ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ Ιστοκαλλιέργεια και Γενετική Βελτίωση Επιμέλεια διαφανειών Τραντάς Μάνος 1

Ορισμοί Ιστοκαλλιέργεια είναι η τεχνική ανάπτυξης φυτικών ιστών ή κυττάρων, σε κατάλληλα θρεπτικά υποστρώματα, συνθήκες θερμοκρασίας, υγρασίας και φωτισμού και σε ασηπτικό περιβάλλον Η ιστοκαλλιέργεια αποτελεί κομμάτι της in-vitro καλλιέργειας Εκτός από φυτικά κύτταρα μπορούν να καλλιεργηθούν και ζωικά, βακτηριακά ή μυκητιακά 2

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Με την ιστοκαλλιέργεια μπορούμε και πολλαπλασιάζουμε αγενώς φυτά παράγοντας πάρα πολλά πανομοιότυπα άτομα σε σύντομο χρονικό διάστημα Διαφορετικά ονομάζεται μικροπολλαπλασιασμός και είναι η τέχνη και η επιστήμη του πολλαπλασιασμού στο εργαστήριο Η μέθοδος βασίζεται στην ιδιότητα των φυτικών κυττάρων που ονομάζεται «ολοδυναμικότητα (totipotency)», που επιτρέπει σε διαφοροποιημένα σωματικά φυτικά κύτταρα, να αναγεννούν ολόκληρα φυτά Ολόκληρη η διαδικασία της ιστοκαλλιέργειας γίνεται σε ασηπτικές συνθήκες διότι η ανάπτυξη των φυτικών κυττάρων είναι αργή σε σχέση με την ανάπτυξη βακτηριακών & μυκητιακών με αποτέλεσμα ελάχιστο μικροβιακό φορτίο να αποδεικνύεται μοιραίο για το φυτικό υλικό 3

Εφαρμογές της ιστοκαλλιέργειας Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων, αγενής πολλαπλασιασμός) Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Παραγωγή φυτών απαλλαγμένων από ιώσεις Έρευνα διαφόρων αναπτυξιακών, φυσιολογικών, κ.α. λειτουργιών Γενετική βελτίωση φυτών 4

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Η διαδικασία περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Επιλογή φυτικού υλικού Επιλογή τμημάτων φυτικού υλικού Απολύμανση φυτικού υλικού που θα χρησιμοποιηθεί Επιλογή εκφύτων Καλλογένεση Βλαστογένεση Ριζογένεση Σκληραγώγηση 5

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Θρεπτικά υποστρώματα Η σύνθεση του κάθε θρεπτικού υποστρώματος διαφοροποιείται και εξαρτάται από: Το είδος του προς ιστοκαλλιέργεια φυτικού ιστού. Άλλο υπόστρωμα θα χρησιμοποιηθεί για ιστοκαλλιέργεια πατάτας και άλλο για ιστοκαλλιέργεια ορχιδέας Το στόχο. Άλλο υπόστρωμα θα χρησιμοποιηθεί αν θέλουμε να πάρουμε φυτάρια καπνού από κάλλο και άλλο αν θέλουμε τα φυτάρια καπνού της προηγούμενης περίπτωσης να ριζοβολήσουν Συνήθως προστίθενται τα εξής: Πηγή άνθρακα Μακροστοιχεία, Μικροστοιχεία νερό Προσθήκη συμπληρωματικών οργανικές ενώσεων (φυτορυθμιστικές ουσίες ή ρυθμιστές ανάπτυξης ή φυτικές ορμόνες) Άγαρ (όπου επιθυμείται στερεό θρεπτικό υπόστρωμα) 6

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Τι εξασφαλίζει το υπόστρωμα; Μέσο ανάπτυξης και υποστήριξης στην περίπτωση της καλλιέργειας κυττάρων και της ιστοκαλλιέργειας αντίστοιχα Διαθεσιμότητα ανόργανων στοιχείων Διαθεσιμότητα οργανικών ενώσεων Διαθεσιμότητα νερού Διαθεσιμότητα ρυθμιστών ανάπτυξης Ασηπτικές συνθήκες 7

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) 8

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Δυο κυρίως φυτορρυθμιστικές ουσίες (ορμόνες) επηρεάζουν την διαφοροποίηση: Αυξίνες: Προάγουν την ανάπτυξη των ριζών (π.χ. ΙΑΑ, ΙΒΑ,ΝΑΑ) Κιτοκινίνες: Προάγουν την ανάπτυξη του βλαστού (π.χ. BAP) Γενικά, η αναλογία των συγκεντρώσεων αυτών των δύο είναι που επηρεάζει το προς ποια κατεύθυνση θα κινηθεί η ανάπτυξη, προς την ριζοβολία ή προς την διαφοροποίηση και την ανάπτυξη του βλαστού [Αυξίνη] > [Κιτοκινίνη] = Ριζογένεση [Αυξίνη] < [Κιτοκινίνη] = Βλαστογένεση [Αυξίνη] = [Κιτοκινίνη] = Ανάπτυξη κάλλου 9

