Βιολογικές δράσεις ενός συνθετικού πεπτιδίου του αυξητικού παράγοντα HARP

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Βιολογικές δράσεις ενός συνθετικού πεπτιδίου του αυξητικού παράγοντα HARP Kαψάλη Αναστασία Βιολόγος

Περιεχόμενα 1. Εισαγωγή 5 1.1 Ενδοθηλιακά κύτταρα 5 1.2 Αγγειακό σύστημα 8 1.3 Νεοαγγειογένεση- Αγγειογένεση 10 1.3.1 Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης 13 1.4 Εξωκυττάρια ύλη 15 1.5 Μεταλλοπρωτεάσες του εξωκυττάριου χώρου των θηλαστικών 19 (ΜΜΡs) 1.5.1 Γενικά 19 1.5.2 Δομικά χαρακτηριστικά των MMPs 21 1.5.3 Κατάταξη των MMPs 23 1.5.4 Τρισδιάστατη δομή των MMPs 29 1.5.5 Ενεργοποίηση των MMPs 31 1.5.6 Ρύθμιση της έκφρασης των MMPs 33 1.6 Αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών 34 1.6.1 Ενδογενείς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών 34 1.6.2 Δομή και μηχανισμός δράσης των TIMPs και των παραλλαγών 35 τους 1.6.3 Βιολογικές δράσεις των TIMPs 37 1.6.4 Συνθετικοί αναστολείς των MMPs 38 1.7 Αυξητικοί παράγοντες 40 1.7.1 Γενικά για τους αυξητικούς παράγοντες 40 1.7.2 ΗΑRP 41 1.7.2.1 Γενικά χαρακτηριστικά 42 1.7.2.2 Γονιδιακή οργάνωση και χαρακτηριστικά 43 1.7.2.3 Βιοχημικά χαρακτηριστικά 45 1.7.2.4 Γονιδιακή ρύθμιση της έκφρασης της HARP 47 1.7.3 Ιστοειδική έκφραση της HARP 48 1.7.3.1 Έκφραση στο νευρικό σύστημα 48 1.7.3.2 Έκφραση της HARP σε άλλους ιστούς 50 2

1.7.4 Η HARP και οι υποδοχείς της 53 1.7.5 Δράση της HARP στον πολλαπλασιασμό 56 1.7.6 Δράση της HARP στη μετανάστευση των κυττάρων και την 58 αγγειογένεση 1.7.7 H HARP στον καρκίνο 60 1.7.8 Βιολογικές δράσεις πεπτιδίων της HARP 61 1.8 Σκοπός 67 2. Υλικά και μέθοδοι 68 2.1 Παρασκευή ECGS (endothelial cell growth supplement) από εγκέφαλο 68 βοός 2.2 Απομόνωση κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου 69 2.3 Ανακαλλιέργεια κυττάρων 73 2.4 Μέτρηση κυττάρων σε αιµοκυτταρόµετρο Neubauer 76 2.5 Προσδιορισμός του αριθμού των κυττάρων με τη μέθοδο Crystal 77 Violet 2.6 Πείραμα προσομοίωσης επούλωσης πληγών (Wound healing test) 78 2.7 Μελέτη του χημειοτακτισμού των κυττάρων (Θάλαμος Transwell) 79 2.8 Μέθοδος Bradford 81 2.9 SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS PAGE) 83 2.10 Ανοσοαποτύπωμα (Western blot) 88 2.11 Αποδέσμευση αντισωμάτων και επαναχρησιμοποίηση 91 2.12 Ζυμογράφημα 92 2.13 Απομόνωση RNA από κύτταρα σε καλλιέργεια 94 2.14. Προσδιορισμός συγκέντρωσης διαλύματος νουκλεϊκών οξέων 96 2.15 Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων με τη χρήση συνδυασμένης 97 αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) 2.16 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων 100 3. Αποτελέσματα 103 4. Συζήτηση 118 5. Bιβλιογραφία 128 3

Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής και Κυτταρικής βιολογίας του τομέα Γενετική Μοριακής Βιολογίας και Ανάπτυξης του βιολογικού τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών. Με την ολοκληρωσή της θα ήθελα να ευχαριστήσω πρωτίστως τον επιβλέποντα αυτής της εργασίας, αναπληρωτή καθηγητή του τμήματος βιολογίας Π. Κατσώρη για την ευκαιρία που μου έδωσε να δουλέψω στο εργαστήριό του, για την πολύτιμη στήριξη και συνεχή καθοδήγησή του καθώς και για την εμπιστοσύνη και την υπομονή του κατά τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Ευχαριστίες οφείλω στον αναπληρωτή καθηγητή Κ. Φλυτζάνη καθώς και στον καθηγητή Α.Μίντζα για τις πολύτιµες συµβουλές τους και τις παραγωγικές συζητήσεις µας όπως και για τις εύστοχες παρατηρήσεις και τις οδηγίες τους. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στον υποψήφιο διδάκτορα Μπίρμπα Χαράλαμπο καθώς και στην μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ζαφειροπούλου Καλλιόπη, για την πολύτιμη καθοδήγησή τους και την ατέλειωτη υπομονή τους κατά την διάρκεια των πειραμάτων μου, όπως επίσης και τις φίλες μου, Χαρά και Ιωάννα που μου στάθηκαν και με στήριξαν όλα αυτά τα χρόνια τόσο σε επιστημονικό όσο και σε προσωπικό επίπεδο. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου καθώς και στον αδερφό μου Κωνσταντίνο, που όλα αυτά τα χρόνια με στηρίζουν τόσο υλικά όσο και ψυχικά σε κάθε μου προσπάθεια. Γιατί όπως όπως λέει ο πατέρας μου, «η ζωή είναι ένας συνεχής αγώνας.» 4

1. Εισαγωγή Το κυκλοφορικό σύστημα είναι ένα από τα πιο σημαντικά συστήματα του ανθρώπινου οργανισμού, εφόσον μέσω αυτού εξασφαλίζεται η θρέψη και η λειτουργία των διαφόρων οργάνων, εξυπηρετώντας τη διακίνηση (α) των αναπνευστικών αερίων O 2 και CO 2 (β) των θρεπτικών ουσιών (γ) των περιττών προϊόντων του μεταβολισμού καθώς και όλων των άχρηστων ουσιών για τον οργανισμό. Το κυκλοφορικό σύστημα αποτελείται από διάφορους κοίλους χώρους και σωλήνες (μέσα στο οποίο διακινείται το αίμα και η λέμφος), οι οποίοι συνδέονται μεταξύ τους και απλώνονται σε όλο το σώμα. Χωρίζεται σε δύο τμήματα (α) το καρδιαγγειακό ή αιματικό (κυκλοφορία του αίματος) και (β) το λεμφικό (κυκλοφορία της λέμφου). Το καρδιαγγειακό περιλαμβάνει την καρδιά και τα αγγεία και η λειτουργία του συνίσταται στη µεταφορά αίµατος µεταξύ καρδιάς και ιστών και προς τις δύο διευθύνσεις. Το λεμφικό συλλέγει τη λέµφο, δηλαδή την περίσσεια του εξωκυττάριου υγρού των ιστών και την επαναφέρει στο καρδιαγγειακό σύστηµα. Το λεμφικό υγρό παραλαμβάνεται από τα τριχοειδή του λεμφικού συστήματος και οδηγείται στην αιματική (φλεβική κυκλοφορία) με τα λεμφαγγεία, το τοίχωμα των οποίων περιέχει λείες και ελαστικές μυϊκές ίνες. Έτσι μέσω του λεμφικού συστήματος επιτρέπεται η επαναφορά των πρωτεϊνών από το ενδιάμεσο υγρό στο αίμα. 1.1 Ενδοθήλιο Ο εσωτερικός αυλός των αγγείων του κυκλοφορικού συστήματος καλύπτεται από ενδοθηλιακά κύτταρα που συγκροτούν ένα μονόστοιβο κυτταρικό στρώμα, το ενδοθήλιο, το οποίο αποτελεί το μεγαλύτερο αυτοκρινή, ενδοκρινή και παρακρινή αδένα του ανθρώπινου σώματος. Μέχρι πρόσφατα υπήρχε η αντίληψη ότι το ενδοθήλιο αποτελεί μια ημιπερατή μεμβράνη που παρεμποδίζει τη διάχυση μακρομορίων. Ωστόσο λόγω της καίριας θέσης του ανάμεσα στην αιματική ροή αλλά και στους ιστούς, το ενδοθήλιο φαίνεται να παίζει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση και τον έλεγχο διαφόρων λειτουργιών του αγγειακού συστήματος. Με κριτήριο τη σχέση του με τη βασική μεμβράνη, το ενδοθήλιο είναι δυνατόν να διακριθεί στις ακόλουθες κατηγορίες: 5

