ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΣΤΟΧΕΥΣΗΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΠΛΕΙΟΜΟΡΦΟΥ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΟΣ ΜΕ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΩΝ ΤΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ HER Εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας, Ογκολογικό Τμήμα, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα, Ρίο Επιβλέπων: Καθηγητής Χαράλαμπος Καλόφωνος ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΔΗΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΠΑΤΡΑ 2013

2

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟ-ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΣΤΟΧΕΥΣΗΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΠΛΕΙΟΜΟΡΦΟΥ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΟΣ ΜΕ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΩΝ ΤΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ HER ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΔΗΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΙΑΤΡΟΣ Επιβλέπων: Καθηγητής Χαράλαμπος Καλόφωνος ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2013 3

4

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ Π. ΚΑΛΟΦΩΝΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ- ΟΓΚΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΟΣΧΟΝΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΖΟΛΩΤΑ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ 5

6

ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ Π. ΚΑΛΟΦΩΝΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ- ΟΓΚΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΟΣΧΟΝΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΖΟΛΩΤΑ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ ΓΩΓΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ, ΜΕΛΟΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΑΓΓΕΛΟΣ ΚΟΥΤΡΑΣ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ-ΟΓΚΟΛΟΓΙΑΣ, ΜΕΛΟΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΘΩΜΑΣ ΜΑΚΑΤΣΩΡΗΣ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ- ΟΓΚΟΛΟΓΙΑΣ, ΜΕΛΟΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΛΕΝΑ ΣΟΛΩΜΟΥ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ, ΜΕΛΟΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 7

8

ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 9

ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΣΥΝΕΔΡΙΑ 1. Κ. Δημητρόπουλος, Ε. Γιαννοπούλου, Α.Α. Αργυρίου, Χ.Π. Καλόφωνος, Μελέτη της δράσης των Sunitinib και Lapatinib σε κύτταρα γλοιώματος, Πανελληνιο Συνεδριο Ογκολογιας ΕΟΠΕ, Απρίλιος 2009 (poster). 2. E. Giannopoulou, K. Dimitropoulos, A. Argyriou and H. Kalofonos, Combined treatment with antiangiogenic and anti-egfr agents in glioblastoma, 15th Congress of the European CanCer Organisation, Berlin, 20-24 September 2009 (poster). 3. Giannopoulou E., Dimitropoulos K., Argyriou A. and Kalofonos HP., Effect of Lapatinib and Sunitinib agents in glioma cell lines, 1 st congress of Mediterranean Multidisciplinary Oncology Forum, Athens, Greece, 10th-13en September 2009 (oral presentation). 4. Giannopoulou E., Dimitropoulos K., Argyriou A. and Kalofonos HP., Inhibition of gliomas cell migration through interruption of growth factor receptor complexes with integrins, 27th International Conference entitled "Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology and Symposium on Cancer Stem Cells", Corfu, Greece, 21 st - 23 rd June 2010 (ομιλία). 5. Dimitropoulos K., Giannopoulou E., Argyriou A. and Kalofonos HP., Effects of anti-vegfr and anti-egfr agents in glioblastoma, 21 st Meeting of the European Association for Cancer Research, Oslo, Norway, 26 th 29 th June 2010 (poster). 10

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Μια μικρή ανταπόδοση στην πολύτιμη βοήθειά τους θα ήταν να παραθέσω τις ευχαριστίες μου για όλους όσους συνεισέφεραν στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Παθολογίας - Ογκολογίας κ. Χαράλαμπο Καλόφωνο, για την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπο μου αναθέτοντας μου την παρούσα διατριβή καθώς και την συνεχή και αδιάλειπτη υποστήριξη που μου παρείχε στην οργάνωση και τον προγραμματισμό του ερευνητικού μου έργου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς επιτροπής, Βασιλική Ζολωτα, Νικόλαο Μοσχονά, Θωμά Μακατσώρη, Άγγελο Κούτρα, Χαράλαμπο Γώγο και Έλενα Σολωμού για τις χρήσιμες και απαραίτητες επισημάνσεις τους για την επιμέλεια της συγγραφής της παρούσας διατριβής και την άρτια παρουσίασή της. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Χημικό Έφη Γιαννοπούλου για την υπομονή που έδειξε καθώς και την ιδιαίτερη βοήθειά της σε πρακτικό και θεωρητικό επίπεδο σε καθημερινή βάση σε όλη τη διάρκεια της παραμονής μου στο Εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας. Ταυτόχρονα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Ιατρό Νευρολόγο κ. Ανδρέα Αργυρίου που με την γνώση του αντικειμένου των γλοιοβλαστωμάτων καθώς και την συνδρομή του στην συγγραφή των δημοσιεύσεων, συνεισέφερε στην πραγμάτωση αυτής της διατριβής. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη του Εργαστηρίου Κλινικής Ογκολογίας, Άννα Αντωνακοπούλου, Ισμήνη Κριτικού, Αναστασία Κοτόρου, Διονυσία Λυμπεράτου, Αγγελική Κορπετίνου, Δήμητρα Κοτσιρίλου, Χαρούλα Σιρινιάν και Φωτεινό Δημητρακόπουλο, με τους οποίους συναναστράφηκα την περίοδο 11

2008-2011 τόσο για την αγαστή συνεργασία μας όσο και για την ανοχή τους προκειμένου να συνυπάρξουμε επιστημονικά. 12

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ... 19 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ... 21 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ... 29 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ (RISK FACTORS)... 35 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ... 36 ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ... 40 ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΓΛΟΙΩΒΛΑΣΤΩΜΑΤΟΣ... 42 ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΓΛΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΩΝ... 49 Θεωρίες και παρατηρήσεις στο γλοιοβλάστωμα... 49 Πρωτοπαθή vs δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα... 50 Τα mirnas στην ογκογένεση των γλοιοβλαστωμάτων... 52 Η θεωρία του cancer stem cell... 53 Ανοσολογικοί μηχανισμοί στο γλοιοβλάστωμα... 55 Ο ρόλος της αγγειογένεσης... 57 ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ... 60 Η απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου... 60 Το γονίδιο και οι μεταλλάξεις του ρετινοβλαστώματος και του τp53... 60 Τα μοριακά μονοπάτια στο γλοιοβλάστωμα... 62 ΚΙΝΑΣΕΣ ΤΥΡΟΣΙΝΗΣ... 68 ΟΙ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΕΣ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥΣ... 75 FAK (Focal Adhesion Kinase)... 77 CROSS-TALKING... 80 ΣΚΟΠΟΣ-ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ... 85 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 87 Καλλιέργεια ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος... 87 13

Διαδικασία ανακαλλιέργειας κυττάρων... 87 Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο (ΝEUBAUER)... 90 Έλεγχος της επίδρασης των υπό μελέτη φαρμάκων στο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος... 92 Μέθοδος μελέτης του χημειοτακτισμού (Boyden Chamber Assay): Μελέτη της επίδρασης ουσιών στο χημειοτακτισμό των κυττάρων... 95 Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών... 97 Συμπύκνωση MMPs... 98 Ζυμογράφημα για τη μελέτη της ποσότητας της μεταλλοπρωτεϊνασών 2 και 9 (MMP-2 και MMP-9) που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων... 99 Συλλογή Δειγμάτων για Western blot ανάλυση... 101 Ανοσοκατακρήμνιση... 102 SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση (Sodium Dodecyl Sulphate -PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)... 104 Ανοσοαποτύπωση (ανάλυση κατά Western)... 105 Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από μεμβράνη PVDF (Stripping)... 108 Ποσοτική εκτίμηση των ζωνών ηλεκτροφορητικής ανάλυσης μεταλλοπρωτεϊνασών και πρωτεϊνών... 109 Ανοσοφθορισμός... 109 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων... 112 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 113 Πολλαπλασιασμός... 113 Απόπτωση... 115 Δυναμικό Μετανάστευσης... 117 Επίδραση στην έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs)... 119 Επιδραση του lapatinib στον σχηματισμό του συμπλέγματος ιντεγκρίνης β 1 - EGFR... 120 14

Επίδραση του sunitinib στον σχηματισμό του συμπλέγματος ιντεγκρίνης β 3- VEGFR... 122 Επίδραση του sunitinib στον σχηματισμό του συμπλέγματος β 3 ιντεγκρίνης- PDGFR... 125 Επίδραση του lapatinib στα πρωτεϊνικά επίπεδα της ph-fak... 128 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 129 Οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων στο γλοιοβλάστωμα... 129 Ο καθοριστικός ρόλος των ιντεγκρινών στην μετανάστευση των γλοιωμάτων... 134 Περίληψη... 145 Summary... 151 Βιβλιογραφια... 157 15

16

Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Τα κακόηθες γλοίωμα, η πιο κοινή κατηγορία πρωτοπαθών όγκων εγκεφάλου σε ενήλικες, είναι ένα επιθετικό, εξαιρετικά διηθητικό καρκίνωμα με καταστροφικές συνέπειες για το νευρικό σύστημα και συγκαταλέγεται ανάμεσα στα πιο θανατηφόρα νεοπλάσματα του ανθρώπου. Ενδεικτικό είναι το γεγονός ότι ο μέσος όρος επιβίωσης ασθενών με πλειόμορφο γλοιοβλάστωμα είναι 12-15 μήνες (9-12 μήνες προ10ετίας). Παρά την εξέλιξη σε τεχνολογικό και επιστημονικό επίπεδο, την βελτίωση των χειρουργικών μεθόδων και της συμβατικής χημειοθεραπείας καθώς και τις χιλιάδες ασθενών που έχουν συμμετάσχει σε κλινικές μελέτες, τα αποτελέσματα είναι απογοητευτικά. Ακόμη και με την «έκρηξη» των γνώσεων πάνω στην βιολογία του καρκίνου και την πρόοδο των βασικών επιστημών, τα οποία έχουν συμβάλλει στην αντιμετώπιση διαφόρων νεοπλασιών όπως του μαστού, του πνεύμονα και του προστάτη, ελάχιστα έχουν επιτευχθεί στην αντιμετώπιση των όγκων του εγκεφάλου. Υπάρχει ήδη μια πολύ καλή εικόνα αναφορικά με τις γενετικές αλλαγές που λαμβάνουν χώρα είτε με διαγραφή ή και με ενίσχυση γονιδίων και χρωμοσωμάτων καθώς και σε σχέση με τα σηματοδοτικά μονοπάτια που συμμετέχουν στον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων. Ωστόσο, χρειάζεται να φωτιστούν ακόμη περισσότερες πτυχές αυτών των όγκων όπως για παράδειγμα η συμμετοχή των προγονικών νευρικών κυττάρων (stem cells) στη διαδικασία της καρκινογέννεσης, η αλληλοσύνδεση και η «επικοινωνία» μεταξύ των μοριακών μονοπατιών καθώς και ο ρόλος του ενδοθηλίου στην «ενορχήστρωση» και εξέλιξη της όλης διεργασίας [1, 2]. 19

Από μια άλλη οπτική γωνία, πρέπει να λάβουμε υπόψη την ιδιαίτερη μορφολογία του εγκεφάλου και τη βιολογία του νευρικού κυττάρου, τα οποία θα μπορούσαν να αποτελέσουν τροχοπέδη ή και να οδηγήσουν στην αποτυχία των διαφόρων θεραπευτικών προσεγγίσεων [3]: Οι όγκοι του εγκεφάλου αφορούν μια ιδιαίτερη κατηγορία νεοπλασιών λόγω της ανατομικής τους θέσης. Η ανάπτυξη τους σε έναν σαφώς περιγεγραμμένο χώρο από το οστέινο κρανίο ανάμεσα σε δομές νευρικού ιστού αναδεικνύει τη δυσκολία της θεραπευτικής προσπέλασης των όγκων αυτών καθώς και την ευκολία με την οποία μπορούν να προσβάλουν πολλαπλές παρακείμενες δομές ζωτικής σημασίας. Ο περιορισμένος χώρος καθιστά την πρόκληση πιεστικών φαινομένων να είναι σχεδόν πάντα αναπόφευκτη, αν αναλογιστούμε και την παρουσία νέων αγγείων περιορισμένης λειτουργικότητας, από τα οποία διαφεύγει ορώδες περιεχόμενο. Μπορεί αυτοί οι όγκοι να μην δίνουν απομακρυσμένες μεταστάσεις, αφού επιπλέον, απουσιάζει η δυνατότητα λεμφαγγειακής παροχέτευσης στο ΚΝΣ, ωστόσο η επεκτατική τους τάση, κατά συνέχεια ιστού, καθιστά δύσκολη την χειρουργική εξαίρεσή τους εντός υγιών ορίων. Η παρουσία του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ), αποτελεί εμπόδιο στην συγκέντρωση των χημειοθεραπευτικών ουσιών στην περιοχή της νεοπλασίας. Τέλος, χαρακτηριστικό είναι η μεγάλη ετερογένεια στο γενετικό προφίλ των συγκεκριμένων όγκων με δυσανάλογη απάντηση σε 20

ίδιους θεραπευτικούς παράγοντες ακόμη και όταν πρόκειται για τους ίδιους όγκους σε επίπεδο κακοήθειας (grade). ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Υπάρχουν διάφοροι τύποι όγκων οι οποίοι εξορμώνται από διαφορετικές δομές κύτταρα του ΚΝΣ, ενώ ταυτόχρονα παρουσιάζουν στοιχεία καλοήθειας ή κακοήθειας ανάλογα με την ιστοπαθολογική εικόνα τους [4]. Σύμφωνα με τον WHO (World Health Organization, Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας) στην αναθεωρημένη ταξινόμηση των όγκων εγκεφάλου (2007, 4 th edition) γίνεται μια προσπάθεια κατάταξής τους σε μια κλίμακα διαβαθμιζόμενης κακοήθειας (grades I - IV) κυρίως με βάση την βιολογική συμπεριφορά τους, τη μορφολογία, την πιθανή κλινική έκβαση, την ηλικιακή κατανομή χωρίς περιορισμούς από αυστηρά παθολογοανατομικά κριτήρια. Λιγότερο διαφοροποιημένοι φαινότυποι με συνέπεια μεγαλύτερο δυναμικό κακοήθειας, αντιστοιχούν σε υψηλότερη κλίμακα (grade). Ταυτόχρονα γίνεται εισαγωγή νέων όρων αναλόγως της θέσης και των κυττάρων από όπου εξορμώνται οι εκάστοτε όγκοι (π.χ. υποφυσιοκύττωμα, αγγειοκεντρικό γλοίωμα κ.α.) [5]. Αναμφισβήτητα η συγκεκριμένη κατάταξη από τον WHO είναι ευρέως διαδεδομένη και η μόνη αποδεκτή από όλες τις ειδικότητες που ασχολούνται με το συγκεκριμένο αντικείμενο [6]. 21

Μια ιδέα από την κλίμακα κακοήθειας κατά WHO είναι η εξής: WHO grade I: νεοπλάσματα μη διηθητικά με χαμηλό δυναμικό μιτώσεων και πιθανότητα ίασης μετά από χειρουργική εξαίρεση και μόνο. WHO grade II: νεοπλάσματα γενικώς διηθητικά, χαμηλής μιτωτικής δραστηριότητας τα οποία μπορούν να μεταπίπτουν σε μεγαλύτερης κακοήθειας νεοπλασίες (π.χ. χαμηλής βαθμίδος διάχυτο αστροκύττωμα που μεταπίπτει σε αναπλαστικό αστροκύττωμα και εν συνεχεία σε γλοιοβλάστωμα). WHO grade III: νεοπλάσματα κακοήθη, με έντονη μιτωτική δραστηριότητα και ατυπία πυρήνων. WHO grade IV: νεοπλάσματα με ενεργό μιτωτική δραστηριότητα, με τάση νέκρωσης και ραγδαία εξέλιξη της νόσου σε προεγχειρητικό και μετεγχειρητικό επίπεδο. Εκσεσημασμένη διήθηση παρακείμενων ιστών και επινέμηση του νωτιαίου μυελού. 22