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Φυτικό είδος Είδος εκφύτου Ηλικία Φωτισμός Θρέψη Υγρασία Παθολογία Χειρισμοί Μέγεθος εκφύτου ενδογενής εξωγενής Παράγοντες επιτυχίας ιστοκαλλιέργειας 10

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται στην ιστοκαλλιέργεια αποτελούνται συνήθως από άλατα, βιταμίνες, αμινοξέα, ρυθμιστές ανάπτυξης, σάκχαρα, άγαρ ή gelrite και νερό Τα ανόργανα συστατικά χρησιμοποιούνται από τους ιστούς για την δημιουργία των δομικών στοιχείων, για την σύνθεση των οργανικών μορίων, σαν καταλύτες στις διάφορες βιοχημικές αντιδράσεις (ένζυμα) Το άζωτο, το θείο και ο φώσφορος είναι συστατικά των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων. Το μαγνήσιο και πολλά ιχνοστοιχεία σχηματίζουν χρήσιμες δομές με τα κυτταρικά οργανίδια και λειτουργούν σαν συμπαράγοντες στις καταλυτικές αντιδράσεις Το ασβέστιο και το βορικό οξύ εντοπίζονται κυρίως στα κυτταρικά τοιχώματα και το πρώτο επιτελεί σημαντική λειτουργία στην σταθεροποίηση των βιομεμβρανών Το κάλιο και το χλώριο παίζουν σημαντικό ρόλο στην οσμωτική ρύθμιση και για την ενεργοποίηση ενός μεγάλου αριθμού ενζύμων 11

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Το πιο διαδεδομένο και ευρέως χρησιμοποιούμενο θρεπτικό μέσο είναι αυτό που ανέπτυξαν οι Murashige και Skoog το 1962. Περιέχει πηγή οργανικού άνθρακα (σουκρόζη) και μερικούς άλλους ρυθμιστές αύξησης (βιταμίνες κ.α.) 12

Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Γιατί χρησιμοποιούμε ιστοκαλλιέργεια για μικροπολλαπλασιασμό; Ένα έκφυτο μπορεί να δώσει μέχρι και μερικές χιλιάδες φυτά σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα. Αυτό ευνοεί τον γρήγορο πολλαπλασιασμό φυτικών ειδών για εμπορική εκμετάλλευση Χρησιμοποιώντας το έκφυτο δεν καταστρέφεται το μητρικό φυτό. Με τον τρόπο αυτό σπάνια και δύσκολα φυτά πολλαπλασιάζονται με ασφάλεια Όταν γίνει η εγκατάσταση της ιστοκαλλιέργειας, υπάρχει μια ροή στην προσφορά έτοιμων φυτών για μεγάλο χρονικό διάστημα Μπορούν να δημιουργηθούν τράπεζες συντήρησης ιστών Φυτικές καλλιέργειες σε εγκεκριμένα θρεπτικά μέσα είναι ευκολότερο να πάρουν άδεια εξαγωγής μιας και είναι υγιή και καταλαμβάνουν πολύ μικρό χώρο Η επιλογή στην γενετική βελτίωση γίνεται πιο εύκολα και πιο γρήγορα Τα φυτά από την ιστοκαλλιέργεια είναι «γνήσιοι κλώνοι» συγκρινόμενοι με τα σπορόφυτα 13

Φυτά Lisianthus σε μέσο ριζοβολίας 23

Φυτά Cyclamen persicum σε θερμοθάλαμο Ελεγχόμενη ριζοβολία Στάδιο σκληραγώγησης φυτών σε πλήρως ελεγχόμενους θαλάμους, πριν από την έξοδό τους στο εμπόριο 24

Ιστοκαλλιέργεια Asparagus (σπαράγγια) ανθέων Μόλυνση φυτών από μύκητα Zantedeschia 25