Το συνεχές ενδοθήλιο (μεγάλα αγγεία, σκελετικά αγγεία, αγγεία της καρδιάς, των λείων μυών, του πνεύμονα, του εγκεφάλου, του δέρματος) το οποίο είναι πάντοτε σε επαφή με βασική μεμβράνη. Το πορώδες ενδοθήλιο (αγγεία της μυϊκής στιβάδας του πεπτικού συστήματος, των ενδοκρινών και εξωκρινών αδένων και τριχοειδή των νεφρών). Το ασυνεχές ενδοθήλιο (τριχοειδή του ήπατος και του σπλήνα) το οποίο χαρακτηρίζεται από την έλλειψη βασικής μεμβράνης. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα από διαφορετικούς ιστούς είναι ετερογενή ως προς την έκφραση πρωτεϊνών στην επιφάνειά τους. Για παράδειγμα, ο παράγοντας von Willebrandt (von Willebrandt Factor, vwf), που χρησιμοποιείται ως ένας κοινός δείκτης των ενδοθηλιακών κυττάρων, δεν εκφράζεται ομοιόμορφα από κύτταρα όλων των τύπων των αγγείων ενώ η έκφραση του ιστικού ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (tissue type plasminogen activator, t-pa) περιορίζεται in vivo στο 3% περίπου των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων (Laroia, 2003, Levin, 1997). Σε κάποιες περιπτώσεις ακόμη και αυτοί οι δείκτες δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις (Kumar, 1987). Υπάρχουν ενδείξεις ότι η ετερογένεια των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί εν μέρει οφείλεται στην έκθεσή τους σε διεγέρτες του περιβάλλοντός τους, μερικοί από τους οποίους δρουν μόνο για μικρές αποστάσεις ή ακόμη μπορεί να απαιτούν την επαφή κυττάρου με κύτταρο. Πολλοί εξωγενείς παράγοντες όπως οι μηχανικές πιέσεις, διαλυτοί αυξητικοί επαγωγείς και αναστολείς, οι κυτταροκίνες, τα λιπίδια του πλάσματος επηρεάζουν το φαινότυπο των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και την επαφή τους με κύτταρα που είναι καθηλωμένα, ή εντοπίζονται στην κυκλοφορία. Σύμφωνα με τις τελευταίες επιστημονικές θεωρίες το ενδοθήλιο συμμετέχει σε πολλές διεργασίες όπως η ρύθμιση του αγγεικού τόνου, ο μεταβολισμός των λιπιδίων, οι αντιδράσεις φλεγμονής, η ανάπτυξη των αγγείων όπως επίσης η δημιουργία θρόμβων, η ενεργοποίηση των πλασματοκυττάρων καθώς και η ρύθμιση της λειτουργίας των μονοκυττάρων. Όπως γίνεται αντιληπτό, λόγω της ιδιαίτερης κατανομής τους στους ιστούς τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι υπεύθυνα για έναν μεγάλο αριθμό λειτουργιών, οι οποίες αναφέρονται στον Πίνακα 1.1. 6

Πίνακας 1.1: Λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων (De Angelis, 1996) ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Επιτρέπουν την εκλεκτική διαπερατότητα θρεπτικών στοιχείων, μεταβολιτών και ορμονών Ρυθμίζουν τη ροή του αίματος και την αντιδραστικότητα των αγγείων: - μέσω αγγειοδιασταλτικών μορίων - μέσω αγγειοσυσταλτικών μορίων Ρυθμίζουν τη φλεγμονή και την ανοσία: - μέσω κυτταροκινών - μέσω μορίων προσκόλλησης Ρυθμίζουν την κυτταρική αύξηση - μέσω διεγερτών της αύξησης - μέσω αναστολέων της αύξησης Συνθέτουν αντιθρομβωτικά/ αντιπηκτικά μόρια Συνθέτουν μόρια που επάγουν την πήξη του αίματος Συνθέτουν συστατικά του εξωκυττάριου στρώματος Οξειδώνουν λιποπρωτεΐνες Συμμετέχουν στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων κατά την διαδικασία της μετάστασης Συμμετέχουν στη διαδικασία της αγγειογένεσης 7

1.2 Αγγειακό σύστημα Τα αιμοφόρα αγγεία διακρίνονται σε αρτηρίες, φλέβες και τριχοειδή. Το αρτηριακό σύστημα αποτελείται από διακλαδιζόμενα αγγεία, που είναι κατάλληλα για τη μεταφορά αίματος από την καρδιά προς τα λεπτά τριχοειδή που οδηγούν το αίμα στους ιστούς. Οι φλέβες με τη σειρά τους έχουν ως κύριο ρόλο τη μεταφορά αίματος από τα τριχοειδή στην καρδιά, έχουν τοιχώματα λεπτά και περισσότερο ελαστικά από αυτά των αρτηριών. Εκτός από τις αρτηρίες και τις φλέβες, σημαντικό ρόλο στο αγγειακό σύστημα έχουν και τα τριχοειδή. Τα τριχοειδή είναι τα μικρότερης διαμέτρου αγγεία και εξυπηρετούν την ανταλλαγή των αερίων μεταξύ της αιμοσφαιρίνης των ερυθρών αιμοσφαιρίων και των ιστών. Τα τοιχώματά τους είναι παρά τα πολύ λεπτά, δε διατείνονται ούτε σπάζουν εύκολα με την αύξηση της πίεσης. Η παρουσία των τριχοειδών είναι πολύ σημαντική για τη μεταφορά θρεπτικών ουσιών και άχρηστων μεταβολικών προϊόντων. Οι μικρές αρτηρίες υποδιαιρούμενες σχηματίζουν τα αρτηρίδια, υποδιαίρεση των οποίων αποτελούν τα μεταρτηρίδια, τα οποία οδηγούν στα τριχοειδή, που με τη σειρά τους ενώνονται σχηματίζοντας φλεβίδια και φλέβες. Τα τοιχώματα των τριχοειδών αποτελούνται από μια απλή σειρά ενδοθηλιακών κυττάρων και από περικύτταρα. Οι δύο αυτοί τύποι κυττάρων περιέχουν την απαραίτητη γενετική πληροφορία για τη δημιουργία αυλών, διακλαδώσεων και τελικά ολοκληρωμένων αγγειακών δικτύων. Στην Εικόνα 1.1 φαίνεται η δομή ενός τυπικού αγγείου. Ο αυλός του αγγείου περιβάλλεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα γύρω από τα οποία υπάρχει η βασική μεμβράνη που περιέχει λαμινίνη, κολλαγόνο τύπου IV, τον παράγοντα von Willebrand, πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης, εντακτίνη, βιτρονεκτίνη και ινονεκτίνη. Έξω από τη βασική μεμβράνη υπάρχουν λεία μυϊκά κύτταρα τα οποία περιβάλλονται από ένα στρώμα εξωκυττάριου υλικού αποτελούμενο από ινονεκτίνη, κολλαγόνο, ελαστίνη, θειϊκή χονδροϊτίνη και πρωτεογλυκάνες θειϊκής δερματάνης (Stromblad, 1996). 8

Εικόνα 1.1: Η δομή ενός τυπικού αγγείου. Αποτελείται από τρία ξεχωριστά, συγκεντρικά στρώματα (χιτώνες), τον έξω χιτώνα, τον μέσο χιτώνα και τον έσω χιτώνα. Ο έσω χιτώνας αποτελείται από μονή στοιβάδα πεπλατισμένων ενδοθηλιακών κυττάρων τα οποία σχηματίζουν ένα σωλήνα που επενδύει τον αυλό του αγγείου, μαζί με τον υποκείμενο υπενδοθηλιακό συνδετικό ιστό, ο οποίος στο εξωτερικό τμήμα του περιλαμβάνει μια λεπτή ζώνη ελαστικών ινών, την έσω ελαστική μεμβράνη. Το μεσαίο στρώμα ιστού, ο μέσος χιτώνας, αποτελείται από ινοελαστικό συνδετικό ιστό με επιμήκη προσανατολισμό. Το εξώτατο τμήμα του μέσου χιτώνα συγκροτείται από μια επίσης λεπτή ζώνη ελαστικών ινών, την έξω ελαστική μεμβράνη, που δεν παρατηρείται σε όλες τις αρτηρίες. Τα κύτταρα που βρίσκονται βαθιά στο μέσο χιτώνα καθώς και τα κύτταρα του έξω χιτώνα αιματώνονται από τα αγγεία των αγγείων. Δύο είναι οι αναγνωρισμένοι μηχανισμοί με τους οποίους δημιουργούνται τα αγγεία του αίματος: Η νεοαγγειογένεση (vasculogenesis) και η αγγειογένεση (angiogenesis). Πρόσφατα αναφέρθηκε και ο όρος capillogenesis ή τριχοειδογένεση που αναφέρεται στη δημιουργία τριχοειδών αγγείων κατά την ανάπτυξη ή την ενήλικη ζωή, ανεξαρτήτως μηχανισμών, διαδικασιών ή κυττάρων που συμμετέχουν (Kovacic, 2008). 9