Σχήμα 1: Α. Πιλοκυτταρικό αστροκύττωμα σαφώς περιγεγραμμένο (grade I), Β. Πλειόμορφο ξανθοαστροκύττωμα σαφώς περιγεγραμμένο (grade I), C. Αστροκύττωμα με μετρίου βαθμού πλειομορφισμό των πυρήνων (grade II), D. Αστροκύττωμα με υψηλά ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων (grade III), E. Γλοιοβλάστωμα με εστιακή νέκρωση (grade IV), F. Γλοιοβλάστωμα με εμφανη μικροαγγειακη υπερπλασία (grade IV). Δείγματα ιστών μετά από χρώση ηωσίνης και αιματοξυλίνης 23

Ενώ μία σύνοψη της ταξινόμησης των όγκων του ΚΝΣ είναι η εξής [5, 7]: 1. ΝΕΥΡΟΕΠΙΘΗΛΙΑΚΟΙ ΟΓΚΟΙ Αστροκυτταρικοί όγκοι: 1) Πιλοκυτταρικό Αστροκύττωμα (grade I) 2) Αναπλαστικό Αστροκύττωμα (grade III) 3) Διάχυτο Αστροκύττωμα (grade II) 4) Πλοιόμορφο Ξανθοαστροκύττωμα (grade II) 5) Υποεπενδυματικό γιγαντοκυτταρικό αστροκύττωμα (grade I) 6) Γλοιοβλάστωμα (grade IV) Ολιγοδενδρογλοιακοί Όγκοι: 1) Ολιγοδενδρογλοίωμα (grade II) 2) Αναπλαστικό Ολιγοδενδρογλοίωμα (grade III) Ολιγοαστροκυτταρικοί Όγκοι: 1) Ολιγοαστροκύττωμα (gradeii) 2) Αναλαστικό Ολιγοατροκύττωμα (grade III) Επενδυματικοί Όγκοι: 1) Υποεπενδύμωμα (grade I) 2) Μυξοθηλοειδές επενδύμωμα (grade I) 3) Επενδύμωμα (grade II) 4) Αναπλαστικο επενδύμωμα (grade III) 24

Ολιγοαστροκυτταρικοί Όγκοι: 1) Ολιγοαστροκύττωμα (grade II) 2) Αναπλαστικό Ολιγοαστροκύττωμα (grade III) Άλλοι Νευροεπιθηλιακοί Όγκοι: 1) Αστροβλάστωμα 2) Χορδοειδές γλοίωμα 3 ης κοιλίας (grade II) 3) Εγκεφαλική γλοιωματωση Νευρωνικοί και Μικτοί Όγκοι νευρώνων Γλοίας: 1) Γαγγλιοκύττωμα (grade I) 2) Γαγγλιογλοίωμα (grade I) 3) Αναπλαστικό γαγγλιογλοίωμα (grade III) 4) Δεσμοπλαστικό βρεφικό Αστροκύττωμα (grade I) 5) Δυσπλαστικό γαγγλιοκύττωμα της παρεγκεφαλιδας 6) Δυσεμβριοπλαστικός Νευροεπιθηλιακός Όγκος (grade I) 7) Κεντρικό Νευροκύττωμα (grade II) 8) Εξωκοιλιακό νευροκύττωμα (grade II) 9) Παρεγκεφαλιδικο Λιπονευροκύττωμα (grade II) 10) Παραγαγγλίωμα (grade I) 11) Θηλωματώδης γλοιονευρωνικός όγκος (grade I) 12) Γλοιονευρωνικός Όγκος της 4 ης κοιλίας σε διάταξη ροζέτας(rosette) 13) Παραγαγγλίωμα (grade I) 25

Όγκοι Χοριοειδούς Πλέγματος: 1) Θήλωμα χοριοειδούς Πλέγματος (grade I) 2) Άτυπο Θήλωμα Χοριοειδούς Πλέγματος (grade II) 3) Καρκίνωμα Χοριοειδούς Πλέγματος (grade III) Εμβρυονικοί Όγκοι: 1) Μυελοβλάστωμα (grade IV) 2) Αρχέγονοι νευροεξωδερματικοί Όγκοι ΚΝΣ ( grade IV) 3) Άτυποι τερατοειδείς Όγκοι (grade IV) Όγκοι της περιοχής της Επίφυσης: 1) Επιφυσεοκύττωμα (grade I) 2) Επιφυσεοβλάστωμα (grade II) 3) Επιφυσιακοί παρεγχυματικοί Όγκοι διάμεσης διαφοροποίσης (grade II) 4) Θηλοειδής όγκος τηςπεριοχής της επίφυσης (grade II & III) 2. Όγκοι των μηνίγγων 1) Μηνιγγίωμα (grade I) 2) Μεσεγχυματικοί Όγκοι (grade II & III) 3) Αιμαγγειοβλάστωμα (grade I) 4) Πρωτοπαθείς μελανινοκυτταρικές βλάβες 3. Λεμφώματα και Αιμοποιητικά Νεοπλάσματα 26

1) Κακοήθη Λεμφώματα 2) Πλασματοκύττωμα 3) Κοκκιοκυτταρικό Σάρκωμα 4. Όγκοι παρασπονδυλικών και κρανιακών νεύρων 1) Σβάνωμα (grade I) 2) Νευρίνωμα (grade I) 3) Περινευρίνωμα (grade I, II & III) 4) Κακοήθεις όγκοι του περιβλήματος των νευρικών κυττάρων 5. Όγκοι αρχέγονων κυττάρων 1) Γερμίνωμα 2) Εμβρυωνικό καρκίνωμα 3) Όγκος ενδοδερμικού κόλπου(yolk Sac) 4) Χοριοκαρκίνωμα 5) Τεράτωμα 6) Όγκοι μεικτών αρχέγονων κυττάρων 6. Όγκοι της περιοχής του εφιππίου 1) Κρανιοφαρυγγίωμα (grade I) 2) Ογκοκύττωμα της αδενουπόφυσης (grade I) 3) Υποφυσιοκύττωμα (grade I) 4) Όγκοι κοκκιωδών κυττάρων (grade I) 7. Μεταστατικοί Όγκοι 27

Εκτός από την κατά WHO κατάταξη, ιδιαιτέρως για την κατηγορία των γλοιοβλαστωμάτων - τα οποία αποτελούν αντικείμενο αυτής της μελέτης έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για την συγκρότηση της πιο ορθής και απλουστευμένης κλίμακας κακοήθειας των όγκων αυτών, οι οποίες ξεκινάνε πολλές δεκαετίες πίσω με τον Kernohan et al. [8], τον Ringertz et al. [9] μέχρι και πιο πρόσφατες με τον Daumas- Duport et al. [10]. Σε όλες τις περιπτώσεις συμπεριλαμβάνονται τα κριτήρια των μιτώσεων, της κυτταρικής ανάπλασης, της παρουσίας νέκρωσης, ανωμαλίες των πυρήνων καθώς και η διήθηση των παρακείμενων φυσιολογικών δομών. Τα ιστολογικά χαρακτηριστικά συνήθως προεξάρχουν της πρόγνωσης. Τα τελευταία έτη - και καθώς αναμένεται η επόμενη έκδοση κατά WHO - έχει διατυπωθεί η ανάγκη της ταυτοποίησης και του περαιτέρω διαχωρισμού των όγκων με βάση συγκεκριμένα μόρια τα οποία αποτελούν τη «σφραγίδα» του κάθε τύπου όγκου πέραν της υπάρχουσας μορφολογικής ταξινόμησης. Έχει διαπιστωθεί ότι αλλαγές στην έκφραση κάποιων μορίων, ή σε επίπεδο χρωμοσωμάτων όπως η μετάλλαξη του γονιδίου της ισοκιτρικής δευδρογενάσης IDH-1, η παρουσία/απουσία της διαγραφής των περιοχών 1q/19q, η υπερμεθυλίωση του εκκινητή της Ο6 μεθυλγουανίνης της DNA μεθυλτρανσφεράσης (MGMT), η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη του υποδοχέα του EGFR (EGFRvIII) μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως προγνωστικοί και διαγνωστικοί παράγοντες που θα προβλέπουν και θα καθορίζουν τη διαδικασία της λήψης κλινικών αποφάσεων. Με αυτό τον τρόπο θα γίνει μια δυναμική επαναταξινόμηση των όγκων εγκεφάλου και θα αναδειχτούν νέοι μοριακοί βιοδείκτες οι οποίοι πιθανότατα θα αποτελέσουν και μελλοντικούς θεραπευτικούς στόχους [11-13]. 28

ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Οι γνώσεις μας για την επιδημιολογία των όγκων του εγκεφάλου προέρχονται πρωτίστως από στατιστικές αναλύσεις διαφόρων εταιριών οργανισμών σε ΗΠΑ και Ηνωμένο Βασίλειο σε βάσεις δεδομένων που οι ίδιες συλλέγουν, με συνεχή καταγραφή των περιστατικών σε μεγάλες γεωγραφικές περιοχές. CBTRUS (Central Brain Tumor Registry of the United States): πρόκειται για έναν ερευνητικό οργανισμό ο οποίος ασχολείται επαγγελματικά με την καταγραφή και επεξεργασία δεδομένων που αφορούν πρωτοπαθείς όγκους του εγκεφάλου και του ΚΝΣ και προέρχονται από τον δημόσιο φορέα επιτήρησης NCPR (National Program of Central Registries). SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results): δραστηριοποιείται στην παρουσίαση της επίπτωσης και των ποσοστών επιβίωσης από καταγραφή δεδομένων που αφορούν πρωτοπαθείς όγκους εγκεφάλου καλοήθεις και κακοήθεις, σε βάθος χρόνου περίπου 35 ετών (1975-2009). IARC (International Agency for Research in Cancer): παρέχει πληροφόρηση αναφορικά με τα παγκόσμια στοιχεία των ποσοστών επίπτωσης διαφόρων νεοπλασιών μεταξύ αυτών και των όγκων εγκεφάλου. Τα ποσοστά αυτά είναι προσαρμοσμένα στην ηλικία του καθιερωμένου πρότυπου παγκόσμιου πληθυσμού (world standard population). 29

CRUK (Cancer Research for UK): είναι ο βρετανικός φιλανθρωπικός οργανισμός που ασχολείται με την μελέτη διαφόρων τύπων καρκίνου σε προκλινικό και κλινικό επίπεδο ενώ ταυτόχρονα παρέχει στατιστικά δεδομένα με ελεύθερη πρόσβαση στο διαδίκτυο. Συνολικά για τα έτη 2005-2009 καταγράφηκαν 311.202 περιστατικά όγκων εγκεφάλου (109.695 κακοήθεις και 201.507 μη κακοήθεις) ανάμεσα σε 293.011.631 άτομα τα οποία αντιπροσωπεύουν περίπου το 97% του συνολικού πληθυσμού όλων των πολιτειών της Αμερικής. Από αυτούς, οι 99.063 ήταν νευροεπιθηλιακής προέλευσης με προσβολή των ανδρών κατά 1,4 φορές συχνότερη σε σχέση με τις γυναίκες, ενώ σχεδόν οι μισοί -σε απόλυτο αριθμό 49.088- αφορούσαν το γλοιοβλάστωμα. Μέσος όρος ηλικίας διάγνωσης όλων των πρωτοπαθών όγκων εγκεφάλου και ΚΝΣ ήταν τα 59 έτη. Αντίστοιχα σε δεδομένα που αφορούν τα ποσοστά θνησιμότητας σε όγκους εγκεφάλου από πηγές που προέρχονται από το Ηνωμένο Βασίλειο, παρατηρούμε ότι προκύπτει μια καμπύλη αναλόγως της ηλικίας, στην οποία υπάρχουν 2 κορυφές, μια στα 70 έτη, με πολύ μεγάλο απόλυτο αριθμό περιστατικών, και άλλη μια στην παιδική ηλικία (περίπου 4-5 ετών), με σαφέστατα μειωμένο αριθμό κρουσμάτων. Παρόλα αυτά, για την παιδική ηλικία αυτοί οι όγκοι θεωρούνται ως οι δεύτεροι σε συχνότητα, μετά τις λευχαιμίες. 30

0-4 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 85+ Αριθμός Θανάτων Ποσοτό / 100,000 350 300 250 200 150 100 50 0 Male deaths Female deaths 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 Ηλικία θανάτου Σχήμα 2: Kαμπύλη θνησιμότητας με βάση την ηλικία. Παρατηρείται μια μικρή κορυφή στα 5 έτη και μια πολύ μεγαλύτερη στα 70. Αριστερά από κάθε γκρούπ είναι οι αντρες και δεξιά οι γυναίκες. Ολική Επίπτωση: στις ΗΠΑ, τη συγκεκριμένη τετραετία (2005 2009) για τους πρωτοπαθείς όγκους εγκεφάλου και ΚΝΣ η συνολική ετήσια επίπτωση, ανεξαρτήτως ηλικίας και φύλου ήταν 20,59 για κάθε 100.000 ανθρώπους. Σε επιμέρους ταξινόμηση, αναλόγως την ηλικία, αυτή διαμορφώνεται ως εξής: 5,13 ανά 100.000 ανθρώπους για τις ηλικίες 0-19 ετών και 26,81 ανά 100.000 ανθρώπους για τις ηλικίες άνω των 20 ετών [14]. Για το Ηνωμένο Βασίλειο, στο έτος 2010 καταγράφηκαν 9.100 νέες περιπτώσεις πρωτοπαθών όγκων εγκεφάλου με συνολική επίπτωση 12,3 περιστατικά για κάθε 100.000 ανθρώπους, τιμή προσαρμοσμένη ηλικιακά στον πληθυσμό της Ευρώπης. Από μια άλλη οπτική γωνία στην Βρετανία για το 2010 διαγνώστηκαν 25 άτομα 31

ημερησίως με νεοπλασία εγκεφάλου ή ΚΝΣ [15]. Η παγκόσμια ετήσια επίπτωση των πρωτοπαθών όγκων εγκεφάλου και ΚΝΣ εκτιμάται σε 3,5 ανά 100.000 άτομα-χρόνια [16]. Με βάση στατιστικά μοντέλα, χωρίς να έχει γίνει επεξεργασία των καταγεγραμμένων στοιχείων, οι εκτιμήσεις για τις ΗΠΑ των ετών 2012 και 2013 αφορούν την εμφάνιση 68.530 και 69.720 αντίστοιχα, νέων περιπτώσεων όγκων εγκεφάλου και ΚΝΣ. Θνησιμότητα: για το έτος 2010 στο Ηνωμένο Βασίλειο καταγράφηκαν περίπου 4.900 θάνατοι από όγκους εγκεφάλου με ποσοστό 6,1 άτομα ανά 100.000 ανθρώπους. Για το έτος 2012, στις ΗΠΑ έχει εκτιμηθεί ότι 13.700 θάνατοι θα αποδοθούν σε κακοήθεις όγκους εγκεφάλου και ΚΝΣ. Ταυτόχρονα σε παγκόσμιο επίπεδο θεωρείται ότι οι θάνατοι σε αυτή την κατηγορία όγκων ανέρχονται σε 2,6 ανά 100.000 ανθρώπους ετησίως, ενώ θεωρείται ότι κατέχουν την 14 η θέση στη σειρά των πιο συχνά εμφανιζόμενων θανατηφόρων όγκων. Ενθαρρυντικό είναι το γεγονός που έχει παρατηρηθεί αναφορικά με την μείωση του ποσοστού θανάτων στην πάροδο των ετών για τις ηλικίες άνω των 20 ετών. Δια βίου Κίνδυνος: Για τους άνδρες, ο κίνδυνος να εμφανίσουν κάποιον όγκο του εγκεφάλου ή του ΚΝΣ ανέρχεται σε ποσοστό 0,7% ενώ η πιθανότητα να αποβιώσουν από αυτή την αιτία είναι 0,5%. Για τις γυναίκες αντίστοιχα ο κίνδυνος εμφάνισης τέτοιων όγκων είναι 0,6% με πιθανότητα θανάτου από αυτή την αιτία περίπου 0,4% [17]. Επιβίωση και προγνωστικοί παράγοντες: για τα έτη 2005-2009 η ολική 5ετής επιβίωση για όλους τους όγκους του ΚΝΣ και εγκεφάλου 32

