηριστικά της σωστής λειτουργία του συστήματος, ο σχεδιασμός των συσκευών (πύργοι ψύξης, εξατμιστικοί συμπυκνωτές, σχέδιο δικτύου, συσκευές θέρμανσης νερού), που πρέπει να ζητηθούν από τον συντηρητή. 3. Οι βλάβες στην λειτουργία του συστήματος όπως διαρροές και η πιθανή δημιουργία σταγονιδίων από καταιονιστήρες και πύργους ψύξης. 4. Οι διάφορες θέσεις εισόδου αέρα σε κτίρια, οι οποίες δεν πρέπει να βρίσκονται κοντά στους απαγωγούς των πύργων ψύξης. 5. Η καταλληλότητα του προσωπικού που είναι αρμόδιο για την συντήρηση του συστήματος. 6. Η καταγραφή των συνθηκών που ευνοούν την ανάπτυξη του βακτηρίου, όπως η θερμοκρασία του νερού (αν κυμαίνεται μεταξύ 20 0 Cκαι 45 0 C). 7. Η πιθανότητα επαφής ατόμων και ιδιαίτερα ευπαθών ομάδων με μολυσμένα από το βακτήριο αερολύματα. 8. Η προέλευση και την ποιότητα του νερού, που καταλήγει στο σύστημα δηλαδή αν προέρχεται από πηγή, από γεώτρηση, από υδραγωγείο ή είναι υπόγειο. Η αναφορά της εκτίμησης κινδύνου μπορεί να περιλαμβάνει και σύστημα γεωγραφικής χαρτογράφησης και πληροφοριών, GIS, (Geographic Ιnformation System) και ένα σχέδιο υδραυλικών εγκαταστάσεων, που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό σημείων στασιμότητας. Για παράδειγμα δημιουργία χαρτών που απεικονίζουν τα βασικά κτιριακά συγκροτήματα όπως δημόσιες υπηρεσίες, σχολεία και νοσοκομεία. Σημαντικά οφέλη από την ανάπτυξη και την εφαρμογή ενός τέτοιου σχεδίου για την εκτίμηση κινδύνου είναι η συστηματική, η λεπτομερής αξιολόγηση και ιεράρχηση των κινδύνων (βιολογικών, χημικών ή φυσικών παραγόντων, ή συνθήκες νερού, παραγόντων με δυνατότητα πρόκλησης αρνητικών επιπτώσεων στην δημόσια υγεία), καθώς και η συστηματική παρακολούθηση των εμποδίων και των μέτρων ελέγχου (WHO 2004, Davison et al 2005). Η εκτίμηση κινδύνου ολοκληρώνεται με την διεξαγωγή έκθεσης των επιθεωρήσεων. Στην περίπτωση που οι κίνδυνοι είναι ασήμαντοι διεξάγεται περιοδική επανεκτίμηση του συστήματος εκτός βέβαια που κάτι έχει αλλάξει στο σύστημα οπότε πρέπει να γίνει αναθεώρηση και πραγματοποίηση επιτόπου έρευνας (WHO 2004). Εάν όμως στην έκθεση διαπιστωθούν πιθανά επικίνδυνα σημεία, τότε πρέπει να συνταχθεί γραπτή αναφορά που να περιλαμβάνει τα παρακάτω (HSE, 1999): 63

65 1. Το πλήρες σχεδιάγραμμα των εγκαταστάσεων συστημάτων νερού, την περιγραφή της χωροδιάταξης ακόμα και εκείνων των σημείων που βρίσκονται προσωρινά εκτός λειτουργίας. 2. Περιγραφή της λειτουργίας του δικτύου ύδρευσης και άλλων συστημάτων νερού όπως υδρόψυκτα κλιματιστικά. 3. Καταγραφή της θερμοκρασίας ζεστού και κρύου νερού, της συχνότητας συντήρησης, της συγκέντρωσης χλωρίου ή άλλων απολυμαντικών ουσιών 4. Τα μέτρα πρόληψης που εφαρμόζονται, η συχνότητα και η διαδικασία ελέγχου των προληπτικών μέτρων. 5. Τα μέτρα που πρέπει να εφαρμοστούν για την αποφυγή μόλυνσης και σχέδιο διορθωτικών ενεργειών. 6. Προτεινόμενοι έλεγχοι για ελαχιστοποίηση του κινδύνου έκθεσης στο βακτήριο και χρονοδιάγραμμα ελέγχων. II.30. Παρακολούθηση Συστήματος Τα βήματα που εμπλέκονται στην παρακολούθηση του συστήματος είναι τα παρακάτω: ο καθορισμός μέτρων ελέγχου η παρακολούθηση των μέτρων ελέγχου η επικύρωση της αποτελεσματικότητας των σχεδίων ελέγχου συστημάτων νερού Τα μέτρα ελέγχου σε βιομηχανικά συστήματα περιλαμβάνουν τον αποκλεισμό τού μικροοργανισμού, τον έλεγχο των θρεπτικών ουσιών της θερμοκρασίας την πρόληψη της χαμηλής ροής και της στασιμότητας, τον έλεγχο του περιβάλλοντος έτσι ώστε να περιοριστεί η ανάπτυξη του μικροοργανισμού και η χρήση απολυμαντικού (Eggins&Oxley 1982). Στα περισσότερα συστήματα είναι πρακτικά δύσκολο να προληφθεί η περιοδική επαναφορά του βακτηρίου διότι μικρός αριθμός των βακτηρίων Legionella μπορούν να εισέλθουν στο σύστημα διανομής ή στο σύστημα αποθήκευσης, οπότε πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη έμφαση στον σχεδιασμό και τον έλεγχο του συστήματος. Ένα από τα σημαντικά μέτρα ελέγχου είναι ο περιορισμός της ποσότητας και του είδους των θρεπτικών ουσιών (κυρίως οργανικών θρεπτικών συστατικών) που είναι διαθέσιμες για την ανάπτυξη του βακτηρίου. Ο περιορισμός γίνεται με επιλογή υλικών που δεν θα χρησιμεύουν ως υπόστρωμα για την δημιουργία βιομεμβράνης, με διασφάλιση της αποτελεσματικής συγκέντρωσης των χημικών 64

66 πρόσθετων στα συστήματα (Crespi&Ferra 1997) και με σωστό σχεδιασμό του συστήματος για την αποφυγή ιζημάτων, τυφλών σημείων και σημείων με στασιμότητα ροής. Τα συστήματα νερού που κινδυνεύουν από στασιμότητα πρέπει να καθαρίζονται και να απολυμαίνονται συχνότερα. Η πιθανή έκθεση των ανθρώπων σε μολυσμένα αερολύματα που παράγονται κατά την έκπλυση θα πρέπει να ληφθεί υπόψη, έτσι ώστε να λαμβάνονται τα απαραίτητα μέτρα προφύλαξης (προστατευτικός εξοπλισμός, χρήση μάσκας, γαντιών και καλύμματος κεφαλής). Η διατήρηση της σωστής θερμοκρασίας του νερού σε επίπεδα που δεν ευνοούν την ανάπτυξη των βακτηρίων Legionella αποτελεί αποτελεσματικό μέτρο ελέγχου σε συστήματα ζεστού και κρύου νερού. Άρα η αποφυγή θερμοκρασίας μεταξύ 25 C και 45 C είναι απαραίτητη για την αποφυγή του αποικισμού του βακτηρίου. Στην ιδανική περίπτωση η θερμοκρασία πρέπει να διατηρείται κάτω από τους 20 C στο κρύο νερό και πάνω από τους 50 C στο ζεστό. Σε πολλά συστήματα όπως πύργοι ψύξης και συστήματα ζεστού κρύου νερού, είναι δύσκολο να διατηρηθεί η θερμοκρασία εκτός του εύρους για την ανάπτυξη του βακτηρίου, λόγω της φύσης των συστημάτων. Σε αυτά τα συστήματα οι θερμοκρασίες θα πρέπει να διατηρηθούν στα ανώτερα ή κατώτερα όρια του εύρους πολλαπλασιασμού της Legionella. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στο δίκτυο ύδρευσης, έτσι τα μέτρα ελέγχου της διάδοσης του βακτηρίου δεν θα πρέπει να αυξάνουν τον κίνδυνο πρόκλησης εγκαυμάτων. Όσο αναφορά τους πύργους ψύξης θα πρέπει να παρακολουθείται συστηματικά η ποιότητα του νερού (ολική μεσόφιλη χλωρίδα, ph, αγωγιμότητα, σκληρότητα, θερμοκρασία, αιωρούμενα στερεά, ολικός και διαλυμένος σίδηρος, χλωριούχα, θειικά και επίπεδα αναστολέων στο σύστημα) ώστε να ελέγχεται η αποτελεσματικότητα του προγράμματος επεξεργασίας νερού. Η τήρηση αρχείων, με καταγραφή των διαδικασιών συντήρησης του συστήματος, καθαρισμού, απολύμανσης και παρακολούθησης του δικτύου ύδρευσης είναι απαραίτητη για την πρόληψη και τον έλεγχο της ανάπτυξης του βακτηρίου. Η δειγματοληψία στα διάφορα συστήματα θα πρέπει να πραγματοποιείται από ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό το οποίο θα πρέπει να ενημερώνεται συνεχώς για την Legionella και οι εργαστηριακές αναλύσεις από διαπιστευμένα εργαστήρια. Θα πρέπει να διευκρινιστεί πως ένα αρνητικό αποτέλεσμα που προκύπτει από την εργαστηριακή εξέταση για παρουσία Legionella στο σύστημα, δεν εξασφαλίζει ότι δεν υπάρχει κίνδυνος ανάπτυξης του βακτηρίου. Στους παρακάτω πίνακες, αναφέρονται τα μέτρα που θα πρέπει να λαμβάνονται κάθε φορά ανάλογα με τα αποτελέσματα των εργαστηριακών αναλύσεων. Αξίζει να αναφερθεί πως στην χώρα μας δεν έχει θεσπιστεί ειδική Νομοθεσία για την Νόσο των Λεγεωνάριων. Από το Υπουργείο Υγείας και Κοινωνικής Αλληλεγγύης έχουν εκδοθεί μέχρι τώρα δύο εγκύκλιοι (Υ1/ΟΙΚ.2393/17/5/2000, Υ2/Γ.Π./οικ.79305/8/8/2002) που αφορούν 65

67 τα πρόληψη της Νόσου. Σχετικά με την εγκύκλιο του 2002 αναφέρεται πως πρέπει να μελετώνται οι κίνδυνοι ανάπτυξης του βακτηρίου και να λαμβάνονται τα κατάλληλα προληπτικά μέτρα. Σε κάθε περίπτωση θα πρέπει να εκτιμώνται και να προσδιορίζονται οι παράγοντες κινδύνου, να προετοιμάζεται σχέδιο για την πρόληψη και τον έλεγχο κινδύνου, να γίνεται υλοποίηση και έλεγχος αποτελεσματικότητας του σχεδίου και να τηρείται το αρχείο για όλες τις προβλεπόμενες ενέργειες. Η δειγματοληψία νερού στο δίκτυο ύδρευσης για την πρόληψη της Νόσου των Λεγεωνάριων θα πρέπει να πραγματοποιείται κάθε έξι μήνες, ενώ για τον πύργο ψύξης συνίσταται κάθε τρεις μήνες και την καλοκαιρινή περίοδο κάθε μήνα. Πίνακας II.30.1: Απαιτούμενα μέτρα στο δίκτυο ύδρευσης ανάλογα με τα αποτελέσματα μικροβιολογικών εξετάσεων (EWGLI 2003, NSW 2002, Public Health Division 2001) Βακτήρια Legionella (cfu/l) >1000 cfu/l και < cfu/l > cfu/l Απαιτούμενες ενέργειες Α) Ένα ή δύο δείγματα, επανάληψη δειγματοληψίας με την λήψη περισσότερων δειγμάτων. Εάν τα εργαστηριακά αποτελέσματα της δεύτερης δειγματοληψίας δείξουν Legionella >1000 cfu/l συνίσταται απολύμανση του δικτύου και επανεκτίμηση κινδύνου. Σε δύο μέρες μετά την απολύμανση πρέπει να γίνει και τρίτη δειγματοληψία Β) Εάν >2 δείγματα είναι θετικά για Legionella τότε πιθανώς το σύστημα αποικισμένο με μικρό αριθμό βακτηρίων, συνίσταται απολύμανση και επανεκτίμηση κινδύνου. Σε δύο μέρες μετά την απολύμανση πρέπει να γίνει και τρίτη δειγματοληψία Άμεση επανάληψη δειγματοληψίας και χωρίς αναμονή αποτελεσμάτων, συνίσταται απολύμανση και επανεκτίμηση κινδύνου. Σε δύο μέρες μετά την απολύμανση πρέπει να γίνει και τρίτη δειγματοληψία 66

68 Πίνακας II.30.2: Απαιτούμενα μέτρα σε πύργους ψύξης ανάλογα με τα αποτελέσματα μικροβιολογικών εξετάσεων (EWGLI 2003, NSW 2002, Public Health Division 2001) Μέτρηση αερόβιων μικροοργανισμών (cfu/ml) Βακτήρια Legionella (cfu/l) * Απαιτούμενα μέτρα Έως cfu/ml Έως cfu/l Το σύστημα είναι υπό έλεγχο Δεύτερη δειγματοληψία άμεσα. Εάν το δείγμα βρεθεί πάνω από τα επιτρεπτά όρια τότε απολύμανση και καθαρισμός τους συστήματος και εκτίμηση κινδύνου. Σε δύο μέρες επανάληψη δειγματοληψίας cfu/ml cfu/l Δεύτερη δειγματοληψία άμεσα. > cfu/ml > cfu/l Καθαρισμός και απολύμανση συστήματος χωρίς αναμονή αποτελεσμάτων. Σε δύο μέρες επανάληψη δειγματοληψίας. * Καθορίζεται σύμφωνα με το ISO II.31. Σύστημα Επιτήρησης Σύμφωνα με το CDC (1996), ως σύστημα επιτήρησης έχει οριστεί ως η συνεχής και συστηματική συλλογή, ανάλυση και ερμηνεία των δεδομένων που αφορούν την δημόσια υγεία, η οποία είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό, την υλοποίηση και την αξιολόγηση των προγραμμάτων παρακολούθησης και στενά συνδεδεμένη με την έγκαιρη διάδοση αυτών των δεδομένων στις αρμόδιες αρχές. Το τελευταίο κρίκο στην αλυσίδα επιτήρησης είναι η εφαρμογή των δεδομένων για την πρόληψη και τον έλεγχο. Ένα ολοκληρωμένο σύστημα επιτήρησης των ασθενειών περιλαμβάνει την λειτουργική ικανότητα για τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση και τη διάδοση που συνδέονται άμεσα με τα προγράμματα δημόσιας υγείας. Η Νόσος των Λεγεωνάριων είναι λοίμωξη υποχρεωτικής δήλωσης, στις περισσότερες βιομηχανικά ανεπτυγμένες χώρες. Σε κάθε χώρα, εφαρμόζονται διαφορετικά συστήματα επιτήρησης, που καθορίζεται από την τεχνική ικανότητα εντοπισμού κρουσμάτων και διάδοσης των δεδομένων για την συγκεκριμένη λοίμωξη. Η ακριβής συχνότητα της νόσου δεν είναι πλήρως εξακριβωμένη και εξαρτάται από τα κοινωνικό-πολιτικά συστήματα κάθε χώρας. Οι αναφορές που υπάρχουν δεν αντικατοπτρίζουν τα πραγματικά περιστατικά της νόσου. Η πραγματική συχνότητα εμφάνισης είναι δύσκολο να προσδιοριστεί διότι η επαλήθευση των 67

69 περιστατικών απαιτεί ικανή και επαρκή επιτήρηση και οι ερευνητές προτείνουν πως η Νόσος των Λεγεωνάριων θα πρέπει να αναφέρεται σε διεθνές σύστημα παρακολούθησης (Anon. 1998, WHO 1999). Η προτεραιότητα που θα πρέπει να δίνεται στην επιτήρηση της νόσου απαιτείται να είναι μεγαλύτερη λόγω των επιπτώσεών της στην τουριστική βιομηχανία. Από το 1985 έχει ιδρυθεί το σύστημα επιτήρησης για τη Legionella, το οποίο εστιάζει στην εξάπλωση του βακτηρίου στην Αμερική και ονομάζεται Legionella Criteria Document. Σε άλλες χώρες ακόμα δεν είχαν αναπτυχθεί τα προγράμματα επιτήρησης. Η επιτήρηση της νόσου στην Αγγλία και στην Ουαλία ήδη είχε ξεκινήσει από το 1979 αλλά τα δεδομένα από αυτές τις χώρες δεν συμπεριλαμβάνονταν στην αναφορά του Το 1986 συγκροτήθηκε η Ευρωπαϊκή Ομάδα Εργασίας για την Νόσο των Λεγεωνάριων γνωστό ως European Working Group for Legionella Infections (EWGLI) και τον επόμενο χρόνο, το 1987, θεσπίστηκε το Ευρωπαϊκό πρόγραμμα επιτήρησης της Νόσου που σχετίζονται με τα ταξίδια, γνωστό ως EWGLINET. Πρόκειται για δίκτυο, στο οποίο αναφέρονται όλα τα κρούσματα της Νόσου, που εντοπίζονται στις χώρες-μέλη, που συνδέονται με τα ταξίδια. Το δίκτυο ( εκδίδει κατευθυντήριες οδηγίες και τεχνικές συμβουλές, οι οποίες πρέπει να ακολουθούνται από τις ευρωπαϊκές χώρες με σκοπό την προστασία των πολιτών από τη νόσο. Από το 1993, τα μέλη του EWGLI υποβάλλουν ηλεκτρονικά μια ετήσια έκθεση σχετικά με τις λοιμώξεις από Legionella. Από την έναρξη λειτουργία τους συστήματος επιτήρησης EWGLI, ο αριθμός των χωρών που συμμετέχουν αυξάνεται συνεχώς (Joseph 2004). Τα δεδομένα αυτά είναι χρήσιμα διότι δίνουν την δυνατότητα σύγκρισης των ποσοστών εμφάνισης της νόσου μεταξύ χωρών με παρόμοιο πληθυσμό και παρόμοια πυκνότητα πληθυσμού και βοηθά στην εκτίμηση των προγραμμάτων επιτήρησης για τον έλεγχο και την πρόληψη της Νόσου των Λεγεωνάριων στις διάφορες χώρες. Η επιτήρηση περιλαμβάνει την συστηματική συλλογή, την τακτική ενοποίηση και ανάλυση δεδομένων, για την επαλήθευση της αποτελεσματικότητας της επεξεργασίας νερού, της σωστής λειτουργίας του συστήματος, των μέτρων ελέγχου και της εκτίμησης κινδύνου. Το σύστημα επιτήρησης μπορεί να περιλαμβάνει τα ακόλουθα. 1. Τον εξωτερικό και εσωτερικό έλεγχο από τον Αρμόδιο Φορέα Υγείας, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η σωστή ανάληψη διορθωτικών ενεργειών και η σωστή λειτουργία του συστήματος παρακολούθησης, όπως ορίζεται από το σύστημα εκτίμησης κινδύνου ανάπτυξης και μετάδοσης της Legionella. 2. Την μηνιαία παρακολούθηση του αριθμού των ετερότροφων βακτηρίων, στα συστήματα και στις πηγές ύδρευσης. Η ενέργεια αυτή αποσκοπεί στην παρακολούθηση των αλλαγών στο 68

70 σύστημα. Η μικροβιολογική ανάλυση πρέπει να πραγματοποιείται από διαπιστευμένα εργαστήρια. 3. Την δειγματοληψία νερού από τα συστήματα ύδρευσης και τις πηγές ύδρευσης, κάθε έξι μήνες για τον έλεγχο της ανάπτυξης του βακτηρίου Legionella. Η μικροβιολογική ανάλυση των δειγμάτων και σε αυτή την περίπτωση πρέπει να γίνεται σε διαπιστευμένα εργαστήρια. Η αξιολόγηση του συστήματος επιτήρησης θα πρέπει να αναθεωρείται περιοδικά (π.χ κάθε δύο χρόνια) και πάντα μετά από κάθε βασική αλλά του συστήματος ή της διαχείρισης. Μια αρμόδια επίσημη αρχή θα πρέπει να αναλαμβάνει την αναθεώρηση. Όσο αναφορά τον πύργο ψύξης, θα πρέπει, υπό κανονικές συνθήκες εργασίας, να επιθεωρείται από ανεξάρτητη ομάδα παρακολούθησης, φορώντας τον κατάλληλο εξοπλισμό ασφαλείας για την αποτροπή εισπνοής αερολύματος. Βέβαια υπάρχουν κάποια τμήματα στην επιθεώρηση που μπορούν να ελεγχθούν εξωτερικά, όπως η παρουσία μικροβιακής ανάπτυξης, η παρουσία αλγών, διαρροές νερού, δημιουργία μπλοκαρίσματος ή εκτόξευσης στα σημεία εισαγωγής αέρα στο πύργο ψύξης. Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται κάποιος εξοπλισμός όπως κάποιος χλωριωτήρας, θα πρέπει να εξετάζεται η σωστή λειτουργία του και η επάρκεια χημικών ουσιών. Θα πρέπει να καταγράφονται κάποιες λεπτομέρειες σχετικά με την συντήρηση του συστήματος. ενώ θα πρέπει να παρακολουθούνται συνεχώς οι διαδικασίες συντήρησης για την τήρηση των κανόνων λειτουργίας. Επιπλέον κάθε αλλαγή ή τροποποίηση της λειτουργίας θα πρέπει να καταγράφεται λεπτομερώς στο εγχειρίδιο συντήρησης. Οι εστίες μόλυνσης από το βακτήριο της Legionella στα πλοία, κρουαζιερόπλοια και σε ξενοδοχεία, μπορούν να ανιχνευθούν σε πολύ πρώιμο στάδιο. Βέβαια αυτό είναι εφικτό, όταν εφαρμόζεται σχολαστικά ένα σύστημα επιτήρησης για ασθένειες του αναπνευστικού συστήματος και ακολουθούνται οι διαδικασίες για την λήψη μέτρων όταν ο αριθμός των κρουσμάτων αυξάνεται πάνω από ένα όριο. Δεδομένου ότι σε κάποιες περιπτώσεις η περίοδος επώασης της νόσου είναι μεγαλύτερη από την διάρκεια της κρουαζιέρας, τα κρούσματα μπορούν να μην εντοπιστούν, ακόμα και αν το πλοίο διαθέτει ένα σύστημα επιτήρησης. Ως εκ τούτου, κρίνεται σημαντικό κάθε φορά οι γιατροί, σε περιστατικά πνευμονίας, να ρωτούν αν οι ασθενείς έχουν κάνει κάποιο σχετικά πρόσφατο ταξίδι. Για την πρόληψη των εστιών μόλυνσης, θα πρέπει να διεξάγονται από υγειονομικούς επιθεωρητές και από εξωτερικές αρχές έλεγχοι προκειμένου το σύστημα να παρακολουθείται συστηματικά. Στην περίπτωση των ιαματικών λουτρών, των συστημάτων ζεστού νερού και των κολυμβητικών δεξαμενών, οι υγειονομικές αρχές θα πρέπει να επιθεωρούν τακτικά τις εγκαταστάσεις. Ο έλεγχος περιλαμβάνει και επιθεωρήσεις αρχείων σχετικά με την απολύμανση και τον καθαρισμό. 69

71 Ελέγχεται επίσης η επάρκεια του προσωπικού δηλαδή κατά πόσο διαθέτει τα κατάλληλα προσόντα για την συντήρηση των συστημάτων νερού. Η συμμετοχή σε ένα διεθνές σύστημα επιτήρησης είχε σαν αποτέλεσμα την βελτίωση της επιτήρησης και την αύξηση του ποσοστού ανίχνευσης του βακτηρίου σε πολλές Ευρωπαϊκές χώρες. Για παράδειγμα η ανίχνευση των περιστατικών στη Γαλλία, Ισπανία, Ιταλία και στις Κάτω Χώρες έχουν αυξηθεί σημαντικά λόγω της βελτίωσης του συστήματος επιτήρησης. Σε εθνικό επίπεδο υπάρχουν περιορισμοί στο σύστημα επιτήρησης της Νόσου κυρίως διότι, πολλοί ασθενείς με πνευμονία δεν υποβάλλονται στο διαγνωστικό τεστ για Legionella. Επιπλέον, πολλές χώρες δεν έχουν επιδημιολογική παρακολούθηση των εργαστηριακών εκθέσεων σχετικά με τα στοιχεία που συλλέγονται και αναφέρονται. Ολοένα παγκοσμίως, δημοσιεύονται νέα κρούσματα λόγω έξαρσης επιδημιών της Νόσου των Λεγεωνάριων, γεγονός που θα πρέπει να μας καθιστά ιδιαίτερα προσεκτικούς για την επικινδυνότητα της νόσου. Οι νέες ιατρικές και τεχνολογικές γνώσεις και οι βελτιωμένες διαγνωστικές μέθοδοι αποτελούν ένα ισχυρό όπλο για την πρόληψη και την αντιμετώπιση της νόσου. 70

72 Σκοπός Εργασίας Στην παρούσα εργασία ο σκοπός μας ήταν μελέτη της παρουσίας του βακτηρίου Legionella pneumophila στην περιοχή της Νοτιοδυτικής Ελλάδας. Για την επίτευξη του σκοπού αυτού τέθηκαν οι εξής επί μέρους στόχοι: - μελέτη της διασποράς του βακτηρίου Legionella pneumophila μέσω της ανίχνευσης και καταμέτρησης του βακτηρίου σε υδάτινα συστήματα σε όλα τα νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας και σε ξενοδοχειακά συγκροτήματα της Πάτρας. - διερεύνηση μέσω της γονοτυπικής αλληλούχισης και της φυλογενετικής ανάλυσης των ειδών Legionella, που επικρατούν στην Νοτιοδυτική Ελλάδα. - μελέτη των φυσικοχημικών και βιολογικών παραμέτρων που πιθανόν να σχετίζονται, με βάση την διεθνή βιβλιογραφία, με την ανάπτυξη πληθυσμών Legionella στα υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων, που περιελήφθησαν στο δείγμα. - συσχέτιση αυτών των φυσικοχημικών και βιολογικών παραμέτρων με την παρουσία και συγκέντρωση του βακτηρίου στα υδάτινα συστήματα που μελετήθηκαν και σύγκριση των ευρημάτων με τα δεδομένα της διεθνούς βιβλιογραφίας. - καταγραφή των διαγνωσμένων κρουσμάτων πνευμονίας και της Νόσου των Λεγεωνάριων που νοσηλεύονταν στα νοσοκομεία, έτσι ώστε να υπάρξουν επί πλέον στοιχεία για την παρουσία του βακτηρίου στην Νοτιοδυτική Ελλάδα. - αξιολόγηση της συνολικής κατάστασης που επικρατεί στην Νοτιοδυτική Ελλάδα σε σχέση με την διασπορά της Legionella, από την άποψη της Δημόσιας Υγείας, και διατύπωση αντίστοιχων προτάσεων 71

73 III.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 72

74 III.1. Μέθοδος Συνολικά αναλύθηκαν 91 δείγματα νερού από τα υδάτινα συστήματα 8 Νοσοκομείων της Νοτιοδυτική Ελλάδας και 25 δείγματα νερού από τα υδάτινα συστήματα 9 ξενοδοχείων στην ευρύτερη περιοχή της Πάτρας. Αρχικά πραγματοποιήθηκε, δειγματοληψία νερού και στην συνέχεια ακολούθησε ταυτοποίηση του βακτηρίου με τις κλασσικές καλλιεργητικές μεθόδους και τέλος ακολούθησε απομόνωση του DNA του βακτηρίου. Έπειτα έγινε ταυτοποίηση της Legionella pneumophila με τη Μοριακή Μέθοδο της PCR και τέλος τα θετικά προϊόντα της PCR επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση που πραγματοποιήθηκε στην Μονάδα Αλληλουχίας του Τμήματος Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν φυσικοχημικές (μέτρηση του ph, θερμοκρασίας, αγωγιμότητας) μικροβιολογικές αναλύσεις, (έλεγχος παρουσίας της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και 37 0 C και Pseudomonas aeruginosa). Εκτός από το εργαστηριακό κομμάτι της παρούσας διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε και καταγραφή των διαγνωσμένων κρουσμάτων πνευμονίας και της Νόσου των Λεγεωνάριων που νοσηλεύονταν στα νοσοκομεία. Η καταγραφή των κρουσμάτων (εβδομαδιαία καταγραφή των ασθενών που νοσηλεύονταν στα νοσοκομεία) πραγματοποιήθηκε με την βοήθεια των υπεύθυνων ιατρών, χωρίς την χρήση ερωτηματολογίου. III.1.1. Δειγματοληψία-Γενικά Η περιοχή δειγματοληψίας περιελάμβανε τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας και μεγάλα ξενοδοχειακά συγκροτήματα στην ευρύτερη περιοχή της πόλης των Πατρών (Εικόνα III.1.1). Τα δείγματα νερού συλλέχθηκαν από το Μάιο του 2008 έως το Δεκέμβριο του Προκειμένου να μας δοθεί άδεια πρόσβασης στις κλινικές των Νοσοκομείων πραγματοποιήθηκαν συγκεκριμένες ενέργειες, όπως τηλεφωνική επικοινωνία με τους επόπτες υγείας των Νοσοκομείων και γραπτή επιστολή στους Διοικητές των νοσοκομείων για την επίσημη χορήγηση άδειας παραλαβής δειγμάτων νερού από τις κλινικές των νοσοκομείων. Σχετικά με την πρόσβαση μας, στα ξενοδοχεία της ευρύτερης περιοχής των Πατρών, η λήψη την δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με την βοήθεια των εποπτών, της Διεύθυνσης Υγείας της Νομαρχίας Αχαΐας. 73

75 Όλα τα δείγματα νερού συνοδεύονταν στο εργαστήριο με ένα έντυπο δειγματοληψίας, (Παράρτημα 3), το οποίο συμπληρωνόταν αναλυτικά επί τόπου, με τα στοιχεία που αφορούσαν την δειγματοληψία. Το συμπληρωμένο έντυπο, για κάθε δείγμα ξεχωριστά χρησιμοποιήθηκε για την παραλαβή και την ανάλυση του δείγματος στο εργαστήριο. Πιο αναλυτικά, στο έντυπο αναγράφονταν η ημερομηνία δειγματοληψίας, η ώρα δειγματοληψίας, το όνομα δειγματολήπτη, το ακριβές σημείο δειγματοληψίας, στοιχεία που αφορούσαν την περιγραφή του δείγματος, τις συνθήκες δειγματοληψίας και τις φυσικοχημικές παραμέτρους του δείγματος. III.1.2. Σημεία Δειγματοληψίας Η επιλογή των σημείων δειγματοληψίας ήταν αντιπροσωπευτική για ολόκληρο το υδάτινο σύστημα. Με την βοήθεια της τεχνικής υπηρεσίας (με σχέδια των υδραυλικών εγκαταστάσεων) των εξεταζόμενων Νοσοκομείων επιλέγονταν τα σημεία δειγματοληψίας έτσι ώστε να περιλαμβάνουν όλο το σύστημα ύδρευσης του νοσοκομείου. Σχετικά με τα ξενοδοχεία η επιλογή των σημείων δειγματοληψίας πραγματοποιούνταν με την βοήθεια του υπεύθυνου του ξενοδοχείου. Η συλλογή των δειγμάτων νερού, έγινε από όλους τους ορόφους των κτιρίων, ενώ σε κάθε όροφο επιλέγονταν το πιο ακραίο σημείο καθώς και το μεσαίο σημείο. Σε ότι αφορά τα νοσοκομεία η συλλογή του ζεστού νερού έγινε από του καταιονιστήρες των δωματίων όλων των κλινικών και για τα ξενοδοχεία η συλλογή του ζεστού νερού πραγματοποιήθηκε από τους καταιονιστήρες των δωματίων. Η συλλογή του κρύου νερού, για τα νοσοκομεία και για τα ξενοδοχεία, πραγματοποιήθηκε από τις βρύσες των δωματίων. Η συλλογή του ζεστού νερού έγινε μετά από ροή του νερού από τον καταιονιστήρα τουλάχιστον 60 δευτερολέπτων έτσι ώστε να συλλεχθεί το αντιπροσωπευτικό δείγμα του ζεστού νερού που ρέει στο σύστημα. Δεν πραγματοποιήθηκε συλλογή άμεσου δείγματος ζεστού νερού. Η καταγραφή της θερμοκρασίας έγινε με θερμόμετρο που τοποθετήθηκε στο μέσο της στήλης του νερού κατά την διάρκεια της ροής. Η συλλογή του κρύου νερού πραγματοποιήθηκε μετά από ροή του νερού τουλάχιστον 60 δευτερολέπτων από τις βρύσες όλων των κλινικών των νοσοκομείων. Σχετικά με τα ξενοδοχεία η δειγματοληψία έγινε από τις βρύσες (κρύο νερό) και τους καταιονιστήρες (ζεστό νερό) δωματίων του ξενοδοχείου όλων των ορόφων που ήταν αντιπροσωπευτικά των διαφόρων διακλαδώσεων του συστήματος διανομής. Όλα τα δείγματα ανακινήθηκαν καλά και μετρήθηκε επί τόπου το υπολειματικό χλώριο. Είναι σημαντικό να 74

76 τονιστεί πως κατά την διάρκεια της δειγματοληψίας πάρθηκαν τα κατάλληλα μέτρα ασφαλείας και η συλλογή των δειγμάτων έγινε με γάντια και μάσκα προσώπου. Επιπλέον, σε όσα νοσοκομεία και ξενοδοχεία διέθεταν υδρόψυκτα συστήματα κλιματισμού πραγματοποιήθηκε συλλογή δείγματος νερού από την είσοδο, έξοδο και την ανακυκλοφορία του πύργου ψύξης, όπου βέβαια υπήρχε διαθέσιμη πρόσβαση στον πύργο ψύξης. AΓΡΙΝΙΟ ΜΕΣΟΛΟΓΓΙ ΡΙΟ ΑΡΑΞΟΣ ² ² ΠΑΤΡΑ ΑΙΓΙΟ ΚΑΛΑΒΡΥΤΑ ΠΥΡΓΟΣ Εικόνα III.1.1: Χάρτης με τα σημεία δειγματοληψίας 75

77 III.1.3. Διαδικασία Δειγματοληψίας Η δειγματοληψία και η μεταφορά των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του Health Protection Agency (HPA) (Nationanal Standard Method W1). Η θερμοκρασία μεταφοράς κατά τους καλοκαιρινούς μήνες, διατηρήθηκε με παγοκύστες, μεταξύ 6 0 C και 18 0 C, ενώ χρησιμοποιήθηκαν σκουρόχρωμες αποστειρωμένες φιάλες για την προστασία των δειγμάτων από το φως. Ο όγκος του νερού που συλλέχθηκε ήταν 1L σε σκουρόχρωμες γυάλινες αποστειρωμένες φιάλες με εσμυρισμένο πώμα. Για την αποτίμηση της μικροβιολογικής ποιότητας του νερού που υφίσταται απολύμανση με κάποιο οξειδωτικό μέσο (π.χ. χλώριο, βρώμιο κ.τ.λ.), πρέπει να διακοπεί άμεσα η δράση του απολυμαντικού. Στις φιάλες δειγματοληψίας, πριν από την αποστείρωση, προστέθηκε ένα αναγωγικό μέσο, πιο συγκεκριμένα το ενυδατωμένο θειοθειικό νάτριο (Na 2 S 2 O 3 x5h 2O), το οποίο δεν καταστρέφεται κατά την διάρκεια της αποστείρωσης. Συνήθως 180mg Na 2 S 2 O 3 x5h 2 O απαιτούνται για την εξουδετέρωση >50mg χλωρίου σε όγκο ενός λίτρου νερού. Η μέτρηση του υπολειμματικού χλωρίου πραγματοποιήθηκε επί τόπου κατά την διάρκεια της δειγματοληψίας με την μέθοδο DPD (Chlorine Free&Total Pocket Colorimeter II Test Kit ), ενώ η μέτρηση αγωγιμότητας και ph πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο αμέσως μετά το πέρας της δειγματοληψίας. Το χρονικό διάστημα που μεσολάβησε μεταξύ της δειγματοληψίας και της εργαστηριακής ανάλυσης των δειγμάτων ήταν όσο το δυνατό μικρότερο( 2-3 ώρες) Όταν τα δείγματα κατέφθαναν στο εργαστήριο, δεν καταψύχονταν και για την αποφυγή προβλημάτων, όλα τα δείγματα αναλύθηκαν την ίδια μέρα που πραγματοποιήθηκε και η συλλογή των δειγμάτων νερού. Είναι σημαντικό να ακολουθηθεί η σωστή διαδικασία δειγματοληψίας, δεδομένου ότι λανθασμένη διαδικασία καθιστά δύσκολη την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. III.1.4. Αριθμός δειγμάτων Ελήφθησαν συνολικά 91 δείγματα από 8 Νοσοκομεία της Δυτικής Ελλάδας και 25 δείγματα από 9 ξενοδοχεία από την περιοχή της Πάτρας. Όσον αφορά τα νοσοκομεία από τα 91 δείγματα τα 44 δείγματα προέρχονταν από καταιονιστήρα κλινικών, τα 43 από βρύση και τα 4 από πύργους ψύξης. Σχετικά με τις δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν στα ξενοδοχεία, τα 7 δείγματα προέρχονταν από τον πύργο ψύξης, τα 9 δείγματα ελήφθησαν από την βρύση των δωματίων και 76

