ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Δημητρόπουλος Βασίλης ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Pleurotus ostreatus ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΕΔΑΦΟΥΣ - ΑΧΥΡΟΥ
ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Πειραματική μελέτη της ανάπτυξης του μύκητα Pleurotus ostreatus σε υπόστρωμα εδάφους αχύρου Σκοπός είναι να διερευνηθούν παράγοντες, όπως το ποσοστό του αχύρου, η υγρασία, η θερμοκρασία και το θρεπτικό μέσο, που επηρεάζουν και πόσο την ανάπτυξη του συγκεκριμένου μύκητα Ο σχεδιασμός του πειράματος και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων βασίζεται στις αρχές και τεχνικές του στατιστικού σχεδιασμού πειραμάτων Γίνεται χρήση του υπολογιστικού προγράμματος STATGRAPHICS για την επίλυση των στατιστικών μοντέλων
ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ
ΤΟ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΤΗΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ ΤΟΥ ΕΔΑΦΟΥΣ Ελλιπής εικόνα των πολιτών για το μείζον πρόβλημα της ρύπανσης των εδαφών Πρόβλημα που αφορά και την Ελλάδα: άρθρα στον ελληνικό Τύπο για κινδύνους από PCBs & εντομοκτόνα Η ΕΕ καθορίζει με Οδηγίες την ασφαλή διαχείριση επικίνδυνων αποβλήτων Και στην ελληνική νομοθεσία Υπουργικές Αποφάσεις διαχείρισης αποβλήτων. Π.χ. Υπουργική Απόφαση 14312/1302/2000 για τα PCBs Σε αυτήν καταγράφεται και η υφιστάμενη κατάσταση: Το 1991 υπήρχαν 1.400 τόνοι PCBs σε πυκνωτές & μετασχηματιστές
ΟΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΟΙ ΟΡΓΑΝΙΚΟΙ ΡΥΠΟΙ ΤΟΥ ΕΔΑΦΟΥΣ Πετρελαϊκοί Αρωματικοί Υδρογονάνθρακες: Ενώσεις BTEX Βενζόλιο, Τολουόλιο, Αιθυλοβενζόλιο, Ξυλόλιο Πολυκυκλικοί Αρωματικοί Υδρογονάνθρακες: Υδ/κες με 2 ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους (ναφθαλένιο, ανθρακένιο, πυρένιο) Αλογονωμένες Αρωματικές Ενώσεις: π.χ. Χλωριωμένα Διφαινύλια (PCBs), Πενταχλωροφαινόλη (PCP) Αλογονωμένοι Αλειφατικοί Υδρογονάνθρακες: Χλωροφόρμιο, τετραχλωράναθρακας, διχλωρομεθάνιο, βινυλοχλωρίδιο, τριχλωροαιθυλένιο, τετραχλωροαιθυλένιο, κ.ά. Παρασιτοκτόνα: Lindane, DDT, Alachlor, Dieldrin, παραθείο, κ.ά.
ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΕΞΥΓΙΑΝΣΗΣ ΕΔΑΦΩΝ Στρατηγικές: Καταστροφή ή μεταβολή των ρύπων Εξαγωγή ή διαχωρισμός των ρύπων από το έδαφος Ακινητοποίηση των ρύπων Τεχνικές: Επί τόπου τεχνικές (in situ) Εκτός τόπου τεχνικές (ex situ) Τρόποι: Φυσική / χημική επεξεργασία Θερμική επεξεργασία Βιολογική επεξεργασία
ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Ορισμός: είναι η τεχνολογική διαδικασία κατά την οποία βιολογικά συστήματα χρησιμοποιούνται για την εξάλειψη χημικών ρύπων στο περιβάλλον Βιολογική εξάλειψη: βιοαποδόμηση Ανοργανοποίηση: μετατροπή οργ. ένωσης σε ανόργανα προϊόντα (CO 2, H 2 O) Μικροβιακά Συστήματα με εφαρμογή στη Βιοεξυγίανση: Βακτήρια (π.χ. γένος Pseudomonas) Μύκητες (μύκητες λευκής σήψης)
ΕΠΙ ΤΟΠΟΥ ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Στρατηγικές: Φυσική μείωση (natural attenuation) Βιοδιέγερση (biostimulation) Βιοαύξηση (bioaugmentation) Τεχνικές: Φυτοεξυγίανση Βιοαερισμός Ενισχυμένη βιοεξυγίανση