είναι 33,8%. Μόνο για το γλοιοβλάστωμα, η 5ετής επιβίωση μειώνεται δραματικά σε ποσοστό της τάξης του 4,7%, πολύ χειρότερη από το αναπλαστικό αστροκύττωμα όπου είναι 25,9%. Η 5ετής επιβίωση ανάλογα με την ηλικιακή κατανομή σε ομάδες ασθενών ανεξαρτήτως ιστολογικού τύπου, κατανέμεται ως εξής: Πίνακας 1: 5ετής επιβίωση ανάλογα με την ηλικιακή κατανομή Ηλικιακή ομάδα (έτη) Ποσοστό επιβίωσης 0-19 73.0% 20-44 57.7% 45-54 31.7% 55-64 17.6% 65-74 10.0% 75 5.7% Εκτός από την ιστολογική εικόνα που επηρεάζει σαφώς την πρόγνωση έχει βρεθεί ότι τόσο για το διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου PFS (progression free survival), όσο και για την συνολική επιβίωση των ασθενών με γλοιοβλάστωμα διάφορες παράμετροι όπως η ηλικία του ατόμου, η γενική του κατάσταση ( performance status ) κατά την διάγνωση της νόσου, το μέγεθος του όγκου, το εύρος της χειρουργικής εκτομής, η θεραπευτική δόση της ακτινοβολίας και η μετέπειτα χημειοθεραπεία διαδραματίζουν σημαντικότατο ρόλο. Από την άλλη πλευρά, το φύλο, η περιοχή του εγκεφάλου όπου βρίσκεται ο όγκος και η τεχνική της ακτινοβόλησης, δεν αποτελούν στατιστικώς σημαντικά προγνωστικά στοιχεία για την επιβίωση ή το PFS. Δεν πρέπει να παραληφθεί η σημασία των μοριακών «υπογραφών» των όγκων οι οποίες ομολογουμένως καθορίζουν την πρόγνωση με το διαχωρισμό των 33

ατόμων με εξαιρετικά μεγάλη επιβίωση( long term survivors, 3%-5%) με μέσο όρο επιβίωσης τα 3 χρόνια, από το υπόλοιπο σύνολο ασθενών όπου η επιβίωση δεν ξεπερνά τους 12-15 μήνες [18-20]. Επιγραμματικά, το γλοιοβλάστωμα αποτελεί τη δεύτερη πιο συχνά απαντούμενη ιστολογική οντότητα (16%) μετά το μηνιγγίωμα (35%) στο σύνολο των όγκων εγκεφάλου και ταυτόχρονα την πιο συχνή κακοήθεια. Κυρίως αφορά τους ενήλικες μεγάλων ηλικιών (75-84 ετών) και πολύ λιγότερο τα παιδιά. Απαντώνται 2 έως 3 φορές συχνότερα σε καυκάσιους παρά σε ασιάτες ή νέγρους. Η 5ετής επιβίωση είναι εξαιρετικά πτωχή και μικρότερη του 5%, αλλά σαφώς καλύτερη στις ηλικίες κάτω των 20 ετών. Περίπου 8% των ασθενών με γλοιοβλάστωμα κάτω των 20 ετών θα ζουν σε 10 έτη από τη διάγνωση. Αντίστοιχα, για τους ενήλικες και γηραιότερους, για το ίδιο χρονικό διάστημα, το ποσοστό αυτό θα είναι μικρότερο του 1% [14, 21]. Α Β Σχήμα 3: Σχηματική απεικόνιση της κατανομής των όγκων εγκεφάλου και ΚΝΣ ανάλογα: Α. με τον ιστολογικό τύπο, Β. με την θέση εμφάνισης τους (Ν=311.202) [14]. 34

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ (RISK FACTORS) Εκτός από το γενετικό υπόστρωμα, το οποίο λαμβάνει σημαντικό μερίδιο της ευθύνης για την ανάπτυξη των όγκων εγκεφάλου, έχουν διαπιστωθεί ορισμένοι εξωτερικοί-περιβαλλοντικοί παράγοντες οι οποίοι πρακτικά επηρεάζουν την εξέλιξη-γέννεση αυτών. Από τις υπάρχουσες μελέτες προκύπτει διαφορετικού βαθμού βαρύτητα για τον κάθε αιτιολογικό παράγοντα, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να υπάρχουν και αντικρουόμενα στοιχεία, όπως για παράδειγμα η χρήση των κινητών τηλεφώνων. Μεγάλος αριθμός αναφορών εστιάζει σε συγκεκριμένα επαγγέλματα όπως πυροσβέστες, ελαιοχρωματιστές, δάσκαλοι, άτομα με επαγγελματική ενασχόληση την επεξεργασία τροφίμων, την επεξεργασία μετάλλου, εργαζόμενοι στην υφαντουργία κ.α. Σημαντικός θεωρείται επίσης και ο ρόλος των ηλεκτρομαγνητικών πεδίων είτε μεμονωμένα ή μέσω των επιδράσεων σε μέταλλα που περιέχουν μόλυβδο, σε εργαζόμενους στα τρένα. Τέλος, ενοχοποιούνται διάφοροι ιοί και ανοσολογικοί μηχανισμοί, τα χημικά (βαρέα μέταλλα) καθώς και τα νιτρώδη σε φαγητά και καπνό [22, 23]. Πίνακας 2: Παράγοντες κινδύνου για πρωτοπαθείς όγκους εγκεφάλου [23] Κληρονομούμενα σύνδρομα : οζώδης σκλήρυνση, νευροινομάτωση τύπου Ι και ΙΙ, σύνδρομο σπιλώδους βασικοκυτταρικού καρκινώματος, Li- Fraumeni οικογενές σύνδρομο (κληρονομούμενες μεταλλάξεις του p53), σύνδρομα αδενωματώδους πολυποδίασης Οικογενειακό ιστορικό καρκίνων εγκεφάλου Πολυμορφισμοί καθοριστικοί : σε τρανσφεράσες γλουταθειόνης, Ν- ακετυλοτρανσφεράσης, ERCC1 και ERCC2, άλλα γονίδια μεταβολισμού καρκινογόνων, επιδιόρθωσης DNA, ελέγχου λειτουργίας του ανοσοποιητικού 35

Μεταλλαξιγόνος επίδραση της γ ακτινοβολίας στα λεμφοκύτταρα Ιστορικό προηγούμενων καρκίνων Λοιμώδεις παράγοντες ή ανοσολογική απάντηση : διάφοροι ιοί (κοινού κρυολογήματος, της ινφλουέντζας, VZV, ιός JC, άλλοι), Toxoplasma gondii Αλλεργίες Τράυμα κεφαλής Επιληψίες Φάρμακα Διαιτολόγιο και Βιταμίνες : παράγωγα των νιτρωδών (αμίδια, αμίνες, νιτρίτες), ασβέστιο Αλκοόλ και καπνός Ηλεκτρομαγνητικά πεδία αυξημένης έντασης Κινητή τηλεφωνία Βαφές μαλλιών και Spray Επαγγελματική έκθεση και βιομηχανία: παραγωγή συνθετικών γομολάστιχων, κατεργασία βινυλοχλωριδίων, πετρέλαια, και άλλα Ιοντίζουσα ακτινοβολία ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Οι ενδοκράνιοι όγκοι προκαλούν δυο βασικές κατηγορίες ενοχλημάτων συμπτωμάτων: α) αυτά τα οποία προέρχονται από αύξηση της ενδοκράνιας πίεσης (ICP) και β) τα εντοπισμένα συμπτώματα αναλόγως της ανατομικής περιοχής όπου βρίσκεται ο όγκος ή/και της απορρύθμισης των διαφόρων φυσιολογικών/ενδοκρινικών λειτουργιών. Κεφαλαλγία: είναι η πιο συχνή εκδήλωση των όγκων αυτών και αποτελεί το χειρότερο σύμπτωμα για τους ασθενείς. Ως προς τον χαρακτήρα είναι βύθιοι και μόνιμοι και περιστασιακά μπορεί να γίνουν σφύζοντες. Ο εγκέφαλος δεν είναι ευαίσθητος στην ανίχνευση και αίσθηση του πόνου. Η αίσθηση προέρχεται από την παρουσία αποφρακτικού 36

υδροκεφάλου ή από την προσβολή των μηνίγγων ή κάποιων ενδοκράνιων αγγείων. Ναυτία και Έμετοι: Η αυξομείωση της ενδοκράνιας πίεσης έχει καθοριστικό ρόλο ούτως ώστε μετά από ένα κομβικό σημείο μια παραμικρή αύξηση του αναπτυσσόμενου όγκου θα δώσει δυσανάλογα μεγάλη αύξηση στην πίεση με πιθανή ραγδαία επιδείνωση της κλινικής εικόνας του ασθενούς. Τότε είναι που οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί της ενδοκράνιας πίεσης κυρίως ο συνολικός ενδοκράνιος όγκος αίματος και η επιλεκτική μετακίνηση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού- παύουν να είναι λειτουργικοί με αποτέλεσμα να γίνονται εμφανή συμπτώματα όπως ναυτία, έμετοι, οπτικές διαταραχές (διπλωπία και οίδημα οπτικής θηλής) [24, 25]. Επιληπτικές Κρίσεις: μπορεί να είναι εστιακές ή γενικευμένες. Συνήθως είναι επαναλαμβανόμενες και χαρακτηριστικές στον κάθε ασθενή για τον τρόπο που ξεκινάνε είτε με εικόνα αύρας, είτε με συγκεκριμένο πρότυπο (π.χ. έντονη επιθυμία για ύπνο). Στην μετακριτική φάση μπορεί να προκαλέσουν απώλεια συνείδησης και αφασία εκπομπής ή ημιπάρεση (πάρεση τύπου Todd). Για κάποιον αδιευκρίνιστο λόγο είναι πιο συχνές (65%-95%) σε χαμηλού βαθμού κακοηθείας γλοιώματα και κυρίως στο ολιγοδενδρογλοίωμα, παρά στο γλοιοβλάστωμα. Αναλόγως την εντόπιση του όγκου στον εγκέφαλο, υπάρχουν διαφορετικές πιθανότητες να εμφανιστούν επιληπτικές κρίσεις στο άτομο, αυξημένος είναι ο κίνδυνος για τις εντοπίσεις σε βρεγματικό και κροταφικό λοβό [26, 27]. Συγκοπή: με την αύξηση της ενδοκράνιας πίεσης (intracranial pressure, ICP), ακόμη και εγκολεασμός του στελέχους του εγκεφάλου μπορεί να 37

προκληθεί με την μετάπτωση του ασθενούς σε κώμα ή/και θάνατο από την διακοπή των ζωτικών λειτουργιών της καρδιάς και του πνεύμονα. Προκαλώντας χειρισμό Valsava, είτε με βήχα, πταρμό ή έμετο, παροδικά αυξάνεται η ενδοθωρακική πίεση, μειώνεται η επιστροφή του αίματος μέσω των σφαγίτιδων φλεβών και ως αποτέλεσμα έχουμε παροδική αύξηση της ICP. Έπειτα μειώνεται η αιμάτωση του εγκεφάλου και έχουμε το συγκοπτικό επεισόδιο ως επακόλουθο. Αυτό που θα πρέπει να προσεχτεί είναι η διαφορά ανάμεσα στην επιληπτική κρίση και το συγκοπτικό επεσόδιο, που μπορεί να εμφανίζουν παρόμοια κλινική εικόνα με απώλεια της συνείδησης. Η αντιμετώπιση με ένα αντιεπιληπτικό σκεύασμα είναι η θεραπεία εκλογής στην πρώτη περίπτωση ενώ στην δεύτερη θα πρέπει, εκτός των άλλων, να ελαττωθεί η ενδοκράνια πίεση με αποιδηματική αγωγή ή/και με νευροχειρουργική παρέμβαση. Διαταραχές από την νοητική - γνωσιακή σφαίρα: σε ορισμένες περιπτώσεις αυτό που παρατηρείται- συνήθως από το οικείο περιβάλλονείναι η αλλαγή στην προσωπικότητα του ασθενούς, ή αλλαγή στο συναίσθημα αλλά ακόμη και προβλήματα μνήμης. Πολλές φορές μπορεί αυτά τα συμπτώματα να μην αξιολογηθούν λόγω της μη ειδικότητας τους [28]. Εστιακά συμπτώματα: αναλόγως της περιοχής εντόπισης του όγκου παρουσιάζονται σε διαφορετικό βαθμό ή και μεμονωμένα διάφορες αισθητικές διαταραχές (γραφαισθησία, στερεοαγνωσία κ.α.), γενικευμένη αδυναμία, αφασία εκπομπής ή/και διαταραχές των οπτικών πεδίων από 38

προσβολή κατά μήκος του οπτικού μονοπατιού, από το οπτικό χίασμα μέχρι και τον ινιακό λοβό [29]. Πίνακας 3: Συσχέτιση σημείων εντόπισης και συμπτωμάτων (ref). Εντόπιση Συμπτώματα Μετωπιαίος λοβός διαταραχές προσωπικότητας, απάθεια, άρση αναστολών, διαταραχή σχεδιασμού εκφραστική αφασία, ετερόπλευρη μυϊκή αδυναμία, επιληπτικές κρίσεις (τονικο-κλονικές) Κροταφικός λοβός απώλεια της λεκτικής ανάκλησης, απώλεια βραχείας μνήμης, σύνθετες εστιακές κρίσεις, ομώνυμη ημιανοψία ανώτερου τεταρτημορίου Βρεγματικός λοβός ετερόπλευρο αισθητηριακό έλλειμμα, σύνδρομα αφασίας, αφασία εκπομπής, σ. Gerstmann, αγραφία, αλεξία, ομώνυμη ημιανοψία ανώτερου τεταρτημορίου, αισθητηριακές επιληπτικές κρίσεις(αφαιρετικές) Ινιακός λοβός ετερόπλευρη ομώνυμη ημιανοψία, αλεξία, πρωσοποανωσία 39

ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Αναφορικά με την διάγνωση των γλοιοβλαστωμάτων, η απεικόνιση κατέχει σημαντική θέση τόσο για τον χαρακτηρισμό- περιγραφή της κακοήθειας όσο και για τον ακριβή εντοπισμό αυτής. Κλασσικά έχουν χρησιμοποιηθεί η αξονική τομογραφία (CT) και η μαγνητική τομογραφία (MRI). Η τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PET) έχει χρησιμοποιηθεί για να εκτιμηθεί ο μεταβολισμός των κυττάρων του εγκεφάλου σε ασθενείς με γλοιώματα. Ωστόσο, αυτό δεν έγινε αρχικά δυνατό με την κλασσική χρήση της φθοριοδεοξυγλυκόζης (FDG) λόγω του ότι ο συγκεκριμένος ιχνηθέτης έχει αυξημένη απορρόφηση από την φαιά ουσία. Ο ιχνηθέτης της μεθυλομεθειονίνης (MET) κατέστησε δυνατή τη απεικόνιση των γλοιωμάτων με το PET λόγω της αυξημένης έκφρασης μεταφορέων αμινοξέων των κακοήθων αυτών κυττάρων [30]. Τελευταίως, λόγω του μικρού χρόνου ημίσειας ζωής του MET (20 λεπτά) υπάρχει η τάση να αντικατασταθεί από τον ιχνηθέτη φθοροεθυλοτυροσίνη (FET), ο οποίος εμφανίζει μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής περί τα 110 λεπτά και χρησιμοποιείται όλο και συχνότερα διαγνωστικά και για θεραπευτικό προγραμματισμό [31]. 40

Πίνακας 4: απεικονιστικά ευρήματα και εντόπιση όγκων εγκεφάλου αναλόγως του τύπου του όγκου Τύπος Εντόπιση Απεικόνιση Πυκνότητα/Ενταση Σκιαγραφική Ενίσχυση Αστροκύτωμα Yπερσκηνιδιακή Ομοιογενής εστιακή ή διάχυτη Υπόπυκνη-Ισόπυκνη / Όχι low grade ασαφώς αφοριζόμενη μάζα στη λευκή μάζα / καθόλου ή πολύ μικρό οίδημα / Σπάνια κύστες Χαμηλής έντασης (Τ1) Αναπλαστικό αστροκύτωμα Εγκεφαλικά Ημισφαίρια Διηθητική, ασαφώς αφοριζόμενη κυρίως στην λευκή ουσία με μικρό ή μέτριο οίδημα Υπόπυκνη, ασαφώς αφοριζόμενη / ίσης ή χαμηλής έντασης (Τ1) Εστιακή ενίσχυση, διάχυτη ετερογενής / Δακτυλιοειδής ενίσχυση σε εξαλλαγή του σε γλοιοβλάστωμα Πλειόμορφο γλοιοβλάστωμα Υπερσκηνιδιακή κυρίως στη λευκή ουσία Δακτυλιοειδής, παχιά, ανώμαλη, περιφερική σκιαγραφική ενίσχυση με κεντρική νέκρωση και έντονο περιβάλλον οίδημα Ανομοιογενής ισο- ή υπόπυκνη μάζα με κεντρική ή υπόπυκνη νέκρωση Χαρακτηριστική δακτυλιοειδής, παχειά, ανώμαλη περιφερική σκιαγραφική ενίσχυση Πιλοκυτταρικό αστροκύτωμα Υποσκηνιδιακή Κυστική μάζα στην παρεγκεφαλίδα με τοιχωματικό όζο, Κυστική, υπόπυκνος όζος /Ίσης Έντονη σκιαγραφική ενίσχυση του όζου ο οποίος εμφανίζει σκιαγραφική ενίσχυση / με ή χωρίς οίδημα Χαμηλής έντασης ο όζος (Τ1) Ολιγοδενδρογλοίωμα Υπερσκηνιδιακή / υποφλοιώδη Μερικώς αποτιτανωμένη φλοιώδης / υποφλοιώδης εξεργασία σε μεσήλικες Ανομοιογενής με αποτιτανώσεις / Καθόλου έως ανομοιογενής ενίσχυση (50%) λευκή ουσία ασθενείς, με ή χωρίς κυστική εκφύλιση, σαφώς αφοριζόμενα, συνήθως χωρίς οίδημα ανομοιογενής ίσης χαμηλής έντασης (Τ1) Μεταστατικό Υπερσκηνιδιακή Διακριτές παρεγχυματικές μάζες σε λευκή και φαιά ουσία, μονήρες ή πολλαπλές, συνήθως συνοδευόμενες από έντονο οίδημα Ίσο- υπόπυκνες / ίσης χαμηλής έντασης (Τ1) Έντονη, εστιακή, οζώδης ή δακτυλιοειδής 41

ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΟΣ Λόγω του μεγάλου αριθμού των διαφορετικών ιστολογικών τύπων όγκων εγκεφάλου και των διαφορετικών στρατηγικών που ακολουθούνται αναλόγως βαθμού κακοήθειας και της βιολογικής συμπεριφοράς τους, δεν είναι εφικτό να αναλυθεί η θεραπεία του καθενός χωριστά. Γνωρίζουμε όμως ότι εξέχοντα ρόλο έχουν η χειρουργική αντιμετώπιση, η χημειοθεραπεία καθώς και η ακτινοθεραπεία, με διαφορετική σειρά - σημαντικότητα σε κάθε περίσταση. Επιλεκτικά αναφέρονται παρακάτω τα θεραπευτικά πρωτόκολλα που ακολουθούνται για τους όγκους των γλοιοβλαστωμάτων, στα οποία και μόνο θα γίνονται αναφορές εφεξής. Από τη στιγμή που από την ακτινολογική εικόνα υπάρχει μεγάλη υποψία για υψηλής κακοήθειας γλοίωμα, πρέπει ο ασθενής να υποβληθεί σε χειρουργική αντιμετώπιση του όγκου. Στόχος είναι να μειωθούν τα συμπτώματα από την πίεση (mass effect) και η πιθανή μετακίνηση της μέσης γραμμής, η αποτελεσματικότερη δράση των βοηθητικών - υποστηρικτικών θεραπειών καθώς και η λήψη ιστού για την τεκμηρίωση της ιστοπαθολογικής ταυτότητας του όγκου [32]. Παλαιότερες προσπάθειες με χημειοθεραπευτικά σχήματα όπως προκαρβαζίνη, λομουστίνη και βινκριστίνη αν και έδειξαν αξιόλογη αποτελεσματικότητα στο PFS απέτυχαν να βελτιώσουν την ολική επιβίωση των ασθενών τόσο σε ασθενείς με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα όσο και σε ασθενείς με αναπλαστικά γλοιώματα [33]. 42

Με βάση τα τελευταία δεδομένα μέχρι και σήμερα, η ευρέως αποδεκτή στρατηγική αντιμετώπισης ενός νεοδιαγνωσθέντος ασθενούς με γλοιοβλάστωμα είναι το θεραπετικό πρωτόκολλο του Stupp et al. (2005) το οποίο ουσιαστικά προέρχεται από μια μελέτη φάσης ΙΙΙ σε 573 ασθενείς με γλοιοβλάστωμα, στην οποία διαπιστώθηκε σημαντική βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών στην διετία και την πενταετία. Συνεπώς, αρχικά επιδιώκεται η μέγιστη δυνατή χειρουργική εκτομή, με διατήρηση των νευρολογικών λειτουργιών η οποία ακολουθείται από χημειοθεραπεία με τεμοζολομίδη (ΤΜΖ) και ακτινοθεραπεία ταυτόχρονα. Η καθιερωμένη δοσολογία της ΤΜΖ είναι 75mg/m 2 ανά ημέρα σε καθημερινή βάση ταυτόχρονα με την ακτινοβόληση και έπειτα το σχήμα διαμορφώνεται σε 150-200mg/m 2 ανά ημέρα, για 5 ημέρες επαναλαμβανόμενο κάθε 28 ημέρες και για συνολικό διάστημα 6 κύκλων (μηνών). Η ακτινοθεραπεία περιλαμβάνει τμηματική λήψη 60 Gy σε πενθήμερο πρόγραμμα 6 εβδομάδων (συνολικά 30 συνεδρίες). Η δράση της τεμοζολομίδης είναι γενικά καλά ανεκτή σε αυτή τη συγκέντρωση με πιο συχνές ανεπιθύμητες ενέργειες για τους ασθενείς μυελοτοξικότητα, θρομβοεμβολικά επεισόδια, εξάντληση, ναυτία, έμετο, εξάνθημα, αρθραλγίες και δυσκοιλιότητα [34]. Σε ασθενείς οι οποίοι υποβάλλονται σε χειρουργείο εκ νέου για υποτροπή (relapse) της νόσου γίνεται τοποθέτηση-εντός της κοιλότητας του όγκου-βιοδιασπώμενων σωματιδίων (wafers) καρμουστίνης, τα οποία έχουν ως βάση τη νιτροζουρία. Η δράση αυτών ξεκινά άμεσα μετά από τη χειρουργική επέμβαση και διαρκεί για αρκετές εβδομάδες. Έχει διαπιστωθεί ότι αυτή η θεραπυτική μέθοδος βελτιώνει σε σημαντικό βαθμό την επιβίωση 43

των ασθενών. Συγκεκριμένα η εξάμηνη επιβίωση ανέρχεται σε 64% έναντι 44% σε ασθενείς που ελάμβαναν placebo [35]. Τα τελευταία 10-15 έτη έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για να ανευρεθούν νέα μόρια στη θεραπευτική των όγκων του ΚΝΣ και συγκεκριμένα του γλοιοβλαστώματος. Στόχοι των θεραπευτικών προσεγίσεων είναι η διαδικασία της αγγειογένεσης του όγκου, οι διάφοροι ανοσολογικοί μηχανισμοί και τα αρχικά κύτταρα της καρκινογένεσης, ενώ ακόμη και γονιδιακές θεραπείες έχουν διερευνηθεί για την αντιμετώπιση αυτών των όγκων. Αξίζει να αναφέρουμε ότι πολλά υποσχόμενα μόρια είναι οι αναστολείς των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι θεωρητικά στοχεύουν στην «πηγή του κακού», τα μοριακά μονοπάτια που καθορίζουν τον πολλαπλασιασμό (proliferation), την μετανάστευση (migration) και την αποφυγή της απόπτωσης (evasion of apoptosis). Αυτά τα μόρια, έχουν επιφέρει επανάσταση στη μοριακή βιολογία για την εκλεκτικότητα της δράσης τους, την ικανότητα τους να λαμβάνονται από του στόματος, ενώ εμφανίζουν πρακτικά ηπιότερες ανεπιθύμητες ενέργειες συγκριτικά με την κλασσική συμβατική χημειοθεραπεία. Από την έρευνα, έχουν προκύψει διάφορα μόρια με ικανότητα απευθείας αναστολής των υποδοχέων τυροσινικής κινάσης αλλά και αντισώματα για να αναστείλουν την δράση των μονοπατιών με στόχευση των προσδετών των υποδοχέων. Ένα από αυτά τα αντισώματα, το Bevacizumab (Avastin)- μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του VEGF - έχει πάρει έγκριση μόνο στις ΗΠΑ από τον FDA, σχετικά προσφάτως (Μάιος 2009) για την αντιμετώπιση της υποτροπής των γλοιοβλαστωμάτων, είτε μόνο του, είτε σε συνδυασμό με 44

χημειοθεραπεία. Από διάφορες κλινικές μελέτες φάσης ΙΙ εμφανίζεται βελτίωση της επιβίωσης σε ασθενείς που έλαβαν το αντίσωμα μόνο του ή σε συνδυασμό με ιρινοτεκάνη ή τεμοζολομίδη. Η συνολική επιβίωση αυξήθηκε κατά 9 περίπου μήνες σε σχέση με τους ασθενείς που ελάμβαναν την κλασσική χημειοθεραπεία (control), ενώ αναδείχτηκε μια τάση μείωσης της δόσης των στεροειδών για τη θεραπεία του οιδήματος. Δεν έλλειπαν βεβαίως οι παρενέργειες όπως εν τω βάθει φλεβοθρόμβωση, πνευμονική εμβολή, ισχαιμικά αγγειακά επεισόδια και αιμορραγία εντός των όγκων [36, 37]. Ωστόσο, οι έρευνες αποδεικνύουν πως εμφανίζεται καλύτερη ανταπόκριση σε συγκεκριμένες ομάδες ασθενών με γλοιοβλάστωμα, όπως σε αυτούς που τα νεοπλασματικά κύτταρα έχουν αυξημένη δραστηριότητα στα μονοπάτια Ras/MAPK και PI3K/AKT/mTOR [38]. Έτσι αναδύεται η ανάγκη για σχεδίαση στοχευμένων θεραπειών εξατομικευμένων ειδικά για κάθε ασθενή, με βάση το μοριακό προφίλ των όγκων. Επιπλέον, αν ανατρέξει κανείς στη βιβλιογραφία της τελευταίας δεκαετίας, θα παρατηρήσει τη συνεχή ανακάλυψη και διερεύνηση μορίων αναστολέων με διαφορετική δράση και στόχευση. Αναστολείς κινάσης τυροσίνης (erlotinib, gefitinib, imatinib, vatalanib, sunitinib, pazopanib, lapatinib, sunitinib), αναστολείς μεταβίβασης σήματος σε ενδοκυττάριο επίπεδο (everolimus, sirolimus, enzastaurin), αναστολείς ιντεγκρινών (cilengitide), ακόμη και αναστολείς τροποποιητών πρωτεϊνών (tipifarnib, lonafarnib), έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές προκλινικές μελέτες in vitro αλλά και in vivo, ενώ σταδιακά εξετάζεται η δράση τους είτε ως μονοθεραπείες ή/και σε συνδυασμό μεταξύ τους καθώς και ταυτόχρονα με 45

ακτινοθεραπεία ή/και τεμοζολομίδη, σε μελέτες φάσης Ι, ΙΙ και ΙΙΙ, με ποικίλα αποτελέσματα [39]. Σχήμα 4: τα σηματοδοτικά μονοπάτια των αυξητικών παραγόντων και η αναστολή αυτών από συγκεκριμένους παράγοντες [40] Η τάση είναι τα νέα μόρια που κατασκευάζονται, να έχουν πολλαπλούς μοριακούς στόχους, όπως οι αναστολείς πολλαπλών κινασών τυροσίνης (multi-targeted receptor tyrosine kinases inhibitors, multi-rtkis). Όπως καθίσταται σαφές και παρακάτω, στην μοριακή βιολογία των γλοιοβλαστωμάτων, η βάση των παρατηρούμενων αλλαγών μεταλλάξεων είναι οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων οι οποίοι ενεργοποιούνται 46

συνεχώς και μεταβιβάζουν σήματα ανάπτυξης και μετανάστευσης. Τα ενδοκυττάρια μόρια των μονοπατιών, αν και εμφανίζουν μεταλλάξεις που τους επιτρέπουν να ενεργοποιούνται αυτόματα, ελάχιστα συνεισφέρουν στον κακοήθη φαινότυπο, σε σχέση με τους υποδοχείς. Ενδεικτικά αναφέρουμε 2 multi-rtkis, το lapatinib και το sunitinib, οι οποίοι και χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα. Η επιλογή τους έγινε λόγω της ευρείας δράσης τους και λόγω του γεγονότος ότι ο συνδυασμός τους αναστέλει ταυτόχρονα 3 οικογένειες υποδοχέων αυξητικών παραγόντων: τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, VEGFR) και τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των αιμοπεταλίων (Platelet-Derived Growth Factor Receptor, PDGFR) με σημαντική θέση στο γλοιοβλάστωμα. Lapatinib (Λαπατινίμπη) Το lapatinib (Τykerb/Tyverb, GW572016) είναι ένας αναστολέας κινάσης τυροσίνης με διπλή δράση έναντι του EGFR (ErbB1) αλλά και του HER2/neu (ErbB2). Αναλυτικότερα, ο μηχανισμός δράσης του είναι μέσω της αντιστρεπτής αναστολής των δυο ανωτέρω υποδοχέων - με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα έναντι του ErbB1- όπου δρα ανταγωνιστικά αναστέλλοντας την πρόσδεση του ATP στην ενδοκυττάρια περιοχή του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης στην ειδική θέσης πρόσδεσης για το μόριο του ATP.[41] 47