78 τα 9 δείγματα από τον καταιονιστήρα των δωματίων. Συνολικά ελήφθησαν 25 δείγματα, εκ των οποίων τα 11 προέρχονταν από ζεστό νερό και τα 14 από κρύο νερό. III.1.5. Πύργος Ψύξης και Δειγματοληψία Πιο συγκεκριμένα οι πύργοι ψύξης των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων από τους οποίους ελήφθησαν τα δείγματα νερού, εκτός από ένα νοσοκομείο, ήταν όλοι τοποθετημένοι στην οροφή των κτιρίων και στην εικόνα που ακολουθεί φαίνεται το τυπικό σχεδιάγραμμα του πύργου ψύξης (Εικόνα III.1.5). Η κατάσταση των πύργων ψύξης από όπου ελήφθησαν τα δείγματα, δεν ήταν η προβλεπόμενη από υγειονομική άποψη, (σύμφωνα με όσα προβλέπονται από την Εγκύκλιο Υ2/Γ.Π./οικ.79305/ ) ενώ σε κάποιους πύργους δεν είχε πραγματοποιηθεί καθόλου συντήρηση. Το σύστημα των πύργων ψύξης σε όλα τα εξεταζόμενα νοσοκομεία και ξενοδοχεία βρίσκονταν εκτός λειτουργίας (κατά την διάρκεια του χειμώνα) για μεγάλο χρονικό διάστημα, η χρήση τους ήταν περιοδική, γίνονταν κυρίως τους καλοκαιρινούς μήνες, για αυτό και οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν εκείνο το χρονικό διάστημα. Η δειγματοληψία του νερού έγινε από την είσοδο, την έξοδο και την ανακυκλοφορία του πύργου ψύξης, βέβαια όπου αυτό ήταν εφικτό, διότι στις περισσότερες περιπτώσεις δεν ήταν δυνατή η λήψη του νερού λόγω απουσίας βάνας νερού στο σύστημα. 77

79 Εικόνα III.1.5: Σχεδιάγραμμα πύργου ψύξης. (Πηγή: Public Health Division, Victorian Government, Department of Human Services, Melbourne Victoria A Guide to Developing Risk Management Plans for Cooling Tower Systems. November 2001). III.1.6. Καταγραφή κρουσμάτων πνευμονίας Προκειμένου να υπάρξει μια συμπληρωματική εικόνα της διασποράς της Νόσου των Λεγεωνάριων στην περιοχή της Νοτιοδυτικής Ελλάδος, πραγματοποιήθηκε μια καταγραφή των κρουσμάτων πνευμονίας και των κρουσμάτων της Νόσου των Λεγεωνάριων στα Νοσοκομεία από τα οποία ελήφθησαν τα δείγματα νερού προς εξέταση για ανίχνευση του βακτηρίου Legionella pneumophila. Το χρονικό διάστημα της καταγραφής ήταν ένας χρόνος (από 01/09/2009 έως 1/09/2010) στα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδος, από τα οποία ελήφθησαν δείγματα νερού για την ανίχνευση και καταμέτρηση του βακτηρίου. Προκειμένου να καταγραφούν τα περιστατικά πνευμονίας που νοσηλεύονταν στα υπό έρευνα Νοσοκομεία, υπήρξε εβδομαδιαία τηλεφωνική επικοινωνία με τους υπεύθυνους γιατρούς των νοσοκομείων για την συστηματική καταχώριση του αριθμού των κρουσμάτων πνευμονίας και των κρουσμάτων της Νόσου των Λεγεωνάριων που νοσηλεύονταν. 78

80 Πιο συγκεκριμένα, για το Νοσοκομείο Α, υπήρξε επικοινωνία με τους ειδικευόμενους ιατρούς της Παθολογικής κλινικής, ενώ για το Νοσοκομείο Β, αρχικά υπήρξε επικοινωνία με τον υπεύθυνο λοιμωδών και στην συνέχεια με τον ειδικευόμενο ιατρό της Παθολογικής κλινικής. Όσο αναφορά το Νοσοκομείο Α, υπήρξε ελλιπής καταγραφή των κρουσμάτων, διότι δεν ήταν εφικτή η εβδομαδιαία επικοινωνία με τους ειδικευόμενους ιατρούς, επιπλέον δεν υπήρχε συστηματική τήρηση του αρχείου των ασθενών που νοσηλεύονταν. Στο Νοσοκομείο Γ, η καταγραφή γίνονταν μέσα από στοιχεία που μας παρείχε ο πνευμονολόγος και στο Νοσοκομείο Δ από στοιχεία που παρέιχε ο ειδικευόμενος ιατρός. Στο Νοσοκομείο Ε, η καταγραφή των κρουσμάτων πνευμονίας γίνονταν, για το χρονικό διάστημα των τεσσάρων πρώτων μηνών, μετά από επικοινωνία με τον υπεύθυνο λοιμωδών του Νοσοκομείου και στην συνέχεια από τον πνευμονολόγο-παθολόγο της Παθολογικής κλινικής. Στο Νοσοκομείο ΣΤ, υπήρξε εβδομαδιαία τηλεφωνική επικοινωνία με τον πνευμονολόγο ιατρό της Παθολογικής κλινικής, ενώ στο Νοσοκομείο Ζ και Η, δεν υπήρξε καταγραφή των κρουσμάτων, λόγω ελλειπούς τήρησης φακέλων ασθενών στα αναφερόμενα νοσοκομεία. Για το χρονικό διάστημα της καταγραφής, στο τέλος της εβδομάδας, υπήρξε τηλεφωνική επικοινωνία με τον εκάστοτε ιατρό, για την καταγραφή του αριθμού των κρουσμάτων πνευμονίας και την αιτιολογία των πνευμονιών που νοσηλεύονταν στο νοσοκομείο. Αξίζει να σημειωθεί πως, από όλα τα νοσοκομεία που εξετάστηκαν, μόνο στα Νοσοκομεία Α και Δ, πραγματοποιούνταν από το μικροβιολογικό εργαστήριο των νοσοκομείων, έλεγχοι με τη χρήση ειδικού διαγνωστικού τεστ, για την ανίχνευση του αντιγόνου του βακτηρίου Legionella pneumophila στα ούρα των ασθενών με πνευμονία. Σχετικά με τα νοσοκομεία που εξετάστηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή, θα πρέπει να αναφερθεί πως το Νοσοκομείο Α, καλύπτει μια αστική περιοχή, με πληθυσμό πάνω από , με δυναμικότητα περίπου 650 κλινών. Το Νοσοκομείο Β, καλύπτει μια αστική και αγροτική περιοχή των κατοίκων περίπου, έχοντας χωρητικότητα 93 κλινών, ενώ ετησίως νοσηλεύονται περίπου ασθενείς. Το Νοσοκομείο Γ έχει δυναμικότητα 30 κλίνες και βρίσκεται σε αγροτική περιοχή καλύπτοντας αγροτικό πληθυσμό, περίπου κατοίκων. Το Νοσοκομείο Δ, έχει δυναμικότητα 50 κλίνες και βρίσκεται σε μεγάλη αστική περιοχή (πληθυσμού πάνω από ), ενώ το Νοσοκομείο Ε, καλύπτει έναν αστικό πληθυσμό που ξεπερνά τους κατοίκους, με δυναμικότητα περίπου 100 κλινών. Το Νοσοκομείο ΣΤ, με περίπου 280 κλίνες, βρίσκεται σε αστική περιοχή, καλύπτοντας έναν πληθυσμό, περίπου κατοίκων. Τέλος, το Νοσοκομείο Ζ, το οποίο δόθηκε σε λειτουργία το 2006, έχει δυναμικότητα 120 κλινών και καλύπτει μια αγροτική περιοχή, περίπου κατοίκων, ενώ το Νοσοκομείο 79

81 Η (αποτελεί παράρτημα μεγαλύτερου Νοσοκομείου), διαθέτει λιγότερες από 100 κλίνες, καλύπτει ένα μεγάλο αριθμό αστικού πληθυσμού (πάνω από ). III.2. Υλικά και εργαστηριακές μέθοδοι III.2.1.Καλλιεργητική Μέθοδος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Pseudomonas aeruginosa ΟΡΓΑΝΑ/ ΥΛΙΚΑ /ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ Πίνακας III.2.1α: Όργανα για την καλλιεργητική μέθοδο ανίχνευσης του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa Όργανα Προέλευση Υδατόλουτρο πλαστικός κρίκος (loops) Υαλικά, Κωνικές φιάλες 500ml, 1L - GFL D3006 Petri dishes (τρυβλία) 90mm, 60mm Calna (Κωδικός ) Eppendorf, Safe Lock for 2/1.5 tuber Φίλτρα Διήθησης, Membrane Filter Type 0.45μm, 47mm Αυτόματη Πιπέτα (Pipetboy Plus) Eppendorf (Order No ) PALL Corporation, Life Sciences (Cat. No. P/N 66191) Technomara No Ηλεκτρονικός ζυγός Επωαστικός κλίβανος Αυτόκαυστο(υγρή αποστείρωση) GF 3000 (A&D Instruments) Memmert, WTB BINDER Yamato Autoclave SM52 Πεχάμετρο (ph meter) Consort (C830) Λάμπα UV (365nm 312 nm) Uvitec Limited (M ) Ψυγείο (2-8 C) Frigorex 80

82 Πίνακας III.2.1β: Υλικά για την καλλιεργητική μέθοδο ανίχνευσης του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa Διαλύματα Προέλευση Ποσότητα Nessler Reagent Hach, Germany (Cat.No σταγόνες Ethanol absolute 99% CARLOERBA (Code No ) 1ml Distilled dionized water (dd.h 2 O) Γλυκερόλη Τεστ οξειδάσης (Oxidase Strips) - Merck KGaA, Darmstadt, Germany Merck KGaA, Darmstadt, Germany (Cat.No ) - 5 ml 1 strip Πίνακας III.2.1γ: Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος Pseudomonas Agar Base (Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Σύσταση Ποσότητα (g/litre) Gelatin peptone 16.0 Casein hydrolysate 10.0 Potassium sulphate 10.0 Magnesium chloride 1.4 Agar 11.0 ph 7.1 ± 0.2 σε 25 C Πίνακας III.2.1δ: Σύσταση συμπληρώματος εκλεκτικού υποστρώματος, Pseudomonas CN Selective Supplement (Κωδικός: SR0102, Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Περιεχόμενο φιαλιδίου (κάθε φιαλίδιο χρησιμοποιείται για 500 ml θρεπτικού υποστρώματος) Ανά φιαλίδιο per litre Cetrimide 100.0mg 200.0mg Sodium nalidixate 7.5mg 15.0mg Πίνακας III.2.1ε: Σύσταση ζωμού ακεταμιδίου, Acetamide Nutrient Broth (Sigma-Aldrich Chemie, GmbH Buchs, Switzerland, Κωδικός 00185) Σύσταση Ποσότητα (g/litre) Acetamide 2.0 Dipotassium hydrogen phosphate 0.2 Ferrous sulfate Magnesium sulfate Sodium chloride 0.2 ph 7.0 ± 0.2 σε 37 C 81

83 Πίνακας III.2.1στ: Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος, KING-Agar B (Basis) (Κωδικός , Merck KGaA, Darmstadt, Germany) Σύσταση Ποσότητα (g/litre) Proteose-Pepton 20.0 Magnesium ssulfate 1.5 Tri-Potassium phosphate 3-hydrate 1.8 Agar 10.0 ph 7.1 ± 0.2 σε 25 C Πίνακας III.2.1ζ: Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος, Nutrient Agar Medium (Κωδικός: CM0309 Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Σύσταση Ποσότητα (g/litre) Tryptone 4.0 Glucose 5.0 Potassium dihydrogen phosphate 50.0 Potassium chloride 0.55 Calcium chloride Magnesium sulphate Ferric chloride Manganese sulphate Bromocresol green Agar ph 5.5 ± 0.2 III.2.1.A. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος Pseudomonas Selective Agar ΓΕΝΙΚΑ Για την παρασκευή του υποστρώματος για την ανίχνευση του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa, χρησιμοποιήθηκε το Pseudomonas Selective Agar (Oxoid, England). Το Pseudomonas Agar Base είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε με την προσθήκη των κατάλληλων συμπληρωμάτων (SR0102 ), να γίνεται επιλεκτικό για το είδος Pseudomonas aeruginosa. To υλικό βάσης είναι μια τροποποίηση του υλικού King s A Medium στο οποίο η παρουσία θειικού καλίου και χλωριούχου μαγνησίου ενισχύουν την παραγωγή χρωστικής. 82

84 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Διαλύονται 24.2g του υλικού Pseudomonas agar base, σε 500ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη του 1L. Το διάλυμα προσεκτικά φέρεται σε βρασμό σε φούρνο μικροκυμάτων για την πλήρη διάλυση της σκόνης και προστίθενται 5ml γλυκερόλης. Αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Στην συνέχεια τοποθετείται στο υδατόλουτρο για να παγώσει σε θερμοκρασία 50 C. Για την παρασκευή του εκλεκτικού συμπληρώματος Pseudomonas CN Supplement (SR0102), ενυδατώνεται το φιαλίδιο με προσθήκη 2ml μίγματος αιθανόλης/dd.η 2 Ο σε αναλογία 1/1. Το ενυδατωμένο φιαλίδιο προστίθεται στο διάλυμα και αναμιγνύεται καλά. Τέλος το διάλυμα στρώνεται άμεσα σε τρυβλία (petri dishes). Τα τρυβλία παραμένουν για μία μέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για να στεγνώσουν καλά, ελέγχονται για στειρότητα μικροσκοπικά και μακροσκοπικά και κατόπιν αποθηκεύονται στο ψυγείο (+4 C). III.2.1.Β. Παρασκευή ζωμoύ ακεταμιδίου, Acetamide Nutrient Broth ΓΕΝΙΚΑ Πρόκειται για ένα θρεπτικό μέσο, επιλεκτικό για την απομόνωση βακτηρίων που μεταβολίζουν το ακεταμίδιο, και χρησιμοποιείται στις διαδικασίες δοκιμής για την ανίχνευση των βακτηρίων Pseudomonas aeruginosa στο νερό. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Διαλύονται 2,56g του υλικού Acetamide Nutrient Broth, σε 950ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη του 1L. Το διάλυμα διαλύεται προσεκτικά και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι το 1 λίτρο. Ελέγχεται το ph και διορθώνεται ανάλογα. Αφού διαλυθεί καλά, αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Το διάλυμα διατηρείται σε στείρες συνθήκες και αποθηκεύεται στο ψυγείο (+4 C). 83

85 III.2.1.Γ. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος Nutrient Agar ΓΕΝΙΚΑ Για την ανακαλλιέργεια των ύποπτων αποικιών Pseudomonas aeruginosa, χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα Nutrient Agar (Oxoid, Cambridge, England). Πρόκειται για ένα θρεπτικό μέσο, επιλεκτικό για την απομόνωση βακτηρίων με cycloheximide. Συνιστάται για τον προσδιορισμό μικροοργανισμών που βρίσκονται στην διαδικασία της ζύμωσης. Το χρονικό διάστημα της επώασης του συγκεκριμένου υποστρώματος εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά του μικροοργανισμού που επιθυμούμε να προσδιορίσουμε και κυμαίνεται από 2 μέχρι 14 ημέρες. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Διαλύονται 37.5g του θρεπτικού υποστρώματος Nutrient Agar, σε 500ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη του 1L. Το διάλυμα προσεκτικά φέρεται σε βρασμό σε φούρνο μικροκυμάτων για την πλήρη διάλυση της σκόνης. Αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Στην συνέχεια τοποθετείται στο υδατόλουτρο για να παγώσει σε θερμοκρασία 50 C. Τέλος το διάλυμα στρώνεται άμεσα σε τρυβλία (petri dishes). Τα τρυβλία παραμένουν για μία μέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για να στεγνώσουν καλά, πραγματοποιείται μικροσκοπικός και μακροσκοπικός έλεγχος και κατόπιν αποθηκεύονται στο ψυγείο (+4 C). III.2.1.Δ. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος King s Agar B Medium ΓΕΝΙΚΑ Για την επιβεβαίωση των θετικών αποικιών Pseudomonas aeruginosa χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα KING Agar B (Merck Darmstadt, Germany). Πρόκειται για ένα θρεπτικό υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για την επιβεβαίωση αποικιών (φθορισμός), που ανακαλλιεργούνται από το θρεπτικό υπόστρωμα Pseudomonas Selective Agar. Το χρονικό διάστημα της επώασης του συγκεκριμένου υποστρώματος κυμαίνεται από 1 μέχρι 5 ημέρες. 84

86 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Διαλύονται 16.75g του υλικού King s Agar B Medium, σε 500ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη του 1L. Το διάλυμα προσεκτικά φέρεται σε βρασμό σε φούρνο μικροκυμάτων για την πλήρη διάλυση της σκόνης. Αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Στην συνέχεια τοποθετείται στο υδατόλουτρο για να παγώσει σε θερμοκρασία 50 C. Τέλος το διάλυμα στρώνεται άμεσα σε τρυβλία (petri dishes). Τα τρυβλία παραμένουν για μία μέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για να στεγνώσουν καλά, ελέγχονται για στειρότητα μικροσκοπικά και μακροσκοπικά και κατόπιν αποθηκεύονται στο ψυγείο (+4 C). III.2.1.Ε. Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης της Pseudomonas aeruginosa Η ανίχνευση και η καταμέτρηση του βακτηρίου της Pseudomonas aeruginosa πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις πρότυπες μεθόδους ISO 16266:2006. Πιο συγκεκριμένα διηθήθηκαν 250ml δείγματος νερού υπό κενό από μεμβράνη Mixed cellulose ester (PALL Corporation, Life Sciences) με μέγεθος πόρων 0,45μm. Η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε θρεπτικό υλικό Pseudomonas Selective Agar (Oxoid, England) που περιέχει το C-N supplement. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 36 ο C ± 2 ο C για 44 ώρες ± 4 ώρες. Στη συνέχεια έγινε καταμέτρηση των τυπικών αποικιών της Pseudomonas aeruginosa που είχαν χρώμα γαλάζιο/πράσινο και φθορίζουν υπό ακτινοβολία 360±20nm. Οι αποικίες άλλου χρώματος που φθορίζουν υπό UV θεωρήθηκαν ύποπτες και ακολουθήθηκε επιβεβαίωση με το ζωμό ακεταμιδίου. Οι ύποπτες αποικίες εμβολιάστηκαν σε ζωμό ακεταμιδίου στους 36 ο C ± 2 ο C για 22 ± 2 ώρες και στη συνέχεια έγινε προσθήκη 1-2 σταγόνων Nessler Reagent (Hach, Germany). Ο σχηματισμός κεραμιδί ιζήματος δίνει θετικό επιβεβαιωτικό αποτέλεσμα και οι ύποπτες αποικίες είναι Pseudomonas aeruginosa. Επίσης οι καφέ-κόκκινες αποικίες που δεν φθορίζουν υπό UV θεωρήθηκαν ύποπτες και ακολουθήθηκε επιβεβαίωση με το test οξειδάσης, το ζωμό ακεταμιδίου και το King s Agar B (Merck, Germany) όπως περιγράφονται στις επιβεβαιωτικές δοκιμές παρακάτω: 85

87 Επιβεβαιωτικές δοκιμές Αρχικά πραγματοποιήθηκε έλεγχος των ύποπτων καφέ-κόκκινων αποικιών με τεστ οξειδάσης ως ακολούθως. 1.ΤΕΣΤ ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ α. Τοποθέτηση κάθε μεμονωμένης ύποπτης αποικίας σε Oxidase Strips (Merck KGaA, Darmstadt, Germany ). β. Εμφάνιση μπλε-ιώδους χρώματος εντός 10 δευτερολέπτων θεωρείται θετική αντίδραση (θετικό τεστ οξειδάσης) Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανακαλλιέργεια των θετικών στο τεστ οξειδάσης αποικιών σε θρεπτικό υπόστρωμα King s Agar B και εμβολιασμός σε ζωμό ακεταμιδίου. 2. KING S AGAR B MEDIUM α. Επώαση των ύποπτων αποικιών στους 36 ο C ± 2 ο C μέχρι 5 ημέρες (συνήθως 24 ώρες αρκούν). β. Έλεγχος τυχόν φθορισμού υπό UV ακτινοβολία καθημερινά. Ο φθορισμός δίνει θετικό αποτέλεσμα. 3. ΖΩΜΟΣ ΑΚΕΤΑΜΙΔΙΟΥ, ACETAMIDE NUTRIENT BROTH α. Εμβολιασμός αποικιών από το Nutrient agar σε σωληνάκι που περιέχει ζωμό ακεταμιδίου (acetamide broth). β. Επώαση στους 36 ο C ± 2 ο C για 22 ± 2 ώρες. Προσθήκη 1-2 σταγόνων Nessler Reagent (Hach, Germany). Αν σχηματιστεί κεραμιδί ίζημα, τότε οι ύποπτες αποικίες θεωρούνται Pseudomonas aeruginosa. Οι ύποπτες καφέ-κόκκινες αποικίες που έδιναν θετικό τεστ οξειδάσης και συγχρόνως φθόριζαν στο KING Agar B και παρήγαγαν αμμωνία σε ζωμό ακεταμιδίου (σχηματισμός κεραμιδί ιζήματος) θεωρήθηκαν αποικίες Pseudomonas aeruginosa. 86

88 III.2.2. Καλλιεργητική Μέθοδος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας(ΟΜΧ) στους 22 ο C και στους 37 ο C ΟΡΓΑΝΑ/ ΥΛΙΚΑ /ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ Πίνακας III.2.2α: Όργανα για την καλλιεργητική μέθοδο ανίχνευσης της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 ο C και στους 37 ο C Όργανα Προέλευση Υδατόλουτρο GFL D3006 Petri dishes (τρυβλία) 90mm Calna (Κωδικός ) Αυτόκαυστο (υγρή αποστείρωση) Ηλεκτρονικός ζυγός Yamato Autoclave SM52 GF 3000 (A&D Instruments) Επωαστικός κλίβανος, 22 ο C και στους WTW TS i, WTB BINDER, 37 ο C Καταμετρητής αποικιών WTW BZG 30 Υαλικά, Κωνικές φιάλες 500ml, 1L - Πίνακας III.2.2β: Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος Water plate count agar (ISO) (Κωδικός: CM1012 Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Σύσταση Ποσότητα (g/litre) Tryptone 6.0 Yeast Extract 3.0 Agar 15.0 ph 7.2 ± 0.2 σε 25 C III.5.2.Α. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας (Total Count) στους 22 C και στους 37 C ΓΕΝΙΚΑ Για την παρασκευή του υποστρώματος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 C και 37 C, χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα Water Plate Count Agar (ISO), (Oxoid, England). Το συγκεκριμένο υπόστρωμα είναι ένα μη επιλεκτικό θρεπτικό 87

89 μέσο για την καλλιέργεια μικροοργανισμών στο νερό σύμφωνα με το την πρότυπη μέθοδο ISO 6222:1999 για την καταμέτρηση των μικροοργανισμών που μπορούν να αναπτυχθούν στους 37 C και στους 22 C. Σε όλα τα είδη των νερών (υπόγεια, πόσιμα κτλ.) περιέχονται μια ποικιλία μικροοργανισμών και η καταμέτρηση τους παρέχει πληροφορίες για την μικροβιακή ποιότητα του νερού. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Διαλύονται 12g του υλικού Water Plate Count Agar, σε 500ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη του 1L. Το διάλυμα προσεκτικά φέρεται σε βρασμό σε φούρνο μικροκυμάτων για την πλήρη διάλυση της σκόνης. Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Στην συνέχεια τοποθετείται στο υδατόλουτρο για να παγώσει σε θερμοκρασία, 45±1 C και έπειτα χρησιμοποιείται για την ενσωμάτωση ενός 1ml δείγματος. III.5.2.Β. Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης τηςολικής μεσόφιλης Χλωρίδας Η ανίχνευση και καταμέτρηση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 ο C και στους 37 ο C πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις πρότυπες μεθόδους ISO 6222:1999. Πιο συγκεκριμένα τοποθετήθηκε 1ml από το εξεταζόμενο δείγμα νερού σε καθένα από 2 τρυβλία Petri διαμέτρου 9cm. Στη συνέχεια προστέθηκαν στα τρυβλία 15-20ml θρεπτικό υλικό Plate Count Agar (Oxoid, England), το οποίο έχουμε διατηρήσει σε υγρή μορφή (~50 ο C) κλασσική μέθοδος pour plate. Όλη η διαδικασία δεν υπερέβη το χρονικό διάστημα των 15 min. Πραγματοποιήθηκε καλή ανάμιξη του δείγματος νερού με το θρεπτικό υλικό, κουνώντας προσεκτικά τα τρυβλία κυκλικά. Αφού τα δείγματα στερεοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, επωάστηκαν τα τρυβλία στους 36 ο C ± 2 ο C για 44 ώρες ± 4 ώρες και στους 22 ο C ± 2 ο C για 68 ώρες ± 4 ώρες. Εν τέλει, έγινε καταμέτρηση όλων των εμφανιζομένων αποικιών σε ειδικό καταμετρητή για κάθε θερμοκρασία και τα αποτελέσματα αναγράφηκαν σε CFU/ml. 88

90 III.5.3. Καλλιεργητική Μέθοδος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Legionella spp. ΥΛΙΚΑ/ ΟΡΓΑΝΑ /ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ Πίνακας III.5.3α: Υλικά για την καλλιεργητική μέθοδο ανίχνευσης του βακτηρίου Legionella spp. Διαλύματα Προέλευση Ποσότητα PBS Tablets (Phosphate Buffer Saline) GIBCO TM. Invitrogen Corporation (UK) 10ml Polymixin B-sulfate Merck KGaA (Cat.No 5291) 16 μl Sodium Chloride (NaCl) SIGMA-ALDRICH (Cat.No 31434) - Potassium chloride (KCl) Merck KGaA (Cat.No ) - Hydrochloric acid fuming 37% Merck KGaA (Cat.No ) - Tween 20 (Polysorbate) Merck KGaA (Cat.No ) 144μl Ethanol absolute 99% CARLOERBA (Code No ) - Distilled Deionized ml( ddh 2 O) - - Θετικό στέλεχος Lenticules discs Legionella pneumophila Health Protection Agency (Cat No ) Strain No: NCTC

91 Πίνακας III.5.3β: Όργανα για την καλλιεργητική μέθοδο ανίχνευσης του βακτηρίου Legionella spp. Όργανα Προέλευση Φίλτρα Διήθησης, Polyamide Membrane Filter Type 0,22 μm, 47mm Millipore, USA (Cat.No GSWGO47S7) Eppendorf Safe Lock for2/1.5 tuber Eppendorf (Order No ) Petri dishes (τρυβλία) 60mm CALNA (Code No ) Υδατόλουτρο Πλαστικός κρίκος, falkon 50ml, 15 ml, μεταλλικό αποστειρωμένο spreader GFL D3006 Αυτόματη Πιπέτα (Pipetboy Plus) Technomara (Code No ) - Σκουρόχρωμη, στενόλαιμη φιάλη δειγματοληψίας με εσμυρισμένο πώμα 1000ml, κωνικές φιάλες, υαλικά - Ηλεκτρονικός ζυγός Επωαστικός κλίβανος Αυτόκαυστο(υγρή αποστείρωση) Ψυγείο (2-8 C) Επωαστικός Κλίβανος με παροχή CO 2 GF 3000 (A&D Instruments) Memmert, WTB BINDER Yamato Autoclave SM52 Frigorex Heal force HF 90 Smart Cell Συσκευή φυγοκέντρησης SIGMA 3K30, Laboratory Centrifuges SIGMA 3K30 High- Speed Refrigerated Centrifuge, max capacity 4 x 100 ml SIGMA Θάλαμος κάθετης νηματικής ροής CYTAIR 155, FLUFRANCE, Equipments Scientifiques Ind. Συσκευή Διήθησης υπό κενό PALL Gelman Laboratory No Αποστειρωμένη σακούλα (stomacher bag) Seward Lab System circulator Model 6141 Patemt Appln No Στερεοσκόπιο VM, VMT 1x,2x Bacacos Japan Πίνακας III.5.3γ: Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος Legionella CYE Agar Base (Κωδικός: CM0655 Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Σύσταση Ποσότητα (g/litre) Activated charcoal 2.0 Yeast extract 10.0 Agar

92 Πίνακας III.5.3δ: Σύσταση συμπληρώματος εκλεκτικού υποστρώματος, Legionella (GVPC) Selective Supplement (Κωδικός : SR0152 Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Σύσταση Glycine (Ammonia free) Vancomycin hydrochloride Polymyxin B sulphate Cycloheximide Περιεχόμενο φιαλιδίου (κάθε φιαλίδιο χρησιμοποιείται για 500 ml θρεπτικού υποστρώματος) 1.5 g 0.5 mg IU 40.0 mg Πίνακας III.5.3ε: Σύσταση συμπληρώματος εκλεκτικού υποστρώματος Legionella BCYE growth Supplement (Κωδικός: SR0110, Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Σύσταση φιαλιδίου(1 φιαλίδιο ανά 100ml Ποσότητα ανά υποστρώματος) φιαλίδιο per litre Buffer/Potassium hydroxide 1.0g 10g Ferric pyrophosphate 0.025g 0.25g L-cysteine HCl 0.04g 0.4g α-ketoglutarate 0.1g 1.0g Πίνακας III.5.3ζ: Σύσταση συμπληρώματος εκλεκτικού υποστρώματος, Legionella BCYE growth Supplement without L-cysteine (Κωδικός : SR0175 Oxoid Ltd., Hampshire, UK) Σύσταση (κάθε φιαλίδιο χρησιμοποιείται για 100 ml θρεπτικού υποστρώματος) ACES Buffer/Potassium hydroxide 1.0g Ferric pyrophosphate 0.025g a ketoglutarate 0.1g Ποσότητα φιαλιδίου 91

93 III.5.3. Α. Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Legionella spp. ΓΕΝΙΚΑ Για την παρασκευή του υποστρώματος για την ανίχνευση και καταμέτρηση του βακτηρίου Legionella spp. χρησιμοποιήθηκε αρχικά CYE Agar Base, Charcoal Yeast Extract Agar for the isolation of Legionellaceae, (CM0655) (Oxoid, England). Το CYE Agar Base Legionella είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε με την προσθήκη των κατάλληλων συμπληρωμάτων (SR0152, SR0110, SR0175), να γίνεται επιλεκτικό για το είδος Legionella. Διάφορες μελέτες από τον Fallon έχουν γίνει σχετικά με τον παθογόνο μικροοργανισμό που προκαλεί την Νόσο των Λεγεωνάριων (Fallon 1979). Σύμφωνα με τους Feeley et al. περιγράφεται μια τροποποίηση του F-G Agar (Feeley et al. 1978) στο οποίο το acid hydrolysed casein, αντικαταστάθηκε από το yeast extract και η πηγή πρωτεϊνών και αμύλου αντικαταστάθηκε από τον ενεργό charcoal Norit A σε τελική συγκέντρωση 0.2% (w/v). Το συγκεκριμένο θρεπτικό υπόστρωμα, το οποίο ονομάστηκε CYE Agar (Feely et al. 1979) έχει συμπληρωθεί περαιτέρω με ACES Buffer και α-κετογλουταρικό και περιγράφεται στη βιβλιογραφία ως BCYE-α Medium (Edelstein 1981), το οποίο έχει αποδειχθεί ότι παρέχει την βέλτιστη αξιοποίηση των ειδών Legionellaceae σε μικρότερο χρονικό διάστημα επώασης από περιβαλλοντικά και κλινικά δείγματα (PHLS 1983). ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΘΡΕΠΤΙΚΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ GVPC AGAR Πιο συγκεκριμένα για την παρασκευή του θρεπτικού υποστρώματος GVPC ζυγίζονται 13,88 g CYE Agar Base, και διαλύονται σε 500ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη του 1 L. Το διάλυμα προσεκτικά φέρεται σε βρασμό σε φούρνο μικροκυμάτων για την πλήρη διάλυση της σκόνης. Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Στην συνέχεια τοποθετείται στο υδατόλουτρο για να παγώσει σε θερμοκρασία 45±1 C. Στην συνέχεια προστίθεται άμεσα το εκλεκτικό συμπλήρωμα SR0152 το οποίο έχει ενυδατωθεί με 10 ml dd.h 2 O. Το διάλυμα αναδεύεται καλά και στην συνέχεια προστίθεται επιπλέον το εκλεκτικό συμπλήρωμα BCYEα Legionella Growth Supplement SR0110A, το οποίο έχει ενυδατωθεί με 10 ml dd.h 2 O. Το τελικό ph του διαλύματος πρέπει να είναι 6.9 ±0.2. Τέλος το διάλυμα στρώνεται άμεσα σε τρυβλία (petri dishes). Τα τρυβλία παραμένουν για μία μέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για να στεγνώσουν καλά, ελέγχονται για στειρότητα μικροσκοπικά και μακροσκοπικά και κατόπιν αποθηκεύονται στο ψυγείο (+4 C). 92

94 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΘΡΕΠΤΙΚΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ BCYE AGAR ΜΕ L-CYSTEINE (BCYE+) Πρόκειται για ένα εκλεκτικό συμπλήρωμα που χρησιμοποιείται για την προκαταρκτική ταυτοποίηση των πιθανών ειδών Legionella. Πιο συγκεκριμένα για την παρασκευή του θρεπτικού υποστρώματος Legionella BCYE growth Supplement BCYE Agar without L- Cysteine ζυγίζονται 2,5 g CYE Agar Base (CM0655), και διαλύονται σε 90ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη των 250ml. Το διάλυμα προσεκτικά φέρεται σε βρασμό σε φούρνο μικροκυμάτων για την πλήρη διάλυση της σκόνης. Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min και τοποθετείται στο υδατόλουτρο για να παγώσει σε θερμοκρασία στους 45±1 C. Στην συνέχεια προστίθεται άμεσα το εκλεκτικό συμπλήρωμα SR0110 το οποίο έχει ενυδατωθεί με 10 ml dd.h 2 O. Το τελικό ph του διαλύματος πρέπει να είναι 6.9 ±0.2. Τέλος το διάλυμα στρώνεται άμεσα σε τρυβλία (petri dishes). Τα τρυβλία παραμένουν για μία μέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για να στεγνώσουν καλά, ελέγχονται για στειρότητα μικροσκοπικά και μακροσκοπικά και κατόπιν αποθηκεύονται στο ψυγείο (+4 C). ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΘΡΕΠΤΙΚΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ BCYE AGAR ΧΩΡΙΣ L-YSTEINE (BCYE-) Πρόκειται για ένα εκλεκτικό συμπλήρωμα (στο οποίο δεν περιέχεται η L-Cysteine) για την προκαταρκτική ταυτοποίηση των πιθανών ειδών Legionella. Πιο συγκεκριμένα για την παρασκευή του θρεπτικού υποστρώματος BCYE Agar without L-Cysteine ζυγίζονται 2,5 g CYE Agar Base (CM0655), και διαλύονται σε 90ml απεσταγμένου νερού σε κωνική φιάλη των 250ml. Το διάλυμα προσεκτικά φέρεται σε βρασμό σε φούρνο μικροκυμάτων για την πλήρη διάλυση της σκόνης. Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min και τοποθετείται στο υδατόλουτρο για να παγώσει σε θερμοκρασία στους 45±1 C. Στην συνέχεια προστίθεται άμεσα το εκλεκτικό συμπλήρωμα SR0175 το οποίο έχει ενυδατωθεί με 10 ml dd.h 2 O. Το τελικό ph του διαλύματος πρέπει να είναι 6.9 ±0.2. Τέλος το διάλυμα στρώνεται άμεσα σε τρυβλία (petri dishes). Τα τρυβλία παραμένουν για μία μέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για να στεγνώσουν καλά, ελέγχονται για στειρότητα μικροσκοπικά και μακροσκοπικά και κατόπιν αποθηκεύονται στο ψυγείο (+4 C). ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ PBS Σε 500ml απεσταγμένου νερού διαλύεται μία ταμπλέτα PBS, αναδεύεται καλά και το διάλυμα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο στους C για 15 min. 93