1.3 Νεοαγγειογένεση- Αγγειογένεση Η αγγειογένεση διακρίνεται σε πρωτογενή ή νεοαγγειογένεση (vasculogenesis), η οποία λαμβάνει χώρα κατά την εμβρυογέννεση και σε δευτερογενή αγγειογένεση (angiogenesis), που περιγράφει το σχηματισμό νέων τριχοειδών αγγείων από ενδοθηλιακά κύτταρα προϋπαρχόντων αιμοφόρων αγγείων (Rissau, 1997). Ωστόσο έχει δωθεί και ένας άλλος διαφορετικός ορισμός της αγγειογένεσης ο οποίος περιγράφει την αγγειογένεση ως την εξάπλωση νέων τριχοειδών αγγείων τα οποία αποτελούνται μόνο από αυλούς, επενδύονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και στερούνται λείων μυϊκών κυττάρων ή επιπλέον δομών για την επένδυσή τους (Heil, 2006). Η νεοαγγειογένεση αποτελεί τη διαδικασία σχηματισμού αγγείων de novo από πρωταρχικά κύτταρα, τους αγγειοβλάστες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου (Conway, 2001). Η νεοαγγειογένεση ξεκινάει έξω από το έμβρυο στο λεκιθικό σάκο. Μέσα στο μεσόδερμα και δίπλα στο εξωεμβρυϊκό εξώδερμα σχηματίζονται συστάδες μεσεγχυματικών κυττάρων, οι αιματικές νησίδες (blood islands), με μία διαδικασία διαφοροποίησης μέσω του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών (fibroblast growth factor, FGF). Οι αιματικές νησίδες αποτελούν κοινούς προγόνους των αγγειοβλαστών και των κυττάρων του αιμοτοποιητικού συστήματος. Από τα κύτταρα που βρίσκονται στο κέντρο των νησίδων αυτών σχηματίζονται τα πρόδρομα κύτταρα του αιματοποιητικού συστήματος ενώ από τα κύτταρα που βρίσκονται στην περιφέρεια τους προκύπτουν οι αγγειοβλάστες. Επτά περίπου ημέρες μετά τη σύλληψη του εμβρύου, αγγειοβλάστες που έχουν μεταναστεύσει σε διάφορα σημεία του εμβρύου αρχίζουν να ενώνονται, να πολλαπλασιάζονται και να σχηματίζουν ένα δίκτυο από το οποίο τελικά σχηματίζεται η ραχιαία αορτή, οι καρδιακές φλέβες και οι πρόδρομες αρτηρίες και φλέβες του εμβρύου που θα αναπτυχθούν περαιτέρω με τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Παράγοντες που εμπλέκονται στη διαδικασία της νεοαγγειογένεσης είναι τα μέλη της οικογένειας του αυξητικού παράγοντα του ενδοθηλίου (vascular endothelial growth factor, VEGF) και οι διάφοροι υποδοχείς του (Risau, 1997). Μύες οι οποίοι δεν έχουν κάποια από τα αντίστοιχα γονίδια πεθαίνουν πριν από την 10η ημέρα της εμβρυϊκής ανάπτυξης, λόγω απουσίας ή καθυστερημένης διαφοροποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων και ατελή νεοαγγειογένεση. Μετά από τη 10

δημιουργία του πρώτου αυτού δικτύου, τα ενδοθηλιακά κύτταρα αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και να σχηματίζουν νέα τριχοειδή. Το δίκτυο αυτό αναδιοργανώνεται με γρήγορο ρυθμό, προκειμένου να σχηματίσει το ώριμο πλέον αγγειακό σύστημα, με μια διαδικασία που καλείται αγγειογένεση (Εικόνα 1.2). Εικόνα 1.2 : Σχηματική αναπαράσταση της νεοαγγειογένεση και της αγγειογένεσης. Στη νεοαγγειογένεση, αγγειοβλαστικά αρχέγονα κύτταρα στα νεοσχηματιζόμενα όργανα, όπου βρίσκονται ως νησίδες, αναπτύσσονται σε ενδοθηλιακά και αιματοποιητικά κύτταρα. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα θα σχηματίσουν το πρόδρομο αγγειακό πλέγμα, το οποίο αναπτύσσεται και διαφοροποιείται περαιτέρω προκειμένου να σχηματίσει το ώριμο αγγειακό σύστημα. Η αγγειογένεση είναι δυνατόν να διακριθεί διαδικασίες, όπως η επαγωγή πρωτεϊνασών και η μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Gerwins, 2000). Έχει διαπιστωθεί ότι η διαδικασία της νεοαγγειογένεσης δεν συμβαίνει μόνο κατά την περίοδο της εμβρυογένεσης. Προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία προέρχονται από τον μυελό των οστών, ενσωματώνονται σε εστίες νεοαγγειογένεσης σε περιπτώσεις τραυματισμού του κερατοειδή χιτώνα, ισχαιμιών των άκρων και σε όγκους, 11

αποδεικνύοντας έτσι ότι η νεοαγγειογένεση μπορεί να συμβεί και σε ενήλικα άτομα (Asahara, 1997, Asahara, 1999). Η δημιουργία των νέων αγγείων μπορεί να πραγματοποιηθεί με εκβλάστηση (sprouting) ή με διάσπαση (splitting) των υπαρχόντων αγγείων (Risau, 1997). Η αγγειογένεση με εκβλάστηση συμβαίνει στο λεκιθικό σάκο και στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, ενώ στο ενήλικο άτομο παρατηρείται κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου και τη διαδικασία επούλωσης των πληγών, όπως επίσης και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως δημιουργία όγκων, διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια, ψωρίαση, οστεοαρθρίτιδα, ρευματοειδή αρθρίτιδα κ.ά.. Η διαδικασία της αγγειογένεσης μπορεί να διακριθεί σε πέντε διαφορετικά στάδια (Eικόνα 1.3): 1. Ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων από ένα αγγειογενετικό ερέθισμα Αυξητικοί παράγοντες όπως ο VEGF και FGF επάγουν την αγγειογένεση μέσω δεσμεύσής τους σε υποδοχείς της επιφάνειας των ενδοθηλιακών κυττάρων και έκφρασης γονιδίων μέσω διαφόρων οδών μεταβίβασης σήματος. 2. Αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού και της βασικής μεμβράνης των υπαρχόντων αιμοφόρων αγγείων από μεταλλοπρωτεάσες (ενδοπεπτιδάσες) που εκκρίνονται από τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα (Maragoudakis, 1993) και μετανάστευση των κυττάρων προς το αγγειογενετικό ερέθισμα. Το στάδιο αυτό σημαντική είναι η συμμετοχή μορίων προσκόλλησης όπως π.χ. η ιντεγκρίνη ανβ3. 3. Μετά τη μετανάστευση ακολουθεί πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων και οργάνωσή τους σε νέα αγγεία. Σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αυτή παίζει η σελεκτίνη Ε, μία διαμεβρανική γλυκοπρωτεΐνη που συμβάλει στη δημιουργία επαφών μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων. 4. Το δίκτυο των νέων αγγείων που αρχικά δημιουργείται αναδιοργανώνεται και σχηματίζονται μεγαλύτερα ώριμα αγγεία. Γύρω από τα νέα αγγεία συσσωρεύονται λεία μυϊκά κύτταρα και περικύτταρα (διαφοροποιημένα μεσεγχυματικά κύτταρα), τα οποία σταθεροποιούν το νεοσχηματιζόμενο αγγείο (Ausprunk, 1977). Η αγγειογένεση με διάσπαση συμβαίνει όταν ένα προϋπάρχον αγγείο διχοτομείται από διατριχοειδικά τμήματα ή θέσεις εξωκυττάριου υλικού. Αγγειογένεση της μορφής αυτής συμβαίνει όταν στο εσωτερικό ενός αγγείου γίνεται πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων και δημιουργία ενός μεγάλου αυλού που στη συνέχεια με 12

διατριχοειδικά τμήματα διαιρείται σχηματίζοντας τριχοειδή. Οι δύο τύποι αγγειογένεσης εμπλέκονται στη δημιουργία αγγείων σε όργανα ή ιστούς όπως είναι οι πνεύμονες, η καρδιά και ο λεκιθικός σάκος κατά την ανάπτυξη. Ο τύπος της αγγειογένεσης που θα πραγματοποιηθεί εξαρτάται από τον αριθμό των αγγείων που ήδη υπάρχουν. Εικόνα 1.3: Τα διάφορα στάδια της αγγειογένεσης. Αγγειογενετικοί παράγοντες που απελευθερώνονται από τους παρακείμενους ιστούς (1,2) ενεργοποιούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα (3,4) επάγοντας τον πολλαπλασιασμό (5) και τη μετανάστευση τους (6). Κατά την αναδιοργάνωση του εξωκυττάριου στρώματος σχηματίζονται πρώιμα αγγεία (7,8) τα οποία ενώνονται με τα προϋπάρχοντα αγγεία (9) και σταθεροποιούν τη δομή τους με την υποστήριξη άλλων κυττάρων (10). (www.angio.org/img/cascade) 1.3.1 Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης Πολλά μεταγωγικά μονοπάτια εμπλέκονται στην αγγειογενετική διαδικασία. Αυτά περιλαμβάνουν αυτό του VEGF, το μονοπάτι Νotch/Delta, τις ephrin και τους υποδοχείς τους (Eph receptor), roundabout/slit, and netrin/unc (uncoordinated) receptor families όπως και τις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες hedgehog και sprouty (Ahmed, 2009). Φαίνεται ωστόσο πως η ρύθμιση της αγγειογένεσης είναι εξαιρετικά πολύπλοκη και επηρεάζεται από ένα μεγάλο αριθμό παραγόντων που σχετίζονται με τη διατήρηση της ισορροπίας ανάμεσα στους ενδογενείς προ-αγγειογενετικούς και αντιαγγειογενετικούς παράγοντες. Οι επαγωγείς της αγγειογένεσης επηρεάζουν διαδικασίες 13

όπως ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση ή τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αντίθετα οι αναστολείς της δρουν είτε στοχεύοντας άμεσα τα ενδοθηλιακά κύτταρα, είτε έμμεσα μέσω αναστολής της σύνθεσης αυξητικών παραγόντων από τα κύτταρα του όγκου (Kerbel, 2002) και συνοψίζονται στον Πίνακα 1.2. Πίνακας 1.2 : Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης. Αναστολείς Angiostatin (plasminogen fragment) Antiangiogenic antithrombin III Endostatin (collagen XVIII fragment) Prolactin 16kD fragment Fibronectin fragment Επαγωγείς FGF Angiopoietin-1 Tie receptors VEGF DLL4/Notch receptor Heparinases Νeurophilin-1 Ephrins/Ephrin receptors Midkine Angiopoietin-2 Metalloproteinase inhibitors (TIMPs) κ.α. Platelet-derived endothelial cell growth factor-b (PDGF) Platelet-derived growth factor-b receptor (PDGFR-β) Pleiotrophin (PTN) κ.α. 14