Παραγωγή φυτών απαλλαγμένων από ιώσεις Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που έχουν να αντιμετωπίσουν όσοι ασχολούνται με την διακίνηση φυτικού υλικού είναι οι μολύνσεις από ιούς. Το πρόβλημα αποκτάει και ιδιαίτερη οικονομική σημασία όταν το φυτικό υλικό χρησιμοποιείται σαν μητρική καλλιέργεια στην γενετική βελτίωση Καθαρισμός μολυσμένων φυτών από τους περισσότερους ιούς. Αυτό γίνεται είτε με την ιστοκαλλιέργεια μεριστωματικών ιστών είτε με την μέθοδο της θερμοθεραπείας Ο λόγος για τον οποίο χρησιμοποιούνται τα ακραία μεριστώματα είναι γιατί οι περισσότεροι ιοί δεν έχουν την ικανότητα να περάσουν σε αυτά τα ακραία μεριστωματικά κύτταρα και να τα μολύνουν 26

Παραγωγή φυτών απαλλαγμένων από ιώσεις 27

Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Οι τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας και φυτικής ιστοκαλλιέργειας αποτελούν σημαντικούς παράγοντες για την βιομηχανική παραγωγή φυσικών προϊόντων, συμπεριλαμβανομένων και φαρμάκων Η βάση για την ιστο- και κυτταροκαλλιέργεια δευτερογενών μεταβολιτών έγκειται στο γεγονός ότι όλα τα κύτταρα ενός οργανισμού, ανεξάρτητα από την εξειδίκευσή τους, περιέχουν όλες τις γενετικές πληροφορίες για την σύνθεση τους 28

Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Από βιομηχανικής απόψεως, η παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω καλλιεργειών κυττάρων σε επωαστήρες αντί της παραλαβής από φυτικά τμήματα, προσφέρει διάφορα πλεονεκτήματα όπως: ανεξαρτησία από κλιματολογικούς παράγοντες συνεχή παροχή υλικού προς εκχύλιση δυνατότητα ρύθμισης της διαδικασίας το επιθυμητό προϊόν λαμβάνεται σαν κύριος μεταβολίτης Οι δευτερογενής μεταβολίτες που παράγονται από τα φυτά μπορεί να ανήκουν στις εξής κατηγορίες: αλκαλοειδή, τερπενοειδή, στεροειδή, ανθοκυανίνες, ανθρακινόνες, πολυφαινόλες κ.α. 29

Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Παραδείγματα: το αλκαλοειδές της ερυσιβώδους όλυρας (π.χ. εργοταµίνη, διυδροεργοταµίνη) από το μύκητα Claviceps purpurea (Clavicipitaceae) το αλκαλοειδές βερβερίνη από το Coptis japonica (Ranunculaceae). Χρησιμοποιείται κατά της διάρροιας ερυθρά χρωστική σικονίνη από το Lithospermum erythrorhizon (Boraginaceae). Χρησιμοποιείται σε δερματικές παθήσεις και αποτελεί συστατικό των crayons για τα χείλη Μειονέκτημα της μεθόδου θεωρείται το γεγονός ότι συνήθως οι ιστο- και κυτταροκαλλιέργειες σε κανονικές συνθήκες δεν αποδίδουν το ίδιο που θα απέδιδαν τα πλήρως ανεπτυγμένα φυτά. Το μειονέκτημα αυτό μάλλον οφείλεται στο ότι τα κύτταρα είναι αδιαφοροποίητα με αποτέλεσμα το προφίλ έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στα μονοπάτια βιοσύνθεσης των επιθυμητών ουσιών να διαφοροποιούνται 30

Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Μέθοδοι αυξήσεως της παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών Βελτιστοποίηση των θρεπτικών μέσων και των περιβαλλοντικών παραγόντων Επιλογή κυττάρων σειρών υψηλής αποδόσεως Χρήση επαγωγέων: μικροοργανισμοί, θέρμανση, ψύξη, απορρυπαντικά, άλατα βαρέων μετάλλων, υπεριώδης ακτινοβολία Καλλιέργεια οργάνων 31

Έρευνα διαφόρων αναπτυξιακών, φυσιολογικών κ.α. λειτουργιών Χωρίς την ιστοκαλλιέργεια θα ήταν αδύνατη η έρευνα πάνω στην αναπτυξιακή βιολογία των φυτών αλλά και γενικότερα 32

Έκφραση GUS σε συγκεκριμένους ιστούς του άνθους της φράουλας με χρήση υποκινητή που κλωνοποιήθηκε από την πετούνια Έκφραση του gus γονιδίου κάτω υπό το έλεγχο του υποκινητή NTM19. Με τον υποκινητή αυτό η έκφραση του γονιδίου περιορίζεται στα μικροσπόρια του άνθους του Brassica napus (λάχανο) Ιστοκαλλιέργεια 2n γύρης 33

Εφαρμογές ιστοκαλλιέργειας στην γενετική βελτίωση Καλλιέργεια κυττάρων in-vitro για επιλογή Καλλιέργεια γύρης Σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών Διατήρηση γενετικού υλικού Εμβρυοκαλλιέργεια Γενετικός μετασχηματισμός 34