95 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ACID BUFFER, PH=2.2±0.2 Αναμιγνύονται 3.9 ml HCL συγκέντρωσης 0,4 mol/l με 25 ml KCl συγκέντρωσης 0,4 mol/ L. Το διάλυμα αναδεύεται καλά και το ph ρυθμίζεται στο 2.2±0.2 με προσθήκη καυστικού νατρίου. Το ρυθμιστικό διάλυμα φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη φιάλη για περίπου ένα μήνα. III.5.3.Β.Καλλιεργητική Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης της Legionella spp. (Πρωτόκολλο HPA, National Standard Method, W12: Detection and enumeration of Legionella species by filtration and centrifugation) ΓΕΝΙΚΑ-ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Η καλλιέργεια των μικροοργανισμών σε θρεπτικά εκλεκτικά υποστρώματα είναι μια αξιόπιστη πρακτική που ακολουθείται σήμερα από τα κέντρα αναφοράς του βακτηρίου Legionella και τα αναλυτικά μικροβιολογικά εργαστήρια. Ενώ τα πλεονεκτήματά της είναι η αξιοπιστία, το χαμηλό κόστος και η εύκολη εφαρμογή, τα μειονεκτήματα της αφορούν κυρίως το γεγονός ότι χρειάζονται από 2 έως 14 ημέρες για να αναπτυχθεί η επιθυμητή αποικία και την πιθανότητα να αναπτυχθούν και άλλα βακτήρια ή μύκητες που θα αλλοιώσουν την εικόνα που αναμένεται. Για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Legionella spp. σε δείγματα νερού ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο της καλλιεργητικής μεθόδου του Health Protection Agency, National Standard Method, W12: Detection and enumeration of Legionella species by filtration and centrifugation (NHS 2006). Για τη διαδικασία της ανίχνευσης του βακτηρίου με την καλλιεργητική μέθοδο χρησιμοποιήθηκε θάλαμος κάθετης νηματικής ροής σε ειδικό χώρο. Παρόλο που το βακτήριο της Legionella ανήκει στην κατηγορία των μικροοργανισμών, Επικινδυνότητας 2, ο θάλαμος κάθετης νηματικής ροής κρίνεται απαραίτητος για την διαδικασία του πρωτοκόλλου. Αρχικά έγινε καλή ανάδευση του 1 L δείγματος νερού για φορές. Στη συνέχεια διηθήθηκαν υπό κενό περίπου 750ml νερού μέσω μεμβράνης Polyamide (Millipore, USA) μεγέθους πόρων 0,22 μm, 47mm. Ο υπόλοιπος όγκος δείγματος νερού χρησιμοποιήθηκε ακολούθως, 1ml για την ανίχνευση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 ο C και στους 37 ο C και 250ml για την ανίχνευση της Pseudomonas aeruginosa. Πραγματοποιούνταν καταγραφή του ακριβή όγκου για όλα τα δείγματα νερού που διηθούνταν κάθε φορά. 94

96 Μετά την διήθηση η μεμβράνη με αποστειρωμένη τσιμπίδα μεταφέρθηκε με προσοχή σε ειδική αποστειρωμένη σακούλα (stomacher bag), που περιείχε 10ml διαλύματος PBS. Ακολούθησε τρίψιμο του φίλτρου με τα δάχτυλα, έτσι ώστε το φίλτρο να είναι σε επαφή με το PBS τουλάχιστον για 2 min. Ο χρόνος τριψίματος ήταν ίδιος για όλα τα δείγματα. Στην συνέχεια με προσοχή μεταφέρθηκε όσο το δυνατότερο περισσότερο υγρό (κατά προτίμηση όλος ο όγκος του υγρού), από το stomacher bag σε centrifuge tubes (falkon) όγκου 50ml. Καταγράφηκε ο τελικός όγκος που μεταφέρθηκε και η μεμβράνη διήθησης απορρίφθηκε. Ακολούθησε φυγοκέντρηση των centrifuge tubes στις 6000x g (6000 RCF ) για 10min, σε θερμοκρασία 21 o C, με φρένο. Το υπερκείμενο υγρό, εκτός του 1ml, αφαιρέθηκε με προσοχή χωρίς αναταραχή του δείγματος. Ο τελικός όγκος του 1 ml, ανακινήθηκε καλά (vortex) έτσι ώστε να γίνει κατακρήμνιση του ιζήματος με το υπολειπόμενο 1 ml. Ο όγκος αυτός (1 ml) αποτέλεσε τον τελικό όγκο του συμπυκνώματος, στον οποίο πραγματοποιήθηκε επεξεργασία με τους ακόλουθους τρεις τρόπους : Heat treatment (A), Acid treatment (B), Untreatead (Γ). Παράλληλα με την εξέταση των δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκε θετικό στέλεχος γνωστής συγκέντρωσης Legionella pneumophila, (lenticules discs) για την καλλιέργεια θετικών αποικιών Legionella pneumophila. Η διαδικασία της καλλιεργητικής μεθόδου που ακολουθήθηκε για το θετικό στέλεχος Legionella pneumophila NCTC 12821, γνωστής συγκέντρωσης, ήταν παρόμοια με αυτή των αγνώστων δειγμάτων. Επεξεργασία (Α): Heat treatment Μεταφέρθηκαν 0.2ml του τελικού συμπυκνώματος (από το 1 ml) σε eppendorf (1.5ml), το οποίο τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 50 o C για 30min± 2min. Ακολούθησε άμεσα καλή ανάδευση του δείγματος (vortex) και πραγματοποιήθηκε επίστρωση 0.1 ml με μεταλλικό αποστειρωμένο spreader σε τρυβλία Petri διαμέτρου 9cm με θρεπτικό υλικό Legionella Selective Supplement, GVPC. Τα τρυβλία παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου, για να απορροφήσουν καλά το υγρό και αφού τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένη πλαστική σακούλα (stomacher bag), σφραγίστηκαν με ταινία και επωάστηκαν σε κλίβανο με 2,5 % CO 2 σε θερμοκρασία 36 ο C± 2 ο C, για το χρονικό διάστημα των 10 ημερών. Επεξεργασία (Β): Acid treatment Μεταφέρθηκαν 0.2ml του τελικού συμπυκνώματος(από το 1 ml) σε eppendorf (1.5ml), στο οποίο προστέθηκε ίσος όγκος (0.2ml) ρυθμιστικού διαλύματος οξέος) acid buffer με ph= 2.2±0.2. Μετά από χρονικό διάστημα 5min± 30sec, πραγματοποιήθηκε επίστρωση 0.1 ml με 95

97 μεταλλικό αποστειρωμένο spreader σε τρυβλία Petri διαμέτρου 9cm με θρεπτικό υλικό Legionella Selective Supplement, GVPC, (Oxoid England). Τα τρυβλία παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου, για να απορροφήσουν καλά το υγρό. Στην συνέχεια τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένη πλαστική σακούλα (stomacher bag), σφραγίστηκαν με ταινία και επωάστηκαν σε κλίβανο με 2,5 % CO 2 σε θερμοκρασία 36 ο C± 2 ο C, για το χρονικό διάστημα των 10 ημερών. Επεξεργασία ( Γ ): Untreated Πραγματοποιήθηκε επίστρωση με μεταλλικό αποστειρωμένο spreader, 0.1ml τελικού συμπυκνώματος σε τρυβλία Petri διαμέτρου 9cm με θρεπτικό υλικό Legionella Selective Supplement, GVPC. Τα τρυβλία παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου, για να απορροφήσουν καλά το υγρό. Στην συνέχεια τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένη πλαστική σακούλα (stomacher bag), σφραγίστηκαν με ταινία και επωάστηκαν σε κλίβανο με 2,5 % CO 2 σε θερμοκρασία 36 ο C± 2 ο C, για το χρονικό διάστημα των 10 ημερών. Η εξέταση και καταγραφή ανάπτυξης αποικιών όλων των τρυβλίων πραγματοποιούνταν ανά δύο με τρεις μέρες μέχρι και την δέκατη μέρα. Οι ύποπτες αποικίες εμφανίζονταν στο στερεοσκόπιο ως εξής: λευκές με «εσμυρισμένη» (μορφή σπασμένου γυαλιού), ιριδίζουσα εμφάνιση. Οι χαρακτηριστικές αποικίες του βακτηρίου στο θρεπτικό υπόστρωμα έχουν ομαλή εμφάνιση και συχνά είναι άσπρες ή γκρι-μπλε-μωβ, αλλά κάποιες φορές εμφανίζονται να έχουν χρώμα καφέ, ροζ, απαλό πράσινο ή βαθύ κόκκινο. Κατά την εξέταση όλων των τρυβλίων GVPC μετά την δέκατη μέρα, επιλέχθηκαν με τον κρίκο δύο με τρεις ύποπτες χαρακτηριστικές αποικίες από κάθε είδος. Οι ύποπτες αποικίες ανακαλλιεργούνταν παράλληλα σε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα BCYE with L-cysteine (BCYE +) και σε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα BCYE without L-cysteine (BCYE -). Τα τρυβλία τοποθετούνταν σε αποστειρωμένη πλαστική σακούλα (stomacher bag) σε κλίβανο με 2,5 % CO 2 στους 36 ο C για 2 με 3 μέρες το ελάχιστο. Οι αποικίες που αναπτύσσονταν στο θρεπτικό υπόστρωμα BCYE (+) και δεν αναπτύσσονταν στο θρεπτικό υπόστρωμα BCYE ( ) θεωρήθηκαν πιθανές (ύποπτες) αποικίες Legionella spp. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν επιβεβαιωτικές δοκιμές για την ταυτοποίηση του βακτηρίου. 96

98 III.5.3.Γ.Καλλιεργητική Μέθοδος ανίχνευσης και καταμέτρησης της Legionella spp. (Πρωτόκολλο ISO 11731: Water quality-detection and enumeration of Legionella ) ΓΕΝΙΚΑ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο περιγράφει μια καλλιεργητική μέθοδο για την ανίχνευση του βακτηρίου Legionella spp. και για τον προσδιορισμό του αριθμού των αποικιών στα περιβαλλοντικά δείγματα. Χρησιμοποιείται σε όλα τα περιβαλλοντικά δείγματα συμπεριλαμβανομένου πόσιμου, βιομηχανικού επεξεργασμένου και επιφανειακού νερού. Για την ανίχνευση και καταμέτρηση της Legionella spp. στα τελευταία δείγματα νερού που ελήφθησαν από τα νοσοκομεία, ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο της καλλιεργητικής μεθόδου International Standard, ISO 11731: Water quality-detection and enumeration of Legionella (ISO 1998). Για τη διαδικασία της ανίχνευσης του βακτηρίου με την καλλιεργητική μέθοδο χρησιμοποιήθηκε θάλαμος κάθετης νηματικής ροής σε ειδικό χώρο. Παρόλο που το βακτήριο της Legionella ανήκει στην κατηγορία των μικροοργανισμών, Επικινδυνότητας 2, ο θάλαμος κάθετης νηματικής ροής κρίνεται απαραίτητος για την διαδικασία του πρωτοκόλλου. Αρχικά και πρίν από τη διήθηση του δείγματος, έγινε καλή ανάδευση του 1 L δείγματος νερού για φορές. Στη συνέχεια διηθήθηκαν υπό κενό, 750ml νερού μέσω μεμβράνης Polyamide (Millipore, USA) μεγέθους πόρων 0,22 μm, 47mm. Τα υπόλοιπα 250ml δείγματος νερού χρησιμοποιήθηκαν, 1ml για την ανίχνευση της Ολικής Μεσόφιλης χλωρίδας στους 22 ο C και στους 37 ο C και 250ml για την ανίχνευση της Pseudomonas aeruginosa. Γινόταν καταγραφή του ακριβή όγκου για όλα τα δείγματα νερού που διηθούνταν κάθε φορά. Μετά την διήθηση μεταφέρθηκε η μεμβράνη με αποστειρωμένη τσιμπίδα, σε ειδικό αποστειρωμένο φιαλίδιο όγκου 50ml, (falkon), που περιείχε 10ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού dd.h 2 O. Η μεμβράνη τεμαχίστηκε με αποστειρωμένο ψαλίδι σε μκρότερα κομμάτια, έτσι ώστε να βρίσκονται σε επαφή όλα τα κομμάτια της μεμβράνης με το dd.h 2 O. Ακολούθησε καλή ανάδευση με vortex, τουλάχιστον για 2 min, για να απομακρυνθούν τα βακτήρια από την μεμβράνη. Ο χρόνος ανάδευσης ήταν ίδιος για όλα τα δείγματα. Στην συνέχεια με προσοχή, απορρίφθηκε η μεμβράνη και ο όγκος των 10ml αποτέλεσε τον τελικό όγκο τoυ δείγματος (concentrate), στον οποίο πραγματοποιήθηκε επεξεργασία με τους ακόλουθους τρεις τρόπους: Heat treatment (A), Acid treatment (B) και Untreatead (Γ). Παράλληλα με την εξέταση των δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκε θετικό στέλεχος γνωστής συγκέντρωσης Legionella pneumophila, (lenticules discs) για την καλλιέργεια θετικών αποικιών 97

99 Legionella pneumophila. Η διαδικασία της καλλιεργητικής μεθόδου που ακολουθήθηκε για το θετικό στέλεχος Legionella pneumophila NCTC 12821, γνωστής συγκέντρωσης, ήταν παρόμοια με αυτή των αγνώστων δειγμάτων. Επεξεργασία (Α): Heat treatment Μεταφέρθηκαν 1ml του τελικού συμπυκνώματος, (από τα 10ml), σε eppendorf (1.5ml), το οποίο τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 50 o C για 30min± 2min. Μετά το πέρας του χρόνου ακολούθησε καλή ανάδευση του δείγματος (vortex), άμεσα, και πραγματοποιήθηκε επίστρωση 0.5 ml του δείγματος, με μεταλλικό αποστειρωμένο spreader σε τρυβλία Petri διαμέτρου 9cm με θρεπτικό υλικό Legionella Selective Supplement, GVPC. Τα τρυβλία παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου, για να απορροφήσουν καλά το υγρό και επωάστηκαν σε κλίβανο με 2.5%CO 2 σε θερμοκρασία 36 ο C±2 ο C για 10 ημέρες. Για την διατήρηση της υγρασίας στο εσωτερικό του κλιβάνου, τοποθετήθηκε στο κάτω μέρος του κλιβάνου επαρκής όγκος αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού, dd.h 2 O. Επεξεργασία (Β): Acid treatment Μεταφέρθηκαν 8ml του τελικού συμπυκνώματος (από τα 10ml), σε centrifuge tubes όγκου 50ml και ακολούθησε φυγοκέντρηση των centrifuge tubes στις 6000x g (6000 RCF ) για 10min, σε θερμοκρασία 21 o C, με φρένο. Αφαιρέθηκε το υπερκείμενο υγρό, όγκου 4ml, με προσοχή χωρίς αναταραχή του δείγματος και στην συνέχεια προστέθηκε ίσος όγκος (4ml) ρυθμιστικού διαλύματος οξέος, acid buffer με ph= 2.2±0.2. Μετά από χρονικό διάστημα 5min± 30sec, πραγματοποιήθηκε επίστρωση δείγματος όγκου 0.5 ml με μεταλλικό αποστειρωμένο spreader σε τρυβλία Petri διαμέτρου 9cm με θρεπτικό υλικό Legionella Selective Supplement, GVPC. Τα τρυβλία παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου, για να απορροφήσουν καλά το υγρό. Στην συνέχεια επωάστηκαν σε κλίβανο με 2.5% CO 2 σε θερμοκρασία 36 ο C±2 ο C, για το χρονικό διάστημα των 10 ημερών. Για την διατήρηση της υγρασίας στο εσωτερικό του κλιβάνου, τοποθετήθηκε στο κάτω μέρος του κλιβάνου επαρκής όγκος αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού, dd.h 2 O. 98

100 Επεξεργασία ( Γ ): Untreated Πραγματοποιήθηκε επίστρωση με μεταλλικό αποστειρωμένο spreader, 0.5ml τελικού συμπυκνώματος, από τα 10ml concentrate σε τρυβλία Petri διαμέτρου 9cm με θρεπτικό υλικό Legionella Selective Supplement, GVPC. Τα τρυβλία παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου, για να απορροφήσουν καλά το υγρό. Στην συνέχεια επωάστηκαν σε κλίβανο με 2.5% CO 2 σε θερμοκρασία 36 ο C±2 ο C, για το χρονικό διάστημα των 10 ημερών. Για την διατήρηση της υγρασίας στο εσωτερικό του κλιβάνου, τοποθετήθηκε στο κάτω μέρος του κλιβάνου επαρκής όγκος αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού, dd.h 2 O. Η εξέταση και καταγραφή ανάπτυξης αποικιών όλων των τρυβλίων πραγματοποιούνταν ανά δύο με τρεις μέρες μέχρι και την δέκατη μέρα. Γινόταν λεπτομερής καταγραφή του αριθμού καθώς και της μορφολογίας των αποικιών που παρατηρούνταν. Οι ύποπτες αποικίες εμφανίζονταν στο στερεοσκόπιο ως εξής: λευκές με «εσμυρισμένη» (μορφή σπασμένου γυαλιού), ιριδίζουσα εμφάνιση. Οι χαρακτηριστικές αποικίες του βακτηρίου στο θρεπτικό υπόστρωμα έχουν ομαλή εμφάνιση και συχνά είναι άσπρες ή γκρι-μπλε-μωβ, αλλά κάποιες φορές εμφανίζονται να έχουν χρώμα καφέ, ροζ, απαλό πράσινο ή βαθύ κόκκινο. Κατά την εξέταση όλων των τρυβλίων GVPC μετά την δέκατη μέρα, επιλέχθηκαν με τον κρίκο δύο με τρεις ύποπτες χαρακτηριστικές αποικίες από κάθε είδος. Οι ύποπτες αποικίες ανακαλλιεργούνταν παράλληλα σε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα BCYE with L-cysteine (BCYE +) και σε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα BCYE without L-cysteine (BCYE -). Τα τρυβλία τοποθετούνταν σε κλίβανο με 2.5% CO 2 στους 36 ο C±2 ο C για 2 με 3 μέρες το ελάχιστο. Οι αποικίες που αναπτύσσονταν στο θρεπτικό υπόστρωμα BCYE (+) και δεν αναπτύσσονταν στο θρεπτικό υπόστρωμα BCYE ( ) θεωρήθηκαν πιθανές (ύποπτες) αποικίες Legionella spp. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν επιβεβαιωτικές δοκιμές για την ταυτοποίηση του βακτηρίου. 99

101 Επιβεβαιωτικές δοκιμές ΥΛΙΚΑ/ΟΡΓΑΝΑ Πίνακας III.5.3.Γ.α: Διαλύματα για τις επιβεβαιωτικές δοκιμές Διαλύματα Προέλευση Ποσότητα PBS Tablets GIBCO TM. Invitrogen Corporation. Manufactured in UK. Polymixin B-sulfate Merck KGaA (Cat.No. 5291) 16 μl Sodium chloride( NaCl) SIGMA-ALDRICH (Cat.No ) 0,9% Tween 20 (Polysorbate) Merck KGaA ( Cat.No ) 144μl Duopath Glisa Rapid Legionella latex test Duopath Legionella(Κωδικός: ) 1 ml Πίνακας III.5.3.Γ.β: Όργανα για τις επιβεβαιωτικές δοκιμές Όργανα Προέλευση Υδατόλουτρο GFL D3006 πλαστικό κρίκος (loops) - Eppendorf, Safe Lock for 2/1.5 tuber Eppendorf (Order No ) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ (STOCK) 0,9 % NACL / 1% TWEEN 20 Για την παρασκευή του διαλύματος, ζυγίζονται 0,9g NaCl και διαλύονται σε 100 ml αποστειρωμένου αποσταγμένου νερού dd.h 2 O σε κωνική φιάλη των 250 ml. Το διάλυμα αυτό στην συνέχεια αναμιγνύεται με 1% του διαλύματος Tween 20 και το τελικό διάλυμα, Stock, φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη υάλινη φιάλη στο ψυγείο για μικρό χρονικό διάστημα (απορρίπτεται μετά το πέρας των 6 μηνών). 100

102 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΟΥ DUOPATH GLISA RAPID LEGIONELLA LATEX TEST ΓΕΝΙΚΑ Πραγματοποιήθηκε επιβεβαίωση των ύποπτων θετικών αποικιών σε ειδικό τεστ συγκόλλησης αντισωμάτων για την ανίχνευση της Legionella pneumophila και Legionella spp. σε περιβαλλοντικά δείγματα (Legionella latex test, Duopath Glisa Rapid test, Merck). Πρόκειται για ένα τεστ ταχείας δοκιμής για τον προσδιορισμό των ειδών Legionella spp. και της Legionella pneumophila σε περιβαλλοντικά και κλινικά δείγματα. Η πειραματική πορεία του τεστ περιγράφεται παρακάτω: ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Μεταφέρουμε 1-3 τυπικές αποικίες (ελάχιστη διάμετρο 1 mm, ανώτατο όριο 3 mm) από το BCYE άγαρ ή GVPC άγαρ με πλαστικό κρίκο μιας χρήσης (loops) και διαλύεται σε 144μl 0,9%- / 1% Tween 20-Stock διαλύματος σε eppendorf (1.5ml). Προστίθεται 16 μl διαλύματος Polymyxin και αναδεύεται καλά. Επωάζεται για 2-5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (+15 έως +25 C). Θερμαίνεται σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 C για 5 min. Τοποθετείται η συσκευή ελέγχου του τεστ σε μια επίπεδη επιφάνεια (προσοχή η εκτέλεση των δοκιμών πραγματοποιείται εντός 2 ωρών μετά το άνοιγμα). Αναδεύεται καλά (vortex) και μεταφέρονται 150 μl του δείγματος εντός της κυκλικής θύρας στη συσκευή δοκιμής. Παρατηρείται το αποτέλεσμα της δοκιμής σε 30 min μετά την εφαρμογή του δείγματος στην συσκευή δοκιμής Οι ύποπτες αποικίες Legionella pneumophila που αναπτύχθηκαν στο θρεπτικό υπόστρωμα BCYE(+) και δεν αναπτύχθηκαν στο θρεπτικό υπόστρωμα BCYE(-) και επιπλέον έδωσαν θετικό τεστ, συλλέχθησαν με προσοχή από το θρεπτικό υπόστρωμα BCYE(+). Στην συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε 1ml PBS σε eppendorf σε θερμοκρασία -20 ο C για περαιτέρω ανάλυση. 101

103 Εικόνα III.5.3.Γ.1: Τεστ ταχείας δοκιμής για τον προσδιορισμό των ειδών Legionella spp. και της Legionella pneumophila 102

104 III.Α.Μοριακές Μέθοδοι για την ανίχνευση της L.pneumophila 103

105 III.A.1. Εισαγωγή στην τεχνική PCR (Polymerase Chain Reaction) Η ανακάλυψη και η εφαρμογή της Polymerase Chain Reaction (PCR) μεθόδου αποτέλεσε σταθμό στην εξέλιξη της επιστήμης και συνεχώς κερδίζει έδαφος στις προτιμήσεις των μικροβιολογικών εργαστηρίων για την ασφαλέστερη και γρηγορότερη μέθοδο ανίχνευσης του DNA στόχου. Με τη συγκεκριμένη μέθοδο επιτρέπεται ο επιλεκτικός πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων DNA. Με αυτό τον τρόπο είναι δυνατόν να επιτευχθεί η σύνθεση πολλών αντιγράφων, μέχρι και 10 6, συγκεκριμένης περιοχής DNA ή γονιδίου, που λέγονται στόχοι DNA (target DNA). Ο καθορισμός της αλληλουχίας του τμήματος DNA που θα επιθυμούμε να πολλαπλασιαστεί κάθε φορά πραγματοποιείται με την κατάλληλη επιλογή συγκεκριμένου ζεύγους εκκινητών (primers). Η αντιγραφή και ο εκθετικός πολλαπλασιασμός της επιθυμητής περιοχής του DNA εξασφαλίζεται με τους επαναλαμβανόμενους κύκλους της αντίδρασης σε ειδικό θερμικό κυκλοποιητή και τη θερμοάντοχη DNA πολυμεράση. Μετά το τέλος της διαδικασίας, το προϊόν που προκύπτει (PCR product), αναλύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης έχοντας στόχο την ανίχνευση τμήματος DNA με το αναμενόμενο μέγεθος. Το μίγμα αντίδρασης γνωστό ως Master Mix, εκτός από το DNA, τους εκκινητές και την πολυμεράση περιέχει κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα ορισμένου ph, ιόντα Mg ++, που είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του ενζύμου. Επίσης το μίγμα αντίδρασης περιέχει και τα δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) ως υπόστρωμα για τη σύνθεση DNA. Ο εργαστηριακός εξοπλισμός που είναι απαραίτητος για την διαδικασία της μεθόδου είναι: ένας θάλαμος βιολογικής ασφάλειας, eppendorf tubes χωρητικότητας 0,5 ml tips για pipettors (ακρορρύγχια) των 10 μl, 20 μl, 200 μl και μl μαζί με τα αντίστοιχα pipettοrs και στατό. Τα βασικά συστατικά της αντίδρασης περιγράφονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας III.A.1.1). 104

106 Πίνακας III.A.1.1. Συστατικά για την εφαρμογή της μεθόδου PCR Συστατικά Απαιτούμενη Ποσότητα PCR buffer 10X (Ρυθμιστικό διάλυμα) Taq DNA Polymerase 5U/μl Εκκινητές F (Forward Primers) Εκκινητές R (Reverse Primers) dntps 25mM (Μίγμα νουκλεοτιδίων) MgCl 2 50mM Απεσταγμένο νερό, απαλλαγμένο από νουκλεάσες (Nuclease free distilled water) DNA 1X 0,5 2 Units 0,1 1 μμ 0,1 1 μμ μm 0,5 4mM Ανάλογα με τις απαιτήσεις της αντίδρασης 1 pg 1mg Η αντίδραση πραγματοποιείται σε κύκλους και ο κάθε κύκλος περιλαμβάνει τρία στάδια όπως περιγράφονται ακολούθως: Πρώτο στάδιο: Αποδιάταξη. Σε αυτό το στάδιο το δίκλωνο μόριο DNA μετατρέπεται σε μονόκλωνο. Για να γίνει αυτό οι θερμοκρασίες που απαιτούνται είναι o C. Από τη στιγμή που το DNA target θα βρίσκεται στη μορφή της μονής αλυσίδας, μπορούν να υβριδοποιηθούν τα μονόκλωνα μόρια των εκκινητών και να ξεκινήσει η αντιγραφή του DNA από την πολυμεράση. Δεύτερο στάδιο: Επανασύνδεση. Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται υβριδοποίηση των εκκινητών (annealing) στα δύο άκρα του τμήματος που θα πολλαπλασιαστεί, στις θερμοκρασίες o C. Η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών είναι κρίσιμη για την ειδικότητα της αντίδρασης και εξαρτάται από τη θερμοκρασία τήξης των εκκινητών. Τρίτο στάδιο: Σύνθεση. Σε αυτό το στάδιο συντελείται σύνθεση της αλυσίδας γνωστή ως extension. Η πολυμεράση, στις θερμοκρασίες o C, προσθέτει στο ένα άκρο του κάθε εκκινητή συμπληρωματικά νουκλεοτίδια αντιγράφοντας το ήδη υπάρχον μόριο. Τα παραπάνω στάδια επαναλαμβάνονται φορές και σε κάθε κύκλο αυξάνεται ο αριθμός μορίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μήτρα για την πολυμεράση (τα αρχικά μόρια και αυτά που έχουν παραχθεί στον προηγούμενο κύκλο της αντίδρασης). Η αντίδραση τελειώνει με το στάδιο της τελικής επιμήκυνσης όλων των μη ολοκληρωμένων προϊόντων στη θερμοκρασία μεταξύ 70 o C και 74 o C. Ως αποτέλεσμα, έχουμε την εκθετική αύξηση των αντιγράφων του γονιδίου / της επιθυμητής περιοχής DNA. Λόγω της μεγάλης ευαισθησίας της ειδικότητας και της επαναληψιμότητας της αντίδρασης, κυρίως όμως για την ευαισθησία της, υπάρχει μεγάλος κίνδυνος επιμόλυνσης. Για αυτό, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται πάντα αρνητικοί μάρτυρες. 105

107 Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρονται η θερμοκρασία και ο χρόνος στα διάφορα στάδια της αντίδρασης PCR (Πίνακας III.A.1.2). Πίνακας III.A.1.2. Το θερμικό προφίλ της αντίδρασης PCR Στάδιο Θερμοκρασία ( o C) Χρόνος (min) Διαδικασία Αρχική μετουσίωση (Initial denaturation) ,5 1 Μετουσίωση (Denaturation) ,5 1 Υβριδοποίηση εκκινητών (Annealing) ,5 3 Σύνθεση DNA (DNA synthesis extension) 5 Στάδια Επανάληψη σταδίων 2 έως 4 για φορές Τελική επιμήκυνση (Final extension) Άπειρο Τέλος Σε κάθε ανάλυση που πραγματοποιείται συμπεριλαμβάνονται ένας θετικός και ένας ή περισσότεροι αρνητικοί μάρτυρες. Ο θετικός μάρτυρας περιλαμβάνει γνωστό DNA στόχο, που να είναι στο επίπεδο του ορίου ανίχνευσης. Κατά προτίμηση, οι αρνητικοί μάρτυρες είναι ένας μάρτυρας που προέρχεται από τη διαδικασία εκχύλισης απομόνωσης DNA (extraction control) και πρόκειται για λευκό (blank) δείγμα, που επεξεργάζεται σε όλα τα στάδια της διαδικασίας απομόνωσης DNA (DNA extraction). Είναι σωστό σε κάθε ομάδα δειγμάτων που επεξεργάζονται ταυτόχρονα, να περιλαμβάνεται ένας μάρτυρας εκχύλισης. Προτιμάται το σωληνάριο που περιλαμβάνει αυτόν τον μάρτυρα να επεξεργάζεται τελευταίο στη σειρά. Επιπλέον, στην αντίδραση PCR, περιλαμβάνεται και ο μάρτυρας ελέγχου των συστατικών της αντίδρασης και της διαδικασίας προετοιμασίας της αντίδρασης (αρνητικός μάρτυρας της PCR). Περιέχει όλα τα συστατικά της αντίδρασης, εκτός από το DNA στόχο, καθώς για το DNA στο μίγμα προστίθεται αντίστοιχος όγκος νερού έτσι ώστε να διατηρηθούν οι αναλογίες των υπόλοιπων συστατικών. Συνήθως, χρησιμοποιείται περίπου ένας αρνητικός μάρτυρας για κάθε δέκα αντιδράσεις που πραγματοποιούνται κάθε φορά (Lipp et al 2005). 106

108 III.A.2. Εισαγωγή στην Ηλεκτροφόρηση σε Πήκτωμα Αγαρόζης (gel agarose) Πρόκειται για μία τεχνική η οποία επιτρέπει το διαχωρισμό, το χαρακτηρισμό και την απομόνωση τμημάτων DNA. Είναι μια τεχνική που καθιστά δυνατή την ανάλυση τμημάτων DNA, τα οποία δεν μπορούν να διαχωριστούν με τις συμβατικές τεχνικές διαχωρισμού. Πρόκειται για μια απλή, εύκολη και γρήγορη τεχνική. Μπορούν να διαχωριστούν τμήματα DNA μεγέθους από 200 bp έως 60 kb σε πηκτώματα αγαρόζης, διαφόρων συγκεντρώσεων. Υπό ηλεκτρικό πεδίο σταθερής τάσης, πραγματοποιείται η ηλεκτροφόρηση και συνήθως εκτελείται σε οριζόντιο επίπεδο. Πιο αναλυτικά για να παρασκευαστεί ένα πήκτωμα αγαρόζης, η αγαρόζη διαλύεται καλά με θέρμανση σε ρυθμιστικό διάλυμα. Όταν το διάλυμα γίνει διαυγές, το μίγμα χύνεται σε κατάλληλη μήτρα, προκειμένου να σταθεροποιηθεί. Ως αποτέλεσμα της πήξης αυτής, είναι η δημιουργία ενός δικτύου, του οποίου η πυκνότητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της αγαρόζης που χρησιμοποιείται κάθε φορά. Όπως είναι γνωστό, το DNA, το οποίο είναι αρνητικά φορτισμένο με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου στα άκρα του πηκτώματος, μεταναστεύει προς την άνοδο. Οι παράμετροι που αναφέρονται παρακάτω καθορίζουν την ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA. 1. Μοριακό βάρος των τμημάτων DNA. Σε ένα πήκτωμα αγαρόζης, ο ρυθμός με τον οποίο κινούνται τα δίκλωνα γραμμικά τμήματα DNA, είναι αντιστρόφως ανάλογος του δεκαδικού λογαρίθμου (log 10 ) του αριθμού των βάσεων, από τις οποίες αποτελούνται. Τα μεγάλα τμήματα DNA μεταναστεύουν πιο αργά από τα μικρότερα, εξαιτίας των μεγαλύτερων τριβών που αναπτύσσονται κατά τη μετακίνηση τους μέσα από το πλέγμα της αγαρόζης. 2. Συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα. Σε πηκτώματα αγαρόζης διαφορετικής συγκέντρωσης, ένα γραμμικό τμήμα DNA, γνωστού μεγέθους, μετακινείται με διαφορετικό ρυθμό. Ανάμεσα στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA (μ) και τη συγκέντρωση του πηκτώματος (τ), υπάρχει μια γραμμική σχέση και περιγράφεται από την εξίσωση: logμ = logμ ο K r τ, όπου μ ο είναι η ελεύθερη ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA και Κ r ο συντελεστής καθυστέρησης (retardation coefficient), σταθερά η οποία σχετίζεται με τις ιδιότητες του πηκτώματος, το μέγεθος και το σχήμα των προς ανάλυση μορίων. Με αυτό τον τρόπο, είναι δυνατό να διαχωριστεί ένα ευρύ φάσμα μεγεθών DNA, χρησιμοποιώντας πηκτώματα διαφορετικών συγκεντρώσεων (Πίνακας III.A.2.1). 107

109 Πίνακας III.A.2.1. Σχέση μεταξύ συγκέντρωσης αγαρόζης στο πήκτωμα και εύρους διαχωρισμού του DNA. Ποσότητα της αγαρόζης στο πήκτωμα Εύρος διαχωρισμού τμημάτων DNA % (w/v) (kb) 0, , ,7 0,8 10 0,9 0,5 7 1,2 0,4 6 1,5 0,2 3 2,0 0, Στερεοδιαμόρφωση του DNA. Τμήματα DNA τα οποία είναι υπερελικωμένα (τύπος Ι), ανοικτά κυκλικά (τύπος ΙΙ) και ευθύγραμμα (τύπος ΙΙΙ) και τα οποία έχουν το ίδιο μοριακό βάρος, κινούνται με διαφορετικό ρυθμό σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Η συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα ο βαθμός ιονισμού του διαλύματος, η πυκνότητα των ελίκων της μορφής Ι του DNA καθώς και η εφαρμοζόμενη τάση καθορίζουν τις σχετικές κινητικότητες των τριών μορφών. Υπό συγκεκριμένες συνθήκες, η μορφή Ι του DNA μεταναστεύει γρηγορότερα από τη μορφή ΙΙΙ, ενώ η σειρά αυτή μπορεί να αντιστραφεί υπό άλλες συνθήκες. 4. Εφαρμοζόμενη τάση. Ο ρυθμός μετατόπισης γραμμικών μορίων DNA υπό χαμηλή διαφορά δυναμικού είναι ανάλογος της εφαρμοζόμενης τάσης. Σε περίπτωση αύξησης της διαφοράς δυναμικού, η κινητικότητα των μεγάλου μοριακού βάρους τμημάτων DNA θα αυξηθεί διαφορετικά. Επομένως το ικανοποιητικό εύρος διαχωρισμού, σε πηκτώματα αγαρόζης, μειώνεται όσο αυξάνεται η εφαρμοζόμενη διαφορά δυναμικού. Πρέπει να εφαρμόσουμε στο πήκτωμα τάση τέτοια ώστε η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου να μην είναι μεγαλύτερη από 5 V/cm έτσι ώστε να επιτύχουμε τη μέγιστη ανάλυση τμημάτων DNA, τα οποία διαφέρουν κατά 2 kb. 5. Σύνθεση του ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης. Κάθε φορά η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA επηρεάζεται από τη σύνθεση και το βαθμό ιοντισμού του διαλύματος ηλεκτροφόρησης. Η ηλεκτρική αγωγιμότητα είναι ελάχιστη, απουσία ιόντων, και το DNA μετακινείται με πολύ αργό ρυθμό ή καθόλου. Τα διαλύματα με υψηλό βαθμό ιοντισμού δημιουργούν υψηλή ηλεκτρική αγωγιμότητα έχοντας ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη θερμότητας στη συσκευή. Η χειρότερη περίπτωση που μπορεί να συμβεί είναι το πήκτωμα να τήκεται και το DNA να αποδιατάσσεται. Τα 108