Έχει πάρει έγκριση για την θεραπεία του θετικού για την έκφραση του υποδοχέα HER2 καρκίνου του μαστού, είτε ως μονοθεραπεία, είτε σε συνδυασμό με καπεσιταμπίνη. Παρόλα αυτά, η χρησιμοποίησή του σε μελέτες φάσης Ι/ΙΙ σε ασθενείς με υποτροπή γλοιοβλαστώματος (GBM) απέτυχαν να δείξουν ιδιαίτερη αποτελεσματικότητα, ανεξαρτήτως της παρουσίας του μεταλλαγμένου EGFRvIII ή την κατάσταση του PTEN [42]. Σύμφωνα με τον οργανισμό κλινικών δοκιμών, (clinical trials gov), έχουν ήδη ολοκληρωθεί 2 μελέτες φάσης Ι/ΙΙ σε ασθενείς με υποτροπή γλοιοβλαστώματος, με χρήση του φαρμάκου ως μονοθεραπεία (φάσης Ι) αλλά και σε συνδυασμό με χειρουργείο, με προεγχειρητική και μετεγχειρητική χορήγησή του (φάσης Ι/ΙΙ). Τα αποτελέσματά τους αναμένονται, ενώ υπάρχει ήδη μια μελέτη πρώτης γραμμής σε εξέλιξη, με τη χορήγηση του φαρμάκου σε συνδυασμό τεμοζολομίδη και ακτινοθεραπεία. Sunitinib (Σουνιτινίμπη) Το Sunitinib malate (Sutent, SU11248) είναι ένα από του στόματος μικρό μόριο- αναστολέας των υποδοχέων VEGFR1-3, PDGFRa-b, c-kit, Flt3, και RET [43]. Έχει πάρει έγκριση από τον FDA και χρησιμοποιείται ως πρώτης γραμμής θεραπεία για τον καρκίνο του νεφρού καθώς και για τον ανθεκτικό στο imatinib στρωματικό όγκο του γαστρεντερικού (GIST). Σε μια σχετικά πρόσφατη μελέτη φάσης ΙΙ, το sunitinib απέτυχε να επιδείξει κλινική αποτελεσματικότητα ως μονοθεραπεία σε ασθενείς με υποτροπή γλοιοβλαστώματος με μεταλλαγμένο γονίδιο MGMT, ενώ ταυτόχρονα 48

παρουσίασε και σημαντική τοξικότητα [44]. Αν και σε μια μικρή υποομάδα ασθενών διαπιστώθηκε να επηρεάζεται η αγγείωση του γλοιώματος, δεν αποδείχτηκε αντικειμενική βελτίωση της αιματικής ροής και του όγκου εντός της βλάβης σε σύγκριση με τον φυσιολογικό εγκέφαλο. Υπάρχουν 9 κλινικές μελέτες φάσης Ι/ΙΙ από τις οποίες κάποιες έχουν ολοκληρωθεί και περιμένουμε αποτελέσματα, ενώ κάποιες τερματίστηκαν πρόωρα. Σε αυτές το sunitinib έχει χρησιμοποιηθεί είτε ως μονοθεραπεία είτε σε συνδυασμό με άλλους αντιαγγειογενετικούς παράγοντες για την αντιμετώπιση υποτροπών (κυρίως) του γλοιοβλαστώματος. Τέλος, σε εξέλιξη είναι μια τελευταία μελέτη φάσης ΙΙ με συνδυασμό της σουνιτινίμπης και της σιλενγιτίδης (Cilengitide), ενός πολλά υποσχόμενου μορίου που αναστέλει τη δράση των ιντεγκρινών. ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΩΝ Θεωρίες και παρατηρήσεις στο γλοιοβλάστωμα Η νεοπλασία προκύπτει ως αποτέλεσμα μιας διαδικασίας που αποτελείται από πολλαπλά «βήματα». Κάθε βήμα αντανακλά μια γενετική μεταβολή που σταδιακά μπορεί να οδηγήσει το φυσιολογικό κύτταρο σε κακοήθη εξαλλαγή. Διέπεται από 6 βασικές αρχές: Αυτονομία στα σήματα ανάπτυξης Απευαισθητοποίηση των ανασταλτικών σημάτων ανάπτυξης Αποφυγή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου Ασταμάτητος πολλαπλασιασμός 49

Επαγόμενη αγγειογένεση Εισχώρηση σε παρακείμενους ιστούς. Αυτά είναι ήδη γνωστά για περισσότερο από μία δεκαετία. Ωστόσο πρόσφατα προτάθηκε η προσθήκη δύο επιπλέον αξιωμάτων: Μεταβολικές αλλαγές των κυττάρων για να υποστηρίξουν την ανάπτυξη της νεοπλασίας Ικανότητα των καρκινικών κυττάρων αποφυγής της καταστροφής τους από τους ανοσοποιητικούς μηχανισμούς [45] Υπάρχει μεγάλη πιθανότητα η γενετική αστάθεια των καρκινικών κυττάρων να ευοδώνεται από την παρουσία ενός μικροπεριβάλλοντος με φλεγμονώδη χαρακτήρα και ταυτόχρονα τα ίδια κακοήθη κύτταρα να προωθούν τη δημιουργία ενός τέτοιου φλεγμονώδους περιβάλλοντος από επιθηλιακά και στρωματικά κύτταρα, τα οποία συνήθως εμφανίζουν καρκινικές αλλαγές στο γενετικό τους υλικό. Πρωτοπαθή vs δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα Έχει διαπιστωθεί ότι τα γλοιοβλαστώματα μπορεί να είναι πρωτοπαθή, δηλαδή να εμφανίζονται de novo - χωρίς κλινική, ακτινολογική ή μορφολογική απόδειξη κάποιας προϋπάρχουσας ηπιότερης μορφής κακοήθειας - ή ως δευτεροπαθή, ακολουθώντας μια συγκεκριμένη πορεία από διαδοχικές αλλοιώσεις σε γενετικό επίπεδο με μετάλλαξη γονιδίων ή/και διαγραφές/προσθήκες διαφόρων χρωμοσωμάτων. Τα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα έχουν την τάση να εμφανίζονται σε ηλικιωμένους ασθενείς και εμφανίζουν υπερέκφραση του EGFR, μεταλλάξεις του PTEN και 50

απαλοιφή του γονιδίου της κινάσης CDKN2A (p16). Αντίστοιχα, στα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα, οι μεταλλάξεις του p53 είναι οι πιο πρώιμα εντοπιζόμενες αλλαγές, με μεγαλύτερη επίπτωση αυτών σε πιο νέους ασθενείς. Επίσης συχνές είναι και οι μεταλλάξεις του γονιδίου της ισοκιτρικής δευδρογενάσης IDH-1 και IDH-2 [46]. Μακροσκοπικά αυτά δεν εμφανίζουνιστοπαθολογικές διαφορές, ενώ ταυτόχρονα εμφανίζουν τον ίδιο κακοήθη φαινότυπο με διήθηση των παρακείμενων δομών, αποφυγή της απόπτωσης και διαρκή πολλαπλασιασμό. Αν αναλυθούν όμως σε μοριακό επίπεδο με την βοήθεια των microarrays, το μοριακό προφίλ των μεταγραφικών προϊόντων τους διαφέρει σε μεγάλο βαθμό μέσω της έκφρασης διαφορετικών mrnas. Το ίδιο προκύπτει και από την ανάλυση του αριθμού των αντιγράφων (CNAs) ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων, τα οποία εξαρτώνται πρωτίστως από τις μεταθέσεις χρωμοσωμάτων. Ορισμένα γονίδια εκφράζονται σε διαφορετικό βαθμό ή/και αποσιωπούνται, δίνοντας με αυτόν τον τρόπο την δυνατότητα της επιπλέον κατηγοριοποίησής τους σε προνευρικού τύπου (έκφραση γονιδίων για ανάπτυξη νευρικών κυττάρων), μεσεγχυματικού τύπου (γονίδια που απαντούν στα σήματα της εξωκυτταρίου ουσίας) και πολλαπλασιαστικού τύπου (γονίδια που εξυπηρετούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [47]. Εκτεταμένες αναλύσεις σε γενετικό επίπεδο από τα γλοιοβλαστώματα, δείχνουν ότι οι απώλειες του γενετικού υλικού είναι «διασκορπισμένες» κατά μήκος ολόκληρου του γονιδιώματος και επηρεάζουν σχεδόν όλα τα χρωμοσώματα σε συχνότητες που κυμαίνονται από 2% μέχρι και 80%. Ιδιαίτερα συχνές απωλεσθείσες περιοχές είναι οι εξής: 1p, 6q, 9p, 10p, 10q, 13q, 14q, 15q, 17p, 18q, 19q, 22q και το χρωμόσωμα Y [48]. 51

Σχήμα 5: Διαφορές στην μοριακή βιολογία ανάμεσα σε πρωτοπαθούς (de novo) και δευτεροπαθούς προέλευσης γλοιοβλαστώματα. Τα mirnas στην ογκογένεση των γλοιοβλαστωμάτων Στην προσπάθεια επεξήγησης αυτού του φαινομένου της διαφορετικής «ποσοτικής» έκφρασης των γονιδίων οι έρευνες έχουν στραφεί σε ορισμένες επιγενετικές μεταβολές που λαμβάνουν χώρα: η μεθυλίωση του DNA, οι τροποποιήσεις των ιστονών και η έκφραση των micrornas (mirnas) έχουν σημαίνοντα ρόλο με το τελευταίο να αποτελεί πεδίο εντατικής μελέτης στην έρευνα κατά του καρκίνου [49]. Tα mirnas είναι RNAs που αποτελούνται από μικρό αριθμό νουκλεοτιδίων (περιπου 20-22 βάσεις) τα οποία δεν μεταφράζονται σε τελικό προϊόν (πρωτεΐνη) αλλά συνδέονται σε διάφορα mrnas (για τα οποία είναι ειδικά και στα οποία συνδέονται) και αναστέλλουν παροδικά τη μετάφραση ή μόνιμα με τον κατακερματισμόαποσύνθεση των μεταγράφων [50]. Στο γλοιοβλάστωμα έχουν βρεθεί μεγάλη ποικιλία mirnas τα οποία είναι αυξημένα σε αριθμό σε σχέση με τα 52

φυσιολογικά νευρικά κύτταρα όπως το mir-21 όπου έχει συσχετιστεί με τον TGF-β, τον NF-kB, τα γονίδια του EGFR και το p53. Ταυτόχρονα σε κακοήθη γλοιώματα, έχουν βρεθεί σταθερά μειωμένα ορισμένα mirnas όπως τα mir-124, mir-137 και mir-451, τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες αυξάνονται παροδικά και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου επάγοντας τη διαφοροποίησή του. Υπάρχουν πολλές μελέτες σε κυτταρικές σειρές με ενθαρρυντικά αποτελέσματα, που αφορούν στην έρευνα των mirnas ταυτόχρονα/μετά από ακτινοβόληση γλοιοβλαστωμάτων καθώς και με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, ενώ πολλές άλλες αναμένονται τα επόμενα έτη [51]. Η θεωρία του cancer stem cell Οι δύο παραπάνω διαφορετικοί «δρόμοι» των γλοιοβλαστωμάτων, είτε με τον ένα, είτε με τον άλλο τρόπο συμπεριφέρονται ως μια ενιαία κλινική οντότητα με παρόμοιο μέσο όρο επιβίωσης για τους ασθενείς - γεγονός που αντανακλά παρόμοιους ρυθμούς ανάπτυξης και επέκτασης της νεοπλασίας- καθώς και ίδια αντίσταση σε όλες τις υπάρχουσες θεραπευτικές μεθόδους. Η επιστημονική κοινότητα προκειμένου να εξηγήσει αυτά τα δεδομένα οδηγήθηκε στην αναζήτηση του αρχικού κυττάρου (cell of origin) που μεταλλάσσεται και «πυροδοτεί» την ογκογένεση. Έχει αποδειχτεί η παρουσία συγκεκριμένων κυττάρων, τα οποία μοιάζουν με αρχέγονα ή προγονικά νεοπλασματικά κύτταρα (stem like cancer cells) και εμφανίζουν την δυναμική να διαφοροποιούνται και να δίνουν γένεση σε διαφορετικούς πληθυσμούς νευρικών κυττάρων. Η συγκεκριμένη παραδοχή του αρχικού κυττάρου προέλευσης (cell of origin) των γλοιοβλαστωμάτων προέρχεται από παρατηρήσεις σε μεικτά 53

ολιγοαστροκυττώματα όπου ιστολογικά εμφάνιζαν δύο τύπους κυττάρων με διαφορετική μορφολογία αλλά το γενετικό προφίλ τους ήταν παρόμοιο με απώλεια της ετεροζυγοτίας των 1p και 19q [52]. Ταυτόχρονα, το γεγονός ότι από κυτταροκαλλιέργειες αρχέγονων νευρικών κυττάρων- κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες- μπορούν να προκύψουν αστροκύτταρα αλλά ταυτόχρονα και κύτταρα λείων μυϊκών ινών [53], δίνουν την εντύπωση ότι υπάρχουν πολυδύναμα αρχέγονα νευρικά κύτταρα ή προγονικά γλοιωματικά κύτταρα (CSCs) τα οποία μπορούν να μεταλλάσσονται και να παρουσιάζουν καρκινικό φαινότυπο [54]. Τα εν λόγω κύτταρα εντοπίζονται πρωτίστως στον οδοντωτό γύρο του ιππόκαμπου και στην ζώνη κάτω από τις πλάγιες κοιλίες [55]. Σε βασική έρευνα με ποντίκια έχει διαπιστωθεί ότι μία μετάλλαξη ή απάντηση σε εξωκυττάρια χημειοτακτικά ερεθίσματα είναι ικανή να προκαλέσειει μετακίνηση των προγονικών κυττάρων σε περιοχές απομακρυσμένες εντός του εγκέφαλου (φλοιός, ραβδωτό σώμα κ.α.) και από εκεί μπορούν να αποκτήσουν επιπλέον γενετικές μεταλλάξεις μέχρι την πλήρη κακοήθη εξαλλαγή [56]. Από πολλές μελέτες σε γλοιοβλαστώματα έχει διαπιστωθεί ότι τα κύτταρα που «οδηγούν» τον καρκίνο εμφανίζουν συγκεκριμένους επιτόπους επιφανείας με πιο χαρακτηριστικό την πρωτεΐνη CD133 (nestin) η οποία έχει βρεθεί σε πολλά προγονικά κύτταρα και πρωτίστως σε αυτά του αίματος [57]. Αυτός ο μοριακός κυτταρικός δείκτης είναι απαραίτητος γιατί προσδίδει ορισμένα βασικά χαρακτηριστικά στα CSCs: την ικανότητα να δίνουν γένεση στον όγκο και να τον διατηρούν, να οργανώνουν τη μετάσταση και να προκαλούν την αντίσταση στη θεραπεία. Αν αποσιωπηθεί η έκφραση του CD133, τότε επηρεάζεται η ικανότητα της 54

