Κυτταρική ανάπτυξη- Κινητικά μοντέλα Δημήτρης Κέκος, Καθηγητής ΕΜΠ kekos@chemeng.ntua.gr 1
Περιεχόμενα 1. Πώς αναπτύσσονται τα κύτταρα (φάσεις ανάπτυξης) 2. Επίδραση της θερμοκρασίας στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών 3. Επίδραση του ph στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών 4. Επίδραση του οξυγόνου στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών 5. Οξειδοαναγωγικό/ηλεκτροχημικό δυναμικό μέσου καλλιέργειας 6. Ιοντική ισχύς μέσου καλλιέργειας 7. Θερμότητα κατά την ανάπτυξη των μικροοργανισμών 8. Μοντέλα κυτταρικής ανάπτυξης 2
Υπόστρωμα + Κύτταρα Εξωκυτταρικά προϊόντα + Περισσότερα Κύτταρα Σ + ΣP + n net net 1 g d k d όπου: συγκέντρωση των κυττάρων (g/l) t χρόνος (h) μ net o καθαρός ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) μ g συνολικός ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) k d ειδικός ρυθμός θανάτου των κυττάρων ή ενδογενούς μεταβολισμού (h -1 ) 3
Κυτταρόμετρο Μέτρηση αναπτυσσόμενων αποικιών Μετρητές σωματιδίων Άμεσες Ξηρό βάρος Όγκος (φυγοκέντρηση) Οπτική πυκνότητα Έμμεσες Μέτρηση RNA ή DNA Μέτρηση πρωτεΐνης ή αζώτου Μέτρηση ATP (λουσιφεράση) Ρυθμός αναπνοής (κατανάλωση Ο 2 ) 4
Eμβόλιο (Χ ) Θρεπτικό μέσο 5
Δεν αυξάνεται ο αριθμός των κυττάρων Επαγωγή των ενζύμων για την χρησιμοποίηση των υποστρωμάτων Προκειμένου να αυξηθεί η παραγωγικότητα ενός συστήματος θα πρέπει να μειωθεί η λανθάνουσα φάση i. Εμβολιασμός με κύτταρα που βρίσκονται στην εκθετική φάση ανάπτυξης ii. Εγκλιματισμός των κυττάρων στο μέσο καλλιέργειας iii. Μεγάλος όγκος εμβολίου (5% έως 1% κ.ο. καλλιέργειας) 6
Υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος και θρεπτικών Ο ρυθμός ανάπτυξης είναι ανεξάρτητος της συγκέντρωσης του υποστρώματος και θρεπτικών Συγκέντρωση κυττάρων και κυτταρικής μάζας αυξάνει εκθετικά 1 d Χ = μ net = σταθερό Χ = Χ, για t = ολοκληρώνοντας e net t ή ln = μ net t Κλίση = μ max Χρόνος διπλασιασμού των κυττάρων (t d ) = 2 ln 2 = μ max t d ή t d = ln 2 =.693 μ max μ max Iσορροπημένη ανάπτυξη σταθερή σύσταση κυττάρων 7
Εξάντληση ενός ή περισσοτέρων θρεπτικών Συσσώρευση τοξικών παραπροϊόντων Αναδιοργάνωση κυττάρου με στόχο την αύξηση των πιθανοτήτων επιβίωσής του Iσχύει: 1 d k 1 b net ή k 1 net C t dc t Y C d όπου: C t : συγκέντρωση τοξικού παραπροϊόντος 8
Ο καθαρός ρυθμός ανάπτυξης μηδενίζεται Ρυθμός ανάπτυξης κυττάρων = Ρυθμό θανάτου κυττάρων Παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών (προϊόντα) Ενδογενής μεταβολισμός Απομάκρυνση τοξικών ουσιών και προσθήκη θρεπτικών συστατικών μπορεί να οδηγήσει σε ανάπτυξη των κυττάρων 9
Λύση κυττάρων Ο ρυθμός θανάτου των κυττάρων ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης όπου: k d σταθερά πρώτης τάξης για τον κυτταρικό θάνατο (h -1 ) κυτταρική συγκέντρωση στο τέλος της φάσης στασιμότητας (g/l) Μεταφορά των κυττάρων σε νέο θρεπτικό μέσο ανανέωση καλλιέργειας 1