110 πιο συνηθισμένα ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι το Tris-acetate (TAE) και το Tris-borate (TBE) (Κόκκινος Π. 2008). Πιο αναλυτικά, υλικά: 10Χ TBE, 10X διάλυμα χρωστικής: 0,25% bromophenol blue (Loading Buffer 10X). 109

111 ΙΙΙ.Β. Ταυτοποίηση της L.pneumophila από αποικίες με τη Μοριακή Μέθοδο της PCR 110

112 ΥΛΙΚΑ/ΟΡΓΑΝΑ Πίνακας III.B.1. Υλικά για την απομόνωση DNA των ύποπτων αποικιών Legionella spp. Διαλύματα Προέλευση Ποσότητα PBS Tablets (Phosphate Buffer Saline) 1X GIBCO TM. Invitrogen Corporation. 200 μl Proteinase K QIAamp DNA Mini Kit Qiagen S.p.A.,Italy 20 μl Buffer AL QIAamp DNA Mini Kit Qiagen S.p.A.,Italy 200 μl Buffer AW1 QIAamp DNA Mini Kit Qiagen S.p.A.,Italy 500 μl Buffer AW2 QIAamp DNA Mini Kit Qiagen S.p.A.,Italy 500 μl Buffer AE QIAamp DNA Mini Kit Qiagen S.p.A.,Italy 100 μl Ethanol absolute 99% CARLOERBA (Code No ) 200 μl Distilled Deionized (ddh 2 O) - - Πίνακας III.B.2. Όργανα για την απομόνωση DNA των ύποπτων αποικιών Legionella spp. Όργανα Προέλευση Συσκευή Vortex Eppendorf Safe Lock for2/1.5 tuber Στατό για eppendorfs - Υδατόλουτρο ρυθμισμένο στους 56 o C Πλαστικός κρίκος (loops) - Αυτόματη Πιπέτα (Pipetboy Plus) Συσκευή φυγοκέντρησης για eppendorfs Mini Spin Column, (ειδικοί σωλήνες μιας χρήσης) Φιαλίδιο συλλογής (collection tube) Θάλαμος κάθετης νηματικής ροής Scientific GE Industries INC BOHEMIA n.y U.S.A Model K-550-GE Eppendorf (Order No ) GFL D3006 Technomara No Hermle Z160M. Hermle Labortechnik. Hermsteller Spintrom INC. QIAamp DNA Mini Kit Qiagen S.p.A., Milan, Italy QIAamp DNA Mini Kit Qiagen S.p.A., Milan, Italy CYTAIR 155, FLUFRANCE, Equipments Scientifiques Industriels III.B.2. Μέθοδος απομόνωσης αποικιών Legionella spp. Για την απομόνωση του DNA των αποικιών Legionella ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο που περιεχόταν στο εμπορικό kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen S.p.A., Milan, Italy, Dneasy 111

113 Blood & Tissue Handbook, July 2006, Για τη διαδικασία τις απομόνωσης του γενετικού υλικού χρησιμοποιήθηκε θάλαμος κάθετης νηματικής ροής που βρίσκεται σε απομονωμένο ειδικό χώρο του εργαστηρίου. Η διαδικασία ενεργειών που ακολουθήθηκε περιγράφεται παρακάτω: 1. Στο eppendorf με το περιεχόμενο ίζημα, τις ύποπτες αποικίες (500μl), προστίθενται με σειρά: 200 μl PBS 20 μl Proteinase K (το οποίο διαλύει τα κύτταρα) 200 μl Buffer AL (ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχεται στο εμπορικό kit). 2. Στη συνέχεια, αναδεύονται έντονα (vortex) τουλάχιστον για 10 δευτερόλεπτα. 3. Επωάζονται στο υδατόλουτρο, σε θεοκρασία 56 o C για 10 λεπτά. 4. Προστίθενται 200 μl αιθανόλης καθαρότητας 99%. 5. Το μίγμα που προκύπτει εισάγεται σε Dneasy Mini Spin Column, (ειδικοί σωλήνες μιας χρήσης που περιέχονται στη συσκευασία του εμπορικού kit). 6. Φυγοκέντρηση σε στροφές (rpm) για 1 λεπτό. 7. Το Dneasy Mini Spin Column εξάγεται από το δικό του φιαλίδιο συλλογής (collection tube) και εφαρμόζεται σε νέο. 8. Προστίθενται 500 μl Buffer AW1 (ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχεται στο εμπορικό kit). 9. Φυγοκέντρηση σε στροφές (rpm) για 1 λεπτό. 10. Επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία όπως το βήμα Προστίθεται 500 μl Buffer AW2 (ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχεται στο εμπορικό kit). 12. Φυγοκέντρηση σε στροφές (rpm) για 3 λεπτά. 13. Το Dneasy Mini Spin Column εξάγεται από το δικό του φιαλίδιο συλλογής (collection tube) και εφαρμόζεται σε eppendorf (1.5ml) με κομμένο καπάκι. 14. Προστίθεται σε 100 μl Buffer AE (ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχεται στο εμπορικό kit). 15. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό. 16. Φυγοκέντρηση σε στροφές (rpm) για 1 λεπτό. 17. Προστίθεται επιπλέον 100 μl Buffer AE (ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχεται στο εμπορικό kit). 18. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό. 19. Φυγοκέντρηση σε στροφές (rpm) για 1 λεπτό. 20. Συλλογή του τελικού μίγματος (200 μl) και τοποθέτηση σε νέα eppendorf του 1,5 ml με καπάκι. 112

114 21. Το προϊόν απομόνωσης του DNA τοποθετείται σε φενιζόλ με πάγο για άμεση χρήση ή συντηρείται τις -20 o C για μελλοντική χρήση. III.B.3. Εκκινητές (Primers) για την Μοριακή Τεχνική PCR ΓΕΝΙΚΑ Ως εκκινητές χρησιμοποιούνται συνθετικά μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια, που είναι συμπληρωματικά με τις αμφίπλευρες περιοχές της αλληλουχίας που πολλαπλασιάζεται. Το καθένα προσκολλάται στη μία από τις δύο αλυσίδες του DNA. Με αυτόν τον τρόπο, οι εκκινητές υβριδοποιούνται με τα δύο άκρα του DNA στόχου και το ένζυμο της πολυμεράσης συνθέτει πολλά αντίγραφα τις καθορισμένης περιοχής, χρησιμοποιώντας ως καλούπι και τις δύο αλυσίδες του DNA. Συνήθως το βέλτιστο μήκος των εκκινητών κυμαίνεται μεταξύ 15 και 30 νουκλεοτιδίων, γιατί η χρήση μικρότερου μήκους εκκινητών μπορεί να οδηγήσει σε δημιουργία παραπροϊόντων δηλαδή μη ειδικών και θεμιτών προϊόντων πολλαπλασιασμού. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιλέχθηκαν τα εξής ζεύγη εκκινητών, διότι σύμφωνα με το European Working Group for Legionella Infections, Sequence-Based Typing (SBT) protocol for epidemiological typing of Legionella pneumophila, Version 4.2, για την ανίχνευση της Legionella pneumophila με την τεχνική PCR χρησιμοποιούνται τα παρακάτω ειδικά γονίδια (primers): Το ζεύγος εκκινητών mip-74/mip-595 και το ζεύγος εκκινητών flaa- 619/ flaa-846. Ζεύγος Εκκινητών mip74/mip 595 Το ζεύγος των εκκινητών mip-74/mip-595 ενισχύει μια περιοχή 558 bp τις αλληλουχίας του DNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη mip (macrophage infectivity potentiator) βάρους 24 kda. Ζεύγος Εκκινητών flaa 619/ flaa 846 Το ζεύγος των εκκινητών flaa-619/ flaa-846 ενισχύει μια περιοχή 245 bp τις αλληλουχίας του DNA που κωδικοποιεί την πρωτεϊνική υπομονάδα των μαστιγίων του βακτηρίου Legionella pneumophila serogroup 1, βάρους 48kDa. 113

115 III.B.4. Μέθοδος αντίδρασης PCR ΥΛΙΚΑ/ΟΡΓΑΝΑ Πίνακας III.B.4.α. Υλικά για την διαδικασία της τεχνικής PCR Διαλύματα Προέλευση Εκκινητής (primer) mip-58 F 205,6 pmole/ μl Εκκινητής (primer) mip-595r 187,6 pmole/μl Εκκινητής (primer) flaa-619f 320,0 pmole/μl Εκκινητής (primer) flaa-846r 118,4 pmole/μl dntps Set, 100 Μm, PCR Grade 4 x 25 μmol Marker DNA Ladder 100 bp, 50 μg Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας Εργαστήριο Μικροχημείας (Number 181) Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας Εργαστήριο Μικροχημείας (Number 182) Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας Εργαστήριο Μικροχημείας (Number 179) Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας Εργαστήριο Μικροχημείας (Number 180) Invitrogen (Cat. No ) Takara (Product No.3407A) Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen (Cat. No ) TBE Buffer 10x, Molecular Biology Grade CALBIOCHEM (Cat. No ) Αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό (dd.h 2 O) - PCR buffer(10x) Invitrogen (Lot. No.WA2B 1b) MgCl 2 (25 mm) Invitrogen (Lot. No ) Πίνακας III.B.4.β. Όργανα για την διαδικασία της τεχνικής PCR Όργανα Προέλευση Θερμικός κυκλοποιητής PCR Αυτόματη Πιπέτα (Pipetboy Plus) Eppendorf, Safe Lock for2/1.5 tuber Μικροπιπέτες 10 μl,100 μl DNA/RNA UV Cleaner MJ Mini 48-Well Personal Thermal Cycler BIORAD, PTC-1148EDU,120/240 V, compact thermal cycler Technomara No Eppendorf (Order No ) Eppendorf Kisker D Producte fur die Biotechnologie Steinfurt 114

116 ΓΕΝΙΚΑ Μετά την απομόνωση του DNA από τις ύποπτες αποικίες, ακολουθήθηκε η διαδικασία της τεχνικής PCR, όπως περιγράφεται παρακάτω. Επίσης το DNA που απομονώθηκε από τις αποικίες των θετικών στελεχών Legionella pneumophila (lenticule disc), χρησιμοποιούνταν στη συνέχεια ως θετικός μάρτυρας για τις PCR που γίνονταν στα ύποπτα απομονωμένα δείγματα DNA. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε σύμφωνα με το European Working Group for Legionella Infections, Sequence-Based Typing (SBT) protocol for epidemiological typing of Legionella pneumophila, Version 4.2, περιγράφει την τεχνική PCR για την ανίχνευση της Legionella pneumophila χρησιμοποιώντας 7 ειδικά γονίδια (primers) (flaa, pile, asd, mip, momps, proa, neua). Στον πίνακα 5 περιγράφονται αναλυτικά τα χαρακτηριστικά των γονιδίων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, για την τεχνική της PCR, σύμφωνα και με την βιβλιογραφία, χρησιμοποιήθηκαν τα 2 (flaa και mip) από τα 7 ειδικά γονίδια. Πίνακας 5. Χαρακτηριστικά εκκινητών (primers) Εκκινητής Αλληλουχία 5 3 Μέγεθος προϊόντος (bp) mip-74(f) GCT GCA ACC GAT GCC AC 558 mip-595(r) CAT ATG CAA GAC CTG AGG GAA C flaa- 619 (F) TTTCTCTGGCGCAAGCTTCC 245 flaa -846 (R) GCTGCTTTGGCATAGGCAG pile-35(f) CAC AAT CGG ATG GAA CAC AAA CTA 459 pile-453r GCT GGC GCA CTC GGT ATC T asd-511f CGA ATG TTA TCT GCG ACT ATC CAC 575 asd-1039r CGA ATG TTA TCT GCG ACT ATC CAC momps-450f TTG ACC ATG AGT GGG ATT GG 710 momp-1126r TGG ATA AAT TAT CCA GCC GGA CTT C proa-1107f GAT CGC CAA TGC AAT TAG 480 proa-1553r ACC ATA ACA TCA AAA GCC neua-196f CCG TTC AAT ATG GGG CTT CAG neua-611r CGA TGT CGA TGG ATT CAC TAA TAC 459 (F) = Forward primer, R) = Reverse primer 115

117 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Σε κάθε αντίδραση της PCR φτιάχνεται ένα μίγμα (Master Mix), επειδή οι ποσότητες είναι αρκετά μικρές και υπάρχει κίνδυνος επιμόλυνσης. Η διαδικασία προετοιμασίας του Master Mix πραγματοποιήθηκε στο εσωτερικό ειδικής συσκευής DNA/RNA UV Cleaner. Στην ποσότητα του Master Mix υπολογίζουμε τον αριθμό των δειγμάτων που θέλουμε κάθε φορά, συν ένα δείγμα για τον αρνητικό μάρτυρα, συν ένα δείγμα για το θετικό μάρτυρα και ένα επιπλέον εφεδρικό δείγμα. Πιο αναλυτικά, όταν πρέπει να γίνει PCR σε 5 δείγματα, θα παρασκευασθεί ένα Master Mix για 8 δείγματα. Η συγκέντρωση και η ποσότητα των διάφορων ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν αναγράφονται αναλυτικά στον πίνακα 6. Θα πρέπει να αναφερθεί πως οι ουσίες μπήκαν αυστηρά με τη σειρά που αναγράφονται. Το τελικό διάλυμα που προκύπτει από την προσθήκη των παραπάνω ουσιών είχε τελικό όγκο 50 μl και μεταφέρθηκε σε θερμικό κυκλοποιητή (MJ Mini Personal Thermal Cycler). Τα βήματα και οι συνθήκες του θερμικού κυκλοποιητή για τα δύο ζεύγη εκκινητών στην διαδικασία της PCR αναγράφονται αναλυτικά στον πίνακα III.B.6.β, που ακολουθεί παρακάτω. III.B.5. PCR για το γονίδιο mip Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: o mip-74(forward), με αλληλουχία GCT GCA ACC GAT GCC AC και ο mip-595(reverse), με αλληλουχία CAT ATG CAA GAC CTG AGG GAA C. Οι PCRs πραγματοποιούνταν σε διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 50μl, το οποίο περιείχε 5μl του ειδικού ρυθμιστικού διαλύματος (PCR buffer), 5μl MgCl 2, 2μl μείγματος φωσφορικών νουκλεοτιδίων (dntps), 1μl του κάθε εκκινητή, 0.5μl Taq DNA πολυμεράση, 0.5μl του DNA και 35.1μl νερού ελεύθερου νουκλεασών (Πίνακας III.B.6.α). Σε συσκευή θερμοκυκλοποιητή η αντίδραση πραγματοποιήθηκε υπό τις εξής συνθήκες: θέρμανση στους 95 0 C για χρονικό διάστημα 5min για την αρχική αποδιατάξη του DNA, ακολουθούμενη από 35 κύκλους πολλαπλασιασμού με την αποδιάταξη στους 95 0 C για χρονικό διάστημα 30sec, τον υβριδισμό των εκκινητών με την αλληλουχία-στόχο στους 55 0 C για χρονικό διάστημα 30sec και την επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας DNA στους 72 0 C για χρονικό διάστημα 40sec. Η τελική επιμήκυνση του προϊόντος της PCR, πραγματοποιήθηκε στους 72 0 C για χρονικό διάστημα 10min (Πίνακας III.B.7.β). Για τον έλεγχο της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε νερό ελεύθερο νουκλεασών ως αρνητικός μάρτυρας. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το DNA 116

118 που απομονώθηκε από θετικό στέλεχος αναφοράς Legionella pneumophila (lenticules discs). Στην συνέχεια το προϊόν της αντίδρασης ηλεκτροφορήθηκε όπως περιγράφεται στην ενότητα III.B.8. III.B.6. PCR για το γονίδιο flaa Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: για τον flaa-619 (forward), με αλληλουχία TTTCTCTGGCGCAAGCTTCC και για τον flaa-846 (reverse), με αλληλουχία GCTGCTTTGGCATAGGCAG. Οι PCRs πραγματοποιούνταν σε διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 50μl, το οποίο περιείχε 5μl του ειδικού ρυθμιστικού διαλύματος (PCR buffer), 5μl MgCl 2, 2μl μείγματος τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (dntps), 1μl του κάθε εκκινητή, 0.5μl Taq DNA πολυμεράση, 0.5μl του DNA και 35.1μl νερού ελεύθερου νουκλεασών (Πίνακας III.B.6.α). Σε συσκευή θερμοκυκλοποιητή η αντίδραση πραγματοποιήθηκε υπό τις εξής συνθήκες: θέρμανση στους 95 0 C για χρονικό διάστημα 5min για την αρχική αποδιατάξη του DNA, ακολουθούμενη από 35 κύκλους πολλαπλασιασμού με την αποδιάταξη στους 95 0 C για χρονικό διάστημα 30sec, τον υβριδισμό των εκκινητών με την αλληλουχία-στόχο στους 55 0 C για χρονικό διάστημα 30sec και την επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας DNA στους 72 0 C για χρονικό διάστημα 40sec. Η τελική επιμήκυνση του προϊόντος της PCR, πραγματοποιήθηκε στους 72 0 C για χρονικό διάστημα 10min (Πίνακας III.B.6.β). Για τον έλεγχο της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε νερό ελεύθερο νουκλεασών ως αρνητικός μάρτυρας. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το DNA που απομονώθηκε από θετικό στέλεχος αναφοράς Legionella pneumophila (lenticules discs). Στην συνέχεια το προϊόν της αντίδρασης ηλεκτροφορήθηκε όπως περιγράφεται στην ενότητα III.B.8. Πίνακας III.B.6.α. Συγκέντρωση των διάφορων ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για την τεχνική της PCR Α/Α Διαλύματα Συγκέντρωση (μl) Όγκος Αντίδρασης (μl) 1 0 Nuclease free water (dd.h 2 O) PCR buffer(10x) 1X MgCl 2 (25 mm) 2.5 mm Primer Forward (10 pmoles/ μl) 0.2 pmoles Primer Reverse (10 pmoles/ μl) 0.2 pmoles dntps (25 mμ) 200μΜ Taq DNA Polymerase (5 U/μl) 2.5 (U/μl) DNA extraction product 2 Total

119 Πίνακας III.B.6.β. Παράμετροι (θερμοκρασία, χρόνος) της αντίδρασης PCR για την ταυτοποίηση των ειδών Legionella Στάδια Θερμοκρασία 0 C Χρόνος Διαδικασία Αριθμός min Αρχική μετουσίωση (Initial Denaturation) 1 κύκλων sec Μετουσίωση (Denaturation) sec Υβριδοποίηση εκκινητών (Annealing) 72 40sec Σύνθεση DNA (Extension) min Τελική επιμήκυνση (Final extension) Άπειρο Τέλος III.B.7. Παρασκευή Πηκτώματος Αγαρόζης ΥΛΙΚΑ/ΟΡΓΑΝΑ Πίνακας B.7.α. Υλικά για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης Διαλύματα Προέλευση Βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) Invitrogen (Cat. No ) TBE Buffer 10x, Molecular Biology Grade CALBIOCHEM (Cat. No ) Αγαρόζη UltraPure TM Agarose Invitrogen (Cat. No ) Πίνακας B.7.β. Όργανα για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης Όργανα Προέλευση Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας GF 3000 (A&D Instruments) Υαλικά, κωνικές φιάλες - Αυτόματη Πιπέτα (Pipetboy Plus) Technomara No Eppendorf, Safe Lock for2/1.5 tuber Eppendorf (Order No ) Μικροπιπέτες 10 μl, 100 μl Eppendorf ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης, ζυγίστηκε ποσότητα αγαρόζης (UltraPure TM Agarose) σε ηλεκτρονικό ζυγό ακριβείας και στη συνέχεια διαλύθηκε σε κωνική φιάλη που 118

120 περιείχε διάλυμα 0,5X ΤΒΕ. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, το πήκτωμα αγαρόζης παρασκευάστηκε με 2% συγκέντρωσης βάρους κατ όγκο (2% w/v). Πιο συγκεκριμένα ζυγίστηκαν 3,2g αγαρόζης και διαλύθηκαν σε 160 ml ΤΒΕ 0,5X. Για την πλήρη διάλυση και ομογενοποίηση του διαλύματος, το διάλυμα ανακινήθηκε προσεκτικά και ήπια, ενώ θερμάνθηκε σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι βρασμού του διαλύματος. Στη συνέχεια και αφού κρύωσε, προστέθηκε διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου, σε τελική συγκέντρωση 10 mg/ml (5μl/100ml διαλύματος) και αναδεύτηκε καλά, μέχρι πλήρους διάλυσης. Το βρωμιούχο αιθίδιο έχει ερυθρό χρώμα και με τη σωστή διάλυσή του στο διάλυμα αγαρόζης που είναι διαφανές, αφήνει ένα απαλό ροζ χρωματισμό. Επειδή το βρωμιούχο αιθίδιο είναι πτητικό και καρκινογόνο, πάρθηκαν οι απαραίτητες προφυλάξεις για την αποφυγή εισπνοής των ατμών και επαφής με το δέρμα. III.B.8. Ηλεκτροφόρηση σε Πήκτωμα Αγαρόζης ΥΛΙΚΑ/ΟΡΓΑΝΑ Πίνακας III.B.8.α: Υλικά για την ηλεκτροφόρηση σε 2% w/v gel αγαρόζης Διαλύματα Προέλευση Βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) Invitrogen (Cat. No ) Κυανούν της βρωμοφαινόλης Loading Buffer 10X Invitrogen (Cat. No ) Μάρτυρας Marker DNA Ladder 100 bp, 50 μg Takara (Product No.3407A) TBE Buffer 10x, Molecular Biology Grade CALBIOCHEM (Cat. No ) Πίνακας III.B.8.β: Όργανα για την ηλεκτροφόρηση σε 2% w/v gel αγαρόζης Όργανα Προέλευση Ειδική μήτρα ηλεκτροφόρησης (Electrophoresis Power Supply) Φωτογραφική μηχανή εταιρείας UVP Αυτόματη Πιπέτα (Pipetboy Plus) Μικροπιπέτες 10 μl,100 μl Eppendorf, Safe Lock for2/1.5 tuber Appligene (400V-250mA) UVP GelDoc-It Imaging System W/Gel HR Gam, Gel P/N , HR Camera 6100 Series, Upland CA,USA Technomara (No ) Eppendorf Eppendorf (Order No ) 119

121 Πίνακας III.B.8.γ: Σύσταση του 2% w/v πηκτώματος (gel) αγαρόζης Υλικά Αγαρόζη TBE 0,5x Βρωμιούχο αιθίδιο Ποσότητα 3,2gr 160ml 5μl Πίνακας III.B.8.δ: Ρυθμιστικά διαλύματα για την ηλεκτροφόρηση σε 2% w/v gel αγαρόζης TBE 0.5x, 1000 ml Διαλύματα Tris-Base Boric Acid d.h2o EDTA ph= 8.00 Ποσότητα 100Mm 90Mm Μέχρι τα 1000ml 1Mm Πίνακας III.B.8.ε: Ρυθμιστικά διαλύματα για την ηλεκτροφόρηση σε 2% w/v gel αγαρόζης 10Χ Loading Buffer Διαλύματα Loading Buffer Ποσότητα 3 μl Πίνακας III.B.8.ζ: Ρυθμιστικά διαλύματα για την ηλεκτροφόρηση σε 2% w/v gel αγαρόζης DNA Ladder Διαλύματα Ποσότητα Stock 1Kb/100bp 5μl ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Η διαπίστωση της ύπαρξης του DNA του βακτηρίου στα δείγματα έγινε με ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της αντίδρασης σε πήκτωμα αγαρόζης συγκέντρωσης 2% βάρους κατ όγκο (2% w/v) σε διάλυμα TBE 0.5X (100Mm Tris, 90Mm Boric Acid, 1Mm EDTA, ph 8.00, Calbiochem). Η σταθεροποίηση του πηκτώματος έγινε σε γυάλινη ή πλαστική επιφάνεια, με συγκεκριμένες διαστάσεις. 120

122 Στη συνέχεια αυτά τοποθετήθηκαν προσεκτικά στους υποδοχείς του πηκτώματος, με τη βοήθεια μικροπιπέτας Με τη βοήθεια ειδικής μήτρας, σχηματίστηκαν οι θέσεις-υποδοχείς των προς ανάλυση δειγμάτων DNA. Η ανάλυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου, υπό σταθερή ένταση ρεύματος (20 40 ma). Η χρώση του πηκτώματος αγαρόζης έγινε με διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου 0.5 μg/ml. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μια χρωστική που παρεισφρύει μεταξύ των βάσεων των νουκλεικών οξέων και γενικά χρησιμοποιείται για τη χρώση του DNA κατά την διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Ως δείκτης μοριακών βαρών χρησιμοποιήθηκε ο ladder 100bp DNA της Takara με τον οποίο ανιχνεύονται προϊόντα με μοριακό βάρος από 100 bp έως 1500 bp. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε ειδική συσκευή και η ψηφιακή αποτύπωση του ηλεκτροφορητικού προτύπου στο σύστημα ανάλυσης εικόνας της εταιρείας UVP (UVP GelDoc-It Imaging System W/Gel HR Gam, Gel P/N , HR Camera 6100 Series). 121

123 ΙΙΙ.Γ. Ταυτοποίηση της L.pneumophila με Αλληλούχιση (Sequence analysis) 122

124 III.Γ.1. Εισαγωγή στην Ανάλυση Αλληλουχίας (Sequence analysis) Ο όρος «ανάλυση Αλληλουχίας» στην επιστήμη της βιολογίας προϋποθέτει την υποβολή μιας αλληλουχίας DNA ή πεπτιδίων σε βάσεις δεδομένων αλληλούχισης, σε επαναλαμβανόμενες αναζητήσεις αλληλούχισης, ή άλλες μεθόδους βιοπληροφορικής σε έναν υπολογιστή. Στην επιστήμη της Γενετικής και της Μοριακής βιολογίας η ίδια διαδικασία αναφέρεται απλά ως «αλληλούχιση» (sequencing). Δεδομένου, πως κατά την διάρκεια της δεκαετίας του 90, η ανάπτυξη μεθόδων υψηλής απόδοσης για την παραγωγή αλληλουχιών γονιδίων και πρωτεϊνών ήταν ραγδαία, το ποσοστό της προσθήκης νέων αλληλουχιών στις βάσεις δεδομένων αυξήθηκε σημαντικά. Βέβαια πρέπει να αναφερθεί πως η συλλογή αλληλουχιών γονιδίων από μόνης της, δεν αποτελεί εργαλείο στα χέρια των επιστημόνων για την κατανόηση της βιολογίας των διάφορων οργανισμών. Ωστόσο συγκρίνοντας διάφορες αλληλουχίες με ήδη γνωστές, είναι ένας τρόπος να κατανοήσουμε την βιολογία του υπό εξέταση οργανισμού από τον οποίο προέρχεται η αλληλουχία. Επομένως, από την μελέτη των διαφόρων ομοιοτήτων μεταξύ των συγκεκριμένων αλληλουχιών, η ανάλυση αλληλουχίας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ορισμό της λειτουργίας των γονιδίων και των πρωτεϊνών. Σήμερα υπάρχουν πολλές τεχνικές και μέθοδοι, οι οποίες παρέχουν συγκρίσεις αλληλουχιών (αντιστοίχηση αλληλουχιών) και αναλύσεις του προϊόντος αντιστοίχησης για την περαιτέρω κατανόηση της βιολογίας. Στην επιστήμη της Βιολογίας και της Βιοπληροφορικής, η ανάλυση της αλληλουχίας είναι ένα αυτοματοποιημένο εργαλείο που βασίζεται στην εξέταση και ανάλυση στον υπολογιστή των χαρακτηριστικών τμημάτων π.χ. της αλυσίδας του DNA. Τα στοιχεία που περιλαμβάνει είναι τα εξής: 1. Σύγκριση των αλληλουχιών προκειμένου να βρεθούν ομοιότητες και διαφορές στις συγκρινόμενες αλληλουχίες (αντιστοίχιση αλληλουχίας) 2. Εύρεση και σύγκριση σημειακών μεταλλάξεων ή πολυμορφισμών σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο στον οργανισμό, προκειμένου να οριστεί ο γενετικός κώδικας. 3. Αποκάλυψη της ποικιλομορφίας της εξέλιξης και της γενετικής των οργανισμών. 4. Σχολιασμός της λειτουργίας των γονιδίων. Αναλυτικά, η αλληλούχιση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε επίπεδο DNA, RNA, πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών. Πιο συγκεκριμένα ο όρος DNA αλληλούχιση αναφέρεται στις μεθόδους αλληλούχισης για τον καθορισμό της σειράς των βάσεων των νουκλεοτιδίων -αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη, θυμίνη- σε ένα τμήμα του DNA. Αξίζει να σημειωθεί πως η ραγδαία ανάπτυξη της τεχνολογίας 123

125 αλληλούχισης του DNA, έχει οδηγήσει στην πλήρη αλληλούχιση του Ανθρώπινου Γονιδιώματος. III.Γ.2. Αλληλούχιση και Φυλογενετική Ανάλυση (Phylogenetic Tree Analysis) Τα προϊόντα της PCR από τα θετικά δείγματα Legionella, καθαρίστηκαν στο QIAcube αυτοματοποιημένο σύστημα, QIAquick PCR purification kit (Qiagen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του μηχανήματος. Περαιτέρω, τα θετικά δείγματα επιβεβαιώθηκαν με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας. Η αλληλούχιση πραγματοποιήθηκε στην Μονάδα Αλληλουχίας του Τμήματος Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας (Sequence unit, Department of Immunology and Histocompatibility, School of Medicine, Univesrity of Thessaly, Larissa). Οι παραγόμενες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες αναλύθηκαν σύμφωνα με το πρόγραμμα BLAST στην ιστοσελίδα του NIH website (NCBI, National Centre for Technology Control, NIH, USA). Επιπρόσθετα, πολλαπλές αλληλουχίσεις πραγματοποιήθηκαν με το πρόγραμμα Clustal Χ. Η μέθοδος της βιοπληροφορικής neighbor-joining καθώς και το πρόγραμμα MEGA 4.0.2, (Saitu και Nei 1987, Thompson et al. 1997; Kumar et al. 2001) χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου. Με τη χρήση του προγράμματος Clustal Χ, πραγματοποιήθηκε η στοίχιση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των προϊόντων της PCR (όπως αυτές προέκυψαν από την αλληλούχιση του DNA), με τις αντίστοιχες άλλων στελεχών, του γένους Legionella, οι οποίες είναι καταχωρημένες στην Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank DataBase). Επιπλέον για την κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Νeighbor-joining, ενώ η αξιοπιστία των μεθόδων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MEGA (Saitu &Nei 1987, Thompson et al 1997, Kumar et al 2001). Στα φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν με βάση τα γονίδια mip και flaa, εκτός από τα είδη Legionella που ανιχνεύθηκαν στην Νοτιοδυτική Ελλάδα, περιελήφθησαν και αντιπροσωπευτικά είδη που έχουν ανιχνευθεί σε άλλες χώρες. Στους Πίνακες VI.1 και VI.12, φαίνονται αντίστοιχα τα είδη Legionella που συμπεριελήφθησαν στη φυλογενετική ανάλυση του γονιδίου mip και flaa. Επιπλέον, στους ίδιους πίνακες αναφέρονται και οι κωδικοί (Accession Numbers) με τους οποίους είναι κατατεθειμένοι στην Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank DataBase). 124

126 Πίνακας III.Γ.1: Περιγραφή των στελεχών Legionella και των κωδικών για τις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων τους, που χρησιμοποιήθηκαν για την φυλογενετική ανάλυση του γονιδίου mip. Legionella spp. Στέλεχος Κωδικός L. pneumophila Philadelphia 1 AJ L. pneumophila Corby CP L. pneumophila serogroup 6 AJ L. pneumophila - AJ L. pneumophila Philadelphia 1 AJ L. pneumophila 2300/99 Alcoy CP L. pneumophila serogroup 1 AF L. pneumophila Philadelphia 1 AJ L. pneumophila Paris CR L. pneumophila serogroup 1 AJ L. pneumophila serogroup 1 AJ L. pneumophila Philadelphia 1 AJ L. pneumophila Philadelphia 1 AJ L. pneumophila serogroup 8 AJ L. pneumophila serogroup 8 AJ L.israelensis - U L.jordanis - U L.longbeachae ATCC AF L.gormanii - U L.parisiensis - U L.anisa - U L.bozemanii - U L.adelaidensis - U Πίνακας III.Γ.2: Περιγραφή των στελεχών Legionella και των κωδικών για τις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων τους, που χρησιμοποιήθηκαν για την φυλογενετική ανάλυση του γονιδίου flaa. Legionella spp. Στέλεχος Κωδικός L. pneumophila Philadelphia 1 AJ L. pneumophila Philadelphia 1 AJ L. pneumophila serogroup 1 AJ L. pneumophila 2300/99 EU L. pneumophila - X L.longbeachae - AJ L. pneumophila serogroup 6 AJ L. pneumophila serogroup 6 AJ L. pneumophila NIB252 AB L. pneumophila serogroup 8 AJ L. pneumophila serogroup 6 AJ III.Γ.3. Στατιστική Επεξεργασία αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα Microsoft Office Excel 2007 και το στατιστικό πρόγραμμα GraphPad Prism, Version Εφαρμόστηκαν κατά περίπτωση οι εξής στατιστικές δοκιμασίες: Linear regression, Pearson and Spearman Correlation για γραμμικές συσχετίσεις, D'Agostino&Pearson omnibus normality test, για έλεγχο κανονικότητας, το t-test, Mann-Whitney test, Kruskal Wallis-test, Dunn's Multiple Comparison Test και One Way Anova Non Parametric test για εύρεση στατιστικώς σημαντικών διαφορών και συγκρίσεις μέσων τιμών. Σε όλες τις στατιστικές δοκιμασίες, οι τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. 125

127 ΙV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 126

128 IV.1. Αριθμός και προέλευση δειγμάτων Στην παρούσα διπλωματική εργασία, ελήφθησαν συνολικά 91 δείγματα από 8 Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας και 25 δείγματα από 9 ξενοδοχεία από την περιοχή της Πάτρας, όπως περιγράφονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας IV.1.1). Ο προγραμματισμός των δειγματοληψιών είχε γίνει έτσι, ώστε σε χρονικό διάστημα ενός έτους να συλλεχτούν δείγματα, μία φορά από όλα τα Νοσοκομεία που βρίσκονταν στην Νοτιοδυτική Ελλάδα και από τα μεγάλα ξενοδοχειακά συγκροτήματα της περιοχής των Πατρών. Υπήρξαν όμως περιπτώσεις, που πραγματοποιήθηκαν περισσότερες δειγματοληψίες και πιο συγκεκριμένα σε 3 Νοσοκομεία και σε 1 ξενοδοχείο πραγματοποιήθηκαν 2 δειγματοληψίες στο χρονικό διάστημα των προγραμματισμένων δειγματοληψιών. Η δεύτερη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε λόγω της ανίχνευσης του βακτηρίου σε υψηλές συγκεντρώσεις αλλά και της έντονης επιθυμίας των υπεύθυνων των νοσοκομείων. Αξίζει να σημειωθεί πως όλα τα νοσοκομεία, πλην ενός, και όλα τα ξενοδοχεία προμηθεύονταν χλωριωμένο νερό από το κεντρικό σύστημα διανομής του δήμου που βρίσκονταν. Το σύστημα διανομής ενός νοσοκομείου προμηθεύονταν νερό από την γεώτρηση του νοσοκομείου η οποία χλωριώνονταν συστηματικά σύμφωνα με τους υπεύθυνους της τεχνικής υπηρεσίας του νοσοκομείου. Όσον αφορά τα νοσοκομεία από τα 91 δείγματα που ελήφθησαν τα 44 δείγματα προέρχονταν από καταιονιστήρα κλινικών, τα 43 από βρύση και τα 4 από πύργους ψύξης. Πίνακας IV.1.1. Συγκεντρωτικά στοιχεία για τα σημεία Δειγματοληψίας Σημείο Δειγματοληψίας Νερό Προέλευση νερού Ζεστό Κρύο Βρύση Καταιονιστήρας Π.Ψύξης Νοσοκομεία Ξενοδοχεία Συνολικά Στους πίνακες που ακολουθούν αναφέρονται αναλυτικά ξεχωριστά για το κάθε σημείο δειγματοληψίας, η προέλευση και ο αριθμός των δειγμάτων, που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας και αναλύθηκαν κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής (Πίνακες IV.1.2- IV.1.9). 127