Εφαρμογές ιστοκαλλιέργειας στην γενετική βελτίωση Καλλιέργεια κυττάρων in-vitro για επιλογή Καλλιέργεια γύρης Σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών Διατήρηση γενετικού υλικού Εμβρυοκαλλιέργεια Γενετικός μετασχηματισμός 35

Καλλιέργεια κυττάρων in-vitro για επιλογή Αν και η ιστοκαλλιέργεια θεωρείται ότι παράγει πιστά αντίγραφα του μητρικού υλικού, δημιουργείται παραλλακτικότητα Αυτή η παραλλακτικότητα που εμφανίζεται στην ιστοκαλλιέργεια, ονομάζεται σωμακλωνική παραλλακτικότητα και στις περισσότερες περιπτώσεις είναι επιγενετική, δηλαδή είναι ασταθής και δεν μεταβιβάζεται στις επόμενες γενιές Συνήθως συνδυάζεται με παράγοντες επιλογής ή μεταλλαξογόνους παράγοντες (ακτίνες α-β-γ-χ, υπεριώδης ακτινοβολία κ.α.) Με τον τρόπο αυτό έχουν δημιουργηθεί ποικιλίες ανθεκτικές σε ιούς, ασθένειες, αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες κ.α. 36

Καλλιέργεια κυττάρων in-vitro για επιλογή Επιτυχής χρήση μεθόδου για βελτίωση χαρακτηριστικών που έχουν σχέση με: Ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα Αυξημένη παραγωγή συγκεκριμένων αμινοξέων (π.χ. λυσίνη στο ρύζι) Αντοχή σε αβιοτικές καταπονήσεις (π.χ. σε αυξημένη αλατότητα ή θερμοκρασία) Αντοχή σε ασθένειες 37

Καλλιέργεια κυττάρων in-vitro για επιλογή Στάδια μεθόδου: Κυτταροκαλλιέργειες (συνήθως σε διάλυμα αλλά μπορεί να πετύχει και με κάλλο) Εφαρμογή φυσικού ή χημικού μεταλλαξογόνου για την αύξηση της παραλλακτικότητας Εφαρμογή του παράγοντα επιλογής με βάση τον οποίο θα γίνει η επιλογή των ανώτερων χαρακτηριστικών (χρειαζόμαστε πολύ μικρό ποσοστό επιβίωσης) Αναγέννηση φυτών από τα κύτταρα που επιβίωσαν. Παραπέρα επιλογή για ως προς τα επιθυμητά χαρακτηριστικά 38

Καλλιέργεια κυττάρων in-vitro για επιλογή 39

Εφαρμογές ιστοκαλλιέργειας στην γενετική βελτίωση Καλλιέργεια κυττάρων in-vitro για επιλογή Καλλιέργεια γύρης (pollen culture) Σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών Διατήρηση γενετικού υλικού Εμβρυοκαλλιέργεια Γενετικός μετασχηματισμός 40

Καλλιέργεια γύρης Επειδή οι γυρεόκοκκοι είναι απλοειδής τα φυτά που θα αναγεννηθούν από την ιστοκαλλιέργεια θα είναι και αυτά με την σειρά τους απλοειδή Εάν τροποποιήσουμε απλοειδή φυτά μπορούμε στην συνέχεια να τα μετατρέψουμε σε διπλοειδή, με την χρήση κατάλληλων χημικών ουσιών (π.χ. κολχικίνη). Τα φυτά που θα προέλθουν θα είναι διπλοειδή και ομόζυγα Με τον τρόπο αυτό μπορούμε να παράγουμε καθαρές σειρές σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η μέθοδος έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε διάφορα φυτικά είδη π.χ. σε είδη της οικογένειας των σολανωδών (Solanaceae) 41

Καλλιέργεια γύρης Aα 2πλοειδές φυτό Ιστοκαλλιέργεια γύρης απλοειδή φυτά Α φυτά ή α φυτά εφαρμογή κολχικίνης εφαρμογή κολχικίνης ΑΑ φυτά αα φυτά 2πλοειδή φυτά 100% ομόζυγα άτομα 42