1.4 Εξωκυττάρια ύλη H εξωκυττάρια ύλη (ECM) αποτελεί βασικό συστατικό του μικροπεριβάλλοντος του στρώματος με μεγάλη δομική και λειτουργική σημασία. Λειτουργεί ως «σκαλωσιά» εξυπηρετώντας την οργάνωση των ιστών και ρυθμίζοντας τη διαθεσιμότητα των αυξητικών παραγόντων και των χημοκινών με σκοπό τη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών και οργάνων. Η πολυπλοκότητα του μικροπεριβάλλοντος γίνεται πιο έντονη καθώς πολλά από τα εκκρινόμενα μόρια δρούν ως μόρια που έχουν την ικανότητα να πέπτουν εξωκυττάρια ύλη προκαλώντας ανακατατάξεις, όπως κατά τη διαδικασία επούλωσης τραυμάτων. Η προσκόλληση των κυττάρων στην εξωκυττάρια ύλη εξυπηρετεί την κυτταρική επιβίωση, την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό τους, καθώς η απουσία αλληλεπιδράσεων μπορεί να ενεργοποιήσει μονοπάτια κυτταρικού θανάτου ενώ τυχόν τροποποιήσεις της σύστασής της μπορούν να οδηγήσουν σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος. Η εξωκυττάρια ύλη συγκροτείται από ένα πλήθος πρωτεϊνών οι οποίες συντείθενται από τα παρόντα κύτταρα και απελευθερώνονται στον εξωκυττάριο χώρο. Οι πρωτεΐνες αυτές κατηγοριοποιούνται σε (α) πρωτεογλυκάνες, όπου ανήκουν η θειϊκή ηπαρίνη, η θειϊκή δερματάνη και η θειϊκή κερατάνη (β) οι μη-πρωτεογλυκανικοί πολυσακχαρίτες, όπου ανήκει το υαλουρονικό οξύ το οποίο έχει ως ρόλο να απορροφά τις διακυτταρικές πιέσεις που αναπτύσσονται, μέσω της απορρόφησης νερού και (γ) οι ινώδεις πρωτεΐνες όπως το κολλαγόνο, η ελαστίνη, η ινονεκτίνη και η λαμινίνη (Marastoni, 2008). Όταν το δίκτυο των μακρομορίων της εξωκυττάριας ύλης παρατηρούνται διάφοροι κυτταρικοί τύποι όπως λεμφοκύτταρα, μακροφάγα κ.α. τότε το δίκτυο περιγράφεται με τον όρο συνδετικός ιστός (Εικόνα 1.4). Κολλαγόνο Το κολλαγόνο αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη του συνδετικού ιστού των ζωικών οργανισμών σε ποσοστό 25-30% στο σύνολο των πρωτεϊνων που συγκροτούν τους ιστούς. H εμφάνιση των ινών κολλαγόνου ξεκινά από τα πρώτα στάδια ανάπτυξης των άκρων, και αποτελεί κύριο συστατικό των τενόντων, των συνδέσεων και των οστών. Οι ίνες αυτές αυξάνονται σε μέγεθος και αριθμό κατά τα εμβρυονικά και μεταεμβρυικά 15

αναπτυξιακά στάδια, ενώ η διαδικασία αυτή συνεχίζεται και μέχρι το στάδιο του ενηλίκου ατόμου. Παράγεται από τους ινοβλάστες και τους οστεοβλάστες και κύρια δομική μονάδα συγκρότησής του είναι το τροποκολλαγόνο ή πρωτοκολλαγόνο (Kadler, 2008). Εικόνα 1.4: Αναπαράσταση συνδετικού ιστού. Περιγράφεται το δίκτυο των μακρομορίων της εξωκυττάριας ύλης καθώς και οι διάφοροι κυτταρικοί τύποι που συμμετέχουν. To τροποκολλαγόνο έχει μήκος 300 nm και συνίσταται από τρεις αριστερόστροφες πολυπεπτιδικές αλυσίδες που όλες μαζί σχηματίζουν μια δεξιόστροφη υπερέλικα, η οποία σταθεροποιείται με υδρογονικούς δεσμούς. Η δομή αυτή ονομάζεται μικροϊνίδιο και έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με γειτονικά μικροϊνίδια με σκοπό την τελική σταθεροποίηση της δομής του κολλαγόνου. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες του κολλαγόνου είναι πλούσιες σε γλυκίνη και προλίνη, τα οποία εμφανίζουν περιοδικότητα (κάθε τρίτο αμινοξύ είναι γλυκίνη). Η προλίνη ή υδροξυπρολίνη αποτελούν το 1/6 της ολικής αλληλουχίας του κολλαγόνου ενώ αντίστοιχα η γλυκίνη το 1/3 αυτής. Η σπουδαιότητα της υδροξυπρολίνης καταδεικνύεται στην ασθένεια του σκορβούτο, καθώς ο ασκορβικό όξύ διατηρεί την ενεργότητα της υδροξυλάσης της προλίνης, του ενζύμου που την αναγάγει σε υδροξυπρολίνη. Η διαδικασία αυτή είναι απαραίτητη για το 16

σχηματισμό της βασικής δομής του κολλαγόνου. Η ανικανότητα σχηματισμού του κολλαγόνου οδηγεί σε διαταραχές όπως αιμορραγίες, καταστροφή των ιστών υποστήριξης, δερματικές βλάβες κ.α. Ως τώρα έχουν πιστοποιηθεί 25 διαφορετικές αλυσίδες που κωδικοποιούν από ξεχωριστά γονίδια. Με βάση των αριθμό γονιδίων και τη βασική δομή κολλαγόνου (τριάδα) θα έπρεπε να υπάρχουν πάνω από 1000 διαφορετικά μόρια. Εντούτοις έχουν διαπιστωθεί μόνο 15 διαφορετικά μόρια κολλαγόνου. Υπάρχουν 29 τύποι κολλαγόνου, αλλά το 90% του κολλαγόνου στο σώμα μας είναι τύπου Ι,ΙΙ,ΙΙΙ ή ΙV. To κολλαγόνο τύπου Ι αποτελεί κύριο συστατικό του δέρματος, των οργάνων και των οστών, ενώ ο τύπος ΙΙ απαντάται στους χόνδρους. Το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ σχηματίζει δίκτυο κατά μήκος του πρώτου τύπου κολλαγόνου, ενώ το κολλαγόνο τύπου IV αποτελεί συστατικό της βασικής μεμβράνης. Γενετικές ελλείψεις επηρεάζουν τη βιοσύνθεση του κολλαγόνου, τη συγκρότηση και τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του με αποτέλεσμα την εκδήλωση ασθενειών όπως η ίνωση των πνευμόνων, του ήπατος, το σύνδρομο Ehles-Danlos κ.α. Ελαστίνη Η ελαστίνη είναι πρωτεΐνη του συνδετικού ιστού και επιτρέπει στους ιστούς να διατηρούν την ελαστικότητα και το σχήμα τους. Απαντάται στο δέρμα, τα αιμοφόρα αγγεία και είναι πλούσια σε γλυκίνη και προλίνη, χωρίς όμως τη χαρακτηριστική περιοδικότητα του κολλαγόνου. Τα μόριά της συνδέονται μεταξύ τους με ομοιοπολικούς δεσμούς δημιουργώντας ένα εκτεταμένο ελαστικό δίκτυο (Εικόνα 1.5). Σε ασθενείς που τα μόρια της ελαστίνης δεν έχουν την ικανότητα να διασυνδεθούν επειδή τους λείπει το ένζυμο οξειδάση της λυσίνης, οι αρτηρίες χάνουν την ελαστικότητά τους (Μαρμάρας, 2000). 17

Εικόνα 1.5: Διάταξη των ινών κολλαγόνου και ελαστίνης. (A) Η τριπλή έλικα του κολλαγόνου με τις τρεις πρωτεϊνικές αλυσίδες που περιτυλίσσονται η μία γύρω από την άλλη. Οι δομές του κολλαγόνου φέρουν τη μορφή ράβδου και συνδέονται μεταξύ τους για να φτιάξουν την τελική μορφή του κολλαγόνου. (B) Οι αλυσίδες της ελαστίνης συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας ελαστικά «κουβάρια». Κάθε ελαστικό μόριο ελαστίνης ξετυλίσσεται παίρνοντας μια νέα διαμόρφωση όταν η ίνα εκτείνεται και επανέρχεται στην αρχική της κατάσταση όταν πάψει να ασκείται η δύναμη αυτή. (www.accessexcellence.org) Ινονεκτίνη (Φιμπρονεκτίνη) Η ινονεκτίνη είναι μια μεγαλομοριακή πρωτεΐνη 440kDa με ικανότητα να προσδένεται σε άλλες πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας όπως οι ιντεγκρίνες μέσω του μοτίβου αργινίνη-γλυκίνη-ασπαραγίνη, ή και σε συστατικά της εξωκυττάριας ύλης όπως το κολλαγόνο και οι πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαρίνης. Υφίσταται ως διμερές που αποτελείται από δύο μονομερή που συνδέονται μεταξύ τους με ένα ζεύγος δισουλφιδικών δεσμών. Η διαφορική ωρίμανση του RNA της, έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία διαφορετικών ισομορφών. Στο άνθρωπο έχουν διαπιστωθεί 20 mrna ινονεκτίνης γεγονός που προσδίδει εξειδικευμένη λειτουργικότητα στο μόριό της. Στα σπονδυλωτά υπάρχουν δύο διαφορετικές μορφές ινονεκτίνης (α) η διαλυτή μορφή, που αποτελεί και την κύρια πρωτεΐνη του πλάσματος στο αίμα και παράγεται από τα ηπατοκύτταρα και (β) η μη-διαλυτή μορφή, που αποτελεί συστατικό της εξωκυττάριας ύλης και εκκρίνεται από πολλά κύτταρα και κυρίως τους ινοβλάστες. 18