ΕΚΤΟΣ ΤΟΠΟΥ ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Τεχνικές: Κομποστοποίηση Βιοσωροί Άροση Βιοαντιδραστήρες
ΜΥΚΗΤΕΣ & ΒΙΟΕΞΥΓΙΑΝΣΗ Καταγεγραμμένα είδη: 75.000 Εκτιμήσεις: 1.500.000 είδη Ιδιαίτερη αξία για βιοεξυγίανση: Βασιδιομύκητες Μύκητες λευκής σήψης (white-rot fungi) Ικανότητα αποδόμησης της λιγνίνης του ξύλου με βάση ένα μη ειδικευμένο λιγνινολυτικό σύστημα ενζύμων
ΛΙΓΝΙΝΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΝΖΥΜΩΝ 1 Οι μύκητες λευκής σήψης διαθέτουν 2 τύπους εξωκυτταρικών ενζύμων: 1. Λακκάσες 2. Υπεροξειδάσες - Υπεροξειδάση της λιγνίνης - Υπεροξειδάση του μαγγανίου
ΛΙΓΝΙΝΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΝΖΥΜΩΝ 2 Καταλυτικοί Κύκλοι
ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΩΝ ΑΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ Το λιγνινολυτικό σύστημα ενζύμων είναι μη ειδικευμένο - Αποδομεί τη λιγνίνη αλλά και πλήθος ξενοβιοτικών ενώσεων (οργανικοί ρύποι) όπως: πολυκυκλικούς αρωματικούς υδ/κες κες (PAHs) χλωριωμένες αρωματικές ενώσεις (PCBs, PCP) χρωστικές βαφές παρασιτοκτόνα Επιτυγχάνουν μεγάλες μειώσεις στις συγκεντρώσεις των ρύπων Οι περισσότερες έρευνες εστιάζονται σε υγρές καλλιέργειες ή σε PDA Λίγοι μύκητες λευκής σήψης έχουν διεξοδικά διερευνηθεί: Phanerochaete chrysosporium Lentinula edodes Pleurotus ostreatus Trametes versicolor
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ
ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Pleurotus ostreatus ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΕΔΑΦΟΥΣ - ΑΧΥΡΟΥ Μίγμα εδάφους (άμμος) αχύρου σε δοκιμαστικούς σωλήνες Προσθήκη υγρασίας & θρεπτικού μέσου Εμβολιασμός του υποστρώματος με μύκητα Pleurotus ostreatus Εγκλιματισμός σε θάλαμο σταθερής & ελεγχόμενης θερμοκρασίας Καταγραφή του χρόνου εμφάνισης ανάπτυξης (χρόνος υστέρησης) του μυκηλίου Μέτρηση του μέγιστου βάθους ανάπτυξης του μύκητα στο υπόστρωμα μετά από 2 εβδομάδες
ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ 1 Εφαρμογή του Στατιστικού Σχεδιασμού Πειραμάτων: Central Composite Design πλαισίωση αστέρα & 2 ο βαθμιο μοντέλο Παράγοντες σχεδιασμού: - Ποσοστό αχύρου (%) επί του εδάφους (Χ 1 ) - Ποσοστό υγρασίας (%) επί του ξηρού μίγματος εδάφους-αχύρου (Χ 2 ) - Θερμοκρασία ( C) (Χ 3 ) - Ποσοστό θρεπτικού μέσου (%) επί του ξηρού μίγματος (Χ 4 ) Παράμετροι αριστοποίησης: - Χρόνος Υστέρησης (d) (Υ 1 ) - Βάθος Ανάπτυξης (mm) (Y 2 )
ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ 2 Κωδικοποιημένες & φυσικές τιμές των παραγόντων σχεδιασμού Παράγοντας -α -1 0 +1 +α Χ 1 : Ποσοστό αχύρου (%) 49.8 58 75 92 100.2 X 2 : Ποσοστό υγρασίας (%) 40 45 55 65 70 X 3 : Θερμοκρασία ( C) 9.6 13 20 27 30.4 X 4 : Ποσοστό θρεπτικού μέσου (%) 5.1 7.5 12.5 17.5 19.9
ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ 3 Συναρτήσεις απόκρισης των 2 παραμέτρων αριστοποίησης: χρόνος υστέρησης (d) : Y 1 = b 0 + b 1 X 1 + b 2 X 2 + + b 11 X 12 + b 22 + + + b 12 X 1 X 2 + b 13 X 1 X 3 + b 14 X 1 X 4 + Βάθος ανάπτυξης (mm) : Y 2 = c 0 + c 1 X 1 + c 2 X 2 + + c 11 X 12 + c 22 + + + c 12 X 1 X 2 + c 13 X 1 X 3 + c 14 X 1 X 4 + 22 X 2 2 22 X 2 2 Ο αριθμός των δοκιμών σωλήνων Ν είναι για k = 4 παράγοντες σχεδιασμού: Ν = 2 4 + 2 42 4 + 2 = 26 Πραγματοποιείται 1 επανάληψη (repetition), άρα ο συνολικός αριθμός των δοκιμών είναι 52 Ομαδοποίηση των δοκιμών με βάση τη θερμοκρασία: 2x1 σωλήνες σε Τ = 9.6 C 2x8 σωλήνες σε Τ = 13 C 2x8 σωλήνες σε Τ = 20 C ΣΥΝΟΛΟ = 52 σωλήνες 2x8 σωλήνες σε Τ = 27 C 2x1 σωλήνες σε Τ = 30.4 C
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ : ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ - Σε κωνική φιάλη των 100 ml: 50 ml H 2 O + 1 gr Malt Extract Broth - Εμβολιασμός της φιάλης με δισκία μυκηλίου από καλλιέργεια σε Petri με PDA
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ : ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΠΡΩΤΩΝ ΥΛΩΝ Ξήρανση της άμμου στους 40 C για 24 h Ξήρανση του αχύρου στους 40 C για 24 h Παρασκευή θρεπτικού μέσου (PDA χωρίς άγαρ): - 1 lit απιονισμένο νερό - 200 gr πατάτες - 20 gr γλυκόζη
ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 1 Η ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΙΓΜΑΤΟΣ & ΠΛΗΡΩΣΗ ΣΩΛΗΝΩΝ 5 διαφορετικά μίγματα: - 49.8 % άχυρο - 58 % άχυρο - 75 % άχυρο - 92 % άχυρο - 100.2 % άχυρο Παρασκευή μίγματος: - ζύγιση των καταλλήλων ποσοτήτων αχύρου & άμμου - ομοιογενοποίηση του μίγματος μέσω ανάδευσης Πλήρωση σωλήνων: 5 gr μίγματος σε κάθε σωλήνα
ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 2 Η ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗ ΤΩΝ ΣΩΛΗΝΩΝ 3 διαδοχικές αποστειρώσεις των σωλήνων αποστείρωση σε αυτόκλειστο στους 120 C για 20 min
ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 3 Η ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΘΡΕΠΤΙΚΟΥ ΜΕΣΟΥ & ΥΓΡΑΣΙΑΣ Προσθήκη θρεπτικού μέσου: με πιπέτα & αποστειρωμένα tips 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις θρεπτικού μέσου: - 5.1 % θρεπτικό μέσο - 7.5 % θρεπτικό μέσο - 12.5 % θρεπτικό μέσο - 17.5 % θρεπτικό μέσο - 19.9 % θρεπτικό μέσο Προσθήκη υγρασίας: με πιπέτα & αποστειρωμένα tips 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις υγρασίας: - 40 % υγρασία - 45 % υγρασία - 55 % υγρασία - 65 % υγρασία - 70 % υγρασία
ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 4 Η ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Με μίξερ: διάσπαση του μυκηλίου της κωνικής φιάλης & ομοιογενοποίηση του μίγματος Εμβολιασμός: με πιπέτα & αποστειρωμένα tips: - προσθήκη σε κάθε σωλήνα 2 ml εμβολίου
ΚΥΡΙΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΦΑΣΗ 5 Η ΕΓΚΛΙΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Εγκλιματισμός των σωλήνων σε θάλαμο ελεγχόμενης & σταθερής θερμοκρασίας 5 διαφορετικές θερμοκρασίες 5 διαφορετικές ημερομηνίες εκτέλεσης: - Θερμοκρασία 27 C : 24 Σεπτεμβρίου 2003 8 Οκτωβρίου 2003 - Θερμοκρασία 13 C : 8 Οκτωβρίου 2003 22 Οκτωβρίου 2003 - Θερμοκρασία 30.4 C : 3 Νοεμβρίου 2003 17 Νοεμβρίου 2003 - Θερμοκρασία 9.6 C : 8 Δεκεμβρίου 2003 22 Δεκεμβρίου 2003 - Θερμοκρασία 20 C : 12 Φεβρουαρίου 2004 26 Φεβρουαρ. 2004