129 Πίνακας IV.1.2. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου Α Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο/ Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από καταιονιστήρα Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης Νοσοκομείο Α Νευροχειρουργική 203/2 ος Χειρουργική 204/2 ος 1 1 Νεφρολογική 408,417/4 ος 2 2 Καρδιολογική 416/4 ος 1 1 Γυναικολογική 306,309/3 ος 2 2 Παιδιατρική 123/1 ος 1 1 Ορθοπεδική 207/2 ος 1 1 Παθολογική /Βραχεία Νοσηλεία 402,513/4 ος 2 3 Πίνακας IV.1.3. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου Β Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο/ Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από καταιονιστήρα Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης Νοσοκομείο Β Ορθοπεδική 101,102/1 ος Χειρουργική 110,111/1 ος 2 2 Παθολογική 303,309/3 ος 2 2 Μ. Εμφράγματος 2 ος 1 1 Καρδιολογική 210,211/2 ος 1 1 Πίνακας IV.1.4. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου Γ Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο/ Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από καταιονιστήρα Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης Νοσοκομείο Γ Θάλαμος Νοσηλ. 11/Ισόγειο 1 1 Θάλαμος Νοσηλ. 5,6/Ισόγειο Εφημερείο Ιατρών Ημιόροφος 1 1 Πίνακας IV.1.5. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου Δ Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο/ Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από καταιονιστήρα Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης Νοσοκομείο Δ Κλινική Δωμ. 3 3/2 ος 1 1 Κλινική Δωμ /2 ος Κλινική Δωμ /2 ος

130 Πίνακας IV.1.6. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου Ε Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο/ Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από καταιονιστήρα Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης Νοσοκομείο Ε Ορθοπεδική 03/Ισόγειο Παθολογική 105/1 ος 1 1 Χειρουργική 301/2 ος 1 1 Πίνακας IV.1.7. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου ΣΤ Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο/ Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από καταιονιστήρα Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης Νοσοκομείο ΣΤ Παιδιατρική 104/1 ος 1 1 Παθολογική 204/2 ος Ορθοπεδική 316/3 ος 1 1 Χειρουργική 324/3 ος 2 2 Γυναικολογική 110/1 ος 1 1 Πίνακας IV.1.8. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου Ζ Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο/ Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης καταιονιστήρα Νοσοκομείο Ζ Παθολογική 403/3 ος 1 1 Παιδιατρική 422/3 ος 1 1 Χειρουργική 302/2 ος Γυναικολογική 220/1 ος 1 1 Ορθοπεδική 215/1 ος 1 1 Πίνακας IV.1.9. Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας του Νοσοκομείου Η Σημεία Δειγματοληψίας Κλινικές Δωμάτιο Όροφος Αριθμ. δειγμάτων από βρύση Αριθμ. δειγμάτων από Αριθμ. δειγμάτων από Πύργο ψύξης καταιονιστήρα Νοσοκομείο Η Γυναικολογική /2 ος 1 1 Ω.Ρ.Λ. /3 ος Οφθαλμολογική /2 ος

131 Σχετικά με τις δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν στα Ξενοδοχεία, τα 7 δείγματα προέρχονταν από πύργους ψύξης, τα 9 ελήφθησαν από τη βρύση των δωματίων και τα υπόλοιπα 9 από τον καταιονιστήρα των δωματίων. Συνολικά ελήφθησαν 25 δείγματα νερού, εκ των οποίων τα 11 ήταν ζεστό νερό και τα 14 κρύο. Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρονται αναλυτικά, ξεχωριστά για το κάθε σημείο δειγματοληψίας, ο αριθμός και η προέλευση των δειγμάτων που ελήφθησαν από τα Ξενοδοχεία της ευρύτερης περιοχής των Πατρών (Πίνακας IV.1.10). Πίνακας IV Αναλυτικά στοιχεία για τα σημεία δειγματοληψίας των ξενοδοχείων Σημεία Δειγματοληψίας Όροφος Αριθμός δειγμάτων από βρύσες Αριθμός δειγμάτων από καταιονιστήρες Αριθμός δειγμάτων από Πύργο ψύξης Ξενοδοχείο 1 2 ος Ξενοδοχείο 2 2 ος Ξενοδοχείο Ξενοδοχείο 4 1 ος Ξενοδοχείο 5 3 ος Ξενοδοχείο 6 3 ος Ξενοδοχείο 7 3 ος Ξενοδοχείο 8 3 ος Ξενοδοχείο 9 3 ος IV.2. Αποτελέσματα Φυσικοχημικών και Μικροβιολογικών παραμέτρων Στους πίνακες που ακολουθούν παρακάτω, αναφέρονται αναλυτικά για το κάθε Νοσοκομείο ξεχωριστά, τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών και μικροβιολογικών παραμέτρων των δειγμάτων νερών. (Πίνακες IV.2.1- IV.2.13). Όπως φαίνεται και στον πίνακα IV.2.1, η θερμοκρασία του κρύου νερού για το Νοσοκομείο Α στα υδάτινα συστήματα των κλινικών κυμάνθηκε από 19,4 0 C έως 22,2 0 C, ενώ του ζεστού νερού από 31,3 0 C έως 47 0 C. Οι μετρήσεις του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν σχεδόν μηδενικές για τα περισσότερα δείγματα νερού, ενώ η υψηλότερη τιμή υπήρξε στον πύργο ψύξης 2 (0,36 mg/l). Δεν πραγματοποιήθηκε μέτρηση του ph (ανώτερο όριο 6,5-9,5) για όλα τα 130

132 δείγματα και οι μετρήσεις της αγωγιμότητας (ανώτερο όριο 2500 μs/cm) κυμάνθηκαν από 613 έως 1980 μs/cm. Πίνακας IV.2.1. Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Α Κλινικές/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/ L) Θερμοκρασία ( 0 C) Νευροχειρουργική /Βρύση ,07 19,4 Νευροχειρουργική /Καταιονιστήρα ,05 37,6 Χειρουργική /Βρύση ,03 21,2 Χειρουργική /Καταιονιστήρα ,02 39,7 Νεφρολογική 1 /Βρύση ,02 21,8 Νεφρολογική 1 /Καταιονιστήρα ,02 39,2 Νεφρολογική 2 /Βρύση 7, ,22 22 Νεφρολογική 2 /Καταιονιστήρα 7, ,02 49 Καρδιολογική /Βρύση ,03 19 Καρδιολογική /Καταιονιστήρα ,03 39,4 Γυναικολογική 1 /Βρύση ,03 40,2 Γυναικολογική 1 /Καταιονιστήρα ,05 22,2 Γυναικολογική 2 /Βρύση ,18 20 Γυναικολογική 2 /Καταιονιστήρα ,08 51 Παιδιατρική/Βρύση ,25 18,9 Παιδιατρική/ Καταιονιστήρα ,10 37 Ορθοπεδική /Βρύση ,06 19 Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα ,1 37,1 Βραχεία Νοσηλεία/Βρύση ,15 19,4 Βραχεία Νοσηλεία/ Καταιονιστήρα ,08 31,3 Παθολογική 1/ Καταιονιστήρα ,2 Παθολογική/Βρύση 7, ,1 20 Παθολογική 2 / Καταιονιστήρα 8, ,1 47 Πύργος Ψύξης 1 7, ,09 51 Πύργος Ψύξης 2 7, ,

133 Πίνακας IV.2.2. Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Α Κλινικές/ Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα (cfu/ml) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Νευροχειρουργική /Βρύση <10 Νευροχειρουργική/Καταιονιστήρα >1000 Χειρουργική /Βρύση <10 Χειρουργική /Καταιονιστήρα >1000 Νεφρολογική 1 /Βρύση <10 Νεφρολογική 1 /Καταιονιστήρα >1000 Νεφρολογική 2 /Βρύση 1000 >1000 >1000 <10 Νεφρολογική 2 /Καταιονιστήρα 1000 >1000 >1000 <10 Καρδιολογική /Βρύση <10 Καρδιολογική /Καταιονιστήρα >1000 Γυναικολογική 1 /Βρύση <10 Γυναικολογική 1 /Καταιονιστήρα >1000 Γυναικολογική 2 /Βρύση 1000 >1000 >1000 <10 Γυναικολογική 2 /Καταιονιστήρα <10 Παιδιατρική/Βρύση <10 Παιδιατρική/ Καταιονιστήρα 0 > <10 Ορθοπεδική /Βρύση <10 Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα <10 Βραχεία Νοσηλεία/Βρύση <10 Βραχεία Νοσηλεία/ Καταιονιστήρα >1000 Παθολογική/ Καταιονιστήρα <10 Παθολογική/Βρύση <10 Παθολογική 2 / Καταιονιστήρα <10 Πύργος Ψύξης <10 Πύργος Ψύξης > <10 Οι μικροβιολογικές αναλύσεις για το Νοσοκομείο Α (Πίνακας IV.2.2), έδειξαν υψηλή συγκέντρωση του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa ( cfu/250l) στη Γυναικολογική και τη Νεφρολογική κλινική καθώς και στον πύργο ψύξης, ενώ στα υπόλοιπα δείγματα κυμάνθηκε από 0 έως 6 cfu/250l. Αυξημένη ήταν και η παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C (από 0 έως >1000 cfu/ml) και στους 37 0 C (από 1 έως >1000 cfu/ml) 132

134 σχεδόν σε όλα τα δείγματα νερού. Η ανίχνευση του βακτηρίου Legionella spp. πραγματοποιήθηκε σε δείγματα της Νευροχειρουργικής, Χειρουργικής, Νεφρολογικής, Καρδιολογικής, Γυναικολογικής κλινικής καθώς και στη Βραχεία Νοσηλεία σε υψηλή συγκέντρωση (>1000cfu/L), ενώ στα υπόλοιπα δείγματα δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο (<10 cfu/l). Πίνακας IV.2.3. Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Β Κλινικές/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ορθοπεδική 1 /Βρύση 7, ,09 20 Ορθοπεδική 1 / Καταιονιστήρα 8, ,04 40 Χειρουργική 1/Βρύση 7, ,1 20 Χειρουργική 1/Καταιονιστήρα 8, ,08 36 Παθολογική 1 / Βρύση 7, ,06 20 Παθολογική 1 / Καταιονιστήρα 7, ,04 39 Μονάδα Εμφράγματος /Βρύση 7, ,05 20 Μονάδα Εμφράγματος /Καταιονιστήρα 8, ,02 32 Χειρουργική 2 /Βρύση 8, ,05 20,5 Χειρουργική 2 /Καταιονιστήρα 8, ,05 39 Ορθοπεδική 2 /Βρύση 8, ,01 21 Ορθοπεδική 2 / Καταιονιστήρα 8, ,02 41,5 Παθολογική 2 / Βρύση 7, Καρδιολογική /Βρύση 8, ,02 20 Καρδιολογική /Καταιονιστήρα 8, ,02 40,5 Σχετικά με τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων για τα δείγματα νερού του Νοσοκομείου Β, όπως φαίνονται και στον Πίνακα IV.2.3, παρατηρήθηκε πως η θερμοκρασία του κρύου νερού στα δείγματα των κλινικών κυμάνθηκε από 20 0 C έως 20,5 0 C, ενώ του ζεστού νερού από 32 0 C έως 40,5 0 C. Οι μετρήσεις του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν σχεδόν μηδενικές για τα όλα τα δείγματα, ενώ οι μετρήσεις του ph κυμάνθηκαν από 7,77 έως 8,23. Επιπλέον οι μετρήσεις της αγωγιμότητας κυμάνθηκαν από 700 έως 860 μs/cm. Στον πίνακα (Πίνακας IV.2.4) που ακολουθεί αναφέρονται οι μικροβιολογικές αναλύσεις για το Νοσοκομείο Β, σύμφωνα με τις οποίες η παρουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa στα υδάτινα συστήματα της Παθολογικής 1 κλινικής εμφανίστηκε σε 133

135 υψηλή συγκέντρωση 165cfu/250L, ενώ στις υπόλοιπες κλινικές κυμάνθηκε σε χαμηλά επίπεδα (από 0 έως 26 cfu/250l). Η συγκέντρωση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C κυμάνθηκε από 0 έως 210 cfu/ml και στους 37 0 C από 0 έως 1000 cfu/ml. Στα υδάτινα συστήματα της Ορθοπεδικής 1 (Βρύση) και Χειρουργικής 1 κλινικής καθώς και στην Μονάδα Εμφράγματος (Βρύση) δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο Legionella spp. (<10 cfu/l). Στα υπόλοιπα δείγματα νερού των κλινικών το βακτήριο Legionella spp. ανιχνεύθηκε σε συγκέντρωση από 36 έως 3450 cfu/l. Πίνακας IV.2.4. Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Β P. aeruginosa Κλινικές/ Ολική μεσόφιλη Προέλευση νερού (cfu/250ml) Χλωρίδα (cfu/ml) 22 0 C 37 0 C Legionella spp. (cfu/l) Ορθοπεδική 1 /Βρύση <10 Ορθοπεδική 1 / Καταιονιστήρα Χειρουργική 1/Βρύση <10 Χειρουργική 1/Καταιονιστήρα <10 Παθολογική 1 / Βρύση Παθολογική 1 / Καταιονιστήρα Μονάδα Εμφράγματος /Βρύση <10 Μονάδα Εμφράγματος /Καταιονιστήρα Χειρουργική 2 /Βρύση Χειρουργική 2 /Καταιονιστήρα Ορθοπεδική 2 /Βρύση Ορθοπεδική 2 / Καταιονιστήρα Παθολογική 2 / Βρύση Καρδιολογική /Βρύση Καρδιολογική /Καταιονιστήρα Σχετικά με τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων για τα δείγματα νερού του Νοσοκομείου Γ, (Πίνακας IV.2.5) η θερμοκρασία του κρύου νερού στα υδάτινα συστήματα του Θαλάμου Νοσηλείας 11,του Θαλάμου Νοσηλείας 5&6 και του Εφημερίου Ιατρών ήταν 20, 19 και 18 0 C αντίστοιχα, ενώ η θερμοκρασία του ζεστού νερού ήταν 36, 25 και 52 0 C αντίστοιχα. Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν σχεδόν μηδενική για τα όλα τα δείγματα νερού (0,02-0,04 mg/l), οι μετρήσεις του ph για τα δείγματα νερού κυμάνθηκαν από 7,88 έως 8,06, ενώ οι μετρήσεις της αγωγιμότητας κυμάνθηκαν από 455 έως 543 μs/cm. 134

136 Πίνακας IV.2.5. Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Γ Κλινικές/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Θάλαμος Νοσηλείας 11/ Βρύση 8, ,02 20 Θάλαμος Νοσηλείας 11/ Καταιονιστήρα 7, ,02 36 Θάλαμος Νοσηλείας 5&6/ Βρύση 7, ,04 19 Θάλαμος Νοσηλείας 5&6/ Καταιονιστήρα 7, ,03 25 Εφημερείο Ιατρών / Βρύση 8, ,02 18 Εφημερείο Ιατρών / Καταιονιστήρα 8, ,03 52 Οι μικροβιολογικές αναλύσεις του Νοσοκομείου Γ (Πίνακας IV.2.6) έδειξαν παρουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa στον καταιονιστήρα του Θαλάμου Νοσηλείας 11(σε χαμηλή συγκέντρωση, 4 cfu/250l), ενώ στα υπόλοιπα δείγματα δεν υπήρξε παρουσία του βακτηρίου. Στα υδάτινα συστήματα του ζεστού νερού παρατηρήθηκε παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C (1-44 cfu/ml), ενώ στα συστήματα του κρύου νερού δεν υπήρξε ανίχνευση. Η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C κυμάνθηκε από 4 έως 207 cfu/ml. Παρατηρήθηκε παρουσία του βακτηρίου Legionella spp. στον καταιονιστήρα του Θαλάμου Νοσηλείας 5&6 και στο Εφημερείο Ιατρών σε συγκέντρωση 1971 και 28 cfu/l αντίστοιχα. Στα υπόλοιπα δείγματα του Νοσοκομείου Γ δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο (<10cfu/L). Πίνακας IV.2.6. Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Γ P. aeruginosa Κλινικές/ Ολική μεσόφιλη Προέλευση νερού (cfu/250ml) Χλωρίδα (cfu/ml) cfu/l 22 0 C 37 0 C Θάλαμος Νοσηλείας 11/ Βρύση <10 Θάλαμος Νοσηλείας 11/ Καταιονιστήρα <10 Θάλαμος Νοσηλείας 5&6/ Βρύση <10 Θάλαμος Νοσηλείας 5&6/ Καταιονιστήρα Εφημερείο Ιατρών / Βρύση <10 Εφημερείο Ιατρών / Καταιονιστήρα Legionella spp. Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρονται τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων για τα δείγματα νερού του Νοσοκομείου Δ, σύμφωνα με τα οποία η θερμοκρασία του κρύου νερού για τα Δωμάτια 3, 17 και 22 των κλινικών του νοσοκομείου ήταν 24 0 C, 23,5 0 C 135

137 και 24 0 C αντίστοιχα, ενώ η θερμοκρασία του ζεστού νερού ήταν 55 0 C, 52 0 C και 51 0 C αντίστοιχα (Πίνακας IV.2.7). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου για τα δείγματα κρύου νερού ήταν 0,1 mg/l, και για τα δείγματα ζεστού νερού 0,09 mg/l. Το ph κυμάνθηκε από 8,05 έως 8,25, ενώ οι μετρήσεις της αγωγιμότητας για δείγματα που προέρχονταν από την βρύση των κλινικών στα δωμάτια 3 (1890 μs/cm) και 17 (1480 μs/cm) ήταν σχετικά υψηλή συγκριτικά με τα άλλα δείγματα, τα οποία κυμάνθηκαν σε φυσιολογικά επίπεδα ( 362 έως 405 μs/cm). Πίνακας IV.2.7. Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Δ Κλινικές/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Κλινική Δωμ.3 / Βρύση 8, ,1 24 Κλινική Δωμ.3/ Καταιονιστήρα 8, ,09 55 Κλινική Δωμ.17 / Βρύση 8, ,1 23,5 Κλινική Δωμ.17 / Καταιονιστήρα 8, ,09 52 Κλινική Δωμ.22 / Βρύση 8, ,1 24 Κλινική Δωμ.22 / Καταιονιστήρα 8, ,09 51 Όπως φαίνεται και στον πίνακα IV.2.8, το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα νερού του Νοσοκομείου Δ. Η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 22 0 C ανιχνεύθηκε στα συστήματα του κρύου νερού στις κλινικές των δωματίων 3 και 22, ενώ η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα και κυμάνθηκε από 5 έως 470 cfu/ml. Σε 2 δείγματα ζεστού νερού (καταιονιστήρα) παρατηρήθηκε παρουσία του βακτηρίου Legionella spp. σε χαμηλές συγκεντρώσεις (14 cfu/l στο δωμάτιο 3 και 72 cfu/l στο δωμάτιο 17), ενώ στα υπόλοιπα δείγματα δεν υπήρξε παρουσία του βακτηρίου (<10 cfu/l). 136

138 Πίνακας IV.2.8. Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Δ Κλινικές/ Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα (cfu/ml) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Κλινική Δωμ.3 / Βρύση <10 Κλινική Δωμ.3/ Καταιονιστήρα Κλινική Δωμ.17 / Βρύση <10 Κλινική Δωμ.17 / Καταιονιστήρα Κλινική Δωμ.22 / Βρύση <10 Κλινική Δωμ.22 / Καταιονιστήρα <10 Τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων για τα δείγματα νερού του Νοσοκομείου Ε, έδειξαν πως η θερμοκρασία του ζεστού νερού κυμάνθηκε από 44 0 C έως 59 0 C και του κρύου από 19 0 C έως 25 0 C (Πίνακας IV.2.9). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου για τα δείγματα κρύου νερού κυμάνθηκε από 0 έως 0,04 mg/l, και για τα δείγματα ζεστού από 0-0,04 mg/l. Η τιμή του ph για τα δείγματα κρύου νερού κυμάνθηκε από 8,1 έως 8,35, ενώ για τα δείγματα ζεστού κυμάνθηκε από 8,15 έως 8,23. Τέλος οι μετρήσεις της αγωγιμότητας ( μs/cm) κυμάνθηκαν σε φυσιολογικά όρια ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει το δείγμα κρύου νερού που προέρχονταν από την βρύση της Ορθοπεδικής κλινικής, το οποίο είχε αγωγιμότητα 1760 μs/cm, σχετικά υψηλή για πόσιμο νερό. Πίνακας IV.2.9. Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Ε Κλινικές/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ορθοπεδική /Βρύση 8, Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα 8, Παθολογική / Βρύση 8, ,04 24 Παθολογική / Καταιονιστήρα 8, ,03 59 Χειρουργική /Βρύση 8, ,04 25 Χειρουργική /Καταιονιστήρα 8, ,04 44 Πύργος Ψύξης 1 8, ,04 24 Πύργος Ψύξης 2 8, ,04 19 Τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων για τα δείγματα νερού του Νοσοκομείου Δ (Πίνακας IV.2.9) έδειξαν παρουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa σε 3 δείγματα νερού (Παθολογική /Καταιονιστήρα, Χειρουργική /Βρύση, Πύργος Ψύξης 2) σε 137

139 χαμηλή συγκέντρωση (2-8cfu/250L), ενώ στα υπόλοιπα δείγματα δεν υπήρξε παρουσία του βακτηρίου. Δεν υπήρξε παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C εκτός από το δείγμα νερού που προέρχονταν από τον πύργο ψύξης 2 (20cfu/mL). Η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C κυμάνθηκε από 0 έως 10 cfu/ml, ενώ παρατηρήθηκε μεγάλη συγκέντρωση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C στο δείγμα που προέρχονταν από την βρύση της Ορθοπεδικής κλινικής (>1000 cfu/ml). Η ανίχνευση του βακτηρίου Legionella spp. έγινε σε 4 δείγματα σε συγκέντρωση cfu/l. Πίνακας IV.2.9. Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Ε Κλινικές/ Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα(mg/L) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ορθοπεδική /Βρύση 0 0 >1000 <10 Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα Παθολογική / Βρύση <10 Παθολογική / Καταιονιστήρα <10 Χειρουργική /Βρύση <10 Χειρουργική /Καταιονιστήρα Πύργος Ψύξης Πύργος Ψύξης <10 Σχετικά με τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων, για τα δείγματα νερού του Νοσοκομείου ΣΤ (Πίνακας IV.2.10), παρατηρείται πως η τιμή της θερμοκρασίας του κρύου νερού που προέρχονταν από τις βρύσες των κλινικών του Νοσοκομείου ΣΤ, κυμάνθηκε από 18,5 0 C έως 22 0 C, ενώ η θερμοκρασία του ζεστού νερού που προέρχονταν από τους καταιονιστήρες των κλινικών κυμάνθηκε από 30 0 C έως 49,5 0 C. Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν σχεδόν μηδενική για τα περισσότερα δείγματα (0,02-0,07 mg/l), ενώ για τα υπόλοιπα δείγματα κυμάνθηκε σε φυσιολογικά επίπεδα (0,36-0,44 mg/l). Το ph κυμάνθηκε από 7,53 έως 8,21. Οι μετρήσεις της αγωγιμότητας για δείγματα κρύου νερού που προέρχονταν από την βρύση των κλινικών κυμάνθηκαν από 512 μs/cm έως 585μS/cm και για τα δείγματα ζεστού νερού που προέρχονταν από τους καταιονιστήρες των κλινικών κυμάνθηκαν από 543 μs/cm έως 590 μs/cm. 138

140 Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο ΣΤ Κλινικές/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Γυναικολογική /Βρύση 8, ,02 20,5 Γυναικολογική/Καταιονιστήρα 7, ,03 49,5 Παθολογική 1 / Καταιονιστήρα 8, ,02 41 Παθολογική 2 / Βρύση 8, ,03 20,5 Παθολογική 2 / Καταιονιστήρα 8, ,02 41 Χειρουργική 1 /Βρύση 7, ,02 21 Χειρουργική 1 /Καταιονιστήρα 7, ,02 49 Παιδιατρική /Βρύση 7, ,44 18,5 Παιδιατρική / Καταιονιστήρα 7, ,06 40,5 Παθολογική 3 / Βρύση 7, ,39 19 Παθολογική 3 / Καταιονιστήρα 7, ,07 30 Ορθοπεδική /Βρύση 7, ,41 22 Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα 7, ,06 42 Χειρουργική 2 /Βρύση 7, ,36 22 Χειρουργική 2 /Καταιονιστήρα 7, ,07 42 Σε ότι αφορά τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων για το Νοσοκομείο ΣΤ, όπως φαίνεται και στον πίνακα IV.2.10, το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa ανιχνεύθηκε σε 3 δείγματα νερού που προέρχονταν από τον καταιονιστήρα των κλινικών, Ορθοπεδική (7 cfu/250ml) και Χειρουργική 2 (4 cfu/250ml) και από την βρύση της κλινικής Χειρουργικής 2 (3 cfu/250ml). Υπήρξε παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C σε συγκεντρώσεις που κυμάνθηκαν από 0 έως 180 cfu/ml και από 0 έως 230 cfu/ml αντίστοιχα. Στα υδάτινα συστήματα ζεστού και κρύου νερού, στις κλινικές Γυναικολογική, Παθολογική 1, Παθολογική 2 και Χειρουργική 1, η παρουσία του βακτηρίου Legionella spp. υπήρξε σε υψηλή συγκέντρωση (>1000cfu/L). 139

141 Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο ΣΤ Κλινικές/ Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα (cfu/ml) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Γυναικολογική /Βρύση <10 Γυναικολογική/Καταιονιστήρα >1000 Παθολογική 1 / Καταιονιστήρα >1000 Παθολογική 2 / Βρύση >1000 Παθολογική 2 / Καταιονιστήρα >1000 Χειρουργική 1 /Βρύση >1000 Χειρουργική 1 /Καταιονιστήρα <10 Παιδιατρική /Βρύση <10 Παιδιατρική / Καταιονιστήρα <10 Παθολογική 3 / Βρύση <10 Παθολογική 3 / Καταιονιστήρα <10 Ορθοπεδική /Βρύση <10 Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα <10 Χειρουργική 2 /Βρύση <10 Χειρουργική 2 /Καταιονιστήρα Σχετικά με τις φυσικοχημικές παραμέτρους που αναλύθηκαν, για τα δείγματα νερού του Νοσοκομείου Ζ, η θερμοκρασία του κρύου νερού για την Παθολογική, Παιδιατρική, Χειρουργική, Γυναικολογική και Ορθοπεδική κλινική κυμάνθηκε από 18 0 C έως 22 0 C. Η θερμοκρασία του ζεστού για τις κλινικές Παθολογική και Παιδιατρική ήταν 38 0 C και για τις κλινικές Χειρουργική, Γυναικολογική και Ορθοπεδική ήταν 36 0 C (Πίνακας IV.2.11). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου για όλα τα δείγματα που ελήφθησαν από τις κλινικές του Νοσοκομείου Ζ κυμάνθηκε σε φυσιολογικά επίπεδα (0,24-0,33 mg/l). Το ph κυμάνθηκε από 8,1 έως 8,25, ενώ οι τιμές της αγωγιμότητας για τα δείγματα κρύου νερού που προέρχονταν από την βρύση των κλινικών ήταν από 390 μs/cm έως 524 μs/cm) και για τα δείγματα ζεστού νερού που προέρχονταν από τον καταιονιστήρα των κλινικών ήταν από 396 μs/cm έως 447 μs/cm. 140

142 Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Ζ Κλινικές/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Παθολογική / Βρύση 8, ,32 19 Παθολογική / Καταιονιστήρα 8, ,34 38 Παιδιατρική /Βρύση 8, ,3 22 Παιδιατρική / Καταιονιστήρα 8, ,28 38 Χειρουργική /Βρύση 8, ,26 20 Χειρουργική /Καταιονιστήρα 8, ,24 36 Γυναικολογική /Βρύση 8, ,29 21 Γυναικολογική/Καταιονιστήρα 8, ,3 36 Ορθοπεδική /Βρύση 8, ,32 18 Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα 8, ,33 36 Οι αναλύσεις των μικροβιολογικών παραμέτρων του Νοσοκομείου Ζ (Πίνακας IV.2.11) έδειξαν παρουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa στον καταιονιστήρα της Παθολογικής κλινικής και στην βρύση της Χειρουργικής κλινικής, σε συγκέντρωση 55 cfu/250l και 15 cfu/250l, ενώ στα υπόλοιπα δείγματα δεν υπήρξε παρουσία του βακτηρίου. Επίσης στα υδάτινα συστήματα του Νοσοκομείου Ζ παρατηρήθηκε παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C σε συγκεντρώσεις, 0-160cfu/mL και 0-239cfu/mL αντίστοιχα. Το βακτήριο Legionella spp. δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα δείγματα νερού που ελήφθησαν από το Νοσοκομείο Ζ (<10 cfu/l). Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Ζ Κλινικές/ Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα(cfu/mL) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Παθολογική / Βρύση <10 Παθολογική / Καταιονιστήρα <10 Παιδιατρική /Βρύση <10 Παιδιατρική / Καταιονιστήρα <10 Χειρουργική /Βρύση <10 Χειρουργική /Καταιονιστήρα <10 Γυναικολογική /Βρύση <10 Γυναικολογική/Καταιονιστήρα <10 Ορθοπεδική /Βρύση <10 Ορθοπεδική / Καταιονιστήρα <10 141

143 Σχετικά με τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων για τα δείγματα νερού του τελευταίου νοσοκομείου που μελετήθηκε, Νοσοκομείο Η, η θερμοκρασία του κρύου νερού κυμάνθηκε από 18,5 0 C, έως 20,5 0 C και η θερμοκρασία του ζεστού από 39,5 0 C έως 41 0 C (Πίνακας IV.2.12). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου για όλα τα δείγματα ήταν χαμηλή (0,07-0,18 mg/l). Οι τιμές των μετρήσεων του ph για τα δείγματα νερού κυμάνθηκαν από 7,98 έως 8,1. Τέλος η τιμή της αγωγιμότητας του κρύου νερού για τα δείγματα που ελήφθησαν από τις κλινικές, κυμάνθηκε από 430 μs/cm έως 444 μs/cm και του ζεστού από 445 μs/cm έως 451 μs/cm. Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Η Κλινικές/ ph Αγωγιμότητα Υπολειπόμενο Προέλευση νερού (μs/cm) Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Γυναικολογική /Βρύση 8, ,17 18,5 Γυναικολογική/Καταιονιστήρα 7, ,07 40,5 Ω.Ρ.Λ /Βρύση 8, ,15 20,5 Ω.Ρ.Λ /Καταιονιστήρα 8, ,02 41 Οφθαλμολογική /Βρύση 8, ,2 19 Οφθαλμολογική/Καταιονιστήρα 8, ,18 39,5 Ο πίνακας που ακολουθεί, αναφέρει τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων για το Νοσοκομείο Η, σύμφωνα με τα οποία, δεν υπήρξε ανίχνευση του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa στα δείγματα που ελήφθησαν από τις κλινικές του νοσοκομείου (Πίνακας IV.2.13). Η παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C κυμάνθηκε σε συγκεντρώσεις από 0 cfu/ml έως 105 cfu/ml και από 0 cfu/ml έως 110 cfu/ml αντίστοιχα. Σχετικά με το βακτήριο Legionella spp. δεν υπήρξε ανίχνευση σε κανένα από τα δείγματα που ελήφθησαν από τα υδάτινα συστήματα του νοσοκομείου (<10cfu/L). Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Νοσοκομείο Η Κλινικές/ P. aeruginosa Ολική μεσόφιλη Legionella spp. Προέλευση νερού (cfu/250ml) Χλωρίδα(cfu/mL) (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Γυναικολογική /Βρύση <10 Γυναικολογική/Καταιονιστήρα <10 Ω.Ρ.Λ /Βρύση <10 Ω.Ρ.Λ /Καταιονιστήρα <10 Οφθαλμολογική /Βρύση <10 Οφθαλμολογική/Καταιονιστήρα <10 142

144 Σχετικά με τα δείγματα νερών που ελήφθησαν από τα Ξενοδοχεία της περιοχής Πατρών, στους πίνακες που ακολουθούν παρακάτω, αναφέρονται τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών και μικροβιολογικών παραμέτρων για τα δείγματα νερού που ελήφθησαν από αυτά (Πίνακες IV IV.2.30). Σε ότι αφορά τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων για τα δείγματα νερού που ελήφθησαν από το Ξενοδοχείο 1, η θερμοκρασία του κρύου και του ζεστού νερού ήταν 22 0 C (βρύση δωματίου) και 44 0 C(καταιονιστήρα δωματίου) αντίστοιχα, ενώ η θερμοκρασία του υδρόψυκτου πύργου ψύξης του ξενοδοχείου στην είσοδο και στην ανακυκλοφορία ήταν 10 0 C (Πίνακας 27). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου για τα δείγματα νερού που ελήφθησαν από τα δωμάτια κυμάνθηκε σε φυσιολογικά όρια: 0,38 mg/l( βρύση/κρύο) και 0,24 mg/l (καταιονιστήρα/ζεστό). Οι τιμές των μετρήσεων του ph κυμάνθηκαν από 8,12 έως 8,21, ενώ η τιμή της αγωγιμότητας κυμάνθηκε από 223 μs/cm έως 416 μs/cm. Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 1 Ξενοδοχείο/ ph Αγωγιμότητα Υπολειπόμενο Θερμοκρασία Προέλευση νερού (μs/cm) Χλώριο (mg/l) ( 0 C) Ξενοδοχείο 1/ Πύργος Ψύξης, 8, ,04 10 ανακυκλοφορία Ξενοδοχείο 1/ Πύργος Ψύξης, είσοδος 8, ,05 10 Ξενοδοχείο 1/ Βρύση 8, ,38 22 Ξενοδοχείο 1/ Καταιονιστήρα 8, ,24 44 Οι μικροβιολογικές αναλύσεις των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από το Ξενοδοχείο 1 (Πίνακας IV.2.15) έδειξαν απουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa σε όλα τα δείγματα. Η παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C υπήρξε στα δείγματα νερού που προέρχονταν από την είσοδο και την ανακυκλοφορία του πύργου ψύξης, σε συγκέντρωση 14 cfu/ml(είσοδος) και 41cfu/mL (ανακυκλοφορία) αντίστοιχα και 2 cfu/ml (είσοδος) και 120 cfu/ml (ανακυκλοφορία) αντίστοιχα. Δεν υπήρξε ανίχνευση του βακτηρίου Legionella spp. σε κανένα από τα δείγματα που αναλύθηκαν (<10 cfu/l). 143

145 Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 1 Ξενοδοχείο / Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα(cfu/mL) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 1/ Πύργος Ψύξης, <10 ανακυκλοφορία Ξενοδοχείο 1/ Πύργος Ψύξης, είσοδος <10 Ξενοδοχείο 1/ Βρύση <10 Ξενοδοχείο 1/ Καταιονιστήρα <10 Οι μετρήσεις των φυσικοχημικών παραμέτρων για τα δείγματα νερού που ελήφθησαν από το Ξενοδοχείο 2 αναφέρονται στον πίνακα που ακολουθεί (Πίνακας IV.2.16). Η τιμή της θερμοκρασίας του κρύου νερού για τα 2 δείγματα που ελήφθησαν από τα δωμάτια των ξενοδοχείων ήταν 24,5 0 C και 25 0 C, ενώ για την είσοδο και την έξοδο του πύργου ψύξης ήταν 22 0 C και 10,5 0 C αντίστοιχα. Η τιμή της θερμοκρασίας του ζεστού νερού για τα 2 δείγματα που ελήφθησαν από τα δωμάτια των ξενοδοχείων ήταν 50 0 C και 58 0 C (Πίνακας IV.2.16). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου για όλα τα δείγματα βρίσκονταν σε χαμηλά επίπεδα (μη επιτρεπτά όρια, 0,01-0,07 mg/l). Οι τιμές των μετρήσεων του ph κυμάνθηκαν από 7,8 έως 8,23, ενώ η τιμή της αγωγιμότητας του δείγματος από την έξοδο του πύργου ψύξης ήταν αρκετά υψηλή, 6720 μs/cm. Επίσης και οι τιμές της αγωγιμότητας των υπόλοιπων δειγμάτων κυμάνθηκαν σε σχετικά υψηλά επίπεδα, από 660 μs/cm έως 951 μs/cm. Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 2 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 2/ Πύργος Ψύξης, είσοδος 8, ,04 22 Ξενοδοχείο 2/ Πύργος Ψύξης, έξοδος 8, ,07 10,5 Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221α Βρύση 8, ,06 24,5 Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221α Καταιονιστήρα 7, ,04 50 Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221β Βρύση 8, ,01 25 Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221β Καταιονιστήρα 8, ,01 58 Σχετικά με τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από το Ξενοδοχείο 2 (Πίνακας IV.2.17.) η ανίχνευση του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa υπήρξε μόνο σε 2 δείγματα νερού που ελήφθησαν από τη βρύση και τον 144