Η ινονεκτίνη συμμετέχει σε διάφορες λειτουργίες γιατί κάθε περιοχή του μορίου της είναι υπεύθυνη για διαφορετική λειτουργία. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 1.6, φέρει περιοχές που συνδέονται με το κολλαγόνο ή τις πρωτεογλυκάνες, ενώ στην ιδιότητα της να βοηθά στη δέσμευση των κυττάρων με τις εξωκυτταρικές γλυκοπρωτεΐνες, φαίνεται ότι οφείλεται και η συμμετοχή της στη μετανάστευση των κυττάρων, ιδίως κατά την εμβρυακή ανάπτυξη. Συμμετέχει ακόμα στην κυτταροφαγία, την πήξη του αίματος, και την επούλωση πληγών, ενώ εμπλέκεται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπως στον καρκίνο και σε ινώσεις των πνευμόνων και του ήπατος. Εικόνα 1.6: Δομή ινονεκτίνης με τις επιμέρους περιοχές αλληλεπίδρασης με τα άλλα μόρια της εξωκυττάριας ύλης. 1.5 Μεταλλοπρωτεάσες του εξωκυττάριου χώρου των θηλαστικών (ΜΜΡs) 1.5.1 Γενικά Η αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης ρυθμίζεται από την ισορροπημένη δράση πρωτεασών και αναστολέων τους. Στην κατηγορία των μορίων αυτών ανήκουν οι σεραλυσίνες, οι ADAMs καθώς και οι ΜΜPs, ενδοπεπτιδάσες πρωτεϊνικής φύσης, που 19

είναι γνωστές και ως ματριξίνες ή μεταλλοπρωτεϊνάσες (Εικόνα 1.7) λόγω της απαραίτητης παρουσίας ψευδαργύρου (Zn 2+ ) στο ενεργό κέντρο τους προκειµένου να δράσουν (Zinc-dependent). Πρόκειται για υποοικογένεια των Μεταλλοπεπτιδασών στην οποία έχουν αναγνωριστεί τουλάχιστον 23 γονίδια στον άνθρωπο και τα οποία εµφανίζουν µεταξύ τους δοµική αναλογία. Παράγονται από διάφορα κύτταρα, όπως τα µακροφάγα, οι ινοβλάστες, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα κερατινοκύτταρα (Saja, 2007). Εικόνα 1.7: Η υπεροικογένεια των MMPs (Masafumi, 2003). Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες εμπλέκονται στην αναδιοργάνωση των συστατικών της εξωκυττάριας ύλης στα διάφορα στάδια ανάπτυξης, μορφογένεσης και ιστικής διαφοροποίησης, πέπτοντας κολλαγόνο, ελαστίνη, ινονεκτίνη, λαμινίνη και διάφορες πρωτεογλυκάνες. Η απορύθμιση της όλης διαδικασίας αποτελεί πολλές φορές αιτία για την ανάπτυξη ασθενειών όπως η νεφρίτιδα και ο καρκίνος. Αυξημένη εναπόθεση της εξωκυττάριας ύλης μπορεί ακόμη να αποτελέσει αιτία εκδήλωσης αθηροσκλήρωσης, στένωσης, καρδιακής ανεπάρκειας, οστεόλυσης, περιοδοντίτιδας και ρευµατοειδής 20

αρθρίτιδας (Cao, 2000). Παράλληλα φαίνεται να συμμετέχουν και στην διακυτταρική μεταβίβαση σήματος, την επιβίωση και τον κυτταρικό θάνατο. Συγκεκριμένα, σε περιπτώσεις εκδήλωσης φλεγμονής μετά από κάποια μόλυνση ή ισχαιμικό επεισόδιο, μπορούν να οδηγήσουν σε ενεργοποίηση και δράση των πρωτεασών με αποτέλεσμα την αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης και το άνοιγμα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, παρεμποδίζοντας έτσι τη φυσιολογική μεταγωγή σήματος με αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο (Candelario, 2009). Η έκφρασή τους επάγεται κατά την φλεγμονή από κυτταροκίνες, αυξητικούς παράγοντες, ορμόνες, αλληλεπιδράσεις κυττάρου με κύτταρο και κυττάρου με την εξωκυττάρια ύλη (Nagase, 1999). Η ενζυµική δραστικότητα των MMPs ρυθμίζεται αφενός από την ενεργοποίηση των προ-ζυμογόνων (προ-μορφές) και αφετέρου από τη συµπλοκοποίηση των ενεργών µορφών τους από τους ενδογενείς ιστικούς αναστολείς των µεταλλοπρωτεασών, γνωστοί ως TIMPs (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases). Η ισορροπία μεταξύ των MMPs και των TIMPs είναι καθοριστική για την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ύλης σε κάθε ιστό (Newby, 2005, Spinale, 2002). 1.5.2 Δομικά χαρακτηριστικά των MMPs Μια τυπική μεταλλοπρωτεϊνάση αποτελείται από το σηµατοδοτικό πεπτίδιο (signal peptide) μεγέθους 17-30 αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο το οποίο κατευθύνει την πρωτεΐνη στο ενδοπλασµατικό δίκτυο ακολουθώντας την πορεία των εκκρινοµένων ενζύµων (Birkedal-Hansen, 1993) και το προπεπτίδιο (propeptide), μεγέθους 80 αμινοξέων, το οποίο καλύπτει το ενεργό κέντρο του ενζύµου, µέσω ενός δεσµού που αναπτύσσεται µεταξύ Zn 2+ και µιας Cys. Όταν το προπεπτίδιο αφαιρεθεί από το µόριο προκύπτει η ενεργός µορφή του ενζύµου. Φέρει ακόμα ένα καταλυτικό κομμάτι με δράση μεταλλοπρωτεάσης 170 αμινοξέων, ένα συνδετικό πεπτίδιο (hinge region) ποικίλου μεγέθους καθώς και ένα τμήμα 200 περίπου αμινοξέων που εμφανίζει ομολογία με την αιμοπηξίνη. Εξαίρεση από αυτό το βασικό μοντέλο αποτελούν η MMP-7, η MMP-26 και η MMP-23 από τις οποίες απουσιάζουν το συνδετικό πεπτίδιο και η περιοχή της αιμοπηξίνης. Η MMP-23 διαφέρει επίσης από τις άλλες MMPs στο ότι έχει μια μοναδική περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες και μια περιοχή που φέρει ομολογία με την 21

ανοσοσφαιρίνη. Η MMP-2 και η MMP-9 έχουν τρείς επαναλήψεις ενός μοτίβου ινονεκτίνης στο κομμάτι που έχει δράση μεταλλοπρωτεϊνάσης (Εικόνα 1.8) (Nagase, 2006). Kοινά δομικά χαρακτηριστικά για όλες τις MMPs αποτελούν το μοτίβο HEXXHXXGXXH, το οποίο εντοπίζεται στο καταλυτικό τμήμα όλων των MMPs και περιέχει τρεις συντηρημέες ιστιδίνες που συνεργάζονται με το ιόν Zn +2 στην καταλυτική περιοχή καθώς και το μοτίβο PRCGXPD που βρίσκεται στο καρβοξυ-τελικό άκρο του προπεπτιδίου. Η κυστεΐνη στο μοτίβο του προπεπτιδίου συνεργάζεται με το καταλυτικό ιόν Zn +2 και ο δεσμός αυτός (Cys-Zn ++ ) κρατά τις προμορφές των MMPs ανενεργές εμποδίζοντας ένα μόριο H 2 O, σημαντικό για την κατάλυση, να προσδεθεί στο άτομο Zn. Η καταλυτική περιοχή περιέχει επίσης μια συντηρημένη μεθειονίνη, η οποία σχηματίζει μια στροφή- μεθειονίνης (Met-turn) 8 αμινοξέα μετά το μοτίβο που δένει ο Zn, στηρίζοντας έτσι τη δομή γύρω από τον καταλυτικό Zn. Εικόνα 1.8: Δομικά χαρακτηριστικά όλων των οικογενειών των MMPs. 22