αυτό-ανανέωσης και της ογκογένεσης των γλοιοβλαστωματικών προγονικών κυττάρων. Ταυτόχρονα, ενώ παλαιότερα θεωρούσαν ότι ο επίτοπος CD133 εντοπίζεται μόνο στην εξωκυττάρια μεμβράνη αυτών των κυττάρων, πλέον έχει βρεθεί ότι απαντάται σε μεγάλη συγκέντρωση και στο κυτταρόπλασμα με την ικανότητα να αναδύεται στην εξωκυττάρια μεμβράνη αλλά και να αποκρύπτεται από αυτήν με αποτέλεσμα να καθίσταται αναποτελεσματική οποιαδήποτε θεραπεία στοχεύει στην μεμβρανική πρωτεΐνη CD133 [58]. Τέλος, θεωρείται ότι τα CSCs ενορχηστρώνουν την πλαισίωση του όγκου από ενδοθηλιακά κύτταρα και την οργάνωση του αγγειακού δικτύου, με το οποίο δημιουργούν ένα μικροπεριβάλλον και εκφράζουν τον πλήρη κακοήθη φαινότυπό τους. Τα υποστηρικτικά κύτταρα του όγκου και τα κύτταρα του στρώματος «προσλαμβάνονται» από τα CSCs προκειμένου να διαμορφώσουν ένα ανοσοκατασταλτικό περιβάλλον και να αναστείλουν οποιαδήποτε ανοσιακή απάντηση που θα οδηγούσε σε απόρριψη του όγκου [59]. Ανοσολογικοί μηχανισμοί στο γλοιοβλάστωμα Ενώ το ΚΝΣ δεν είναι αυστηρώς «απαραβίαστο» από το ανοσολογικό σύστημα, ωστόσο εμφανίζει μια ανοσολογική αδράνεια λόγω του μικρού αριθμού των κυκλοφορούντων αντιγονοπαρουσιατικών κυττάρων (APCs Antigen Presenting Cells) και της έλλειψης ενός οργανωμένου λεμφικού συστήματος. Ταυτόχρονα ένα είδος προστατευτικού - για το γλοιοβλάστωμα - μηχανισμού προσδίδει και ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός (BBB) [60]. Τα Τ-λεμφοκύτταρα του οργανισμού μπορούν να ανιχνεύσουν αντιγόνα που προέρχονται από έναν όγκο του ΚΝΣ. Έχουν βρεθεί πολλά 55

τέτοια καρκινικά αντιγόνα στο γλοιοβλάστωμα όπως τα WT1, MUC1, LMP2, HPV E6/E7, HER2/Neu, EGFRviii, MAGE A3 και NY-ESO-1, τα οποία ταυτόχρονα έχουν και ανοσολογική σημασία/ρόλο [61]. Όμως τα καρκινικά κύτταρα εφευρίσκουν μηχανισμούς αποφυγής του φυσικού ανοσιακού μηχανισμού με διάφορους τρόπους [62]. Συγκεριμένα, τα κύτταρα γλοιοβλαστώματος μπορούν να επηρεάζουν τον αντιγονοπαρουσιαστικό μηχανισμό με διαρκή εξαλλαγή των καρκινικών αντιγόνων. Επίσης μπορούν να επιδεικνύουν ανοσοκατασταλτική δραστηριότητα με αναστολή της κυτταρικής διαμεσολαβούμενης ανοσίας, λεμφοπενία, μειωμένη παραγωγή αντισωμάτων, ελαττωμένη ανταπόκριση των λεμφοκυττάρων στα ερεθίσματα και άλλα. Πολλές σύνθετες διαντιδράσεις μεταξύ των γλοιωματικών κυττάρων και του ανοσοποιητικού διαμεσολαβούνται από ανασταλτικές κυτταροκίνες των πρώτων όπως IL-6, IL-8, TGFβ-2, PGE2 και VEGF [63]. Πολλά ενδοκυττάρια μονοπάτια έχουν ενοχοποιηθεί, όμως κυρίαρχο ρόλο παίζει η διαρκής ενεργοποίηση του STAT3 (Signal Transducer and Activator), η αναστολή του οποίου θα μπορούσε να αναστείλει την επαγόμενη ανοσοκατασταλτική κατάσταση του γλοιοβλαστώματος [64]. Τα τελευταία χρόνια έχει προταθεί ένας νέος μηχανισμός με την συμμετοχή των μονοκυττάρων. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα του γλοιοβλαστώματος, προσελκύουν φυσιολογικά μονοκύτταρα τα οποία και «ενεργοποιούν» δια μέσου της άμεσης επαφής μαζί τους, και εν συνεχεία τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα εκκρίνουν διάφορους ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες (IL- 10, TGF-β, B7-H1), οι οποίοι μειώνουν την φαγοκυτταρική ικανότητα των Τ κυττάρων και μπορεί να τα οδηγήσουν σε απόπτωση [65]. 56

Ο ρόλος της αγγειογένεσης Επιθετικοί όγκοι όπως το γλοιοβλάστωμα προϋποθέτουν την ανάπτυξη του δικού τους αγγειακού δικτύου που θα τους εξασφαλίσει την παροχή οξυγόνου και θρεπτικών στοιχείων, αλλά και θα υποστηρίξει επιλεκτικά την επιβίωση του CSC. Τα κύτταρα του γλοιοβλαστώματος περιβρογχίζουν τα αγγεία του εγκεφάλου για να αναπτυχθούν, ενώ τα κύτταρα που αναπτύσσονται κυκλικά του αρχικού κυττάρου, όταν ξεπεράσουν την απόσταση των 100-200 μm από ένα αγγείο καθίστανται υποξικά [66, 67]. Η αγγειογένεση πραγματώνεται με διάφορους μηχανισμούς, με την δημιουργία νέων αγγείων που προεκτείνονται εν συνεχεία των φυσιολογικών αγγείων [68], με την επιστράτευση προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από τον μυελό των οστών [69], ακόμη και με την ενσωμάτωση καρκινικών κυττάρων στο τοίχωμα των αγγείων ή και με την διαφοροποίηση των καρκινικών CSCs απευθείας σε ενδοθηλιακά κύτταρα [70], αν και για τα τελευταία υπάρχει διχογνωμία σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες [71]. Σημαντικός και προεξάρχων είναι ο ρόλος των ενδοθηλιακών κυττάρων (Endothelial Cells - ECs). Τα συγκεκριμένα κύτταρα, όταν συσχετίζονται με το γλοιοβλάστωμα, μεταναστεύουν με πιο γρήγορους ρυθμούς σε σχέση με τα φυσιολογικά, ενώ εκκρίνουν σε μεγάλο βαθμό endothelin-1, interleukin-8 και VEGF [72]. Η διεργασία της «παραγωγής» νέων αγγείων είναι αποτέλεσμα δύο διαφορετικών τάσεων μεταξύ προαγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων (σχήμα 4). Στη νεοπλασία η τάση που υπερισχύει είναι αυτή των προαγγειογενετικών παραγόντων, με τους VEGF, PDGF και bfgf αυξητικούς παράγοντες. Ο VEGF είναι το βασικό «μόριο- 57

παίκτης», όπου ασκεί την δράση του με την πρόσδεση του στον υποδοχέα VEGFR-2 των ECs, ενώ εκκρίνεται ως «αντίδραση» στην υποξία κυρίως μέσω του μονοπατιού του HIF-1 (hypoxia-inducible transcription factor) [73]. Κατά τη διαδικασία της αγγειογένεσης, αρχικά γίνεται κατακερματισμός της βασικής μεμβράνης των αγγείων και της εξωκυτταρίου θεμέλιας ουσίας και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά μήκος των χημειοτακτικών ερεθισμάτων των καρκινικών κυττάρων. Αυτό γίνεται με την απάντηση των ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων στο κάλεσμα για μετανάστευση και επιβίωση, με την έκφραση μορίων που συμβάλλουν στην προσκόλληση και κινητοποίησή τους. Ταυτόχρονα, μεσεγχυματικά κύτταρα εκκρίνουν αγγειοποιητιίνη I η οποία προσδένεται στον υποδοχέα Tie-2 και επάγει περεταίρω την αγγειογένεση. Επιπλέον, τα ECs εκκρίνουν και τον παράγοντα PDGF ο οποίος επιστρατεύει περικύτταρα για τη δημιουργία μιας νέας βασικής μεμβράνης [74]. Τα νέα αγγεία της νεοπλασίας που προκύπτουν με την προηγούμενη διαδικασία, εμφανίζουν μεγάλες ιστολογικές διαφορές σε σχέση με την κανονική αγγείωση του οργανισμού: είναι στρεβλωμένα και αποδιοργανωμένα με ελικοειδή πορεία, ενώ είναι διατεταμένα και εμφανίζουν διαρροές από παντού με συχνά αιμορραγικό περιεχόμενο [75, 76]. Έχει αποδειχτεί ότι αυτά τα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν (ή εμφανίζουν μειωμένη έκφραση) ορισμένα μόρια -επιτόπους όπως την CD34 και CD144 τα οποία είναι μόρια προσκόλλησης (καντχερίνες). Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη CD144 είναι απαραίτητη για τη συνοχή του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και τη δημιουργία διακλαδώσεων στα αγγεία. Οποιαδήποτε μεταβολή στην έκφρασή της, συμβάλλει στην 58

αυξημένη διαπερατότητα των αγγείων, γεγονός που αιτιολογεί την παρουσία οιδήματος ή/και αιμορραγίας στο γλοιοβλάστωμα [77, 78]. Α Β Σχημα 6: Α. αγγειογένεση Β. αγγειογενετικοί παράγοντες 59

ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Η απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου Ο κυτταρικός κύκλος του ευκαρυωτικού κυττάρου αποτελείται από 4 ξεχωριστές φάσεις: την G1, την S όπου γίνεται σύνθεση του DNA, τη φάση G2, και την M όπου γίνεται η μίτωση με την παραγωγή 2 νέων θυγατρικών κυττάρων. Η ρύθμιση του γίνεται μέσω του συμπλέγματος κυκλινών (cyclin)- κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CDKs). Οι κυκλίνες αποτελούν τη ρυθμιστική υπομονάδα, ενώ οι CDKs εμπεριέχουν την καταλυτική υπομονάδα ενός ενεργοποιημένου ετεροδιμερούς συμπλέγματος με δράση κινάσης. Σε απουσία των κυκλινών, οι CDKs είναι αδρανείς. Όταν τα κύτταρα λάβουν προμιτωτικά εξωκυττάρια μηνύματα, το σύμπλοκο ενεργοποιείται και καταλύει την φωσφορυλίωση διαφόρων πρωτεϊνών που διαμεσολαβούν στο συντονισμό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [79]. Το γονίδιο και οι μεταλλάξεις του ρετινοβλαστώματος και του TP53 Οι βασικές πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο είναι το ρετινοβλάστωμα (RB) και το p53 (πρώην TP53). Η φωσφορυλίωση του γονιδίου του RB από το σύμπλεγμα CDK4/6 Cyclin D1 οδηγεί σε έκφραση μεταγραφικών παραγόντων όπως του E2F, οι οποίοι ενεργοποιούν γονίδια απαραίτητα για την μετάβαση του κυτταρικού κύκλου πέρα από το σημείο ελέγχου της φάσης G1, στην φάση G2. Από την άλλη πλευρά, τo p53 γονίδιο διαφυλάττει τα κύτταρα από την «ανάρμοστη» προώθηση του κυτταρικού κύκλου πέρα από τα σημεία ελέγχου στις φάσεις G1 και G2, ενώ μπορεί να τα οδηγήσει σε απόπτωση. Δύο ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες, οι p16 και 60

p14arf (ή κοινώς ARF) που κωδικοποιούνται από την ίδια γενετική περιοχή CDKN2A, ελέγχουν μεμονωμένα η καθεμία τις προαναφερθείσες πρωτεΐνες. Αναλυτικά η p16 αναστέλλει την φωσφορυλίωση του γλοιοβλαστώματος ενώ η p14arf αποτρέπει την αποδόμηση του p53 από την MDM-2. Η διάσπαση της συνοχής των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, που προέρχεται από την απορρύθμιση βασικών ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών, θεωρείται απαραίτητη για την γλοιοματογένεση. Σε συγκεκριμένα γλοιώματα και ιδιαίτερα στα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα το γονίδιο p53 είναι μεταλλαγμένο ή έχει υποστεί διαγραφή, ενώ έχει παρατηρηθεί ότι εύκολα παρακάμπτεται η δράση του μέσω της ενισχυμένης έκφρασης του mdm-2. Επίσης, το γονίδιο του ρετινοβλαστώματος(rb), είναι μεταλλαγμένο σε ποσοστό 10-15% σε υψηλού βαθμού κακοήθειας αστροκυττώματα. Σίγαση του γονιδίου του RB παρατηρείται επίσης και σε ένα άλλο ποσοστό της τάξης του 15% των αστροκυττωμάτων μέσω της ενίσχυσης του CDK4, που είναι ανταγωνιστής του πρώτου. Επίσης, η γενετική περιοχή (CDKN2A) που κωδικοποιεί το p16 και p14arf (τα οποία ρυθμίζουν θετικά τα μονοπάτια του RB και του p53), έχει απαλοιφθεί σε περίπου μισά από τα αστροκυττώματα αλλά και σε ολιγοδενδρογλοιώματα, ενώ συσχετίζεται πρωτίστως με de novo γλοιοβλαστώματα [80-82]. 61

Σχήμα 7: το μονοπάτι του ρετινοβλαστώματος (Rb) και του p53 καθώς και τα μόρια-ρυθμιστές αυτών, p16 και p14arf. Τα μοριακά μονοπάτια στο γλοιοβλάστωμα Εκτός από τις ενδοκυττάριες οδούς παραγωγής και μετάδοσης σημάτων που καθορίζουν τον κυτταρικό κύκλο και τη μίτωση, υπάρχει και ρύθμιση αυτών των διαδικασιών από το εξωκυττάριο περιβάλλον μέσω αλληλεπίδρασης προσδετών (ορμόνες, νευροδιαβιβαστές και αυξητικοί παράγοντες) με συγκεκριμένους υποδοχείς οι οποίοι εδράζουν στην εξωκυττάρια μεμβράνη των κυττάρων. Από αυτή τη διαντίδραση προκύπτει ενεργοποίηση ενδοκυττάριων μορίων με διαδοχικές φωσφορυλιώσεις και αποφωσφορυλιώσεις πρωτεϊνών, που τελικό στόχο έχουν τη ρύθμιση ζωτικών λειτουργών του κυττάρου. Έχει βρεθεί ότι στο γλοιοβλάστωμα, πολλά μοριακά μονοπάτια - και κυρίως αυτά των υποδοχέων αυξητικών 62