146 καταιονιστήρα του δωματίου του ξενοδοχείου σε χαμηλή συγκέντρωση, 6 cfu/250ml και 3 cfu/250ml αντίστοιχα. Η παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C, κυμάνθηκε μεταξύ 0-79 cfu/ml και 0-26 cfu/ml αντίστοιχα. Η παρουσία του βακτηρίου Legionella spp. στην είσοδο του υδρόψυκτου πύργου ψύξης του ξενοδοχείου βρέθηκε σε υψηλή συγκέντρωση 1557 cfu/l, ενώ η παρουσία του βακτηρίου στα υπόλοιπα δείγματα κυμάνθηκε σε χαμηλά επίπεδα (14 cfu/l-86 cfu/l). Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 2 Ξενοδοχείο / Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα(cfu/mL) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 2/ Πύργος Ψύξης, είσοδος Ξενοδοχείο 2/ Πύργος Ψύξης, έξοδος Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221α Βρύση <10 Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221α Καταιονιστήρα Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221β Βρύση <10 Ξενοδοχείο 2/ Δωμ. 221β Καταιονιστήρα Σε ότι αφορά τις φυσικοχημικές αναλύσεις, για τo δείγμα νερού από την είσοδο του πύργου ψύξης του Ξενοδοχείου 3, η θερμοκρασία ήταν 32 0 C (Πίνακας IV.2.18). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν χαμηλή (0,01 mg/l), η τιμή του ph 8,98, ενώ η τιμή της αγωγιμότητας, (2120 μs/cm), του δείγματος ήταν σχετικά υψηλή. Σχετικά με τις μικροβιολογικές παραμέτρους, δεν ανιχνεύθηκαν τα βακτήρια Legionella spp. και Pseudomonas aeruginosa, ενώ δεν υπήρχε παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C (Πίνακας IV.2.19). Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 3 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 3/ Πύργος Ψύξης, είσοδος 8, ,

147 Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 3 Ξενοδοχείο / Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα(cfu/mL) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 3/ Πύργος Ψύξης, είσοδος <10 Σύμφωνα με τις μετρήσεις των φυσικοχημικών παραμέτρων για τα δείγματα που ελήφθησαν από το Ξενοδοχείο 4, η θερμοκρασία του κρύου και του ζεστού ήταν 22 0 C (βρύση δωματίου) και 51 0 C (καταιονιστήρα δωματίου) αντίστοιχα, ενώ η θερμοκρασία του υδρόψυκτου πύργου ψύξης του ξενοδοχείου στην ανακυκλοφορία ήταν 25,5 0 C (Πίνακας IV.2.20). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου για τα δείγματα που ελήφθησαν από τα δωμάτια κυμάνθηκε σε φυσιολογικά όρια, 0,28mg/L( βρύση/κρύο) και 0,2 mg/l (καταιονιστήρα/ζεστό). Οι τιμές των μετρήσεων του ph κυμάνθηκαν από 7,54 έως 8,28, ενώ η τιμή της αγωγιμότητας κυμάνθηκε από 497 μs/cm έως 851 μs/cm. Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 4 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 4/ Πύργος Ψύξης, 8, ,5 ανακυκλοφορία Ξενοδοχείο 4/ Βρύση 7, ,28 22 Ξενοδοχείο 4/ Καταιονιστήρα 7, ,2 51 Οι μικροβιολογικές αναλύσεις των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από το Ξενοδοχείο 4 (Πίνακας IV.2.21) έδειξαν αυξημένο μικροβιακό φορτίο του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa (1000cfu/250mL) και της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C (1000 cfu/ml) στην ανακυκλοφορία του υδρόψυκτου πύργου ψύξης. Η παρουσία του βακτηρίου Legionella spp. στην είσοδο του υδρόψυκτου πύργου ψύξης του ξενοδοχείου βρέθηκε σε υψηλή συγκέντρωση 100 cfu/l, ενώ δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο στα δείγματα που προέρχονταν από τα συστήματα ύδρευσης του δωματίου του ξενοδοχείου (<10cfu/L). 146

148 Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 4 Ξενοδοχείο / Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα (cfu/ml) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 4/ Πύργος Ψύξης, ανακυκλοφορία Ξενοδοχείο 4/ Βρύση <10 Ξενοδοχείο 4/ Καταιονιστήρα <10 Τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων για τo δείγματα του Ξενοδοχείου 5 έδειξαν ότι η θερμοκρασία στην έξοδο του υδρόψυκτου πύργου ψύξης ήταν 30 0 C και η θερμοκρασία κρύου ( βρύση δωματίου) και ζεστού (καταιονιστήρα δωματίου) νερού ήταν 25 0 C και 55 0 C αντίστοιχα (Πίνακας IV.2.22). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν σχεδόν μηδενική για τα δείγματα ζεστού και κρύου νερού, ενώ η τιμή στον πύργο ψύξης ήταν 0,13 mg/l. Η τιμή του ph κυμάνθηκε από 8,27 έως 8,47 και η τιμή της αγωγιμότητας υπήρξε υψηλή (1870 μs/cm). Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 5 Ξενοδοχείο/ ph Αγωγιμότητα Υπολειπόμενο Προέλευση νερού (μs/cm) Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 5/ Πύργος Ψύξης, έξοδος 8, ,13 30 Ξενοδοχείο 5/ Βρύση 8, ,06 25 Ξενοδοχείο 5/ Καταιονιστήρα 8, ,02 55 Οι αναλύσεις των μικροβιολογικών παραμέτρων για τα δείγματα του Ξενοδοχείου 5, έδειξαν παρουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa, μόνο στο δείγμα νερού από την έξοδο του πύργου ψύξης (115cfu/250L) (Πίνακας IV.2.23). Η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 22 0 C κυμάνθηκε από 2 cfu/ml έως 56 cfu/ml και η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C ανιχνεύθηκε στο δείγμα του πύργου ψύξης σε υψηλή συγκέντρωση (1000 cfu/ml). Τέλος το βακτήριο Legionella spp. δεν ανιχνεύθηκε στο δείγμα νερού του πύργου ψύξης, ενώ ανιχνεύθηκε στα δείγματα κρύου και ζεστού νερού, σε συγκέντρωση 15 cfu/l και 372 cfu/l αντίστοιχα. 147

149 Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 5 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα (cfu/ml) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 5/ Πύργος Ψύξης, έξοδος <10 Ξενοδοχείο 5/ Βρύση Ξενοδοχείο 5/ Καταιονιστήρα Στο Ξενοδοχείο 6, η θερμοκρασία του κρύου και του ζεστού νερού ήταν 22 0 C (βρύση δωματίου) και 58 0 C (καταιονιστήρα δωματίου) αντίστοιχα (Πίνακας IV.2.24). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν εκτός επιτρεπτών ορίων, 0,04 mg/l (βρύση/κρύο) και 0,02 mg/l(καταιονιστήρα/ζεστό). Η τιμή του ph για τα δείγματα νερού κρύου και ζεστού νερού ήταν 8,16 και 8,23 αντίστοιχα, ενώ η τιμή της αγωγιμότητας ήταν 527 μs/cm για το δείγμα κρύου νερού/βρύση και 701 μs/cm για το δείγμα ζεστού νερού/καταιονιστήρα. Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 6 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 6/ Βρύση 8, ,04 22 Ξενοδοχείο 6/ Καταιονιστήρα 8, ,02 58 Οι μικροβιολογικές αναλύσεις των δειγμάτων νερού του Ξενοδοχείου 6, έδειξαν απουσία των βακτηρίων Pseudomonas aeruginosa, Legionella spp., καθώς και της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C σε όλα τα δείγματα (Πίνακας IV.2.25). Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 6 P. aeruginosa Ξενοδοχείο / Ολική μεσόφιλη Προέλευση νερού (cfu/250ml) Χλωρίδα(cfu/mL) (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 6/ Βρύση <10 Ξενοδοχείο 6/ Καταιονιστήρα <10 Legionella spp. πως Σχετικά με το Ξενοδοχείο 7, οι φυσικοχημικές μετρήσεις των δειγμάτων νερού έδειξαν η θερμοκρασία κρύου νερού/βρύση ήταν 25 0 C και η θερμοκρασία ζεστού 148

150 νερού/καταιονιστήρα ήταν 50 0 C (Πίνακας IV.2.26). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν σχεδόν μηδενική και για τα δύο δείγματα (0,03 mg/l). Η τιμή του ph ήταν 8,13 για το δείγμα της βρύσης και 7,98 για το δείγμα του καταιονιστήρα, ενώ η τιμή της αγωγιμότητας ήταν 753 μs/cm και 689 μs/cm αντίστοιχα. Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 7 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 7/ Βρύση 8, ,03 25 Ξενοδοχείο 7/ Καταιονιστήρα 7, ,03 50 Οι αναλύσεις των μικροβιολογικών παραμέτρων για τα δείγματα του Ξενοδοχείου 7, έδειξαν απουσία των βακτηρίων Pseudomonas aeruginosa και Legionella spp. (Πίνακας IV.2.27). Η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 22 0 C για το δείγμα κρύου νερού, ανιχνεύθηκε σε συγκέντρωση 49 cfu/ml, ενώ η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C ανιχνεύθηκε στο δείγμα κρύου και ζεστού νερού βρέθηκε σε συγκέντρωση 1 cfu/ml και 26 cfu/ml αντίστοιχα. Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 7 Ξενοδοχείο / Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα(cfu/mL) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 7/ Βρύση <10 Ξενοδοχείο 7/ Καταιονιστήρα <10 Σχετικά με τις φυσικοχημικές μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν για τα δείγματα που ελήφθησαν από το Ξενοδοχείο 8, η θερμοκρασία κρύου (βρύση δωματίου) και ζεστού (καταιονιστήρα δωματίου) νερού ήταν 28 0 C και 37,8 0 C αντίστοιχα (Πίνακας IV.2.28). Η συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου ήταν μηδενική και για τα δύο δείγματα και η τιμή του ph ήταν 7,75 και 7,88 για το κρύο και το ζεστό αντίστοιχα. Η αγωγιμότητα είχε τιμή 738 μs/cm για το δείγμα της βρύσης και 739 μs/cm για το δείγμα του καταιονιστήρα. 149

151 Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 8 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 8/ Βρύση 7, Ξενοδοχείο 8/ Καταιονιστήρα 7, ,8 Οι αναλύσεις των μικροβιολογικών παραμέτρων για τα δείγματα νερού του Ξενοδοχείου 8, έδειξαν απουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa και της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C. (Πίνακας IV.2.29). Η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C ανιχνεύθηκε στο δείγμα κρύου νερού/βρύση σε χαμηλή συγκέντρωση 6 cfu/ml και στο δείγμα ζεστού νερού/καταιονιστήρα σε υψηλότερη συγκέντρωση 82 cfu/ml. Τέλος Legionella spp. ανιχνεύθηκε μόνο στο δείγμα νερού του καταιονιστήρα, σε συγκέντρωση 400 cfu/l. Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 8 P. aeruginosa Ξενοδοχείο / Ολική μεσόφιλη Προέλευση νερού (cfu/250ml) Χλωρίδα(cfu/mL) (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 8/ Βρύση <10 Ξενοδοχείο 8/ Καταιονιστήρα Legionella spp. Σχετικά με το τελευταίο ξενοδοχείο που μελετήθηκε, το Ξενοδοχείο 9, η θερμοκρασία κρύου νερού/βρύση ήταν 25,6 0 C και η θερμοκρασία ζεστού νερού/ καταιονιστήρα ήταν 53,8 0 C (Πίνακας IV.2.29). Επιπλέον δεν μετρήθηκε υπολειπόμενο χλώριο (0 mg/l) σε κανένα δείγμα. Η τιμή του ph ήταν 7,95 για το δείγμα της βρύσης και 7,91 για το δείγμα του καταιονιστήρα, ενώ η τιμή της αγωγιμότητας ήταν 707 μs/cm και 702 μs/cm, αντίστοιχα. Πίνακας IV Αποτελέσματα φυσικοχημικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 9 Ξενοδοχείο/ Προέλευση νερού ph Αγωγιμότητα (μs/cm) Υπολειπόμενο Χλώριο (mg/l) Θερμοκρασία ( 0 C) Ξενοδοχείο 9/ Βρύση 7, ,6 Ξενοδοχείο 9/ Καταιονιστήρα 7, ,8 150

152 Σύμφωνα με τις αναλύσεις των μικροβιολογικών παραμέτρων για τα δείγματα του Ξενοδοχείου 9, το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa ανιχνεύθηκε στο δείγμα ζεστού νερού/καταιονιστήρα σε συγκέντρωση 4 cfu/250ml (Πίνακας IV.2.30). Υπήρξε παρουσία Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C για το δείγμα κρύου και ζεστού νερού, σε συγκέντρωση 1 cfu/ml και 65 cfu/ml αντίστοιχα. Legionella spp. ανιχνεύθηκε μόνο στο δείγμα ζεστού νερού του καταιονιστήρα, σε συγκέντρωση 243 cfu/l. Πίνακας IV Αποτελέσματα μικροβιολογικών παραμέτρων για το Ξενοδοχείο 9 Ξενοδοχείο / Προέλευση νερού P. aeruginosa (cfu/250ml) Ολική μεσόφιλη Χλωρίδα(cfu/mL) Legionella spp. (cfu/l) 22 0 C 37 0 C Ξενοδοχείο 9/ Βρύση <10 Ξενοδοχείο 9/ Καταιονιστήρα IV.3. Στατιστική Ανάλυση των Εργαστηριακών Αποτελεσμάτων Στα γραφήματα που ακολουθούν παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των δειγμάτων, που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδος και τα Ξενοδοχεία της περιοχής Πατρών. Στο Γράφημα IV.3.1 φαίνεται ότι το 33% των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας βρέθηκαν θετικά για το βακτήριο L.pneumophila, ενώ το 67% των δειγμάτων ήταν αρνητικά. 151

153 Γράφημα IV.3.1: Ποσοστιαία ανίχνευση του βακτηρίου L. pneumophila στα δείγματα νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας. Στα Ξενοδοχεία της περιοχής των Πατρών, στο 64% των δειγμάτων νερού δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο L.pneumophila, ενώ στο 36% των δειγμάτων υπήρξε παρουσία του βακτηρίου (Γράφημα IV.3.2). Γράφημα IV.3.2: Ποσοστιαία ανίχνευση του βακτηρίου L. pneumophila στα δείγματα νερού που ελήφθησαν από τα Ξενοδοχεία της περιοχής Πατρών. Συνολικά, για τα Ξενοδοχεία που εξετάστηκαν στην περιοχή της Πάτρας, στο 55% των εξεταζόμενων Ξενοδοχείων υπήρξε παρουσία του βακτηρίου στο σύστημα ύδρευσης τους, ενώ στο 45% υπήρξε απουσία του βακτηρίου (Γράφημα IV.3.3). 152

154 Γράφημα IV.3.3: Εξεταζόμενα Ξενοδοχεία της περιοχής Πατρών, για ανίχνευση του βακτηρίου L.pneumophila. Στο γράφημα που ακολουθεί, φαίνεται ότι το 75% των εξεταζόμενων Νοσοκομείων ήταν θετικά για L.pneumophila, ενώ το 25% ήταν αρνητικά (Γράφημα IV.3.4). Γράφημα IV.3.4: Εξεταζόμενα Νοσοκομεία, για ανίχνευση του βακτηρίου L. pneumophila. Η συγκέντρωση του βακτηρίου για το σύστημα ύδρευσης των Νοσοκομείων κυμάνθηκε σε διάφορα μεγέθη. Όπως αναφέρεται και στο παρακάτω γράφημα το 19% των δειγμάτων είχε συγκέντρωση >1000 cfu/l, το 7% των δειγμάτων κυμάνθηκε μεταξύ cfu/l, το 8% των 153

155 δειγμάτων κυμάνθηκε μεταξύ cfu/l και το 66% των δειγμάτων είχε συγκέντρωση <10 cfu/l (Γράφημα IV.3.5). Γράφημα IV.3.5: Συγκέντρωση του βακτηρίου L.pneumophila στα δείγματα που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας. Σχετικά με τα αποτελέσματα που αφορούν τα Ξενοδοχεία της περιοχής Πατρών, η συγκέντρωση της L. pneumophila στα συστήματα ύδρευσης βρέθηκε >1000 cfu/l σε ποσοστό 4%. Το 12% των δειγμάτων κυμάνθηκε μεταξύ cfu/l, το 20% των δειγμάτων κυμάνθηκε μεταξύ cfu/l και το 64% των δειγμάτων είχε συγκέντρωση <10 cfu/l (Γράφημα IV.3.6). 154

156 Γράφημα IV.3.6: Συγκέντρωση του βακτηρίου L. pneumophila στα δείγματα που ελήφθησαν από τα Ξενοδοχεία της περιοχής Πατρών. IV.3.α. Legionella και Υπολειπόμενο Χλώριο Στην γραφική παράσταση που ακολουθεί φαίνεται πως δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης της Legionella spp. με την συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου στα δείγματα που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία (r 2 =0.071) (Γραφική Παράσταση IV3.1). 155

157 Γραφική Παράσταση IV3.1: Γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. με την συγκέντρωση του υπολειπόμενου χλωρίου (mg/l) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 =0.071). Παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου στα δείγματα των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων σε δύο ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις του υπολειπόμενου χλωρίου (Σχήμα IV3.1). Πιο αναλυτικά, η συγκέντρωση της Legionella spp. στα δείγματα νερού με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0.00 mg/l και 0.03 mg/l ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0.10 mg/l και 0.45 mg/l (p<0.0001) (Σχήμα IV3.2). Επίσης η συγκέντρωση του βακτηρίου στα δείγματα με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0.03 mg/l και 0.05 mg/l ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0.10 mg/l και 0.45 mg/l (p<0.001) (Σχήμα IV3.2). 156

158 Σχήμα IV3.1: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp.(cfu/l) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του υπολειπόμενου χλωρίου (mg/l) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p<0.001 (**) και p< (***)). 157

159 Σχήμα IV3.2: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp.(cfu/l) σε τρεις ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις του υπολειπόμενου χλωρίου (mg/l) ( mg/l, mg/l και mg/l) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p<0.001(**) και p< (***)). IV.3.β. Legionella και ph Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων των δειγμάτων νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων, έδειξε πως δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου με τις μετρήσεις του ph στα δείγματα νερού (r 2 =0.02, p=0.182) (Γραφική Παράσταση IV3.2). 158

160 Γραφική Παράσταση IV3.2: Γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. με τις μετρήσεις του ph στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 =0.02, p=0.182). Στο παρακάτω σχήμα παρατηρείται πως δεν υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων σε διάφορες ομαδοποιημένες μετρήσεις του ph (Σχήμα IV3.3). Πιο αναλυτικά, η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού με ph μεταξύ 7.5 και 8.0, δεν ήταν στατιστικώς σημαντική σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με ph μεταξύ , ή με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με ph μεταξύ (p=0.393) (Σχήμα IV3.3). 159

161 Σχήμα IV3.3: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp.(cfu/l) σε διάφορες ομαδοποιημένες μετρήσεις του ph ( , και ) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p=0.393). IV.3.γ. Legionella και Aγωγιμότητα Από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του συνόλου των δειγμάτων νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων, προκύπτει πως δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου με τις μετρήσεις της αγωγιμότητας των δειγμάτων (r 2 =0.002, p=0.589) (Γραφική Παράσταση IV3.3). 160

162 Γραφική Παράσταση IV3.3: Γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. με τις μετρήσεις της αγωγιμότητας μs/cm στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 =0.02, p=0.589). Σχήμα IV3.4: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp.(cfu/l) σε διαφορετικές ομαδοποιημένες μετρήσεις της αγωγιμότητας (μs/cm) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p< (***). 161

163 Στο παραπάνω σχήμα παρατηρήθηκε, πως υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων σε δύο ομαδοποιημένες μετρήσεις της αγωγιμότητας (Σχήμα IV3.4). Πιο αναλυτικά, η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού με αγωγιμότητα μεταξύ 400 μs/cm και 500 μs/cm ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με αγωγιμότητα μεταξύ 700 μs/cm και 800 μs/cm (p<0.0001) (Σχήμα IV3.4). IV.3.δ. Legionella και Θερμοκρασία Γραφική Παράσταση IV3.4: Γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. με τις μετρήσεις της θερμοκρασίας ( 0 C) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 =0.002, p=0.568). Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του συνόλου των δειγμάτων νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων, όπως φαίνεται στην παραπάνω γραφική παράσταση, έδειξε πως δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου με της μετρήσεις της θερμοκρασίας ( 0 C) των δειγμάτων (r 2 =0.002, p=0.568) (Γραφική Παράσταση IV3.4). 162

164 Σχήμα IV3.5: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp.(cfu/l) σε διαφορετικές ομαδοποιημένες μετρήσεις της θερμοκρασίας ( 0 C) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p<0.05 (*), p<0.001 (**) και p< (***)). Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διακύμανση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp σε διάφορες θερμοκρασίες των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία (Σχήμα IV3.5). Η μεγαλύτερη συγκέντρωση του βακτηρίου υπήρξε στις θερμοκρασίες μεταξύ 36 0 C και 40 0 C και στις θερμοκρασίες 40 0 C και 44 0 C. Στο παραπάνω σχήμα παρατηρείται πως υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων σε τέσσερις ομαδοποιημένες μετρήσεις της θερμοκρασίας ( 0 C) (Σχήμα IV3.5). Πιο αναλυτικά, η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού με θερμοκρασία μεταξύ 16 0 C και 20 0 C, ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με θερμοκρασία μεταξύ 36 0 C και 40 0 C και με την συγκέντρωση του βακτηρίου με θερμοκρασία μεταξύ 40 0 C και 44 0 C. Επίσης η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού με θερμοκρασία μεταξύ 32 0 C και 36 0 C, ήταν στατιστικώς 163

165 σημαντικά μειωμένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με θερμοκρασία μεταξύ 40 0 C και 44 0 C (p<0.05 ( * ), p<0.001 ( ** ) και p< ( *** ), (Σχήμα IV3.6). Σχήμα IV3.6: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε τέσσερις ομαδοποιημένες μετρήσεις της θερμοκρασίας ( 0 C) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p<0.05 (*), p<0.001 (**) και p< (***)). IV.3.ε. Legionella και Pseudomonas aeruginosa Η γραφική παράσταση, που ακολουθεί, έδειξε πως δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) με την συγκέντρωση του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa (cfu/250ml) των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία (r 2 =0.012, p=0.805) (Γραφική Παράσταση IV3.5). Επιπλέον, δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου σε διάφορες ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa (cfu/250ml) (p=0.805) (Σχήμα IV3.7). 164

166 Γραφική Παράσταση IV3.5: Γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) με την συγκέντρωση του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa (cfu/250ml) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 =0.012, p=0.257). Σχήμα IV3.7: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa (cfu/250ml) στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p=0.805). 165

167 IV.3.στ. Legionella και Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 22 0 C Στην παρακάτω γραφική παράσταση, παρατηρήθηκε πως δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) με την συγκέντρωση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C, (cfu/ml) των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία (r 2 =0.012, p=0.805) (Γραφική Παράσταση IV3.6). Γραφική Παράσταση IV3.6: Γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) με την συγκέντρωση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C, (Plate Count 22 0 C) (cfu/ml), στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 = , p=0.917). Επιπλέον, δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου σε διάφορες ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C, (p=0.339) (Σχήμα IV3.8). 166

168 Σχήμα IV3.8: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp.(cfu/l) σε διαφορετικές ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C, (Plate Count 22 0 C) (cfu/ml), στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p=0.339). 167

169 IV.3.ζ. Legionella και Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 37 0 C Γραφική Παράσταση IV3.7: Γραμμική συσχέτιση σχέση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) με την συγκέντρωση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C, (Plate Count 37 0 C) (cfu/ml), στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 =0.01, p=0.278). Σύμφωνα με την παραπάνω γραφική παράσταση όπως φαίνεται και από την γραμμή τάσης δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου με την συγκέντρωση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C, που μετρήθηκε στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (r 2 =0.01, p=0.278) (Γραφική Παράσταση IV3.7). 168

170 Σχήμα IV3.9: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε διαφορετικές ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C, (Plate Count 37 0 C) (cfu/ml), στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p=0.584). Δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε επτά ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C (p=0.584). Επίσης, η χαμηλότερη συγκέντρωση του βακτηρίου παρατηρήθηκε για συγκέντρωση cfu/ml της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C στα δείγματα των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (Σχήμα IV3.9). 169

171 IV.3.η. Legionella και Σημεία Δειγματοληψίας Σχήμα IV3.10: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε διάφορα σημεία δειγματοληψίας των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία (p=0.974). Δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης Legionella spp. (cfu/l), μεταξύ των σημείων δειγματοληψίας (Ισόγειο, 1 ος όροφος, 2 ος όροφος, 3 ος όροφος, 4 ος όροφος, πύργος ψύξης), από όπου ελήφθησαν τα δείγματα νερού στα κτίρια των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p=0.974) (Σχήμα IV3.10). 170

172 Σχήμα IV3.11: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε διάφορες κλινικές (p=0.181). Νοσοκομείων Οι μετρήσεις της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε διάφορες κλινικές των Νοσοκομείων έδειξαν πως δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου μεταξύ των διαφορετικών κλινικών (p=0.181). Παρατηρήθηκε πως η μεγαλύτερη συγκέντρωση του βακτηρίου υπήρξε στην καρδιολογική κλινική των Νοσοκομείων και οι μικρότερες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκαν στις κλινικές, Παιδιατρική, Ω.Ρ.Λ και Οφθαλμολογική (Σχήμα IV3.11). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης Legionella spp. (cfu/l), μεταξύ των κτιρίων διαφορετικής χωρητικότητας (10-50 κλίνες, κλίνες, κλίνες, >300 κλίνες), από όπου ελήφθησαν τα δείγματα νερού στα κτίρια των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων (p=0.825) (Σχήμα IV3.12). 171

173 Σχήμα IV3.12: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε σχέση με την χωρητικότητα των κτιρίων (νοσοκομείων και ξενοδοχείων) (p=0.825). IV.3.ι. Legionella και δείγματα ζεστού και κρύου νερού Οι μετρήσεις της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε δείγματα ζεστού νερού (28 0 C-60 0 C), που συλλέχθησαν από τα Νοσοκομεία έδειξαν πως δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου στο ζεστό νερό μεταξύ των διαφορετικών Νοσοκομείων (p=0.154). Παρατηρήθηκε πως η μεγαλύτερη συγκέντρωση του βακτηρίου υπήρξε στα δείγματα ζεστού νερού του Νοσοκομείου Β (Σχήμα IV3.13). 172

174 Σχήμα IV3.13: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε δείγματα ζεστού νερού (28 0 C-60 0 C), των εξεταζόμενων Νοσοκομείων (p=0.154). Σχετικά με το παρακάτω σχήμα, παρατηρήθηκε μια στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου στα δείγματα κρύου νερού (16 0 C-24 0 C), των εξεταζόμενων Νοσοκομείων. Πιο αναλυτικά, η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα κρύου νερού του Νοσοκομείου Α ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη με την συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα κρύου νερού του Νοσοκομείου Β (p<0.001 (**)) (Σχήμα IV3.14). 173

175 Σχήμα IV3.14: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε δείγματα κρύου νερού (16 0 C-24 0 C), των εξεταζόμενων Νοσοκομείων ( p<0.001 (**)). Επιπλέον, οι μετρήσεις της συγκέντρωσης Legionella spp. (cfu/l) σε δείγματα ζεστού νερού (30 0 C-58 0 C), που συλλέχτηκαν από τα ξενοδοχεία έδειξαν πως δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου στο ζεστό νερό μεταξύ των διαφορετικών ξενοδοχείων (p=0.347) (Σχήμα IV3.15). Το ίδιο παρατηρήθηκε και για τα δείγματα κρύου νερού (10 0 C-28 0 C), των εξεταζόμενων ξενοδοχείων της παρούσας διδακτορικής διατριβής (p=0.628), (Σχήμα IV3.16). Επιπλέον παρατηρήθηκε πως οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις του βακτηρίου υπήρξαν στα δείγματα ζεστού νερού των ξενοδοχείων 5 και 8 (Σχήμα IV3.15) και στα δείγματα κρύου νερού του ξενοδοχείου 2, (Σχήμα IV3.16). 174

176 Σχήμα IV3.15: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε δείγματα ζεστού νερού (30 0 C-58 0 C), των εξεταζόμενων ξενοδοχείων (p=0.347). 175

177 Σχήμα IV3.16: Η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. (cfu/l) σε δείγματα κρύου νερού (10 0 C-28 0 C) των εξεταζόμενων ξενοδοχείων (p=0.628). IV.4.1. Αποτελέσματα της αντίδρασης PCR για το γονίδιο mip Από την εφαρμογή της τεχνικής PCR, για το γονίδιο mip σε 116 δείγματα που αναλύθηκαν (91 δείγματα νερού από τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας, 25 δείγματα νερού από τα Ξενοδοχεία της περιοχής Πατρών), γενετικό υλικό της Legionella pneumophila ανιχνεύτηκε σε 30 δείγματα νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία (Εικόνα IV.4.1.α- IV.4.1.δ) και σε 9 δείγματα νερού που ελήφθησαν από τα Ξενοδοχεία. (Εικόνα IV.4.1.ε- IV.4.1.στ). Στις εικόνες που ακολουθούν φαίνονται κάποιες ενδεικτικές εικόνες του πηκτώματος αγαρόζης των δειγμάτων από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία που αναλύθηκαν με την μέθοδο της PCR. 176

178 C+ C- 558 bp Εικόνα IV.4.1.α: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Νοσοκομείων (αριστερά προς δεξιά: Χειρουργική/καταιονιστήρας, Καρδιολογική/καταιονιστήρας, Γυναικολογική/καταιονιστήρας, Νεφρολογική/ καταιονιστήρας, Νοσοκομείου Α και Παθολογική/καταιονιστήρας, Παθολογική/Βρύση, Καρδιολογική/ καταιονιστήρας, Καρδιολογική/βρύση, Νοσοκομείου Β) με το γονίδιο mip (558bp).(C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) C+ C- 558 bp Εικόνα IV.4.1.β: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Νοσοκομείων (αριστερά προς δεξιά: κενό, Βραχεία Νοσηλεία/καταιονιστήρας, Νευροχειρουργική/καταιονιστήρας, Νοσοκομείου Α και Ορθοπεδική/καταιονιστήρας, Ορθοπεδική/Βρύση, Μονάδα Εμφράγματος/καταιονιστήρας, Χειρουργική/καταιονιστήρας, Χειρουργική/βρύση, Θάλαμος Νοσηλείας 5&6/ καταιονιστήρας, Εφημερείο Ιατρών/ καταιονιστήρας Νοσοκομείου Γ και Κλινική Δωμ.3/καταιονιστήρας, Κλινική Δωμ.17/ καταιονιστήρας Νοσοκομείου Δ) με το γονίδιο mip (558bp). (C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) C+ C- 558 bp Εικόνα IV.4.1.γ: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Νοσοκομείων (αριστερά προς δεξιά: κενό, Πύργος Ψύξης, Χειρουργική/ καταιονιστήρας, Ορθοπεδική/καταιονιστήρας, Νοσοκομείου Ε και Παθολογική/ καταιονιστήρας, Παθολογική/ βρύση, Χειρουργική/ βρύση, Νοσοκομείου ΣΤ) με το γονίδιο mip (558bp). (C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) 177

179 558 bp C- C+ Εικόνα IV.4.1.δ: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Νοσοκομείων (αριστερά προς δεξιά: Γυναικολογική/καταιονιστήρας, Παθολογική 2/καταιονιστήρας, Παθολογική 2/βρύση, Παθολογική 1/ καταιονιστήρας, Παθολογική 1/βρύση, Νοσοκομείου ΣΤ, Χειρουργική 2/ βρύση, Χειρουργική 2/καταιονιστήρας, Ορθοπεδική 2/καταιονιστήρας Ορθοπεδική 1/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Β, Παθολογική 2/καταιονιστήρας, Παθολογική 2/βρύση, Χειρουργική 2/ καταιονιστήρας Νοσοκομείου ΣΤ, Πύργος Ψύξης Νοσοκομείου Ε) με το γονίδιο mip (558bp). (C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) C+ C- 558 bp Εικόνα IV.4.1.ε: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Ξενοδοχείων (αριστερά προς δεξιά: καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείου 8, καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείου 9 και Πύργος Ψύξης/ανακυκλοφορία ξενοδοχείου 4) με το γονίδιο mip (558bp). (C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) C- C+ 558 bp Εικόνα IV.4.1.στ: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Ξενοδοχείων (αριστερά προς δεξιά: Πύργος Ψύξης/είσοδος, Πύργος Ψύξης/έξοδος, Δωμ.221α/καταιονιστήρας, Δωμ.221β/ καταιονιστήρας, ξενοδοχείου 2, καταιονιστήρας και Πύργος Ψύξης/είσοδος ξενοδοχείου 3, Πύργος Ψύξης/ανακυκλοφορία ξενοδοχείου 4, βρύση, δωματίου ξενοδοχείου 5, Πύργος Ψύξης/έξοδος, ξενοδοχείου 2) με το γονίδιο mip (558bp). (C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) 178

180 IV.4.2. Αποτελέσματα της αντίδρασης PCR για το γονίδιο flaa Σχετικά με το γονίδιο flaa, το ειδικό προϊόν, μεγέθους 245bp ανιχνεύτηκε σε 30 δείγματα Νοσοκομείων (Εικόνα IV.4.2.α, IV.4.2.β) και σε 9 δείγματα Ξενοδοχείων (Εικόνα IV.4.2.γ, IV.4.2.δ). Παρακάτω φαίνονται κάποιες ενδεικτικές εικόνες του πηκτώματος αγαρόζης των δειγμάτων από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία που αναλύθηκαν με την μέθοδο της PCR για το γονίδιο flaa. C- C+ 245 bp Εικόνα IV.4.2.α: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Νοσοκομείων, (αριστερά προς δεξιά: Χειρουργική/καταιονιστήρας, Καρδιολογική/καταιονιστήρας, Γυναικολογική/καταιονιστήρας, Νοσοκομείου Α και Παθολογική/καταιονιστήρας, Παθολογική/Βρύση, Καρδιολογική/καταιονιστήρας, Καρδιολογική/βρύση, Νοσοκομείου Β) με το γονίδιο flaa (245 bp). (C(+): θετικό στέλεχος L.pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) C+ C- 245 bp Εικόνα IV.4.2.β: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Νοσοκομείων (αριστερά προς δεξιά: κενό, Πύργος Ψύξης/είσοδος, Χειρουργική/ καταιονιστήρας, Ορθοπεδική/καταιονιστήρας, Νοσοκομείου Ε και Παθολογική/ καταιονιστήρας, Παθολογική/ βρύση, Χειρουργική/ βρύση, Νοσοκομείου ΣΤ, Θάλαμος Νοσηλείας 5&6/ καταιονιστήρας, Νοσοκομείου Γ και Κλινική Δωμ.3/ καταιονιστήρας, Κλινική Δωμ.17/ καταιονιστήρας Νοσοκομείου Δ) με το γονίδιο flaa (245 bp). (C(+): θετικό στέλεχος L.pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) 179

181 C- C+ 245 bp Εικόνα IV.4.2.γ: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Ξενοδοχείων (αριστερά προς δεξιά: κενό, Πύργος Ψύξης/είσοδος, Πύργος Ψύξης/έξοδος, Δωμ.221α/καταιονιστήρας, ξενοδοχείου 2, Πύργος Ψύξης/είσοδος ξενοδοχείου 3, Πύργος Ψύξης/ανακυκλοφορία ξενοδοχείου 4, καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείου 5,) με το γονίδιο flaa (245 bp). (C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) C+ C- 245 bp Εικόνα IV.4.2.δ: Ενδεικτική εικόνα της αντίδρασης PCR για τα δείγματα των Ξενοδοχείων (αριστερά προς δεξιά: καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείου 8, καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείου 9 και Πύργος Ψύξης/ανακυκλοφορία ξενοδοχείου 4, Πύργος Ψύξης/έξοδος, ξενοδοχείου 2) με το γονίδιο flaa (245 bp). (C(+): θετικό στέλεχος L. pneumophila NCTC 12821, C(-): Αρνητικό κοντρόλ, Ladder 100 bp) IV.5. Αποτελέσματα της Αλληλούχισης και Φυλογενετικής ανάλυσης (Phylogenetic tree analysis) Τα θετικά Legionella spp. προϊόντα της PCR, επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω, με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας στην Μονάδα Αλληλουχίας του Τμήματος Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας (Sequence unit, Department of Immunology and Histocompatibility, School of Medicine, Univesrity of Thessaly, Larissa). Στο Σχήμα IV.5.1 φαίνεται το φυλογενετικό δέντρο που κατασκευάστηκε με βάση το γονίδιο mip, ενώ στο Σχήμα IV.5.2 φαίνεται το φυλογενετικό δέντρο που κατασκευάστηκε με βάση το γονίδιο flaa. 180