1.5.3 Κατάταξη των MMPs Ανάλογα με την δομή και την προτίμηση ως προς το υπόστρωμα, οι MMPs κατηγοριοποιούνται σε κολλαγενάσες, ζελατινάσες, στρωμολυσίνες, ματρυλυσίνες και οι μεμβρανικού-τύπου MMPs. Οι κολλαγενάσες (MMP-1, MMP-8, MMP-13) αποικοδομούν το κολλαγόνο Ι, ΙΙ, III και IV διάφορα άλλα μόρια εξωκυττάριας ύλης καθώς και διαλυτές πρωτεΐνες (Woessner, 2000). Η κολλαγενάση 1 (ή MMP-1) ανιχνεύεται σε μια πλειάδα φυσιολογικών και παθολογικών ιστών. Κατά την επούλωση πληγών η MMP-1 απελευθερώνεται από τα κερατινοκύτταρα και ρυθμίζει την κυτταρική μετανάστευση μέσω δέσμευσης στην ιντεγκρίνη α2β1 και στο κολλαγόνο Ι (Dumin, 2001). Σε περιπτώσεις αθηροσκλήρωσης, η MMP-1 μαζί με άλλες πρωτεάσες που απελευθερώνονται από ένα μεγάλο αριθμό μακροφάγων που βρίσκονται στην αθηρωματική πλάκα θεωρούνται υπεύθυνες για την αποσταθεροποίηση της ινώδους κάψας και τελικά την ρήξη της (Lutgens, 2003). Η κολλαγενάση 2 (ή MMP-8) απελευθερώνεται κυρίως σε φλεγμονώδεις καταστάσεις από τα ουδετερόφιλα (Jeffrey, 1998). Άν και έχει ανιχνευτεί σε μια πλειάδα καρκινικών ιστών όπως και οι περισσότερες MMPs, θεωρείται ότι έχει ένα προστατευτικό ρόλο ενάντια στον καρκίνο. Συγκεκριμένα μύες οι οποίοι δεν φέρουν το γονίδιο της MMP-8 αν και δεν εμφάνισαν κάποια ανωμαλία κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη ή κατά το ενήλικο στάδιο της ζωής τους βρέθηκε να έχουν μεγάλη πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνων του δέρματος (Balbin, 2003). Επιπλέον, η MMP-8 έχει προστατευτικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου της γλώσσας, συμμετέχοντας στη βελτίωση της υγείας των ασθενών (Korpi, 2008). Τέλος η κολλαγενάση 3 (ή MMP- 13) εκφράζεται κατά την εμβρυονική ανάπτυξη στα χονδροκύτταρα και τους οστεοβλάστες, πέπτει κυρίως το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ, και συνεχίζει να εκφράζεται ακόμη και μετά την γέννηση κατά την σκελετική διαμόρφωση (Tetlow, 2006). Διαγονιδιακή έκφραση της ενεργούς MMP-13 στον αρθρικό χόνδρο μυών οδήγησε σε παθολογικές αλλαγές ίδιες με αυτές που παρατηρούνται στην οστεοαρθρίτιδα στον άνθρωπο, με αυξημένη αποικοδόμηση του κολλαγόνου ΙΙ, του κύριου τύπου κολλαγόνου στους χόνδρους, αποδεικνύοντας έτσι την καταλυτική δράση της MMP-13 στην 23

εμφάνιση της νόσου (Neuhold, 2001). Πειραματικά μοντέλα ποντικών Mmp13 -/- παρουσίασαν μείωση του δερματικού καρκινώματος (squamous cell carcinoma (SCC)), αποδεικνύοντας πιθανό ρόλο της συγκεκριμένης MMP στην εξάπλωση αυτού του καρκινικού τύπου (Lederle, 2009). Επίσης, τόσο η MMP-1 όσο και η MMP-13 εντοπίζονται σε κύτταρα και ιστούς που προέρχονται από κύτταρα και ιστούς ασθενών με ρευματοειδή αρθροπλασία των γονάτων και θεωρούνται υπεύθυνες για την καταστροφή των συνδέσεων (Tetlow, 2009). Οι ζελατινάσες (MMP-2, MMP-9) χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα µετουσιωµένα κολλαγόνα και ιδιαίτερα ζελατίνη που αποτελεί προϊόν αποικοδόμησης του κολλαγόνου IV. Η ζελατινάση 1 (ή MMP-2) αποικοδομεί συγκεκριμένα το κολλαγόνο V, VII και X, την ελαστίνη, την ινονεκτίνη, τη λαμινίνη ενώ ενεργοποιεί ταυτόχρονα την prommp-1 και prommp-9. Τα θραύσματα που προκύπτουν από την αποικοδόμηση της ινονεκτίνης και της λαμινίνης από την MMP-2 φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην συνάθροιση των μακροφάγων στο εσωτερικό της ενδοθηλιακής στοιβάδας στα αρχικά στάδια της φλεγμονής του ενδοθηλίου (Matsumura, 2005). Εκφράζεται από τους περισσότερους τύπους κυττάρων και είναι σημαντική για την κυτταρική μετανάστευση σε φυσιολογικές διαδικασίες όπως η μορφογένεση αλλά και κατά την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων (Yu, 1998). Η ζελατινάση 2 (ή MMP-9) εκτός από την περιοχή που εμφανίζει ομολογία με την ινονεκτίνη περιέχει και μια περιοχή ομόλογη του κολλαγόνου V μεταξύ της καταλυτικής περιοχής και αυτής της αιμοπηξίνης. Αποικοδομεί κυρίως το κολλαγόνο τύπου IV, V και XI και την ελαστίνη (Visse, 2003) παράγεται και εκκρίνεται από πολλά κύτταρα, µεταξύ των οποίων και µονοκύτταρα και η παραγωγή της αυξάνεται όταν τα κύτταρα αυτά διαφοροποιηθούν σε µακροφάγα (Birkedal-Hansen, 1993). Η MMP-9 ενεργοποιεί κυτταροκίνες όπως η ιντερλευκίνη 1-β (Ito, 1996) και ο TGF-β (Yu, 2000) ενώ έχει την ικανότητα να μετατρέπει το πλασμινογόνο σε αγγειοστατίνη (Patterson, 1997). Στην αθηροσκλήρωση μελέτες δείχνουν ότι η MMP-9 συμμετέχει στην ρύθμιση της επέκτασης και της δριμύτητας της αθηρωματικής πλάκας. Βιοψίες από ασθενείς με αρτηριακή απόφραξη έδειξαν αυξημένη έκφραση της MMP-9 (Brown, 1995) και μια μετάλλαξη στον υποκινητή του γονιδίου της η οποία σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση του ενζύμου (Zhang, 1999). Η MMP-9 εμφανίζει αυξημένη έκφραση στον προμετωπιαίο εγκεφαλικό φλοιό και πολυμορφισμοί 24

του γονιδίου της την έχουν συσχετίσει με τη σχιζοφρένεια (Rybakowski, 2009). Σε πειραματικά μοντέλα σκύλων, η αυξημένη έκφρασή της έχει συνδεθεί με το σύνδρομο Alport, προσδίδοντας της σημαντικό ρόλο στην εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης στα νεφρικά σπειράματα (Velidi, 2003). Τα αυξημένα επίπεδα ΜΜΡ-9 αποτελούν προγνωστικό δείκτη ασθενών που παρουσιάζουν μεταστατικό καρκίνο του γαστρεντερικού συστήματος με ταυτόχρονη ανοχή στη χημειοθεραπεία, αποδεικνύοντας το ρόλο της ΜΜΡ-9 τόσο στα αρχικά στάδια διείσδυσης όσο και στα μεταστατικά στάδια αυτού του καρκινικού τύπου (Batran, 2009). Επίσης λεία μυικά κύτταρα που δεν εξέφραζαν MMP-9 εμφάνισαν μειωμένη ικανότητα μετανάστευσης in vitro, αποδεικνύοντας ότι η ενεργότητα της MMP-9 είναι απαραίτητη για την διήθηση των λείων μυικών κυττάρων από την αθηρωματική πλάκα (Galis, 2002). Ωστόσο τα τελευταία χρόνια μελέτες έχουν δείξει έναν αθηροπροστατευτικό ρόλο της MMP-9. Συγκεκριμένα σε μύες οι οποίοι δεν φέρουν το γονίδιο της MMP-9 (MMP-9 -/- ) και πάσχουν από αθηροσκλήρωση η εξέλιξη της νόσου είναι ταχύτερη από αυτή που παρατηρείται στους μύες που φέρουν το γονίδιο (Johnson, 2005). Ο ρόλος λοιπόν της MMP-9 στην αθηροσκλήρωση αλλά και σε μια σειρά άλλων παθολογικών καταστάσεων εξαρτάται από το στάδιο της νόσου αλλά και από άλλα μόρια που προκύπτουν από την δράση του ενζύμου. Ακόμη, τόσο οι MMP-2 και MMP-9 όπως και οι αναστολείς τους ΤΙΜΡ-1 και -2 παράγονται από τα ΝΚ κύτταρα της μήτρας ρυθμίζοντας διαδικασίες κατά τα πρώτα στάδια διάταξης του πλακούντα (Narusel, 2009). Οι στρωματολυσίνες 1 (MMP-3) και 2 (MMP-10) αν και έχουν παρόμοια δομή με τις κολλαγενάσες δεν έχουν την ικανότητα αποικοδόμησης του κολλαγόνου, είναι όμως ικανές να πέψουν ένα ευρύ φάσμα υποστρωμάτων όπως οι πρωτεογλυκάνες, η ινονεκτίνη, η λαμινίνη και η ζελατίνη ενώ παράλληλα μπορούν να ενεργοποιήσουν την προmmp-9 καθώς και τις προκολλαγενάσες (Nagase, 1995). Συγκεκριμένα η MMP-3 εκφράζεται φυσιολογικά κυρίως από τα κύτταρα του στρώματος κατά την ανάπτυξη του μαστικού αδένα (Lung, 1996). Υπερέκφρασή της όμως μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη καρκίνου του μαστού, γεγονός που την καθιστά ένα φυσικό καρκινικό επαγωγέα (Sternlicht, 1999). H ενεργοποίησή της εξαρτάται από σερινοπρωτεάσες (Jin, 2006) ενώ η έκφρασή της μπορεί να επαχθεί και από τον ιστοειδικό ενεργοποιητή του πλασμινογόνου tpa (Suzuki, 2009). Η MMP-10 με την σειρά της παρατηρείται σε ιστούς 25