Καλλιέργεια γύρης Μειονεκτήματα καλλιέργειας γύρης 43

Καλλιέργεια γύρης 44

Σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών Οι πρωτοπλάστες δημιουργούνται με την αποδόμηση των κυτταρικών τοιχωμάτων Ευαίσθητο σύστημα, εργαζόμαστε προσεκτικά Οι πρωτοπλάστες για να συντηχθούν πρέπει να υποβοηθηθούν: Πρωτοπλάστης: Η ζωντανή μονάδα του κυττάρου, που αποτελείται από τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα που περιορίζονται από την κυτταρική μεμβράνη. Δημιουργούνται με την απομάκρυνση των κυτταρικών τοιχωμάτων μετά την δράση ενζύμων που τα αποδομούν Τα κύτταρα-υβρίδια που δημιουργούνται περιέχουν τους πυρήνες και των δυο μητρικών φυτών. Τα φυτά που θα προέλθουν από την αναγέννηση αυτών των διπύρηνων κυττάρων θα περιέχουν χαρακτηριστικά και από τα δυο μητρικά φυτά Δημιουργία νέων ειδών Μεταφορά και ενσωμάτωση χαρακτηριστικών από το ένα είδος στο άλλο πράγμα που είναι αδύνατο να γίνει με άλλο τρόπο 46

Σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών = χλωροπλάστης σύντηξη = μιτοχόνδριο = πυρήνας ετεροκάρυο cybrid υβρίδιο υβρίδιο cybrid 47

Διατήρηση γενετικού υλικού Υπάρχουν δύο τεχνικές που ακολουθούνται: Η τεχνική της αργής αύξησης χαμηλή θερμοκρασία χαμηλός φωτισμός αναστολείς ανάπτυξης αφυδάτωση κ.α. Κρυοσυντήρηση αρχικά ταχεία ανάπτυξη των κυττάρων για τη δημιουργία μικρών χυμοτοπίων επίτευξη εξαιρετικά χαμηλών θερμοκρασιών με ταχεία ψύξη (π.χ. με υγρό άζωτο, -196 C) αναστολή φυσιολογικών διεργασιών και κυτταρικής διαίρεσης χρησιμοποιούνται «κρυοπροστατευτικές» ουσίες π.χ. PEG, DMSO, γλυκερόλη. Προστατεύουν από τη ζημιά που προκαλούν οι παγοκρύσταλοι 49

Ευρείες διασταυρώσεις 52

Εμβρυοκαλλιέργεια Μελέτες ανάπτυξης ενδοσπερμίου Διάσωση εμβρύου που προήλθε από διασταύρωση μεταξύ διαφορετικών ειδών (διειδική) ή και διαφορετικών γενών Γίνεται σε περιπτώσεις που ο βελτιωτής δεν βρίσκει επιθυμητά χαρακτηριστικά ανάμεσα στα φυτά του ίδιου είδους και καταφεύγει σε άλλα είδη και γένη Όσο πιο κοντά, βρίσκονται ταξινομικά τα είδη, τόσο πιο πολλές πιθανότητες υπάρχουν να πετύχει μια διασταύρωση Το έμβρυο που προορίζεται για εμβρυοκαλλιέργεια πρέπει να συλλεχθεί στο κατάλληλο αναπτυξιακό στάδιο, έτσι ώστε να είναι σε θέση να αναπτυχθεί παραπέρα αλλά και να μην έχει πέσει σε λήθαργο 53

Εμβρυοκαλλιέργεια 54

Γενετικός μετασχηματισμός Ο γενετικός μετασχηματισμός δεν θα ήταν δυνατός χωρίς την ανάπτυξη της ιστοκαλλιέργειας, επειδή οι διαδικασίες της γενετικής μηχανικής απαιτούν την αναγέννηση ολόκληρων φυτών από μοναδικά κύτταρα 56

Σωματική εμβρυογένεση Υπό κανονικές συνθήκες τα φυτά αναπαράγονται διαμέσου του σχηματισμού ζυγωτικών εμβρύων. Ο σχηματισμός τους ξεκινάει με την διαίρεση του ζυγωτού μέσα στην ωοθήκη μέχρι την διαφοροποίηση των κυττάρων για των σχηματισμό των νέων οργάνων που τελικά θα δώσουν το νέο φυτάριο. Εναλλακτικά τα φυτάρια μπορούν να σχηματιστούν από σωματικά κύτταρα. Αυτή η διαδικασία η οποία διαφέρει από την φυσική, ονομάζεται σωματική εμβρυογένεση. Όλα τα φυτάρια που θα προέλθουν από την διαδικασία αυτή θα έχουν το ίδιο γενετικό προφίλ. 57

Φυτικά μέρη που προορίζονται για σωματική εμβρυογένεση Ενκαψιδιωμένα σωματικά έμβρυα Σωματικά έμβρυα που σχηματίζονται από την καλλιέργεια φυτικών τμ` ημάτων Ενκαψιδιωμένα σωματικά έμβρυα 58