Φάση ανάπτυξης Περιγραφή Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης Λανθάνουσα Εκθετική Επιβράδυνσης Τα κύτταρα προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον Δεν αυξάνεται ο αριθμός των κυττάρων Ο ρυθμός ανάπτυξης λαμβάνει τη μέγιστη τιμή του Η ανάπτυξη επιβραδύνεται λόγω εξάντλησης των θρεπτικών συστατικών ή συσσώρευσης τοξικών ουσιών μ μ μ max μ < μ max Στασιμότητας Παύση ανάπτυξης μ = Θανάτου Θάνατος κυττάρων μ < 11
Αύξηση της θερμοκρασίας κατά 1 ο C διπλασιασμός του ρυθμού ανάπτυξης Καθαρός ειδικός ρυθμός αναπαραγωγής για Τ> Τ optimum dn ' R k ' d N όπου: μ g συνολικός ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) k d ειδικός ρυθμός θανάτου των κυττάρων (h -1 ) Ε α ενέργεια ενεργοποίησης ανάπτυξης (kcal/mole) E d ενέργεια ενεργοποίησης θερμικού θανάτου (kcal/mole) R παγκόσμια σταθερά αερίων (1.987 cal/mole. K) Τ θερμοκρασία ( ο Κ) Ε α 1-2 (kcal/mole) Ε d 1-2 (kcal/mole) Θερμικός θάνατος είναι περισσότερο ευαίσθητος σε αλλαγές της Τ, από ότι η ανάπτυξη 12
Αποδεκτές τιμές ph 1 έως 2 μονάδες Βέλτιστο ph ανάπτυξης ποικίλει ανάλογα με το μικροοργανισμό Οι μικροοργανισμοί έχουν την ικανότητα να ελέγχουν το εσωκυτταρικό ph H τιμή του ph μπορεί να μεταβληθεί λόγω i. Κατανάλωσης υποστρωμάτων, ΝΗ + 3 απελευθερώνει Η +, ΝΟ - 3 καταναλώνει Η + ii. Παραγωγής οργανικών οξέων, αμινοξέων, CO 2, βάσεων 13
όπου: k L συντελεστής μεταφοράς οξυγόνου (cm/h), α ειδική επιφάνεια (gas-liquid interfacial area) (cm 2 /cm 3 ), k L α ογκομετρικός συντελεστής μεταφοράς οξυγόνου (h -1 ), C* συγκέντρωση κορεσμού του DO (mg/l), C L πραγματική συγκέντρωση του DO στο υγρό καλλιέργειας (mg/l) N O2 ρυθμός μεταφοράς οξυγόνου (mg O 2 /L. h). q O2 όπου: : ειδικός ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (mg O 2 /g ξηρού βάρους κυττάρων/h), Υ x/ο2 :συντελεστής απόδοσης οξυγόνου (g ξηρού βάρους κυττάρων/ g O 2 ) : συγκέντρωση κυτταρικής μάζας (g ξηρού βάρους κυττάρων/l) 14
Όταν η μεταφορά Ο 2 είναι το ελέγχον κινητικά στάδιο OTR = OUR L L O g C C k Y * 2 ή L L O C C k Y d * 2 Ο ρυθμός ανάπτυξης μεταβάλλεται σχεδόν γραμμικά με το ρυθμό μεταφοράς οξυγόνου σε συνθήκες περιορισμού μεταφοράς οξυγόνου 15
Οξειδοαναγωγικό δυναμικό μέσου καλλιέργειας= f (διαλελυμένου Ο2, ph, συγκέντρωσης ιόντων) Επηρεάζει το ρυθμό πολλών οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων Το οξειδοαναγωγικό δυναμικό του μέσου καλλιέργειας μπορεί να μειωθεί με διαβίβαση αζώτου ή με την προσθήκη αναγωγικών παραγόντων όπως κυστεϊνη -HCl ή Na2. E E ' h 2.3RT 2.3RT log P log H 4F F O2 16
όπου: C συγκέντρωση κάποιου ιόντος Ζ i φορτίο του ιόντος Ι ιοντική ισχύς του θρεπτικού μέσου I 1 2 C Z i i 2 Υψηλή συγκέντρωση διαλυμένων ιόντων λειτουργεί παρεμποδιστικά για την λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης (ωσμωτική πίεση, μεταφορά θρεπτικών ουσιών κα.) 17
Μόνο το 4% έως 5% της ενέργειας που είναι αποθηκευμένη στην πηγή άνθρακα μετατρέπεται σε βιολογική ενέργεια (ΑΤΡ) σε αερόβιες ζυμώσεις. Η υπόλοιπη ενέργεια απελευθερώνεται ως θερμότητα κατά τη μετατροπή σε CO2 και Η2Ο H s 1 H c Y YH Θερμότητα καύσης υποστρώματος = Θερμότητα καύσης κυτταρικού υλικού + Μεταβολική θερμότητα ή YH Y H s Y H c όπου: ΔΗ θερμότητα καύσης του υποστρώματος (kj/ g υποστρώματος), ΥΧ/ συντελεστής μετατροπής υποστρώματος σε κυτταρική μάζα (g κυττάρων/ g υποστρώματος), ΔΗc θερμότητα καύσης των κυττάρων (kj/ g κυττάρων), 1/ΥΗ μεταβολική θερμότητα που απελευθερώνεται ανά γραμμάριο παραγόμενης κυτταρικής μάζας (kj/g κυττάρων). 18