που βρίσκονται σε διαδικασία επούλωσης όπου συμμετέχει στην μετανάστευση των κερατινοκυττάρων ενώ ανιχνεύεται και σε διάφορα καρκινώματα. Φαίνεται πως τόσο η MMP-3 όσο και η MMP-1 εμπλέκονται στην ανάπτυξη των οστών, με μόνη διαφορά ότι η MMP-10 εκκρίνεται στην ενεργή της μορφή ενώ η MMP-3 εκκρίνεται με τη μορφή προενζύμου προσδεδεμένη στη θεμέλια ουσία (Krampert, 2004, Bord, 2003). Οι ματριλυσίνες 1 (MMP-7) και 2 (MMP-26) δομικά χάνουν το συνδετικό πεπτίδιο καθώς και την περιοχή που φέρει ομολογία με την αιμοπηξίνη ενώ έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν το κολλαγόνο IV, την λαμινίνη και την εντακτίνη (Wilson, 1998). Η MMP-7 εκκρίνεται φυσιολογικά από επιθηλιακά κύτταρα εξωκρινών αδένων αλλά έχει ανιχνευτεί και σε διάφορους καρκίνους. Συγκεκριμένα έλλειψη της MMP-7 μειώνει την ανάπτυξη όγκων στον εντερικό σωλήνα μυός με καρκίνο του εντέρου (Wilson, 1997). Η MMP-7 συμμετέχει επίσης στην διαδικασία της αθηροσκλήρωσης διευκολύνοντας την διείσδυση των μακροφάγων στο ενδοθήλιο (Haro, 2000). Η MMP- 26 εκφράζεται στη μήτρα, στα νεφρά και στον πλακούντα. Σε περιπτώσεις ασθενειών όμως παρατηρείται στον καρκίνο των πνευμόνων και του ενδομητρίου (Uria, 2000). Ενεργοποιείται συνήθως με αυτοκατάλυση και είναι ταυτόχρονα ικανή να ενεργοποιήσει την προmmp-9. Τέλος έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται στα αρχικά στάδια της εγκυμοσύνης όπου συμμετέχει στην εμφύτευση του εμβρύου στο ενδομήτριο (Liu, 2005). Οι μεμβρανικού τύπου μεταλλοπρωτεϊνάσες (membrane-type metalloproteinases, MT-MMPs) είναι κυρίως υπεύθυνες για την πρωτεόλυση που λαμβάνει χώρα κοντά στην κυτταρική επιφάνεια. Από την πρωτεόλυση εκκινούν διάφορες κυτταρικές διαδικασίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση, η διαφοροποίηση και η μετανάστευση. Έχουν την ικανότητα να πέπτουν πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης όπως ζελατίνη, κολλαγόνο, ινονεκτίνη, λαμινίνη, aggrecan, pelican και πρωτεογλυκάνες, αλλά και πρωτεΐνες που δεν ανήκουν στα συστατικά της εξωκυττάριας ύλης (Εικόνα 1.9). Η MT4-MMP μπορεί να δράσει ως πεπτιδάση του νεκρωτικού παράγοντα TNF-α, ενώ η MT6-MMP απελευθερώνει την D1 υπομονάδα του upa υποδοχέα πέπτοντας το τμήμα που συνδέει τις υπομονάδες D1 και D2 (Sohail, 2008). Περιλαμβάνει 6 μέλη τα οποία φέρουν ένα υδροφοβικό αγκυροβόλιο στο 26

καρβοξυ-τελικό τους, μέσω του οποίου συνδέονται με την πλασματική μεμβράνη (Υana, 2002). Εικόνα 1.9: Κύρια χαρακτηριστικά των MT-MMPs. Στον πίνακα αναλύονται τα χαρακτηριστικά προς το υπόστρωμα που πέπτουν, τους αναστολείς που παρεμποδίζουν τη δράση τους και τους καρκινικούς τύπους στους οποίους υπερεκφράζονται. (Συντομεύσεις: Agg, Aggrecan; CD44, Hyaluronan Receptor; Col, Collagen; CS, Chondroitin Sulfate; DS, Dermatan Sulfate; Fb, Fibrin; Fg, Fibrinogen; Fn, Fibronectin; Gel, Gelatin; GPI, Glycosylphosphatidyl-Inositol; Ln, Laminin; MIP, Myelin-Inhibitory Protein; NI, No Information; Ng, Nidogen; Per, Perlecan; T, Tissue Inhibitor of Metalloproteinases; Te, Tenascin; TMD, Transmembrane Domain; TNF, Transforming Growth Factor; ttg, Surface Tissue Transglutaminase; Vn, Vitronectin; 1-PI, 1-Proteinase Inhibitor; 2M, Macroglobulin 2.) Εκτός από την MMP-17 (MT4-MMP) όλες οι άλλες ενεργοποιούν την pro- MMP2 (Knauper, 1998). Η ομάδα των διαμεμβρανικών MMPs περιλαμβάνει τέσσερις τύπου 1 διαμεμβρανικές MMPs (MT-MMP-1, MT-MMP-2, MT-MMP-3, MT-MMP-5) καθώς και δύο διαμεμβρανικές MMPs που συνδέονται ενδοκυττάρια με μια γλυκόζυλφωσφατιδυλο-ινοσιτόλη (GPI), οι MMP-17, -25 (MT-MMP-4 και MT-MMP-6 αντίστοιχα). Φέρουν μια συντηρημένη αλληλουχία 20 αμινοξέων η οποία αποτελεί σημείο αναγνώρισης από το ένζυμο furin και έτσι ενσωματώνονται στην κυτταρική μεμβράνη ενεργές. Η MMP-14 (MT1-MMP) είναι η σημαντικότερη διαμεμβρανική MMP αφού έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχει σε μια σειρά φυσιολογικών διαδικασιών όπως η κυτταρική μετανάστευση, η αναδιάταξη (remodeling) του στρώματος, η αγγειογένεση, 27

η επούλωση πληγών (Knauper, 1998) αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος, η αθηροσκλήρωση κ.ά. Πέπτει κυρίως λαμινίνη, ινονεκτίνη και υποστρώματα πρωτεογλυκανών ενώ αλληλεπιδρά με την pro-mmp-2 καθώς και την pro-mmp-13 (Υana, 2002). Η MMP-15 (MT2-MMP) με την σειρά της πέπτει ινονεκτίνη, aggrecan και perlecan. Φαίνεται να υπερεκφράζεται σε περιπτώσεις καρκίνου και προστατεύοντας τα καρκινικά κύτταρα από την διαδικασία της απόπτωση (Abraham, 2005). Η MMP-16 πέπτει την ινονεκτίνη και το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ και εμφανίζεται σε υψηλά επίπεδα σε περιπτώσεις οστεοαρθρίτιδας αν και δε φαίνεται να έχει πρωτεύοντα ρόλο στην αποικοδόμηση την εξωκυττάριας ύλης των χόνδρων (Garvican, 2008). Παρόλο που πρωτοανιχνεύτηκε σε όγκους, πλέον έχει διαπιστωθεί ότι εκφράζεται και σε φυσιολογικούς ιστούς όπως ο πλακούντας, ο εγκέφαλος και τα αγγειακά λεία μυικά κύτταρα (Shofuda, 1997). Η MMP-17 (MT4-MMP) ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε καρκίνο του στήθους (Puente, 1996). Φαίνεται να εκφράζεται τόσο σε φυσιολογικούς όσο και σε καρκινικούς ιστούς (Grant, 1999). Η MMP-24 (MT5-MMP) εκφράζεται φυσιολογικά κυρίως στον εγκέφαλο (Llano, 1999). Ανιχνεύεται στους νευρώνες τόσο του κεντρικού όσο και του περιφερικού νευρικού συστήματος (Hayashita, 2001) και συνήθως έλλειψη του γονιδίου της προκαλεί δυσκολία στην μεταφορά των νευρωνικών ερεθισμάτων. Το τελευταίο μέλος των διαμεμβρανικών MMPs, η MMP-25 φαίνεται πως υπερεκφράζεται σε περιπτώσεις καρκίνου του εντέρου (Sun, 2008) και εκφράζεται φυσιολογικά στα λευκοκύτταρα, στους πνεύμονες και στον σπλήνα, ενώ έχει βρεθεί και σε καρκίνους του εγκεφάλου όπου συμμετέχει στην εξέλιξη της νόσου μέσω της ικανότητάς της να ενεργοποιεί την προ-mmp-2 (Velasco, 2000). Όλες οι άλλες MMPs (MMP-11,-12,-19,-20,-21,-22,-23A,-23B και -28) δεν εμφανίζουν κοινά δομικά χαρακτηριστικά με κάποια από τις παραπάνω ομάδες οπότε κατατάσσονται όλες μαζί σε μια τελευταία ομάδα. Η MMP-11 (ή στρωματολυσίνη 3) εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα κατά την εμβρυογένεση αλλά η έκφρασή της αυξάνεται σημαντικά σε περιπτώσεις καρκίνου, κυρίως στους ινοβλάστες που βρίσκονται σε επαφή με τον καρκινικό όγκο και προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα από την απόπτωση αποτελώντας έτσι ένα δείκτη επιθετικότητας του καρκίνου (Muller, 1993, Wu, 2001). Σημαντικός φαίνεται πως είναι ο ρόλος της και στην ανάπτυξη όγκων που σχετίζονται με τα αστροκύτταρα (Stojica, 2008). Η MMP-12 εκκρίνεται κυρίως από τα μακροφάγα και 28