182 Σχήμα IV.5.1. Φυλογενετικό δέντρο αλληλούχισης του γονιδίου mip, από δεκαεπτά (17) ελληνικά στελέχη των νοσοκομείων και ξενοδοχείων ( Κλινική Δωμ.3/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Δ, Χειρουργική/καταιονιστήρας Παθολογική/καταιονιστήρας Νοσοκομείου ΣΤ, Παθολογική/βρύση, Νευροχειρουργική/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Α, Χειρουργική/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Ε, καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείο 5, Ορθοπεδική/καταιονιστήρας, Χειρουργική/βρύση, Χειρουργική/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Β, καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείο 9, Κλινική Δωμ.17/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Δ, Θάλαμος Νοσηλείας/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Γ, Πύργος Ψύξης /ανακυκλοφορία ξενοδοζχείου 4, Πύργος Ψύξης/είσοδος ξενοδοχείου 2, καταιονιστήρας&βρύση δωματίου ξενοδοχείου 5), της παρούσας μελέτης και είκοσι τρία (23) στελέχη αναφοράς, που απεικονίζει την σχέση μεταξύ των περιβαλλοντικών στελεχών L.pneumophila που ανιχνεύθηκαν στην παρούσα 181

183 μελέτη σε σύγκριση με τα στελέχη που ανακτώνται από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (βάση δεδομένων GenBank DataBase). Η φυλογενετική ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από την γονοτυπική αλληλούχιση, βασιζόμενη στο mip γονίδιο για 17 Ελληνικά στελέχη (της παρούσας μελέτης) και για 23 στελέχη αναφοράς που ανακτήθηκαν από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank, DataBase), φαίνονται στο παραπάνω σχήμα (Σχήμα IV.5.1). Οι αριθμοί κάτω από τα κλαδιά του φυλογενετικού δέντρου στο σχήμα IV.5.1 είναι ποσοστιαίες μονάδες εκκίνησης, που υπολογίζονται μετά από bootstrap επαναλήψεις. Οι οριζόντιες γραμμές στο φυλογενετικό δέντρο, είναι ανάλογες με τις διαφορές των νουκλεοτιδίων, ενώ οι κάθετες γραμμές υπάρχουν χάριν της κατανόησης της αλληλούχισης. Η συντομογραφία GR αναφέρεται σε ελληνικά στελέχη και ακολουθείται από τον αριθμό καταχώρισης του δείγματος που αναλύθηκε στην παρούσα διδακτορική διατριβή. Ως εξωτερικό στέλεχος αναφοράς έχει χρησιμοποιηθεί το στέλεχος Legionella adelaidensis. Επίσης στο φυλογενετικό δέντρο περιλαμβάνονται οι αριθμοί των στελεχών αναφοράς που καταχωρήθηκαν από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank DataBase), μαζί με το αντίστοιχο όνομα του στελέχους. Όπως ήταν αναμενόμενο το Αυστραλιανό στέλεχος, U91606, βρίσκεται σε ξεχωριστή ομάδα που αποτελείται από ένα είδος, (clade), σε σχέση με τα άλλα στελέχη Legionella. Τα είδη Legionella bozemanii, anisa, parisiensis, gormanii, lonbeachae, jordanis και israelensis, αποτελούν μια ξεχωριστή ομάδα, η οποία διαφοροποιείται από τα ελληνικά στελέχη και τα από τα στελέχη αναφοράς της L.pneumophila. Τα Ελληνικά στελέχη που απομονώθηκαν στης παρούσα μελέτη επέδειξαν υψηλή ομολογία (96%) με στελέχη L.pneumophila που έχουν χαρακτηριστεί γονοτυπικά με στελέχη της Ιταλίας. Επιπλέον, τα στελέχη με τους αριθμούς αναφοράς CP και CR προέρχονται από την Ισπανία και τη Γαλλία, αντίστοιχα (Σχήμα IV.5.1). 182

184 Σχήμα IV.5.2. Φυλογενετικό δέντρο αλληλούχισης του γονιδίου flaa, από εννέα (9) ελληνικά στελέχη των νοσοκομείων και ξενοδοχείων (Θάλαμος Νοσηλείας/καταιονιστήρας, Εφημερείο Ιατρών/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Γ, Παθολογική/καταιονιστήρας Νοσοκομείου ΣΤ, Ορθοπεδική/καταιονιστήρας, Παθολογική/καταιονιστήρας Νοσοκομείου Β, καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείου 4, καταιονιστήρας δωματίου ξενοδοχείου 8, Χειρουργική/καταιονιστήρας, Πύργος Ψύξης Νοσοκομείου Ε) της παρούσας μελέτης και έντεκα (11) στελέχη αναφοράς που απεικονίζει την σχέση μεταξύ των περιβαλλοντικών στελεχών L.pneumophila που ανιχνεύθηκαν στην παρούσα μελέτη, σε σύγκριση με τα στελέχη που ανακτώνται από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (βάση δεδομένων GenBank DataBase).. 183

185 Το σχήμα IV.5.2 δείχνει την φυλογενετική ανάλυση για το γονίδιο flaa, για 9 Ελληνικά στελέχη της παρούσας μελέτης και για 11 στελέχη αναφοράς που ανακτήθηκαν από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank, DataBase). Ανάλογη ομοιότητα διαπιστώθηκε με τα Ιταλικά στελέχη. Η συντομογραφία GR στο φυλογενετικό δέντρο στο παραπάνω σχήμα, αναφέρεται σε ελληνικά στελέχη και ακολουθείται από τον αριθμό καταχώρισης του δείγματος που αναλύθηκε στην παρούσα έρευνα. Οι αριθμοί κάτω από τα κλαδιά του φυλογενετικού δέντρου στο σχήμα IV.5.2 είναι ποσοστιαίες μονάδες εκκίνησης, που υπολογίζονται μετά από bootstrap επαναλήψεις. Οι οριζόντιες γραμμές στο φυλογενετικό δέντρο, είναι ανάλογες με τις διαφορές των νουκλεοτιδίων, ενώ οι κάθετες γραμμές υπάρχουν χάριν της κατανόησης της αλληλούχισης. Επιπλέον στο φυλογενετικό δέντρο, συμπεριλαμβάνονται οι αριθμοί των στελεχών αναφοράς που καταχωρήθηκαν από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank DataBase), μαζί με το αντίστοιχο όνομα του στελέχους. Ενδεικτικά αναφέρονται τα παρακάτω στελέχη που φαίνονται στο φυλογενετικό δέντρο (AJ isolate 1, AJ environmental control, AJ isolate Trento 49, AJ isolate Trento 36, AJ isolate Pavia 37, AJ isolate Trento 36, AJ isolate Pordenone 1, AJ Chicago isolate)( Σχήμα IV.5.2). IV.6. Καταγραφή κρουσμάτων πνευμονίας Στους πίνακες που ακολουθούν αναφέρονται αναλυτικά ο αριθμός των κρουσμάτων πνευμονίας που νοσηλεύονταν εβδομαδιαίως, για το χρονικό διάστημα ενός χρόνου (από 01/09/2009 έως 1/09/2010) για το κάθε νοσοκομείο (Πίνακας IV.6.1). Η καταγραφή των κρουσμάτων υπήρξε ελλειπής για το Νοσοκομείο Α, λόγω δυσκολίας πρόσβασης στα αρχεία των ασθενών του νοσοκομείου, επιπλέον δεν υπήρξε καμία καταγραφή για τα Νοσοκομεία Ζ και Η, διότι δεν ήταν εφικτή η πρόσβαση στα αρχεία των ασθενών των νοσοκομείων. 184

186 Πίνακας IV.6.1. Καταγραφή κρουσμάτων πνευμονίας και κρουσμάτων για την Νόσο των Λεγεωνάριων για το χρονικό διάστημα 1/09/2009-1/09/2010 στα Νοσοκομεία. Εβδομάδες ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΡΟΥΣΜΑΤΩΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΩΝ Α Β Γ Δ Ε ΣΤ Ζ Η 36 η η η η η η η η η (+) L.pneumophila η η η η 1 (+) L.pneumophila η η η η η η η η η η η η η η

187 Πίνακας IV.6.1. Καταγραφή κρουσμάτων πνευμονίας και κρουσμάτων για την Νόσο των Λεγεωνάριων για το χρονικό διάστημα 1/09/2009-1/09/2010 στα Νοσοκομεία. Εβδομάδες ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΡΟΥΣΜΑΤΩΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΩΝ Α Β Γ Δ Ε ΣΤ Ζ Η 10 η η η η η η η η η η η η η η η η η η η η η η η η η η ΣΥΝΟΛΟ

188 Σχήμα IV.6.1: Κρούσματα πνευμονίας που νοσηλεύονταν σε Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας (+ Θετικό κρούσμα για την Νόσο των Λεγεωνάριων). Σύμφωνα με το παραπάνω σχήμα στο Νοσοκομείο Α καταγράφηκαν 3 κρούσματα πνευμονίας, εκ των οποίων το ένα περιστατικό ήταν θετικό για την Νόσο των Λεγεωνάριων (Σχήμα IV.6.1). Κατά την διάρκεια καταγραφής των κρουσμάτων αξίζει να σημειωθεί πως υπήρξε ελλειπής ενημέρωση από τους υπεύθυνους γιατρούς του Νοσοκομείου Α. Στο Νοσοκομείο Β καταγράφηκαν 29 κρούσματα ενώ στο Νοσοκομείο Γ καταγράφηκαν 7 κρούσματα πνευμονίας. Στο Νοσοκομείο Δ υπήρξαν 102 καταγραμμένα κρούσματα πνευμονίας με ένα θετικό κρούσμα για την Νόσο των Λεγεωνάριων και στο Νοσοκομείο Ε ο αριθμός των περιστατικών ήταν ο υψηλότερος, καταγράφηκαν 124 περιστατικά πνευμονίας. Τέλος στο Νοσοκομείο ΣΤ καταγράφηκαν 60 κρούσματα πνευμονίας. 187

189 V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 188

190 Τα τελευταία χρόνια, η Νόσος των Λεγεωνάριων μελετάται από ερευνητές με μεγαλύτερο ενδιαφέρον λόγω της αύξησης των κρουσμάτων της Νόσου παγκοσμίως. Μέχρι σήμερα, έχουν χαρακτηριστεί τουλάχιστον 50 είδη Legionella ενώ περισσότερα από είκοσι είδη σχετίζονται με ασθένειες στον άνθρωπο (Fields et al 2002, Bartram et al 2007, Declerck et al 2007, Diederen 2008). Το βακτήριο L.pneumophila είναι το πιο κοινό είδος των παθογόνων, υπεύθυνο για την πλειονότητα της Νόσου των Λεγεωνάριων, σε όλο τον κόσμο (Declerck et al 2007). Υπάρχει ως μέρος της φυσικής μικροβιακής χλωρίδας πολλών υδάτινων οικοσυστημάτων, (Riffard et al 2001) και οι πιο κοινές πηγές μόλυνσης είναι τα τεχνητά υδάτινα συστήματα (Bartram et al 2007). Δεν έχει αναφερθεί μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο, επομένως η μόνη πηγή μόλυνσης είναι το περιβάλλον. Τα βακτήρια Legionella εμφανίζουν την ικανότητα να επιβιώνουν σε ένα εξαιρετικά ευρύ φάσμα θερμοκρασιών (Yee 1982, Mathys et al 2008). Κατά συνέπεια, όπως έχει αναφερθεί στα περισσότερα νοσοκομειακά περιστατικά, η ανάπτυξη του βακτηρίου φαίνεται να ευνοείται από υψηλές θερμοκρασίες, σημειώνοντας ότι η μέγιστη ανάπτυξη του βακτηρίου έχει αναφερθεί μεταξύ 30 0 C και 46 0 C (Mathys et al 2008). Επιπλέον έχει τεκμηριωθεί πως κάποια υδατογενή βακτήρια, όπως η Pseudomonas παρέχουν θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη των βακτηρίων Legionella (Kramer&Ford 1994). Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι οι κύριες πηγές μόλυνσης για την Νόσο, είναι τα δίκτυα πόσιμου νερού από μεγάλα κτίρια όπως νοσοκομεία, ξενοδοχεία και μεγάλα κτιριακά συγκροτήματα (Moritz et al 2010, Luck et al 1993, Codony et al 2002, Yu &Stout, 2000). Η πιο κοινή πηγή ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων σε παγκόσμιο επίπεδο, είναι το ζεστό νερό από καταιονιστήρες και βρύσες (Marrie et al 1992, Mathys et al 1999). Πολλές έρευνες έχουν γίνει για την επιδημιολογία της Nόσου των Λεγεωνάριων, από το 1976, που το βακτήριο εντοπίστηκε για πρώτη φορά. Η αυξημένη επιδημιολογική επιτήρηση, η διεθνής βάση δεδομένων καθώς και βελτιωμένες μέθοδοι κλινικής διάγνωσης της νόσου, οδήγησε σε αυξημένη καταγραφή των διαγνωσμένων περιστατικών της νόσου παγκοσμίως και ιδιαίτερα στον Ευρωπαικό χώρο. Περιβαλλοντικές μελέτες συνεχίζουν να εντοπίζουν νέες πηγές μόλυνσης, γεγονός που οδηγεί σε τακτικές αναθεωρήσεις των κατευθυντήριων γραμμών και των κανονισμών, για τον έλεγχο μετάδοσης της νόσου. Αξίζει να σημειωθεί πως μεταξύ 1995 και 2005 έχουν καταγραφεί πάνω από κρούσματα της Νόσου των Λεγεωνάριων παγκοσμίως ενώ περισσότερα από 600 κρούσματα ετησίως έχουν αναφερθεί στην Ευρωπαϊκή Ομάδα Εργασίας για την Νόσο των Λεγεωνάριων (European Working Group for Legionella Infections, EWGLI). Συνολικά 818 περιπτώσεις της Νόσου για το 2009, αναφέρθηκαν από το Ευρωπαϊκό 189

191 Δίκτυο Επιτήρησης για την Νόσο των Λεγεωνάριων, που σχετίζονται με Ταξίδια (Joseph et al 2010). Κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο, καταγράφονται ομαδικά και σποραδικά κρούσματα, τα οποία συνδέονται με συστήματα νερού μεγάλων ξενοδοχειακών συγκροτημάτων που έχουν μολυνθεί με το βακτήριο. Σε ότι αφορά την Ελλάδα μερικές μελέτες έχουν αναφέρει αποικισμό από βακτήρια Legionella στα υδάτινα συστήματα ξενοδοχείων και νοσοκομείων, αλλά καμιά μελέτη δεν έχει αναφέρει συγκεκριμένα στην περιοχή της Πάτρας και της Νοτιοδυτικής Ελλάδας. Στην Ελλάδα περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων έχουν αναφερθεί από παλιά και συγκεκριμένα από το 1982 (Constantopoulos et al 1984). Τα κρούσματα της Νόσου συνεχώς αυξάνονται, κάτι που θα έχει σαν αποτέλεσμα στο μέλλον να τεθεί ζήτημα αναζήτησης περισσότερων πόρων δημόσιας υγείας για τη διαχείριση της ασθένειας. Στον Ελληνικό χώρο, η διάγνωση της Νόσου των Λεγεωνάριων στα νοσοκομεία, είναι ελλιπής καθώς είτε δεν χρησιμοποιούνται τα διαγνωστικά τεστ, είτε δεν καταγράφονται τα περιστατικά της νόσου, ενώ στην ίδια κατάσταση βρίσκονται και πάρα πολλές άλλες χώρες (Sabria&Yu, 2002). Αξίζει να σημειωθεί πως στην Ελλάδα δεν υπάρχει σχετική νομοθεσία για την Νόσο των Λεγεωνάριων, ενώ η πρόληψη της Νόσου καλύπτεται από μια εγκύκλιο, Υ2/Γ.Π./οικ.79305/ , που εκδόθηκε από το Υπουργείο Υγείας και Πρόνοιας. Στην παρούσα δικτατορική διατριβή πραγματοποιήθηκε μια επιδημιολογική μελέτη σε οκτώ (8) νοσοκομεία στη Νοτιοδυτική Ελλάδα και σε εννέα (9) ξενοδοχεία που βρίσκονται στην περιοχή της Πάτρας για την ανίχνευση του βακτηρίου L.pneumophila. Μελετήθηκε η συχνότητα του αποικισμού του βακτηρίου στα υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων, ενώ συγχρόνως πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της συχνότητας εμφάνισης Legionella spp. και των ορολογικών ομάδων που εμπλέκονται. Επιπλέον αξιολογήθηκε και η σχέση μεταξύ της επιμόλυνσης του βακτηρίου σε ζεστό και κρύο νερό και των μικροβιολογικών και φυσικοχημικών παραμέτρων του νερού (Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα στους 22 0 C, και στους 37 0 C, Pseudomonas aeruginosa, θερμοκρασία, ph, αγωγιμότητα, υπολειπόμενο χλώριο), οι οποίες είναι πιθανόν να σχετίζονται με την παρουσία και / ή την ανάπτυξη των βακτηρίων Legionella. Επιπλέον στόχος της μελέτης ήταν να ανιχνευθούν τα διάφορα είδη Legionella που κυκλοφορούν στην Νοτιοδυτική Ελλάδα, ώστε να μελετηθεί η περιβαλλοντική επιδημιολογία της Νόσου και να συγκριθεί με αυτή των άλλων γειτονικών χωρών (π.χ. Ιταλία). Η παρούσα διδακτορική διατριβή, έδειξε έναν ευρέως διαδεδομένο περιβαλλοντικό αποικισμό του βακτηρίου στα υδάτινα συστήματα νερού μεγάλων κτιρίων, όπως στα νοσοκομεία και στα ξενοδοχεία που μελετήθηκαν, ιδίως σε δίκτυα διανομής ζεστού νερού. Το βακτήριο L. pneumophila βρέθηκε στο 33% και 36% των δειγμάτων νερού που συλλέχθηκαν 190

192 από τα νοσοκομεία και τα ξενοδοχεία αντίστοιχα. Η L. pneumophila ήταν το πιο συχνό είδος (σε ποσοστό 95%) που απομονώθηκε, από το σύνολο των 39 θετικών για Legionella περιβαλλοντικών δειγμάτων. Η μοριακή ανάλυση του γονιδιώματος DNA αυτών των στελεχών, επιβεβαίωσε την ομοιότητα των απομονωμένων περιβαλλοντικών στελεχών, τα οποία χαρακτηρίζονται ως L.pneumophila υποομάδα Philadelphia. Από τα αποτελέσματα της γονοτυπικής αλληλούχισης τα περισσότερα θετικά δείγματα της παρούσας μελέτης ήταν L.pneumophila υποομάδα Philadelphia και L.pneumophila υποομάδα 1. Αξίζει να αναφερθεί πως σε πρόσφατη έρευνα, η L.pneumophila υποομάδα 1 βρέθηκε σε ποσοστό 18,8% του θετικών δειγμάτων (Tesauro et al 2010). Επιπλέον σύμφωνα με την φυλογενετική ανάλυση, τα απομονωμένα Ελληνικά στελέχη επέδειξαν υψηλή ομολογία των στελεχών L.pneumophila, και συσχετίζονταν με στελέχη Legionella που έχουν απομονωθεί σε άλλη μελέτη στην Ιταλία (Leoni et al 2005, Chiarini et al 2008). Η ομολογία αυτών των στελεχών μπορεί να εξηγηθεί και από το γεγονός πως η Πάτρα και εκτενέστερα η Νοτιοδυτική Ελλάδα, συνδέεται άμεσα με την γειτονική Ιταλία λόγω του λιμανιού και της ανταλλαγής μεγάλου αριθμού τουριστών μέσα σε λίγες ώρες. Έχουν διεξαχθεί μελέτες για την ανίχνευση του βακτηρίου Legionella σε νοσοκομεία πολλών χωρών με θετικά ποσοστά παρουσίας του βακτηρίου, που κυμαίνονται από 12% έως 85% (Liu et al 1993, Sabria et al 2004) και αξίζει να σημειωθεί πως η παρούσα μελέτη (με ποσοστό 33% θετικών δειγμάτων) είναι η πρώτη μελέτη, μικρής κλίμακας, που πραγματοποιήθηκε στα νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας. Πρόσφατη έρευνα, ( ), που πραγματοποιήθηκε σε υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων έδειξε αποικισμό του βακτηρίου σε ποσοστό 37%, παραπλήσιο με το ποσοστό της δικής μας μελέτης (Mavridou et al 2008, Tesauro et al 2010). Μελέτες, που έχουν γίνει σε άλλες χώρες, έδειξαν συχνό αποικισμό του βακτηρίου στα υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων (με ποσοστό των θετικών δειγμάτων να κυμαίνεται από 30% έως 87%) (Vickers et al 1987, Alary&Joly, 1992, Sabria et al 2001, Legnani et al 2002, Haluk Erdogan 2007) και των ξενοδοχείων (με ποσοστό των θετικών δειγμάτων να κυμαίνεται από 27% έως 43% ), (Leoni et al 2005). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης κυμαίνονται σε αυτά τα επίπεδα. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν μελέτες σε ξενοδοχεία, στην γειτονική μας χώρα, την Ιταλία, σύμφωνα με τις οποίες η L. pneumophila ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 62,2% (Borella et al 2005), σε ποσοστό 36,5% (Napoli et al 2010) και σε ποσοστό 60,9% (Leoni et al 2005) των δειγμάτων που εξετάστηκαν. Επιπλέον, δεδομένα από έρευνες αποδεικνύουν ότι τα θετικά δείγματα στα Ιταλικά νοσοκομεία μπορούν να φθάσουν και το ποσοστό του 100% (Leoni et al 2005) ενώ στην Ταϊβάν φθάνει το 81,5% (Yu et al 2008), στην Ισπανία το ποσοστό φθάνει το 15,9%, στην Γερμανία 191

193 είναι υψηλότερο (70%) (Wellinghausen et al 2001, Rivera et al 2007) και στην Ελλάδα φθάνει το 61,5% (Mavridou et al 2008). Εξετάζοντας μελέτες στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής (ΗΠΑ), που αφορούσαν νοσοκομεία, βρέθηκε αποικισμός του βακτηρίου σε 14 από τα 20 εξεταζόμενα νοσοκομεία (ποσοστό 70% θετικών νοσοκομείων) (Stout et al. 2007). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, βρέθηκε αποικισμός του βακτηρίου, σε 6 από τα 8 νοσοκομεία που συμμετείχαν στην έρευνα (ποσοστό 75% θετικών νοσοκομείων). Στην παρούσα εργασία, σχετικά με τα αποτελέσματα των νοσοκομείων, το 19% των δειγμάτων είχε συγκέντρωση του βακτηρίου >1000 cfu/l, το 7% είχε cfu/l και το 8% των δειγμάτων κυμάνθηκε μεταξύ cfu/l, ενώ σε έρευνα στην Νότια Ιταλία η συγκέντρωση του βακτηρίου >1000 cfu/l βρέθηκε σε υψηλότερο ποσοστό, (54,1%), ενώ ποσοστό 32,6% των δειγμάτων είχαν συγκέντρωση του βακτηρίου, cfu/l (Napoli et al 2010). Σχετικά με τα αποτελέσματα των ξενοδοχείων η συγκέντρωση του βακτηρίου L.pneumophila στα συστήματα ύδρευσης βρέθηκε >1000 cfu/l σε ποσοστό 4%, σε ποσοστό 12% των δειγμάτων είχε cfu/l και το 20% είχε συγκέντρωση cfu/l. Στην ίδια έρευνα, στην γειτονική Ιταλία, στα συστήματα ύδρευσης των ξενοδοχείων βρέθηκε το 44,6% των δειγμάτων να έχει συγκέντρωση >1000 cfu/l και το 30,6% να έχει cfu/l (Napoli et al 2010). Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε πως υψηλότερο ποσοστό των δειγμάτων των νοσοσκομείων σε σχέση με τα ξενοδοχεία είχε συγκέντρωση του βακτηρίου >1000 cfu/l, κάτι που υποδεικνύει κινδύνους για έξαρση κρουσμάτων στα νοσοκομεία. Στα υδάτινα συστήματα των ξενοδοχείων υπήρχε αποικισμός του βακτηρίου σε υψηλότερο ποσοστό σε χαμηλή συγκέντρωση ( cfu/l), γεγονός όμως που δεν θα πρέπει να αγνοείται, διότι αυτό δεν σημαίνει πως δεν υπάρχει κύνδυνος για ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό του σε υψηλές συγκεντρώσεις. Όπως ήδη έχει αναφερθεί, ο αποικισμός του βακτηρίου με υψηλή συγκέντρωση, >1000 cfu/l, εντοπίζεται περισσότερο στα δείγματα νερού που εξετάστηκαν στα νοσοκομεία και σε λιγότερο ποσοστό στα ξενοδοχεία της παρούσας μελέτης. Ωστόσο, είναι σημαντικό να υπογραμμιστεί ότι η απλή μέτρηση της συγκέντρωσης του βακτηρίου δεν δίνει την πραγματική εκτίμηση του κινδύνου μόλυνσης, διότι στην πραγματικότητα, η συγκέντρωση της Legionella στα υδάτινα συστήματα του νοσοκομείου δεν είναι απαραίτητα σταθερή μέσα στο χρόνο (Trerotoli et al. 2003). Πιο συγκεκριμένα για τα νοσοκομεία, μελέτες έχουν εντοπίσει τα υδάτινα συστήματα διανομής των νοσοκομείων και τους υδρόψυκτους πύργους ψύξης να αποτελούν μεγάλους ταμιευτήρες της Legionella και κοινές πηγές μετάδοσης του βακτηρίου (Yu, 1998). Σε πολλές 192

194 Ευρωπαϊκές χώρες, όπως Ιταλία και Σλοβενία, έχουν αναφερθεί πολλές περιπτώσεις της Νόσου των Λεγεωνάριων στα νοσοκομεία (Tercelj-Zorman et al 2004, Triassi et al 2006, Krøjgaard et al 2011). Στην Ελλάδα όλο και πιο συχνά εντοπίζεται αποικισμός του βακτηρίου στα συστήματα ύδρευσης των νοσοκομείων, ενώ αξίζει να σημειωθεί πως στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα έδειξαν πως από τους εξεταζόμενους πύργους ψύξης, το βακτήριο εντοπίστηκε σε όλους, καθιστώντας έτσι τους πύργους ψύξης ως πιθανές εστίες διασποράς της Legionella στα ελληνικά νοσοκομεία. Το βακτήριο Legionella spp. έχει απομονωθεί από τα υδάτινα συστήματα διανομής των ξενοδοχείων σε όλο τον κόσμο, ενώ στοιχεία δείχνουν πως ο αποικισμός του βακτηρίου είναι σταθερός σε κάποια ξενοδοχεία. Τα ξενοδοχεία που συμμετείχαν στην παρούσα μελέτη και βρίσκονται στην περιοχή της Πάτρας βρέθηκαν να είναι θετικά στη παρουσία Λεγιονέλλας σε ποσοστό 55%. Σχετική μελέτη με την ανίχνευση του βακτηρίου σε ξενοδοχεία σε 5 Ευρωπαϊκές χώρες, Αυστρία, Ισπανία, Γερμανία, Ηνωμένο Βασίλειο, και τη γειτονική Ιταλία, έδειξε αποικισμό του βακτηρίου σε ποσοστό, κατά μέσο όρο 55%, που κυμαίνονταν από 33%, στο Ηνωμένο Βασίλειο, έως 66% στην Ισπανία (Starlinger&Tiefenbrunner, 1996). Οι λόγοι της διακύμανσης στα ποσοστά απομόνωσης του βακτηρίου, ανάμεσα σε μελέτες μπορεί να σχετίζονται και με το διαφορετικό αριθμητικό μέγεθος των δειγμάτων που εξετάζονται και στα διαφορετικά πρωτόκολλα απολύμανσης που εφαρμόζονται σε κάθε χώρα. Επιπλέον μπορεί να σχετίζονται και με διαφορές στη μέθοδο απομόνωσης και στα όρια ανίχνευσης, ή ενδεχομένως ακόμη και να εμφανίζονται διακυμάνσεις λόγω των διαφορετικών εποχιακών κλιματολογικών συνθηκών που επικρατούν κατά την διεξαγωγή της μελέτης. Εκείνο που πρέπει να τονιστεί, είναι πως η παρούσα μελέτη, δεν περιελάμβανε ολόκληρη την Ελλάδα, αλλά κομμάτι της, σε αντίθεση με άλλες μελέτες που αφορούσαν ολόκληρες χώρες, κάτι που επίσης μπορεί να επηρεάζει τα αποτελέσματα. Όπως είναι ήδη γνωστό, η επεξεργασία του νερού με βιοκτόνες ουσίες (χλώριο, βρώμιο, κ.τ.λ.) αλλά και η διατήρηση του, μπορεί να εξασφαλίσει αφιλόξενο περιβάλλον για την ανάπτυξη μικροβίων, συμπεριλαμβανομένου και του βακτηρίου Legionella. Οι μετρήσεις του υπολειπόμενου χλωρίου στα υδάτινα συστήματα διανομής των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων έδειξαν απουσία του υπολειπόμενου χλωρίου σχεδόν σε όλα τα υδάτινα συστήματα. Τα δείγματα νερού που βρίσκονταν εντός επιτρεπτών ορίων (0,2 mg/l-0,5 mg/l) όπως προβλέπεται από την Νομοθεσία, έφθαναν μόνο σε ποσοστό 15,5%. Γεγονός, που αποδεικνύει την έλλειψη απολυμαντικής ουσίας στα υδάτινα σύστημα διανομής των κτιρίων, κάτι που ενισχύει την ανάπτυξη μικροοργανισμών επικίνδυνων για την δημόσια υγεία. 193

195 Σε όλους τους πύργους ψύξης που εξετάστηκαν, παρατηρήθηκε πως δεν πραγματοποιούταν συστηματική συντήρηση των μηχανικών τμημάτων του συστήματος, ενώ παράλληλα η χρήση απολυμαντικών και αντιδιαβρωτικών ήταν ελλιπής, υπήρχε σχηματισμός βιομεμβράνης, ενώ ο έλεγχος της μικροβιολογικής και χημικής ποιότητας του νερού στο εσωτερικό του πύργου ψύξης ήταν ανύπαρκτος. Επιπλέον, σημαντική ήταν και η έλλειψη υπολειπόμενου χλωρίου και στα δείγματα νερού που πάρθηκαν από τους υδρόψυκτους πύργους ψύξης (1 δείγμα από τα συνολικά 11 βρισκόταν εντός επιτρεπτών ορίων). Η Legionella spp. είναι αρκετά ανθεκτική στην απολύμανση με χλώριο, συγκριτικά με τα άλλα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένου και του βακτηρίου Escherichia coli (Cucuta et al 1983). Η ανθεκτικότητα της Legionella στο χλώριο, ενισχύεται ακόμα πιο πολύ όταν το βακτήριο βρίσκεται στο εσωτερικό των αμοιβάδων ή από την ενσωμάτωση του βακτηρίου σε βιομεμβράνες, (Kuchta et al 1993), με αποτέλεσμα να παρατηρείται η ανίχνευση του βακτηρίου ακόμα και σε χλωριωμένο νερό, που πληροί τις προϋποθέσεις του πόσιμου νερού (Kuchta et al. 1993). Επομένως δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός πως στα δείγματα νερού που ελέγχθηκαν στην παρούσα μελέτη υπήρξε ανίχνευση του βακτηρίου και σε χλωριωμένα νερά. Η επίδραση της έλλειψης αυτής απεδείχθη και με τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης, σύμφωνα με τα οποία, η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0 mg/l και 0,03 mg/l ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0,10 mg/l και 0,45 mg/l (p<0.0001). Επίσης η συγκέντρωση του βακτηρίου στα δείγματα νερού με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0,03 mg/l και 0,05 mg/l ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με συγκέντρωση υπολειπόμενου χλωρίου μεταξύ 0.10 mg/l και 0.45 mg/l (p<0.001). Οι συνθήκες λειτουργίας του πύργου ψύξης και το εσωτερικό των σωληνώσεων του συστήματος διανομής (νεκρά σημεία, παλιές σωληνώσεις) λόγω των κατάλληλων συνθηκών που δημιουργούνται, π.χ. απόθεση αλάτων, σκουριά, άλγες, δημιουργία βιομεμβράνης, ευνοούσαν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό του βακτηρίου Legionella, όπως παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη. Σχεδόν όλοι οι πύργοι ψύξης που εξετάστηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν παλιοί και δεν συμμορφώνονταν με τις εθνικές κατευθυντήριες οδηγίες για την συνεχή και επαρκή απολύμανση. Ένα από τους σημαντικότερους παράγοντες ανάπτυξης του βακτηρίου είναι και η θερμοκρασία, αφού το βακτήριο επιβιώνει σε ακραίες τιμές θερμοκρασίας, πολλαπλασιάζεται σε θερμοκρασίες μεταξύ 20 0 C και 45 0 C, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να επιβιώσει και σε 194

196 θερμοκρασίες που φθάνουν τους 55 o C-60 o C (Leoni et al 2001, HELA, 2002). Το γεγονός αυτό διαπιστώθηκε και στην παρούσα μελέτη, διότι παρατηρήθηκε διακύμανση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. σε διάφορες θερμοκρασίες των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία και τα Ξενοδοχεία. Στις θερμοκρασίες μεταξύ 36 0 C και 40 0 C και στις θερμοκρασίες 40 0 C και 44 0 C διαπιστώθηκε μεγαλύτερη συγκέντρωση του βακτηρίου. Πολλές μελέτες σε άλλες χώρες συμφωνούν με την δικής μας (Zacheus&Martikainen 1994, Borella et al 2005, Exner et al 2005, Wang et al 2006). Επίσης πρέπει να σημειωθεί πως η θερμοκρασία του ζεστού και κρύου νερού στα συστήματα διανομής των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων που εξετάστηκαν, δεν βρισκόταν στα επιθυμητά όρια. Η θερμοκρασία του ζεστού νερού ήταν χαμηλή και του κρύου υψηλή, κάτι που ευνοεί την ανάπτυξη και το πολλαπλασιασμό του βακτηρίου. Δηλαδή η θερμοκρασία του ζεστού νερού σχεδόν για όλα τα δείγματα νερού που αναλύθηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν κάτω από 50 0 C και η θερμοκρασία του κρύου νερού ήταν πάνω από 20 0 C. Το γεγονός αυτό αποτελεί συχνό πρόβλημα των μεγάλων κτιρίων, όπως είναι τα νοσοκομεία και τα ξενοδοχεία, όπου η απαιτούμενη θερμοκρασία του νερού, δεν μπορεί να φθάσει σε όλα τα ακραία σημεία του κτιρίου, διότι δυσχεραίνεται από τα νεκρά σημεία που τυχόν υπάρχον στο σύστημα διανομής, από προεκτάσεις και διάφορες ανακαινίσεις που μπορεί να έχουν πραγματοποιηθεί. Έρευνες, που συμφωνούν με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, έδειξαν μεγαλύτερη ανάπτυξη του βακτηρίου σε θερμοκρασίες μεταξύ 30 0 C και 46 0 C, (Exner et al 2005, Marrie et al 1992). Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών, έδειξαν επίσης ότι σε θερμοκρασίες υψηλότερες των 55 0 C υπάρχει ένα σημείο καμπής για την ανάπτυξη του βακτηρίου, γεγονός που παρατηρήθηκε και στην παρούσα μελέτη, και το εύρημα αυτό συμφωνεί με τις παρατηρήσεις άλλων ερευνητών που αναφέρουν ότι το εύρος των 55 0 C-60 0 C είναι κρίσιμη ζώνη θερμοκρασίας, πάνω από το οποίο αναστέλλεται ο πολλαπλασιασμός της Legionellae στα συστήματα διανομής ζεστού νερού των μεγαλύτερων κτιρίων (Darelid et al 2002, Arnow et al 1985, Codony et al 2002, Mathys et al 2008). Άλλοι ερευνητές απέδειξαν ότι οι χαμηλότερες θερμοκρασίες ζεστού νερού, ήταν στενά συνδεδεμένες με μόλυνση των συστημάτων διανομής ζεστού νερού από το βακτήριο (Plouffe et al 1983, Stout et al 1992, Lee et al 1988, Alary&Joly 1991). Είναι γνωστό ότι η Legionella πολλαπλασιάζεται εύκολα στα υδάτινα συστήματα υψηλής θερμοκρασίας, όπως πύργους ψύξης και καταιονιστήρες. Πειράματα έχουν αποδείξει πως η καλλιέργεια του βακτηρίου μειώνεται επιτυχώς με την αύξηση της θερμοκρασίας πάνω από ορισμένα επίπεδα (Ohno et al 2003, Brooks et al 2004). 195