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ Μέτρηση του χρόνου υστέρησης: Καταγραφή της ημέρας, μετά την εκτέλεση του πειράματος, εμφάνισης ανάπτυξης του μύκητα (εμφάνιση μυκηλίου) στην επιφάνεια του υποστρώματος Μέτρηση του βάθους ανάπτυξης: Το μέγιστο εμφανές βάθος ανάπτυξης σε mm του μύκητα εντός του υποστρώματος μετά από διάστημα 2 εβδομάδων Καταγραφή συνολικά 52 μετρήσεων: - του χρόνου υστέρησης - του βάθους ανάπτυξης
ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με το πρόγραμμα STATGRAPHICS v5.1: Πίνακας ANOVA Αποκλεισμός των ασήμαντων επιδράσεων στη συνάρτηση απόκρισης: : p-value p μεγαλύτερη από 0.05 - Χρόνος Υστέρησης (Υ 1 ): μόνο 6 από τις 14 επιδράσεις έχουν p-value < 0.05 - Βάθος ανάπτυξης (Υ 2 ): μόνο 5 από τις 14 επιδράσεις έχουν p-value < 0.05 Συντελεστές R 2 : - Για το χρόνο υστέρησης: : 82.4315% - Για το βάθος ανάπτυξης: : 94.007 %
Συναρτήσεις απόκρισης ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 2 Χρόνος υστέρησης: Y 1 = 5.90549 + 0.0533074X 1 0.203173X 3 0.000592773X 12 + 0.00131303X 1 X 3 0.0028505X 2 2 0.00685253X 2 4 Βάθος ανάπτυξης: Y 2 = 414.582 9.99518X 3 + 0.0216368 16368X 12 + 0.0602557 602557X 2 2 + 0.327238 X 32 + 0.259221 259221X 2 4
ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 3 Επιφάνειες απόκρισης Χρόνος Υστέρησης Xronos ysterisis 3.2 2.8 2.4 2 1.6 1.2 Estimated Response Surface Axyro=75.0,Threptiko meso=12.5 45 49 53 57 61 65 1316192225 Ygrasia 28 Xronos ysteris 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 thermokrasia 2.4 2.5 2.6
ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 4 Αριστοποίηση Χρόνος Υστέρησης (Υ 1 ): Ελαχιστοποίηση Βάθος Ανάπτυξης (Υ 2 ): Μεγιστοποίηση Y 1 (d) Y 2 (mm) Άριστη Τιμή 0.00941229 107.61 Άχυρο X 1 (%) 99.9351 100.193 Υγρασία X 2 (%) 40.1742 40.1742 Θερμοκρασία X 3 ( C) 30.3341 30.3776 Θρεπτικό μέσο X 4 (%) 5.08711 19.3572
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ο μύκητας αναπτύχθηκε πλήρως στο σύνολο των 52 σωλήνων και σε όλες τις συνθήκες ΚατάΚατά την εκτέλεση των πειραμάτων ήταν εμφανές πως κυρίαρχος παράγοντας που επηρεάζει την ανάπτυξη: θερμοκρασία Ο χρόνος υστέρησης ελαχιστοποιείται σε: - υψηλά επίπεδα αχύρου - χαμηλά επίπεδα υγρασίας - χαμηλά επίπεδα θρεπτικού μέσου - υψηλές θερμοκρασίες ΤοΤο βάθος ανάπτυξης μεγιστοποιείται σε: - υψηλά επίπεδα αχύρου - χαμηλά επίπεδα υγρασίας - υψηλά επίπεδα θρεπτικού μέσου - υψηλές θερμοκρασίες
ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Περαιτέρω διερεύνηση επίδρασης άλλων παραγόντων, όπως: - ph - ανόργανα άλατα - ποσότητα εμβολίου / βιομάζα μύκητα - συγκέντρωση ρύπου ξενοβιοτικής ένωσης - ύπαρξη αυτόχθονους μικροπανίδας Όμως με παραμετροποίηση επιπλέον παραγόντων (ph, βιομάζα, συγκέντρωση ρύπου) αυξάνει η πολυπλοκότητα του στατιστικού σχεδιασμού. Έτσι central composite design: - με 4 παράγοντες & 1 επανάληψη: : 52 δοκιμές - με 5 παράγοντες & 1 επανάληψη: : 88 δοκιμές Θερμοκρασία: σημαντικός παράγοντας ανάπτυξης η Ελλάδα με τις υψηλές θερμοκρασίες: δυνατότητα εφαρμογής της βιοεξυγίανσης με μύκητες