παρατηρείται αυξημένη σε περιπτώσεις αθηροσκλήρωσης (Luttun, 2004), η MMP-19 εκφράζεται στην επιδερμίδα όπου επάγει τον πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων αποικοδομώντας την προσδενόμενη στην IGF-πρωτεΐνη-3 (IGF-binding protein-3) (Sadowski, 2003). Η MMP-20 (ή εναμελυσίνη) εκφράζεται φυσιολογικά κατά τον σχηματισμό του σμάλτου των δοντιών, η MMP-21 ανιχνεύεται κατά την εμβρυογένεση και αργότερα σε νευρωνικούς ιστούς (Marchenko, 2003), ενώ φαίνεται να επάγεται στα αρχικά στάδια του μελανώματος και να καταστέλλεται στις πιο επιθετικές μορφές καρκίνου του δέρματος. (Kuivanen, 2005), ενώ η MMP-22 εκφράζεται στα Β- λεμφοκύτταρα χωρίς να έχει ταυτοποιηθεί ακόμα η ακριβή της λειτουργία. Τέλος η MMP-23, το γονίδιο της οποίας είναι διπλασιασμένο, εκφράζεται στις οωθήκες, στους όρχεις και στον προστάστη κρατώντας ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην αναπαραγωγική διαδικασία (Velasco, 1999) και τέλος η MMP-28 ή επιλυσίνη, εκφράζεται κυρίως στους όρχεις και την καρδιά, αλλά έχει βρεθεί και στα κερατινοκύτταρα ιστών που έχουν υποστεί βλάβη εμπλεκόμενη έτσι στην επαναδιόρθωση του ιστού (Lohi, 2001). 1.5.4 Τρισδιάστατη δομή των MMPs Στην προσπάθεια να γίνει κατανοητός ο τρόπος με τον οποίο οι MMPs αποικοδομούν το υπόστρωμα, τους κρίθηκε απαραίτητη η αποκάλυψη της τρισδιάστατης δομής και κυρίως της καταλυτικής περιοχής κάθε μορίου. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και φασματοφωτομετρία μάζας (Nagase, 2006, Maskos, 2005). Η MMP-1 που ανήκει στην οικογένεια των κολλαγενασών ήταν η πρώτη που αναλύθηκε και η τρισδιάστατη δομή της παρουσιάζεται στην Εικόνα 1.10 (Nagase, 2006). Για να αποικοδομήσουν τα αντίστοιχα υποστρώματα όλες οι MMPs πρέπει να βρίσκονται στην ενεργή μορφή τους. Η ενεργοποίηση μπορεί να γίνει είτε από άλλες πρωτεϊνάσες όπως το πλασμινογόνο (Frederiks, 2006), είτε από τις ίδιες τις MMPs. Το σημείο στο οποίο δένει η πρωτεϊνάση αρχικά βρίσκεται μεταξύ της πρώτης και της δεύτερης έλικας στο προπεπτίδιο κάθε μεταλλοπρωτεϊνάσης το οποίο όπως αναφέρθηκε και παραπάνω αποτελείται από τρείς α-έλικες. 29

Εικόνα 1.10: Τρισδιάστατη δομή της προmmp-1 και της ενεργούς μορφής της. Στην εικόνα φαίνεται με κόκκινο χρώμα το προπεπτίδιο της MMP-1 το οποίο όπως και σε όλες τις MMPs αποτελείται από τρείς α- έλικες. Ακολουθεί η καταλυτική περιοχή με ρόζ χρώμα η οποία αποτελείται από πέντε β- πτυχώσεις, τρεις α-έλικες και μια συνδετική θηλιά και περιέχει δύο ιόντα Zn (μωβ χρώμα), ένα καταλυτικό και ένα δομικό και τρία ιόντα Ca ++ που σταθεροποιούν την δομή του μορίου. Η περιοχή της αιμοπηξίνης (πράσινο χρώμα) αποτελείται απο πολλές β-πτυχώσεις και ένα ιόν Ca ++. Ο διακεκομένος κύκλος δείχνει το σημείο αλληλεπίδρασης της καταλυτικής περιοχής με αυτή της αιμοπηξίνης. Η επιλογή του υποστρώματος από κάθε μεταλλοπρωτεϊνάση υπαγορεύεται από την δομή του σημείου πρόσδεσης, το οποίο καλείται S1 pocket και βρίσκεται πάντα δίπλα στο καταλυτικό ιόν Zn. Η θέση αυτή είναι υδροφοβική και διαφέρει μεταξύ των MMPs και αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της εξειδίκευσης των MMPs ως προς το υπόστρωμα. Με την πρόσδεση του υποστρώματος στο ένζυμο απομακρύνεται ένα μόριο H 2 O από το ιόν Zn και επιτρέπεται η υδρόλυση ένος πεπτιδικού δεσμού στο υπόστρωμα και έτσι δημιουργούνται δύο θράυσματα τα οποία μπορούν με την σειρά τους να υποστούν περαιτέρω αποικοδόμηση απο την ίδια μεταλλοπρωτεϊνάση (Nagase, 2006). Η κυστεΐνη που βρίσκεται προς το καρβοξυτελικό άκρο του προπεπτιδίου μέσω της σουλφιδρυλ- ομάδας (SH) της αλληλεπιδρά με το ιόν Zn της καταλυτικής περιοχής ώστε να σταθεροποιηθεί η «κλειστή» δομή της ανενεργούς μορφής. Με την απομάκρυνση του προπεπτιδίου ο δεσμός Cys- Zn σπάει και ένα μόριο H 2 Ο δένει στον ιόν Zn. Με αυτό τον τρόπο προκύπτει η «ανοιχτή» δομή του μορίου η οποία είναι πλέον 30

έτοιμη να δεχτεί το υπόστρωμα (Jozic, 2005). Οι ζελατινάσες (MMP-2 και MMP-9) έχουν τρείς επιμέρους περιοχές που φέρουν ομολογία με την ινοονεκτίνη εντός της καταλυτικής περιόχης. Κάθε υποπεριοχή αποτελείται απο δύο αντιπαράλληλες β- πτυχώσεις οι οποίες διασυνδέονται με μια μικρή α-έλικα και σταθεροποιούνται με δύο δισουλφιδικούς δεσμούς (κίτρινο χρώμα στην Εικόνα 1.11). Επιμέρους μελέτες φασματοφωτομετρίας έδειξαν ότι η δεύτερη και τρίτη υποπεριοχή εμφανίζουν αρκετή ευελιξία και πιθανώς αλληλεπιδρούν ταυτόχρονα με πολλές περιοχές της εξωκυττάριας ύλης (Briknarova, 2001). Εικόνα 1.11: Τρισδιάστατη δομή των ομόλογων περιοχών με την ινονεκτίνη στο μόριο της MMP-2. 1.5.5 Ενεργοποίηση των MMPs Οι MMPs συντίθεται και παράγονται ως προμορφές και και ενεργοποιούνται εξωκυττάρια σταδιακά, μετά την απομάκρυνση του προπεπτιδίου. Η σταδιακή ενεργοποίηση μπορεί να γίνει είτε με διάφορες πρωτεϊνάσες και ακόλουθη πρωτεόλυση είτε με κάποια χημική τροποποίηση του δεσμού Cys-Zn. Στην Εικόνα 1.12 φαίνονται τα επιμέρους στάδια των δύο μηχανισμών ενεργοποίησης. 31

Εικόνα 1.12: Σχηματική αναπαράσταση της σταδιακής ενεργοποίησης των MMPs. O γκρι κύκλος συμβολίζει την καταλυτική περιοχή της MMP και πιο συγκεκριμένα με το λευκό χρώμα στο εσωτερικό φαίνεται το ενεργό κέντρο με το καταλυτικό ιόν Zn. Η περιοχή του προπεπτιδίου έχει σχεδιαστεί με μαύρη γραμμή και περιέχει και την περιοχή δόλωμα, bait region, (μαύρο κουτί) την οποία θα πέψει κάποια πρωτεινάση και από εκεί θα ξεκινήσει η ενεργοποίηση. Όταν αυτό το στάδιο ολοκληρωθεί, παράγεται ένα ενδιάμεσο μόριο MMP στο οποίο πλέον ο δεσμός μεταξύ Cys-Zn υδρολύεται και έτσι το υπόλοιπο κομμάτι του προπεπτιδίου είναι ελεύθερο να αποκοπεί με την δράση αυτή τη φορά κάποιας άλλης MMP. Στην περίπτωση της ενεργοποίησης με χημική τροποποίηση, ο δεσμός Cys-Zn αλλάζει με τρόπο ώστε αρχικά επιτρέπεται η απομάκρυνση της Cys από τον Zn και η δημιουργία ενός πιο χαλαρού δεσμού μεταξύ του ενεργού Zn και ενός νέου σημείου στο προπεπτίδιο. Μετά όμως από την αποκοπή ενός κομματιού του προπεπτιδίου από μία πρωτεϊνάση μεταπίπτουμε στον ενδιάμεσο μόριο που ύστερα από την δράση κάποιας άλλης MMP παίρνει την τελική ενεργή μορφή (Nagase, 2006, Visse, 2003). Εκτός όμως από την εξωκυττάρια ενεργοποίηση κάποιες MMPs ενεργοποιούνται ενδοκυττάρια από το ένζυμο, την furin, η οποία αναγνωρίζει την περιοχή KX(R/K)R στο καρβοξυτελικό άκρο του προπεπτιδίου και έτσι αυτόματα με την παραγωγή της ανενεργούς μορφής έχουμε και την ενεργοποίησή της. Η προmmp-11 ήταν η πρώτη που βρέθηκε να ενεργοποιείται με το μηχανισμό αυτό (Pei, 1995) ενώ τον ίδιο μηχανισμό ενεργοποίησης βρέθηκε ότι έχουν και οι έξι MT-MMPs καθώς και η MMP-23 και -28. Τέλος η ενεργοποίηση της προmmp-2 και της προmmp-13 γίνεται στην κυτταρική 32