197 Αξίζει να σημειωθεί πως η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού της παρούσας μελέτης με θερμοκρασία μεταξύ 16 0 C και 20 0 C, ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με θερμοκρασία, 36 0 C C (p<0.001) και με την συγκέντρωση του βακτηρίου με θερμοκρασία, 40 0 C C (p<0.0001). Επίσης η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού με θερμοκρασία μεταξύ 32 0 C και 36 0 C, ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με θερμοκρασία 40 0 C C (p<0.05). Ζεστό νερό με θερμοκρασία 30 o C-55 o C (Marrie et al 1992), που προέρχεται από καταιονιστήρες, βρύσες και οτιδήποτε μπορεί να δημιουργήσει υδατοσταγονίδια έχει αποδειχθεί πως είναι η πιο κοινή πηγή ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων της Νόσου των Λεγεωνάριων (Mathys et al, 1999) και εμφάνισης αντίστοιχων κρουσμάτων πνευμονίας στην κοινότητα, (Pedro-Botet&Sabria, 2005). Όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, η παρουσία αλάτων και διάφορων θρεπτικών ουσιών ευνοεί τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη του βακτηρίου. Η αγωγιμότητα αποτελεί μία από τις παραμέτρους ελέγχου και παρακολούθησης της αποτελεσματικότητας του προγράμματος επεξεργασίας της ποιότητας του νερού (Murga et al 2001, Borella et al 2005). Τα επιτρεπόμενα όρια για την αγωγιμότητα στους υδρόψυκτους πύργους ψύξης είναι κάτω από 1500 μs/cm (Kourea-Kremastinou&Hadjichristodoulou, 2004). Στην παρούσα μελέτη τα 3 από τα 11 δείγματα νερού που προέρχονταν από τους πύργους ψύξης βρίσκονταν εκτός επιτρεπτών ορίων, σε υψηλά επίπεδα (1870 μs/cm, 2120 μs/cm και 6720 μs/cm). Επιπλέον οι ευνοϊκές συνθήκες για την ανάπτυξη του βακτηρίου, που δημιουργούνται λόγω της υψηλής αγωγιμότητας, διαπιστώνονται και από το γεγονός ότι η συγκέντρωση του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού της παρούσας μελέτης, με αγωγιμότητα, 400 μs/cm-500 μs/cm ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με αγωγιμότητα, 700 μs/cm-800 μs/cm (p<0.0001). Σε έρευνα στα υδάτινα συστήματα Φιλανδικού νοσοκομείου η συχνότητα εμφάνισης της Legionella αποδίδονταν στην υψηλότερη αγωγιμότητα (Kusnetsov et al 2003), συμφωνώντας με τα αποτελέσματα της διατριβής. Η αυξημένη αγωγιμότητα σε πολλά δείγματα της παρούσας μελέτης ίσως οφείλεται στην έλλειψη καθαρισμού και συντήρησης των υδάτινων συστημάτων (βρύσες, καταιονιστήρες, σωληνώσεις, πύργοι ψύξης) και των δεξαμενών αποθήκευσης με αποτέλεσμα την απόθεση αλάτων και δημιουργίας βιομεμβράνης και περαιτέρω την ανάπτυξη του βακτηρίου Legionella και την μετανάστευση του σε όλο το σύστημα διανομής νερού (Exner et al. 2005). 196

198 Επίσης η διατήρηση του ph σε επιτρεπτές τιμές ( 7,0-8,0 για τους πύργους ψύξης ) κρίνεται αναγκαία, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η μόνιμη απολύμανση του δικτύου και η αποτελεσματική δράση της απολυμαντικής ουσίας (χλώριο). Στην παρούσα μελέτη τα αποτελέσματα έδειξαν πως η συγκέντρωση του βακτηρίου στα δείγματα νερού με ph 7,5-8.0, δεν ήταν στατιστικώς σημαντικά διαφορετική σε σχέση με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με ph , ή με την συγκέντρωση του βακτηρίου των δειγμάτων νερού με ph , διαπιστώνοντας πως η τιμή του ph των δειγμάτων νερού, δεν διαδραμάτισε ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη του βακτηρίου. Επιπλέον παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε μελέτη σύμφωνα με την οποία ο μέσος όρος του ph των εξεταζόμενων δειγμάτων ήταν ίδιος στα Legionella-θετικά και στα Legionella-αρνητικά δείγματα νερού (Kusnetsov et al 1993b). Πρέπει να σημειωθεί πως, μερικά απομονωμένα δείγματα του νερού που εξετάστηκαν, με υψηλή συγκέντρωση του βακτηρίου, έδειξαν και υψηλότερο ph. Σε παλαιότερη μελέτη, παρατηρήθηκε πως οι τιμές ph ήταν υψηλότερες στα Legionella-θετικά δείγματα (Witherell et al 1986). Σε άλλη έρευνα των υδάτινων συστημάτων νοσοκομείων και ξενοδοχείων η τιμή του ph είχε πολύ μικρή επίδραση στην παρουσία του βακτηρίου (Habicht&Müller, 1988). Προφανώς το ph του νερού δεν αποτελούσε κρίσιμο παράγοντα ρύθμισης της ανάπτυξης του βακτηρίου, συμπέρασμα στο οποίο καταλήξαμε και στην παρούσα μελέτη. Στο παρελθόν, η εκτίμηση κινδύνου για την Νόσο των Λεγεωνάριων έχει γίνει μέσω της τακτικής παρακολούθησης της συγκέντρωσης της Legionella και του συνολικού αριθμού των βακτηρίων (Bentham&Broadbent 1993, Mouchtouri et al 2007a).Τα αποτελέσματατης της παρούσας διδακτορικής διατριβής, έδειξαν πως δεν υπήρξε κάποια συσχέτιση μεταξύ της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C, και της παρουσίας του βακτηρίου. Αυτό ίσως συνέβη λόγω της μεμονωμένης παρουσίας της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στα σημεία δειγματοληψίας. Διαπιστώθηκε πως η χαμηλότερη συγκέντρωση του βακτηρίου παρατηρήθηκε σε συγκέντρωση cfu/mlτης Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και σε συγκέντρωση cfu/ml της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 37 0 C στα δείγματα νερού των Νοσοκομείων και των Ξενοδοχείων αντίστοιχα. Βέβαια, λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει το ρόλο της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και 37 0 C, σε σχέση με την παρακολούθηση της επικράτησης της Legionella σε συστήματα διανομής νερού (Kusnetsov et al 2003, Edagawa et al 2008, Moritz et al 2010, Volker et al 2010). Σε μια πρόσφατη έρευνα, σε συστήματα ζεστού νερού βρέθηκε υψηλή θετική συσχέτιση της παρουσίας και της συγκέντρωσης της Legionella με την παρουσία της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και 37 0 C (Bargellini et al 2011). Επίσης σε παρόμοια έρευνα έχει αποδειχθεί θετική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου με την Ολική Μεσόφιλη 197

199 Χλωρίδα στους 30 0 C (Edagawa et al 2008). Είναι γνωστό πως οι ετερότροφοι οργανισμοί ενισχύουν την δημιουργία βιομεμβράνης και επιτρέπουν την ανάπτυξη πρωτόζωων που απαιτούνται για την επιβίωση της Legionella (Huang&Hsu 2010, Bagh et al 2004). Οι μετρήσεις της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας θεωρείται ότι παρέχουν μια γενικότερη εικόνα των συνθηκών υγιεινής που επικρατεί στα συστήματα διανομής νερού (World Health Organization, 2003). Επιπλέον η μέτρηση της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στα συστήματα του πύργου ψύξης αποτελεί έναν έμμεσο δείκτη πιθανής παρουσίας του βακτηρίου της Legionella. Σύμφωνα με το EWGLI αν υπάρχει ανάπτυξη Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας πάνω από cfu/ml, ακόμα και αν δεν έχει ανιχνευθεί Legionella σε συγκέντρωση >1000 cfu/l, το σύστημα θεωρείται ότι ανήκει στην ομάδα αυξημένου κινδύνου για ανάπτυξη του βακτηρίου (EWGLI, 2003 ). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, η παρουσία του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa, ήταν μεμονωμένη, και ανιχνεύθηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις, μόνο σε συγκεκριμένα σημεία δειγματοληψίας, και όχι στο σύνολο του συστήματος ύδρευσης. Πιο συγκεκριμένα η ανίχνευση της Pseudomonas aeruginosa, ήταν μεγαλύτερη στα δείγματα που προέρχονταν από τους καταιονιστήρες και σε σημεία τα οποία εμφάνιζαν στασιμότητα νερού, σημεία δηλαδή τα οποία ευνοούν την ανάπτυξη της Pseudomonas aeruginosa. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella σε διάφορες ομαδοποιημένες συγκεντρώσεις του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa (p>0.05), επομένως δεν υπήρξε κάποια συσχέτιση της παρουσίας του βακτηρίου Legionella με την παρουσία της Pseudomonas aeruginosa στα δείγματα νερού που αναλύθηκαν. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει πως μερικά βακτήρια ανάμεσα τους και η Pseudomonas παρέχουν τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη της Legionella και πιο συγκεκριμένα η Pseudomonas aeruginosa ενισχύει τον πολλαπλασιασμό της Legionella pneumophila στο εσωτερικό των Naegleria lovaniensis και Acanthamoeba castellanii (Declerck et al 2005). Οι απόψεις διίστανται, διότι υπάρχει και η αντίθετη άποψη, πως η Pseudomonas aeruginosa ανταγωνίζεται σημαντικά την Legionella για το ποια θα αναπτυχθεί (Declerck et al 2005) καθώς πειράματα έχουν αποδείξει από παλιά, πως η ανάπτυξη της Legionella σε καλλιεργητικά θρεπτικά υλικά αναστέλλεται από κάποια βακτήρια και συγκεκριμένα από την Pseudomonas aeruginosa (Paszko-Kolva et al 1993, Rowbotham 1983). Επιπλέον, μη πειραματικές μελέτες ενισχύουν την άποψη για τον ανταγωνιστικό ρόλο της Pseudomonas aeruginosa. Πιο συγκεκριμένα σε έρευνα σε νερό οδοντιατρικών μονάδων, παρατηρήθηκε παρουσία και των δύο μικροοργανισμών σε 2 από τα 208 δείγματα που εξετάστηκαν, δηλαδή σε σχεδόν μηδενικό ποσοστό (0.96%) (Veronesi et al 2007). Επίσης σε μελέτη στην Βορειοδυτική 198

200 Ελλάδα σχετικά με τον μικροβιολογικό έλεγχο νερού πισινών για το χρονικό διάστημα , δεν ανιχνεύθηκε Legionella ενώ ήταν έντονη η παρουσία της Pseudomonas aeruginosa (Papadopoulou et al 2008). Ο αριθμός των υπό εξέταση δειγμάτων καθορίστηκε, λαμβάνοντας υπόψη το μέγεθος των κτιρίων (νοσοκομεία και ξενοδοχεία). Πιο συγκεκριμένα, η παρούσα μελέτη περιελάμβανε νοσοκομεία μεγέθους, που κυμάνθηκαν από <100 κλίνες έως >300 κλίνες και ξενοδοχεία από <50 δωμάτια έως >100 δωμάτια. Δεν παρατηρήθηκε κάποια συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου με το μέγεθος των κτιρίων ή με τους ορόφους των κτιρίων ή τις διάφορες κλινικές των νοσοκομείων. Το γεγονός αυτό μας δείχνει πως δεν υπήρχε μια επίμονη μεμονωμένη εστία μόλυνσης του βακτηρίου, απεναντίας ο αποικισμός του βακτηρίου ήταν διάσπαρτος σε όλο το σύστημα διανομής νερού. Όλα τα νοσοκομεία (εκτός από ένα) και όλα τα ξενοδοχεία προμηθεύονταν χλωριωμένο νερό από το κεντρικό σύστημα διανομής του δήμου που βρίσκονταν. Το σύστημα διανομής ενός νοσοκομείου προμηθευόταν νερό από την γεώτρηση του νοσοκομείου και η οποία χλωριωνόταν από τους υπεύθυνους του νοσοκομείου. Σε ότι αφορά τα νοσοκομεία, δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. μεταξύ των ορόφων από όπου ελήφθησαν τα δείγματα νερού (Ισόγειο, 1ος όροφος, 2ος όροφος, 3ος όροφος, 4ος όροφος) και του πύργου ψύξης. Αυτό συνέβη ίσως, διότι αφού όλοι οι όροφοι των κτιρίων χρησιμοποιούσαν το ίδιο δίκτυο ύδρευσης, η παρουσία του βακτηρίου ήταν διάχυτη σε όλο το κτίριο. Πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη πως οι πύργοι ψύξης σε κάποια νοσοκομεία βρίσκονταν εκτός λειτουργίας για μεγάλο χρονικό διάστημα, χωρίς συντήρηση και γενικά σε συνθήκες μη ικανοποιητικές από υγειονομικής άποψης. Επιπλέον, η στασιμότητα του νερού στις δεξαμενές αποθήκευσης ενισχύει το σχηματισμό βιομεμβράνης με αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα του βακτηρίου στα κεντρικά συστήματα. Σε μερικά νοσοκομεία η διαλείπουσα χρήση του ζεστού νερού, η παλαιότητα και η πολυπλοκότητα των συστημάτων διανομής νερού, σε διάφορες κλινικές διαφορετικών ορόφων, θα μπορούσαν να επιφέρουν διαφορετική συγκέντρωση του βακτηρίου στα διάφορα σημεία δειγματοληψίας. Επιπλέον η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, έδειξε πως δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά της συγκέντρωσης του βακτηρίου μεταξύ των διαφορετικών κλινικών των υπό εξέταση Νοσοκομείων. Αυτό ίσως αποδίδεται στο γεγονός ότι οι ομοειδείς κλινικές σε διαφορετικά νοσοκομεία, ήταν διαφορετικές ως προς την λειτουργία τους, την καθαριότητα των υδάτινων συστημάτων τους, την χρονολογία κατασκευή τους και τον αριθμό ασθενών που νοσηλεύονταν. 199

201 Σχετικά με την καταγραφή των περιστατικών πνευμονίας στα νοσοκομεία της περιοχής της μελέτης και τον εντοπισμό αντίστοιχα περιστατικών που οφείλονται στο βακτήριο Legionella, δημιουργήθηκαν διάφορα σημαντικά προβλήματα κατά την διάρκεια συλλογής των στοιχείων, που δεν επέτρεψαν μιαν ολοκληρωμένη καταγραφή. Συνολικά καταγράφηκαν 325 κρούσματα πνευμονίας από τα νοσοκομεία που εξετάστηκαν για την ανίχνευση του βακτηρίου Legionella, εκ των οποίων υπήρξαν και 2 επιβεβαιωμένα περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων. Η ελλιπής συλλογή του ακριβή αριθμού των περιστατικών που νοσηλεύονταν στα εξεταζόμενα νοσοκομεία στην παρούσα μελέτη, οφείλεται στο ότι δεν ήταν εφικτή η επικοινωνία με τους υπεύθυνους γιατρούς, ενώ σε κάποια νοσοκομεία δεν υπήρχε αρχείο και καταγραφή των ασθενών που νοσηλεύονταν. Οπότε τα συγκεκριμένα στοιχεία και οι αριθμοί των κρουσμάτων δεν αντιστοιχούν στην πραγματικότητα και είναι σίγουρο πως ο αριθμός των κρουσμάτων πνευμονίας και της Νόσου των Λεγεωνάριων, κατά την περίοδο διεξαγωγής της μελέτης στην πραγματικότητα ήταν υψηλότερος. Δεν ήταν επίσης εφικτή η συστηματική ανίχνευση της Νόσου των Λεγεωνάριων στα νοσηλευόμενα κρούσματα πνευμονίας, ούτε υπήρχε αντίστοιχη συστηματική διερεύνηση των κρουσμάτων πνευμονίας προς αυτή την κατεύθυνση, με εξαίρεση ένα μόνο Νοσοκομείο. Τέλος δεν ήταν σαφές αν κάποιο από τα δύο ταυτοποιημένα κρούσματα ήταν ενδονοσοκομειακή λοίμωξη. Με την καταγραφή των κρουσμάτων προσπαθήσαμε, μεταξύ των άλλων, να συσχετίσουμε και την παρουσία του βακτηρίου Legionella στα υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων με τα περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων που νοσηλεύονταν στο νοσοκομείο. Είναι αποδεδειγμένο από παλαιότερες μελέτες, πως υπάρχει συσχέτιση του αποικισμού του βακτηρίου στα συστήματα διανομής νερού των νοσοκομείων με την εμφάνιση ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων της Νόσου των Λεγεωνάριων στα νοσοκομεία (Best et al 1983, Kool et al 1999). Η ελλιπής καταγραφή των κρουσμάτων, είχε σαν αποτέλεσμα να έχουμε πολύ λίγα δεδομένα για την παρούσα μελέτη. Γενικότερα στη χώρα μας φαίνεται να υπάρχει σημαντική υποεκτίμηση της επίπτωσης της νόσου. Στην Ελλάδα, η Νόσος των Λεγεωνάριων αποτελεί νόσημα υποχρεωτικής δήλωσης σε χρονικό διάστημα 24 ωρών από την διάγνωση και θα πρέπει να αναφέρεται και να καταγράφεται. Είναι όμως χαρακτηριστικό ότι το ΚΕΕΛΠΝΟ, αναφέρει περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων, από το 1998 έως το 2008, ενώ μετά το 2008 δεν παρέχει κάποια δεδομένα για την Νόσο των Λεγεωνάριων. Στην Ευρώπη, ο συνολικός ετήσιος αριθμός των περιστατικών της Νόσου των Λεγεωνάριων, φαίνεται να έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια (Joseph&Ricketts 2010). Στην Ελλάδα είναι πιθανόν να υπάρχει σε εξέλιξη ένα αντίστοιχο φαινόμενο σύμφωνα με τα 200

202 στοιχεία που παρέχει ετησίως το European Working Group for Legionella Infections (EWGLI) και το European Surveillance Scheme for Travel Associated Legionnaires Disease. Το 2004 λόγω των Ολυμπιακών Αγώνων υπήρξε σημαντική εντατικοποίηση στη επιδημιολογική επιτήρηση πολλών λοιμωδών νοσημάτων, μεταξύ των οποίων και η Νόσος των Λεγεωνάριων. Παρατηρήθηκε τότε σημαντική αύξηση των καταγραφέντων περιστατικών, λόγω των συνεχών ελέγχων και του μεγάλου αριθμού των δειγμάτων που αναλύθηκαν. Από τα 385 ξενοδοχεία που εξετάστηκαν ο αποικισμός του βακτηρίου στα υδάτινα συστήματα, βρέθηκε να φθάνει το 20.8%, με το ποσοστό απομόνωσης να είναι μεγαλύτερο την καλοκαιρινή περίοδο. (Mouchtouri et al 2007b). Στην παρούσα μελέτη δεν μπορούμε να διατυπώσουμε αντίστοιχα συμπεράσματα, διότι αφενός μεν ο αριθμός των κρουσμάτων που καταγράφησαν ήταν ελλιπής, εφετέρου δε ο αριθμός των δειγμάτων δεν ήταν τόσο μεγάλος. Βέβαια αξίζει να σημειωθεί πως ο αριθμός των θετικών δειγμάτων Legionella ήταν ελάχιστα μεγαλύτερος κατά την καλοκαιρινή περίοδο. Ένα σύστημα βαθμολόγησης και ποσοτικής εκτίμησης, όπως αναφέρεται σε προηγούμενη μελέτη, που εφαρμόστηκε κατά την διάρκεια των Ολυμπιακών Αγώνων 2004, έχει χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για την εκτίμηση κινδύνου της Νόσου των Λεγωνάριων στα ξενοδοχεία και στα νοσοκομεία της Ελλάδας (Hadjichristodoulou et al 2006). Είναι δεδομένο, πως η αυξημένη παρακολούθηση των υδάτινων συστημάτων διανομής των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων οδηγεί σε μείωση του αποικισμού του βακτηρίου, όπως αποδεικνύεται και από πρόσφατη μελέτη στην χώρα μας (Velonakis et al 2011). Η παρούσα υποδεικνύει την ανάγκη για εντατικοποίηση της επιδημιολογικής επιτήρησης, καθώς και των μέτρων παρακολούθησης και απολύμανσης των υδάτινων συστημάτων της Νοτιοδυτικής Ελλάδος. Συνολικά 23 και 27 περιπτώσεις της Νόσου των Λεγεωνάριων στον Ελλαδικό χώρο αναφέρθηκαν το 2007 και το 2008 αντίστοιχα, και καμία δεν χαρακτηρίστηκε νοσοκομειακής προέλευσης (Joseph&Ricketts 2010). Αυτό αποτελεί ένα παράδειγμα της ανεπαρκούς διάγνωσης και της έλλειψης υποβολής αναφοράς των νοσοκομειακών κρουσμάτων της Νόσου στην χώρα μας. Τέλος, σε ότι αφορά τους περιορισμούς της μελέτης, θα πρέπει να σημειωθεί πως κατά τη διεξαγωγή της παρούσας μελέτης, σε κάποια νοσοκομεία πραγματοποιήθηκαν 2 δειγματοληψίες για την ανίχνευση του βακτηρίου ενώ στα υπόλοιπα μόνο μία, με αποτέλεσμα σε κάποια Νοσοκομεία (3) και σε ένα ξενοδοχείο να έχουμε περισσότερα δείγματα νερού σε σχέση με τα υπόλοιπα. Επιπλέον ο έλεγχος των ξενοδοχείων πραγματοποιήθηκε κατά την διάρκεια των καλοκαιρινών μηνών, και όχι σε όλο το χρόνο, ήταν δηλαδή εποχιακός, ενώ παράλληλα οι πύργοι ψύξης κάποιων ξενοδοχείων αλλά και νοσοκομείων ήταν λειτουργικοί κατά τους 201

203 καλοκαιρινούς μήνες, ενώ λίγοι ήταν σε εφαρμογή το υπόλοιπο έτος. Οι πληροφορίες από τους υπεύθυνους σχετικά με τις μεθόδους απολύμανσης και την λειτουργία των υδάτινων συστημάτων διανομής των κτιρίων, τις περισσότερες φορές υπήρξαν ελλιπείς. Σχετικά με το μέρος της διδακτορικής διατριβής που αφορούσε την καταγραφή των κρουσμάτων, η ελλιπής καταγραφή των κρουσμάτων της Νόσου, είτε λόγω μη τήρησης αρχείου ασθενών, είτε λόγω μη χρήσης διαγνωστικού τεστ (μόνο 2 νοσοκομεία διέθεταν το διαγνωστικό τεστ ανίχνευσης του βακτηρίου) είχε σαν αποτέλεσμα να έχουμε πολύ λίγα δεδομένα, χωρίς να μπορούμε να τα αξιολογήσουμε ανάλογα. Τα μεθοδολογικά αυτά προβλήματα θέτουν ορισμένους περιορισμούς στην ερμηνεία των ευρημάτων, ωστόσο σε γενικές γραμμές μπορεί να θεωρηθεί ότι τα αποτελέσματα της μελέτης επιτρέπουν την διατύπωση ορισμένων βασικών συμπερασμάτων, που παρατίθενται στη συνέχεια. 202

204 VI.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 203

205 Από την εφαρμογή των καλλιεργητικών και μοριακών μεθόδων ανιχνεύθηκε το βακτήριο L.pneumophila στο 33% και στο 36% των υδάτινων συστημάτων των νοσοκομείων στην Νοτιοδυτική Ελλάδα και των ξενοδοχείων στην περιοχή της Πάτρας, αντίστοιχα. Βρέθηκε αποικισμός του βακτηρίου σε 6 από τα 8 συνολικά νοσοκομεία (75%) και σε 5 από τα 9 συνολικά ξενοδοχεία (55%). Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν μια συχνή παρουσία σχετικά αυξημένων συγκεντρώσεων της Legionella spp. στα υδατικά συστήματα των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων. Τα αποτελέσματα της φυλογενετικής μελέτης της παρούσας μελέτης, έδειξαν υψηλή ομοιότητα των απομονωμένων Ελληνικών στελεχών με στελέχη της γειτονικής Ιταλίας. Δεν υπήρξε συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού, με το ph, την συγκέντρωση του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa και της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 22 0 C και στους 37 0 C. Υπήρξε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση της συγκέντρωσης του βακτηρίου Legionella spp. στα δείγματα νερού που εξετάστηκαν, με την θερμοκρασία, με την αγωγιμότητα, και με την συγκέντρωση υπολειπόμενου χλώριου. Η έρευνά μας επιβεβαιώνει την επιτακτική ανάγκη τακτικής παρακολούθησης και συστηματικού μικροβιολογικού ελέγχου των υδάτινων συστημάτων στα νοσοκομεία και ξενοδοχεία καθώς και συστηματικής επιδημιολογικής επιτήρησης με καταγραφή των κρουσμάτων και διερεύνηση των πηγών μόλυνσης, για την έγκαιρη αντιμετώπιση της έξαρσης κρουσμάτων ή και εμφάνισης επιδημιών της Νόσου των Λεγεωνάριων. Διαπιστώθηκε ελλιπής χρήση του διαγνωστικού τεστ για ανίχνευση της Legionella, σε περιστατικά πνευμονίας, από τα μικροβιολογικά εργαστήρια των νοσοκομείων (μόνο 2 από τα 9 εξεταζόμενα νοσοκομεία είχαν το διαγνωστικό τεστ Legionella). Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν ανεπαρκή χλωρίωση των υδάτινων συστημάτων και προβάλουν την σημασία της παρακολούθησης και της απολύμανσης του υδάτινου συστήματος των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων, για την μείωση του κινδύνου διασποράς του βακτηρίου. Παρατηρήθηκε έλλειψη διατήρησης της σωστής θερμοκρασίας του ζεστού (τουλάχιστον 50 0 C μετά από ροή νερού για 1 min) και του κρύου (<25 0 C μετά από ροή νερού για >2min) νερού στα υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων και ξενοδοχείων. 204

206 Τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν ότι στην περιοχή της Νοτιοδυτικής Ελλάδας υπάρχουν οι προϋποθέσεις για διασπορά του βακτηρίου Legionella και για εμφάνιση σημαντικού αριθμού κρουσμάτων της Νόσου των Λεγεωνάριων, ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων, ακόμη και επιδημιών. Η κατάσταση αυτή περικλείει κινδύνους τόσο για την Δημόσια Υγεία, όσο και για την τουριστική οικονομία, καθώς μπορεί να προκαλέσουν ακόμη και αποκλεισμό των ξενοδοχείων της περιοχής από τα τουριστικά γραφεία. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης είναι πιθανόν να υποδεικνύουν μια εικόνα της γενικότερης κατάστασης που επικρατεί στον Ελλαδικό χώρο, σχετικά με την παρουσία του βακτηρίου, προβάλλοντας την ανάγκη λήψης μέτρων πρόληψης και αντιμετώπισης της Νόσου. Με βάση τα συμπεράσματα της μελέτης προτείνονται τα παρακάτω: Η χρήση από όλα τα νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας του διαγνωστικού τεστ για ανίχνευση του βακτηρίου Legionella, προκειμένου να εντοπίζονται τα κρούσματα της Νόσου των Λεγεωνάριων σε ασθενείς με πνευμονία και να αναφέρονται. Εξωτερικός και εσωτερικός έλεγχος από τον Αρμόδιο Φορέα Υγείας, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η σωστή ανάληψη διορθωτικών ενεργειών και η σωστή λειτουργία του συστήματος παρακολούθησης, στα νοσοκομεία και ξενοδοχεία, όπως ορίζεται από το σύστημα εκτίμησης κινδύνου ανάπτυξης και μετάδοσης της Legionella. Συστηματική καταγραφή των βλαβών στα υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων και ξενοδοχείων και άμεση αποκατάσταση τους, έτσι ώστε να μην δημιουργούνται πιθανές εστίες μόλυνσης του βακτηρίου και συστηματικός καθαρισμός των σωληνώσεων ύδρευσης. Θα πρέπει να γίνεται σωστή λειτουργία του πύργου ψύξης και συστηματική συντήρηση από εξειδικευμένο προσωπικό σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. 205

207 Περίληψη Η Λεγιονέλλωση είναι μια λοιμώδης νόσος που αναγνωρίστηκε το δεύτερο μισό του 20ου αιώνα. Η σοβαρότητα της Νόσου ποικίλει από μια ήπια εμπύρετη ασθένεια (Pontiac πυρετός), μέχρι σοβαρής μορφής πνευμονία (Νόσος των Λεγεωνάριων). Μέχρι στιγμής, το γένος Legionella περιλαμβάνει τουλάχιστον 50 είδη, τα οποία περιλαμβάνουν 70 ξεχωριστές υποομάδες. Συγκεκριμένα η L.pneumophila περιλαμβάνει 16 υποομάδες, τις περισσότερες συγκριτικά με τα άλλα είδη. Το βακτήριο L.pneumophila είναι το πιο συνηθισμένο και επικίνδυνο μέλος της οικογένειας Legionella. Η L.pneumophila serogroup 1 προκαλεί τον μεγαλύτερο αριθμό κρουσμάτων της νόσου στην Ευρώπη και Αμερική. Πρόκειται για ένα υδατογενές παθογόνο βακτήριο που βρίσκεται παντού στο υδάτινο περιβάλλον και αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες 20οC-45οC, ενώ η θερμοκρασία των 35οC είναι η ιδανικότερη για την ανάπτυξη της Legionella pneumophila. Η ικανότητα του βακτηρίου να επιβιώνει σε υψηλές θερμοκρασίες, του επιτρέπει να αποικίζει σε τεχνητά υδάτινα συστήματα, τα οποία λειτουργούν σε υψηλότερες θερμοκρασίες από την θερμοκρασία περιβάλλοντος. Μεταδίδεται αερογενώς μέσω των εισπνεόμενων υδατοσταγονιδίων, ενώ μέχρι σήμερα δεν έχει διαπιστωθεί μετάδοση της νόσου από άτομο σε άτομο. Από την στιγμή που το βακτήριο είναι ευρέως διαδεδομένο στο περιβάλλον, μπορεί να εγκατασταθεί και να αναπτυχθεί σε τεχνητά συστήματα νερού, όπως οι πύργοι ψύξης και τα συστήματα ζεστού και κρύου νερού. Το 1986 συγκροτήθηκε η Ευρωπαϊκή Ομάδα Εργασίας για την Νόσο των Λεγεωνάριων (EWGLI: European Working Group for Legionella Infections) και το 1987 υλοποιήθηκε η επιτήρηση των περιπτώσεων της Νόσου των Λεγεωνάριων που συνδέονται με ταξίδια, μέσω του Ευρωπαϊκού Δικτύου Επιτήρησης της Νόσου των Λεγεωνάριων. Στην Ελλάδα, η Νόσος των Λεγεωνάριων αποτελεί νόσημα υποχρεωτικής δήλωσης σε χρονικό διάστημα 24 ωρών από την διάγνωση. Είναι όμως χαρακτηριστικό ότι το ΚΕΕΛΠΝΟ, αναφέρει περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων, από το 1998 έως το 2008, ενώ μετά το 2008 δεν παρέχει κάποια δεδομένα για την Νόσο των Λεγεωνάριων. Περιστατικά της Νόσου των Λεγεωνάριων στην Ελλάδα, έχουν αναφερθεί ήδη από το Κάθε χρόνο δηλώνονται κατά μέσον όρο 13 κρούσματα της Νόσου των Λεγεωνάριων. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εξέταση των υδάτινων συστημάτων σε νοσοκομεία και ξενοδοχεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδος για την ανίχνευση των ειδών Legionella. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε προσπάθεια καταγραφής των κρουσμάτων πνευμονίας και της Νόσου των Λεγεωνάριων που νοσηλεύονταν στα νοσοκομεία, έτσι ώστε να υπάρχει μια γενικότερη εικόνα της παρουσίας του βακτηρίου στην Νοτιοδυτική Ελλάδα. Συνολικά αναλύθηκαν 91 δείγματα 206

208 νερού από τα υδάτινα συστήματα 8 νοσοκομείων και 25 δείγματα από 9 ξενοδοχεία για το χρονικό διάστημα Μάιος 2008-Δεκέμβριος Αρχικά πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση του βακτηρίου με την καλλιεργητική μέθοδο (ISO 11731:1998) και στην συνέχεια ακολούθησε απομόνωση του DNA του βακτηρίου. Έπειτα έγινε ταυτοποίηση της Legionella pneumophila με τη Μοριακή Μέθοδο της PCR και τέλος τα θετικά προϊόντα της PCR επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση που πραγματοποιήθηκε στην Μονάδα Αλληλουχίας του Τμήματος Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν φυσικοχημικές αναλύσεις όπως μέτρηση του ph, θερμοκρασία, αγωγιμότητα και μικροβιολογικές αναλύσεις, όπως έλεγχος παρουσίας της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας στους 220C και 370C (ISO 6222:1999) και του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa (ISO 16266:2006). Tο 33% των δειγμάτων νερού που ελήφθησαν από τα Νοσοκομεία της Νοτιοδυτικής Ελλάδας βρέθηκαν θετικά για το βακτήριο L.pneumophila. Όσο αναφορά τα Ξενοδοχεία της περιοχής των Πατρών, στο 36% των δειγμάτων νερού υπήρξε παρουσία του βακτηρίου. Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε, πως τα ελληνικά στελέχη που απομονώθηκαν στην παρούσα μελέτη επέδειξαν υψηλή ομολογία με στελέχη L.pneumophila που έχουν χαρακτηριστεί γονοτυπικά με στελέχη της Ιταλίας. Καταγράφηκαν 325 κρούσματα πνευμονίας, εκ των οποίων τα 2 ήταν θετικά για το βακτήριο. Συμπερασματικά η παρούσα μελέτη υποδηλώνει μια συχνή παρουσία του βακτηρίου Legionella pneumophila, στα υδάτινα συστήματα των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων. Η έρευνα μας επιβεβαιώνει την ανάγκη τακτικής παρακολούθησης των μικροβιολογικής ποιότητας των υδάτινων συστημάτων των νοσοκομείων και των ξενοδοχείων της Νοτιοδυτικής Ελλάδος. 207

209 Abstract Legionellosis is an infectious disease that was recognized in the second half of the 20th century. The severity of the disease varies from a mild febrile illness (Pontiac fever) to severe pneumonia (Legionnaires' disease). To date, the genus Legionella comprises at least 50 species, comprising 70 separate subgroups. Specifically, the L.pneumophila includes 16 subgroups, most compared to other species. The bacterium L.pneumophila is the most common and dangerous member of the family of Legionella. L.pneumophila serogroup 1 causes the majority of cases reported in Europe and in the US. Legionella species are aquatic bacteria that are widespread in nature and have been found everywhere in the aquatic environment, developed at temperature 20oC-45oC and 35oC temperature is ideal for growth of Legionella pneumophila. Their tolerance to relatively to high temperatures probably helps them to colonize in artificial water systems that are often above temperatures. Legionellosis is transmitted via airborne aerosols by aspiration and as far there have been no reported cases of inter-human transmission. Once the bacterium is widespread in the environment can be established and developed in artificial water systems such as cooling towers and systems for hot and cold water. In 1986, the European Working Group for legionnaire's disease (EWGLI: European Working Group for Legionella Infections) established and in 1987 was realized the surveillance of cases of the legionnaires' disease associated with travel through the European Network Monitoring legionnaire's disease. In Greece, the Legionnaires' disease is a modifiable disease in period of 24 hours of diagnosis. It is significant that the KEELPNO states cases of Legionnaires disease from 1998 to 2008, but after 2008 does not provide any data on legionnaire's disease. Cases of Legionnaires disease in Greece have been reported since 1982 and every year reported an average of 13 cases of legionnaires' disease. The aim of the present study was to determine the prevalence of Legionella spp. in water systems of hospitals and hotels located in South Western Greece. Furthermore, attempt to record the incidence of pneumonia and legionnaire's disease hospitalized in hospitals, so that there is a general overview of the presence of the bacterium in South Western Greece. A prevalence survey for Legionella spp. by culturing techniques in water distribution systems of eight hospitals (total 91 water samples) and nine hotels (total 25 water samples) occurred in South Western Greece, for the period May 2008-December Initially carried out identification of the bacterium with the classic culture methods (ISO 1173:1998) and followed by isolation of DNA of the bacterium. Following, was made identification of Legionella pneumophila by molecular methods of PCR and the positive PCR products were confirmed by sequencing conducted in Sequencing 208

210 Unit of the Department of Immunology and Histocompatibility, School of Medicine, University of Thessaly. In parallel physicochemical analysis carried out, such as residual free chlorine, ph, temperature, conductivity and microbiological analysis such as, Total Count (220C and 370C) and Pseudomonas aeruginosa presence according to ISO 6222:1999 and ISO 16266:2006, respectively. Legionella pneumophila was detected in 33% and 36% of the distribution systems of hospitals and hotels. The phylogenetic analysis showed that Greek strains showed a high homology to L.pneumophila strains isolated during a study of genotypic characterization of Legionella species isolated in Italy. 325 cases of pneumonia were recorded, and 2 of them were positive for the bacterium. In conclusion, our survey results suggest a frequent prevalence of elevated concentrations of Legionella spp. in water systems of hospitals and hotels. Our investigation has confirmed the need to regularly monitor the microbiological condition of water systems in hospitals and hotels in South Western Greece. 209

211 Παράρτημα 1 Στο παράρτημα 1 που ακολουθεί δίνεται ένα έντυπο υπόδειγμα του εθνικού συστήματος επιτήρησης που παρέχεται από το Ηνωμένο Βασίλειο του Οργανισμού Προστασίας Υγείας (Health Protection Agency) 210

212 211

213 212

214 213