παραγόντων με δράση κινάσης τυροσίνης - αποτελούν ιδιαίτερο σημείο αναφοράς λόγω της υπερδραστηριότητας που εμφανίζουν. Οι υποδοχείς με δράση κινάσης τυροσίνης έιναι γλυκοπρωτεϊνικά μόρια τα οποία αποτελούνται από: α) Ένα εξωκυττάριο αμινοτελικό άκρο το οποίο διαθέτει την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη, β) Μία διαμεμβρανική α έλικα η οποία είναι το «αγκυροβόλιο» του υποδοχέα στην λιπιδιακή μεμβράνη και γ) Ένα ενδοκυττάριο καρβοξυτελικό άκρο το οποίο κατέχει την καταλυτική περιοχή με δράση κινάσης τυροσίνης [83]. Τα κύρια σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκονται είναι οι «πρωτεϊνικοί καταρράκτες» RAS/RAF/MAPK(ERK) και PI3K/AKT, οι οποίοι έχουν άρρηκτα συσχετισθεί με τη μετακίνηση, μεταβολισμό, διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και κυτταρικό θάνατο των νευρογλοιακών - προγονικών και μη - κυττάρων [84]. PI3K/ Akt/ PTEN Το μονοπάτι του ΑΚΤ (PKB) είναι αυτό που επηρεάζει τη διαφοροποίηση στα κύτταρα της γλοίας. Το πρώτο βήμα στο μονοπάτι είναι η ενεργοποίηση της PI3K από ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα, η οποία καταλύει την μετατροπή του υποστρώματος 4,5-διφωσφο- φωσφατυδιλοινοσιτόλη [PtdIns(4,5)P2] σε 3,4,5 τριφωσφο- φωσφατυδιλο-ινοσιτόλη [PtdIns(3,4,5)P3]. Το τελικό μόριο (PIP3) είναι υπεύθυνο για την περεταίρω μεταγωγή του σήματος με την ενεργοποίηση του ΑΚΤ, μέσω της φωσφορυλίωσης αυτού σε δύο αμινοξέα (Thr308 και Ser473). Αυτό, με τη σειρά του, όντας στην ενεργό του μορφή (ΑΚΤ1 στους ανθρώπους), κινητοποιεί τον μεταβολισμό μέσω της GSK3 (Glycogen Synthase Kinase 3) και 63

τροποποιεί τη μετάφραση διαφόρων πρωτεϊνών με την ενεργοποίηση του mtor (mammalian Target of Rapamycin). Συγκεκριμένα, το μονοπάτι PI3K/Akt/mTOR θεωρείται ότι αποτελεί το επικρατέστερο μονοπάτι που έχει τον κύριο λόγο στη διήθηση. Ταυτόχρονα, η πιο σημαντική του δράση είναι ότι αναστέλλει την απόπτωση μέσω απενεργοποίησης του BAD (BCL-2 associated death promoter), το οποίο είναι ένα μόριο που υπό φυσιολογικές συνθήκες ενεργοποιείται σε καταστάσεις stress επάγοντας την έκφραση των κασπασών (cysteine-dependent aspartate-directed proteases) για προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Επίσης τροποποιεί και τη δυναμική του μεταγραφικού παράγοντα FKHR (Fork Head in Rhabdomyosarcoma ) που εκτός από τον έλεγχο του μεταβολισμού της γλυκόζης και των λιπιδίων, εμφανίζει την ικανότητα να εισέρχεται εντός του πυρήνα και να ενεργοποιεί προαποπτωτικά γονίδια όπως ο Fas-ligand. Σημαντική είναι και η αναστολή του μορίου Mdm-2, το οποίο οδηγεί σε αποσύνθεση της πρωτεΐνης του p53 [85, 86]. Οι επιδράσεις του ΑΚΤ εμφανίζονται και στον υποδοχέα NF-kB καθώς και στο επίπεδο του κυτταρικού κύκλου με την αναστολή των αναστολέων κινασών που εξαρτώνται από τις κυκλίνες (CDK) p21 και p27, με αποτέλεσμα την συνεχή μετάβαση από την G1 φάση στην S του κυτταρικού κύκλου [87]. Η πρωτεΐνη που προέρχεται από το γονίδιο του PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog), το οποίο θεωρείται ογκοκατασταλτικό γονίδιο, έχει δράση φωσφατάσης με ικανότητα αποφωσφορυλίωσης διαφόρων πρωτεϊνών, όπως της FAK (Focal Adhesion Kinase), η οποία «ενορχηστρώνει» τη μετανάστευση και την επέκταση σε παρακείμενους ιστούς, με την οργάνωση- αναδιοργάνωση των νηματίων ακτίνης. Μία σημαντική ιδιότητά 64

του επίσης είναι η δράση εκλεκτικής φωσφατάσης για την περιοχή της 3 φωσφοινοσιτόλης στο μόριο της 3,4,5 τριφωσφο- φωσφατυδιλοινοσιτόλη [PtdIns(3,4,5)P3] καθιστώντας το ανενεργό. Με αυτόν τον τρόπο αναστέλλεται η δράση του ΑΚΤ, και εμμέσως άλλες πρωτεΐνες που έχουν ρόλο στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [88, 89]. Απώλεια ολόκληρου ή μέρους του γονιδίου του χρωμοσώματος 10q, οδηγεί σε απώλεια των γονιδίων του PTEN καθώς και άλλων ογκοκατασταλτικών γονιδίων όπως το MXI1 (Max Interacting Protein 1) και το DMBT1 (Deleted in Malignant Brain Tumors), τα οποία εδράζουν σε παρακείμενες περιοχές. Αυτή η απώλεια των γονιδίων παρατηρείται σε 75-90% των γλοιοβλαστωμάτων (σε ποσοστό 40% ταυτόχρονη εξάλειψη και των δύο αλληλίων), ενώ οι μεταλλάξεις του PTEN εμφανίζονται σε 60% αυτών των όγκων [90, 91]. Ωστόσο, σε πιο πρόσφατες μελέτες γίνεται ξεκάθαρο πως η έλλειψη του PTEN είναι πολύ μεταγενέστερο γεγονός στην κακοήθη εξαλλαγή των γλοιοβλαστωμάτων και πιο πολύ συμβάλει στη μετατροπή των χαμηλής κακοήθειας σε υψηλής κακοήθειας γλοιοβλαστώματα [92]. 65

Σχήμα 8: Το μονοπάτι του Akt και οι επιπτώσεις του στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων. K-RAS Το μόριο του Ras που ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια των μικρών GTPασών, ενεργοποιείται έμμεσα μέσω των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης αλλά και από τις ιντεγκρίνες. Όταν ενεργοποιούνται αυτοί οι υποδοχείς, υπόκεινται σε αυτοφωσφορυλίωση και επιστρατεύουν τις πρωτεΐνες Grb2 (Growth Factor Receptor-Bound Protein-2) and Sos (Son of Sevenless) έτσι ώστε όλα μαζί να δημιουργούν ένα σύμπλεγμα. Το σύμπλεγμα αυτό ενεργοποιεί το μόριο Ras με τον εξής τρόπο: επάγει τη σύνδεσή του με τον GTP και το καθιστά ενεργό και αντίστοιχα, το Ras αδρανοποιείται όταν το GTP υδρολύεται σε GDP. Στην ενεργή μορφή του, το RAS επάγει την ενεργοποίηση των μονοπατιών του RAL, RAC και RAF τα οποία με τη σειρά τους επάγουν τις μιτογόνες κινάσες (Mitogen Activated Protein Kinases MAPKs) ERK 1 και 66

2, καθώς και τα μόρια JNK και p38. Οι MAPKs θεωρούνται ο «ακρογωνιαίος λίθος» για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ τα δύο τελευταία μόρια επάγουν τη δημιουργία ψευδοποδίων για τη μετανάστευση του κυττάρου (lamellipodia and filopodia). Το τελικό αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων που είναι υπεύθυνοι για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, με πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αποφυγή της απόπτωσης, καθώς επίσης και η έκφραση πρωτεασών αποδόμησης της εξωκυτταρίου θεμέλιας ουσίας. Στα γλοιώματα έχει βρεθεί αυξημένη έκφραση του FAS-L γεγονός το οποίο υπόκειται σε αλλαγές αναλόγως της δραστηριότητας του Ras [93]. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, ενδοκυττάριες GTPασες, όπως η πρωτεΐνη της νευροϊνομάτωσης (NF1), υδρολύουν το GTP σε GDP και παύουν την δράση του ενεργοποιημένου RAS [94]. STAT Οι πρωτεΐνες STATs (signal transducers and activators of transcription) ουσιαστικά αποτελούν μια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων (STATs 1, 2, 3, 4, 5a, 5b, 6) οι οποίες ενεργοποιούνται από αρκετούς διαμεμβρανικούς υποδοχείς μεταξύ των οποίων και από υποδοχείς κινάσης τυροσίνης, όπως EGFR και PDGFR. Μόλις ενεργοποιηθούν, φωσφορυλιώνονται και διμερίζονται, ενώ μετακινούνται παράλληλα στον πυρήνα και προσδένονται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA, σε περιοχές ακριβώς πριν από τα γονίδια που επηρεάζουν. Έτσι προωθούν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων που ρυθμίζουν βιολογικές διαδικασίες του κυττάρου όπως πολλαπλασιασμό, απόπτωση, αγγειογένεση και ανοσιακή 67

απάντηση [95]. Από μελέτες ανοσοϊστοχημείας, έχει βρεθεί ότι ανάμεσα σε διαφορετικές βαθμίδες γλοιωμάτων, το STAT ήταν ενεργοποιημένο σε μεγαλύτερο ποσοστό σε υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα σε σχέση με τα χαμηλής κακοήθειας. Αντίστοιχα, από μελέτες με Western Blots, έχει βρεθεί ότι όσο μεγαλώνει ο βαθμός κακοήθειας, τόσο αυξάνει η συγκέντρωση της φωσφορυλιωμένης μορφής του STAT [96, 97]. Σχήμα 9: υποδοχείς αυξητικών παραγόντων στο γλοιοβλάστωμα και τα ενδοκυττάρια μονοπάτια που αυτοί ενεργοποιούν ΚΙΝΑΣΕΣ ΤΥΡΟΣΙΝΗΣ Οι κινάσες είναι μια ευρύτερη κατηγορία ενζύμων που μεταφέρουν μια φωσφατιδική ομάδα από ένα μόριο δότη υψηλής ενέργειας (όπως για παράδειγμα την τριφωσφορική αδενοσίνη), με αποδέκτες συγκεκριμένα υποστρώματα. Για αυτό το λόγο αποκαλούνται και φωσφοτρανφεράσες. Το 68

τελικό αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση πρωτεϊνών στόχων, μέσω της φωσφορυλίωσης αυτών, γεγονός που οδηγεί σε λειτουργικές αλλαγές αυτών των μορίων. Από τις 518 πρωτεϊνικές κινάσες στο ανθρώπινο γονιδίωμα [98], οι 90 κινάσες έχουν δράση κινάσης της τυροσίνης με φωσφορυλίωση συγκεκριμένων αμινοξέων τυροσίνης. Υπάρχουν περίπου 30 οικογένειες τυροσινικών κινασών όπως για παράδειγμα μερικές από αυτές είναι οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, με δράση κινάσης της τυροσίνης στην επιφάνεια των κυττάρων, οι οποίοι αναφέρονται παρακάτω. Μια περαιτέρω κατηγοριοποίηση των τυροσινικών κινασών είναι σε επιφανειακές - με δράση υποδοχέα επιφανείας και σε κυτταροπλασματικές χωρίς δράση υποδοχέα. Οι πρώτες είναι απαραίτητες για τη μετάδοση των εξωκυττάριων σημάτων εντός του κυττάρου ενώ οι δεύτερες είναι απαραίτητες για την εκπλήρωση της ενδοκυττάριας σηματοδότησης. Οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων είναι μονομερή που αποτελούνται από αμινοτελικό άκρο στην εξωκυττάρια πλευρά της μεμβράνης όπου συνδέονται οι προσδέτες ( ligands ), ένα διαμεμβρανικό τμήμα αλλά και το ενδοκυττάριο τμήμα, με το καρβοξυτελικό άκρο τους που διαθέτει τη δράση κινάσης της τυροσίνης. Η συγκεκριμένη περιοχή εμπεριέχει το σημείο - σχισμή που φιλοξενεί το ATP αλλά και την αγκύλη ενεργοποίησης των διαφόρων υποστρωμάτων στη συνέχεια του σηματοδοτικού μονοπατιού [99]. Όταν ένας προσδέτης συνδεθεί με την εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα, τότε αυτός διμερίζεται με έναν άλλον όμοιο του υποδοχέα ή της 69

οικογενείας αυτού (ομο- ή ετεροδιμερισμός). Αυτό το γεγονός αυτόματα επάγει την ενεργοποίησή του με την αυτοφωσφορυλίωση ειδικών αμινοξέων τυροσίνης στην κυτταροπλασματική περιοχή του υποδοχέα, τα οποία αποκτούν ικανότητα δράσης κινάσης [84]. Ο ενεργοποιημένος υποδοχέας χρησιμοποιεί συγκεκριμένες πρωτεΐνες - υποστρώματα που συνδέονται σε συγκεκριμένες περιοχές φωσφορυλίωσης και εν συνεχεία αυτές είναι ικανές να φωσφορυλιώσουν άλλες πρωτεΐνες προάγοντας την σηματοδότηση ένα βήμα παρακάτω. Η ενεργοποίηση των διαφόρων μονοπατιών οδηγεί σε βιολογικές αποκρίσεις όπως κυτταρική ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, μετανάστευση, επιβίωση και αγγειακή διαπερατότητα [100, 101]. Σχήμα 10: Διαδικασία ενεργοποίησης του υποδοχέα 1. Πρόσδεση αυξητικού παράγοντα (ligand) στο εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα του, 2. Διμερισμός υποδοχέα, 3. Ενεργοποίηση υποδοχέα και αυτοφωσφορυλίωση τυροσινών ενδοκυτταρίου τμήματος αυτού, 4. Δράση κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα και φωσφορυλίωση διαμεσολαβητών πρωτεϊνών υποστρωμάτων αυτού 70

EGFR (ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ) Ο υποδοχέας του EGFR έχει ενδοκυττάρια δράση κινάσης τυροσίνης. Ενεργοποιείται κυρίως από τον προσδέτη EGF όπως επίσης και από τον TGF-α, αλλά και άλλους προσδέτες. Έχει τέσσερις ισομορφές: EGFR (ErbB1/HER1), ErbB2( HER2/Neu), ErbB3 (HER3), and ErbB4 (HER4) [102]. Όταν ο υποδοχέας του EGFR συνδέεται με κάποιον προσδέτη του, σχηματίζει σύμπλοκο με έναν όμοιο του ή διαφορετικό υποδοχέα της οικογενείας του και υπόκειται σε ομοδιμερισμό ή ετεροδιμερισμό. Εν συνεχεία αυτοφωσφορυλιώνεται. Το γονίδιο του EGFR στο 7p12 έχει περιγραφεί ως το πιο συχνά υπερεκφρασσόμενο γονίδιο, κυρίως μετά από ενίσχυση, σε ποσοστό της τάξης του 60% των γλοιοβλαστωμάτων [103]. Συγκεκριμένα, περίπου στις μισές των περιπτώσεων των γλοιοβλαστωμάτων που υπερεκφράζουν το αγρίου τύπου (wild type) γονίδιο του EGFR, ταυτόχρονα εκφράζουν και μεταλλαγμένα αλλήλια του EGFR, όπως το EGFRvIII, το οποίο προκύπτει από την διαγραφή των εξονίων 2 έως 7. Το προϊόν είναι ένας νέος διατμημένος υποδοχέας, από τον οποίο εκλείπει η περιοχή πρόσδεσης με τον αυξητικό παράγοντα (ligand) EGF και έχει την ιδιότητα να επάγει αδιάκοπα το μονοπάτι του EGFR με ενεργοποίηση της κινάσης της 3-φωσφατιδυλοινοσιτόλης (PI3K) [104]. Έχει παρατηρηθεί επίσης το γεγονός ότι μέσω του συγκεκριμένου μονοπατιού επάγεται η αντοχή στην ακτινοβολία με την επιδιόρθωση των οποιοδήποτε - προκαλούμενων δια της ακτινοβόλησης - σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA στα καρκινικά κύτταρα. Τελικά, δημιουργείται από τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα μια 71

αυτοκρινική/παρακρινική αγκύλη με αυξητικούς παράγοντες, η οποία ευοδώνει την διαρκή ενεργοποίηση των μοριακών μονοπατιών [105]. Τα ακριβή μονοπάτια που ενεργοποιούνται μεμονωμένα ή και σε συνδυασμό από την ενεργοποίηση του EGFR για την επαγωγή του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της αποφυγής της απόπτωσης δεν είναι απολύτως εξακριβωμένα. Έχουν προηγηθεί πολλά πειράματα στα πλαίσια βασικής έρευνας με κυτταρικές σειρές τα οποία οδηγούν σε ενεργοποίηση των μονοπατιών του AKT και του RAS [106]. PDGFR (ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΤΩΝ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ) Έχουν βρεθεί 4 προσδέτες PDGFA-D οι οποίοι μπορούν να συνδυάζονται μεταξύ τους και να κάνουν ομοδιμερή και εν συνεχεία να ενεργοποιούν έναν από τους δύο υποδοχείς PDGFRα και PDGFRβ. Η πρόσδεση στον υποδοχέα προκαλεί διμερισμό των υποδοχέων και κάθε υπομονάδα του υποδοχέα η οποία έχει δράση κυτταροπλασματικής κινάσης της τυροσίνης μπορεί να φωσφορυλιώσει πολλά μόρια που με την σειρά τους θα ενεργοποιήσουν διάφορα μονοπάτια όπως αυτό των RAS-MAPK, τη φωσφολιπάση C (PLC-γ), τις Src κινάσες και τους Stat μεταγραφικούς παράγοντες. Εξέχουσα είναι η σημασία του PI3K, όπου επάγει την έκφραση ΝF-kB μέσω της υπερέκφρασης του PDGF και έτσι οδηγεί στον πολλαπλασιασμό του γλοιώματος [107]. Έχουν διαπιστωθεί ότι ποσοστό σχεδόν 30% των ανθρωπίνων γλοιωμάτων ακολουθούν «εκφραστικά μοτίβα» που συσχετίζονται με τη σηματοδότηση του PDGFR [108]. Έχει αποδειχτεί επίσης η ταυτόχρονη έκφραση τόσο του υποδοχέα όσο και του ιδίου του προσδέτη του PDGF σε όλες τις βαθμίδες 72

κακοήθειας (II-IV) των γλοιωμάτων με σημαντική αυτοκρινική-παρακρινική δράση μεταξύ τους [109]. Ο υποδοχέας PDGFRα καθώς και οι προσδέτες PDGF-A και PDGF-B υπερεκφράζονται στα δευτεροπαθή γλοιώματα και κυρίως σε αυξημένης κακοήθειας όγκους, ενώ ο υποδοχέας PDGFRβ συναντάται πρωτίστως στα πολλαπλασιαζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα του γλοιοβλαστώματος [110, 111]. VEGFR (ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΤΟΥ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΥ) Ο υποδοχέας VEGFR έχει δύο μορφές, τον VEGFR-1 (Flt-1) και τον VEGFR- 2 (Flk-1/KDR). Ο προσδέτης τους VEGF έχει τέσσερις ισομορφές (A,B,C,D), αν και οι περισσότερες λειτουργίες προέρχονται από τον προσδέτη VEGF-A μέσω ενεργοποίησης του VEGFR-2. Ο συγκεκριμένος υποδοχέας εντοπίζεται σε αυξημένες συγκεντρώσεις πρωτίστως στα ενδοθηλιακά κύτταρα που πλαισιώνουν το γλοιοβλάστωμα, διότι εξυπηρετεί τη φυσιολογική και την παθολογική αγγειογένεση. Μελέτες της τελευταίας δεκαετίας αποδεικνύουν την εκτεταμένη ύπαρξη του VEGFR-2 (Flk-1) στα ίδια τα γλοιοβλαστωματικά κύτταρα [112] όπου σε συνδυασμό με την αύξηση της συγκέντρωσης του VEGF δημιουργούν ένα παρακρινικό ή/και αυτοκρινικό τρόπο δράσης που επιτυγχάνει την αντίσταση στην ακτινοβόληση [113]. Η σημασία του αυτοκρινούς μηχανισμού με την διαρκή ενεργοποίηση του υποδοχέα του VEGFR που επάγει την ασταμάτητη ανανέωση του προσδέτη του, VEGF, είναι πολύ μεγάλη λόγω του ότι μπορεί εν μέρει να εξηγήσει τη σχετική αναποτελεσματικότητα των μονοκλωνικών αντισωμάτων (π.χ.bevacizumab) 73

που στοχεύουν στον VEGF και αντίστοιχα την καλύτερη έκβαση της νόσου σε περιπτώσεις ασθενών όπου έλαβε χώρα απευθείας αναστολή του υποδοχέα [114]. Μεταγενέστερες μελέτες αποδεικνύουν την ενίσχυση του γονιδίου του VEGFR-2, η οποία παρατηρείται σε ποσοστό της τάξης του 40% των πρωτοπαθών γλοιοβλαστωμάτων, ανεξαρτήτως της αντίστοιχα παρατηρούμενης ενίσχυσης του γονιδίου του EGFR. Έκτοτε έχουν ξεκινήσει πολλές προσπάθειες για σχεδιασμό διαφόρων αναστολέων κινάσης τυροσίνης του VEGFR, που ευελπιστούμε ότι θα αποτελέσουν σημαντικά «όπλα» στην φαρέτρα της σύχρονης ογκολογίας για την θεραπεία του γλοιοβλαστώματος [115]. Αναφορικά με την επαγόμενη σηματοδότηση, η ενεργοποίηση του VEGFR οδηγεί σε φωσφορυλίωση ενεργοποίηση των μονοπατιών του c-raf/mapk, του PI3-K/Akt καθώς και του PLCγ/PKC. Στην όλη διεργασία της αγγειογένεσης αξιοσημείωτη είναι η συμμετοχή της καθεψίνης B (cathepsin B) και των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs), όπως επίσης και η έκφραση των πρωτεϊνών-στοιχείων της εξωκυτταρίου θεμέλιας ουσίας (Extracellular Matrix, ECM) ινωδονεκτίνη, λαμινίνη, βιτρονεκτίνη και τενασίνη-c. Όλα αυτά μαζί καθορίζουν την αποδόμηση καθώς και την αναδιαμόρφωση του συνδετικού ιστού που περιβάλλει τα κακοήθη κύτταρα [116]. 74

Πινακας 5: μονοπάτια που διαταρράσονται στο γλοιοβλάστωμα και σε άλλα γλοιώματα ΟΙ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΕΣ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥΣ Οι ιντεγκρίνες (integrins) είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες που συντίθενται από τον συνδυασμό ετεροδιμερών υπομονάδων, με χρήση μίας από τις 18 α και μίας από τις 8 β διαθέσιμες υπομονάδες. Έτσι προκύπτουν 24 διαφορετικές μορφές ιντεγκρινών. Αυτές κατέχουν σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση του κυττάρου με άλλα κύτταρα και στην διαντίδραση του κυττάρου με το ECM. Προσδένονται με συγκεκριμένες πρωτεΐνες του ECM όπως ινωδονεκτίνη, λαμινίνη, κολλαγόνο, ινωδογόνο μέσω προσδετών που αναγνωρίζουν το μοτίβο του τριπεπτιδίου αργινίνη- γλυκίνη- ασπαρτικό οξύ (R-G-D) [117]. Πιο συγκεκριμένα ο ρόλος τους αφορά στην «σύνδεση» του εξωκυτταρίου περιβάλλοντος των κυττάρων με τα νημάτια ακτίνης του κυτταροσκελετού τους, για την συνοχή της αρχιτεκτονικής και διατήρηση του σχήματος τους καθώς και την ρύθμιση της μετανάστευσης. Οι α και οι β υπομονάδες διαθέτουν ξεχωριστά μια μεγάλη εξωκυττάρια περιοχή, μια μικρή διαμεμβρανική περιοχή και μια επίσης μικρή κυτταροπλασματική «ουρά», η οποία - εν αντιθέσει με τους υποδοχείς κινάσης τυροσίνης - δεν 75

διαθέτει δράση ενδοκυττάριας κινάσης. Αυτό που γίνεται μετά την ενεργοποίηση από τα εξωκυττάρια ερεθίσματα-προσδέτες, είναι η κινητοποίηση των ενδοκυττάριων τμημάτων τους με συσσώρευση των μορίων των ιντεγκρινών κατά τόπους για τη δημιουργία συμπλεγμάτων εστιακής προσκόλλησης (focal adhesion complexes). Το μόριο παίκτης από αυτό το σημείο και πέρα είναι η FAK (Focal Adhesion Kinase, κινάση εστιακής προσκόλλησης) το οποίο επιστρατεύεται στις συγκεκριμένες περιοχές και αυτοφωσφορυλιώνεται για να ενεργοποιήσει περεταίρω τα μονοπάτια του PI3K, ERK/MAPK, Src καθώς και τον NFkB [118]. Από την πληθώρα ιντεγκρινών που προκύπτουν οι υπομονάδες β1 και β5 έχουν βρεθεί σε διάφορους τύπους κακοήθων γλοιωμάτων και αφορούν στη διηθητική συμπεριφορά του γλοιοβλαστώματος, ενώ συγκεκριμένα ο συνδυασμός α3β1 χαρακτηριστικά συσχετίζεται με τη μετανάστευση των κυττάρων [119, 120]. Από άλλες μελέτες προκύπτει ότι οι ιντεγκρίνες ανβ3 και ανβ5 εμφανίζουν αυξημένη έκφραση σε κακοήθη αστροκυττώματα τάξης ΙΙΙ και ΙV, συγκριτικά με τα αντίστοιχα αστροκυττώματα κακοηθείας τάξης ΙΙ ή το φυσιολογικό ιστό του εγκεφάλου [121]. Επιπλέον, έχει περιγραφεί συσχέτιση-συνεργασία μεταξύ των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων και των ιντεγκρινών σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων για την εκδήλωση του κακοήθους φαινοτύπου. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι η συνεντόπιση του PDGFRβ και η ιντεγκρίνη ανβ3 σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος, η συσχέτιση του υποδοχέα VEGFR-2 με την ιντεγκρίνη ανβ3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα και τέλος η συνεργασία του υποδοχέα EGFR με την ιντεγκρίνη α5β1 στα επιθηλιακά κύτταρα [122-124]. 76

Σχήμα 11: σημεία εστιακής προσκόλλησης, «σύνδεση» εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας με κυτταροσκελετό FAK (Focal Adhesion Kinase) Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη στην οποία έχει ήδη γίνει αναφορά προηγουμένως, είναι μια κυτταροπλασματική κινάση της τυροσίνης - η οποία δεν έχει δράση υποδοχέα - και προωθεί τη μετανάστευση σε διάφορους τύπους κυττάρων. Αποτελείται από ένα αμινοτελικό άκρο με την περιοχή FERM, η οποία εν συνεχεία εμφανίζει μια περιοχή πλούσια σε αμινοξέα προλίνης, τη βασική περιοχή με δράση κινάσης, ακολουθούμενη από 2 επιπλέον περιοχές πλούσιες σε προλίνη (PR1 και PR2) και τέλος την περιοχή FAT (Focal Adhesion Targeting) στο καρβοξυτελικό άκρο. Η περιοχή FERM διαμεσολαβεί τις διαντιδράσεις του μορίου με τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες όπως τις ιντεγκρίνες και τους ενεργοποιημένους υποδοχείς, ενώ 77

ταυτόχρονα ρυθμίζει τη δράση του μορίου ως κινάση με την «ενδοεπικοινωνία» του με την περιοχή της κινάσης [125, 126]. Στο αμινοτελικό άκρο διευκολύνονται οι αντιδράσεις με μόρια που περιέχουν SH2 περιοχές αντίστοιχες, όπως ενδοκυττάριο Src, ενώ στο καρβοξυτελικό άκρο διευκολύνονται οι διαντιδράσεις με μόρια όπως το CAS, που περιέχουν ομολογία περιοχής SH3. Η περιοχή FAT είναι απαραίτητη για να υπεισέρχεται το μόριο της FAK στη δημιουργία της εστιασμένης προσκόλλησης (focal adhesions), κατόπιν της διαντίδρασης με τα μόρια paxillin και talin [127, 128]. Σχήμα 12: Το μόριο της FAK από το αμινοτελικό μέχρι και το καρβοξυτελικό άκρο του με τις διάφορες τυροσινικές ομάδες και τις άλλες κομβικές περιοχές. Το ίδιο το μόριο της FAK θεωρείται ενεργοποιημένο όταν γίνεται αυτοφωσφορυλίωση στο αμινοξύ Y397. Έπειτα, γίνεται προσκόλληση με το μόριο του Src, το οποίο εν συνεχεία φωσφορυλιώνει άλλες περιοχές της FAK με αμινοξέα τυροσίνης και συγκεκριμένα την ειδική περιοχή κινάσης που διαθέτει η FAK στις περιοχές Y576/577. Το Src μπορεί να φωσφορυλιώσει 78

και τις περιοχές Y407, Y861, και Y925 όπου μπορούν να προσκολληθούν άλλα μόρια-μεταβιβαστές σηματοδότησης όπως για παράδειγμα το ERK [129, 130]. Η ενεργοποίηση λαμβάνει χώρα συνήθως όταν γίνεται παροδική συνάθροιση μορίων ιντεγκρίνης κατά τόπους ύστερα από προσκόλληση σε προσδέτες του ECM, είτε μέσω της ενεργοποίησης από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Σε φυσιολογικά κύτταρα η ενεργοποίηση της FAK γίνεται μόνο από τα εξωκυττάρια ερεθίσματα και όχι αυτόνομα. Σε κακοήθεις εξαλλαγές, όπως και στο γλοιοβλάστωμα έχει βρεθεί ότι η FAK ενεργοποιείται από μόνη της χωρίς προηγούμενο ερέθισμα, γεγονός που υποδηλώνει έναν διαφορετικό τρόπο ενεργοποίησης της [131]. Έχει βρεθεί ότι σε αυξημένης κακοήθειας γλοιώματα (grade III και ΙV) από ασθενείς, η FAK εμφανίζει αυξημένη έκφραση της ενεργοποιημένης (φωσφορυλιωμένης) μορφής της. Τα αποτελέσματα έχουν επιβεβαιωθεί τόσο από βιοψίες με ανοσοϊστοχημεία όσο και από ανάλυση με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot Analysis, Immunoblotting) από διαφορετικά εργαστήρια και ερευνητές [132, 133]. 79

Σχήμα 13: συσχέτιση ιντεγρινών με υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, και ο ρόλος της FAK ως ρυθμιστής - συντονιστής της σηματοδότησης αυτών για μια συνολική απάντηση του κυττάρου CROSS-TALKING Σημαντικό είναι το γεγονός ότι όλα τα προαναφερθέντα μονοπάτια που δραστηριοποιούνται σε απάντηση των εξωκυττάριων ερεθισμάτων μέσω της ενεργοποίησης των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, δεν αποτελούν μεμονωμένα στοιχεία σηματοδότησης για ρύθμιση των διαφόρων λειτουργιών του κυττάρου. Έχει βρεθεί σημαντική αλληλοεπικάλυψη μεταξύ των πρωτεϊνών-διαμεσολαβητών όπως γίνεται εξάλλου σαφές και από τις ανωτέρω αναφορές. Οι καταρράκτες της αλλεπάλληλης ενεργοποίησηςφωσφορυλίωσης πρωτεϊνών μοιράζονται κοινά μόρια-πρωτείνες ενώ 80