QGR V L net 1 YH όπου: QGR ρυθμός απελευθερούμενης θερμότητας VL όγκος καλλιέργειας (L) μnet o καθαρός ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h-1) Χ συγκέντρωση κυτταρικής μάζας (g/l) 1/ΥΗ μεταβολική θερμότητα που απελευθερώνεται ανά γραμμάριο παραγόμενης κυτταρικής μάζας (kj/g κυττάρων). όπου: QGR ρυθμός απελευθερούμενης θερμότητας (kcal/h) QΟ2 ρυθμός πρόσληψης Ο2 (millimoles O2/h) 19
ΜΗ ΔΟΜΗΜΕΝΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΣΤΑΘΕΡΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΙΣΟΡΡΟΠΗΜΕΝΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΔΟΜΗΜΕΝΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΗ ΙΣΟΡΡΟΠΗΜΕΝΗ ΟΜΟΓΕΝΕΙΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΙ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΙ ΚΥΤΤΑΡΑ ΙΔΙΑ ΑΝΕΞΑΡΤΗΤΑ ΗΛΙΚΙΑΣ & ΦΑΣΗΣ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΙΑΚΡΙΤΑ ΗΛΙΚΙΑ ΦΑΣΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ 2
Για υψηλά επίπεδα κυτταρικού πληθυσμού g K m όπου: μ g ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) μ m μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης όταν >>Ks, (h -1 ) Κ s σταθερά κορεσμού ή ημίσειας ταχύτητας συγκέντρωση υποστρώματος αρχική συγκέντρωση υποστρώματος 21
Εξίσωση Blackman: Εξίσωση Tessier: Εξίσωση g m όταν 2K s g g K Για n=1 η εξίσωση Μoser παίρνει τη μορφή της εξίσωσης Μοnod 2 m m 1 όταν < 2K s K e m n 1 1 g m K s Moser: n K s n όπου: μ g ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) μ m μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης όταν >>Ks, (h -1 ) Κ s σταθερά κορεσμού ή ημίσειας ταχύτητας συγκέντρωση υποστρώματος Κ σταθερά εξίσωσης Tessier n σταθερά της εξίσωσης Moser Εξίσωση Contois: g K sx m 22
g K 1 m K I m g K 1 1 K ή αν Κ Ι >>K s τότε : I όπου: μ g ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) μ m μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης όταν >>Ks, (h -1 ) Κ s σταθερά κορεσμού ή ημίσειας ταχύτητας Κ I σταθερά αναστολής (παρεμπόδισης) συγκέντρωση υποστρώματος g K m 2 K I 23
g g K K 1 1 m P K m P 1 P K P όπου: μ g ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) μ m μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης όταν >>Ks, (h -1 ) Κ s σταθερά κορεσμού ή ημίσειας ταχύτητας Κ P σταθερά αναστολής (παρεμπόδισης) από το προϊόν P συγκέντρωση προϊόντος Παράδειγμα μη συναγωνιστικής αναστολής από το προϊόν: η παραγωγή αιθανόλης g K 1 m 1 P P m n g m K 1 e P K P όπου: P m σταθερά αναστολής (παρεμπόδισης) από το προϊόν 24
g g g m I K 1 KI m K 1 I 1 K I όπου: μg ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h-1) μm μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης όταν >>Ks, (h-1) Κs σταθερά κορεσμού ή ημίσειας ταχύτητας ΚI σταθερά αναστολής (παρεμπόδισης) συγκέντρωση υποστρώματος I συγκέντρωση τοξικής ουσίας m K 1 I K I I 1 K I 25
Η παρουσία τοξικών ουσιών προκαλεί θάνατο των κυττάρων. Ο καθαρός ειδικός ρυθμός ανάπτυξης συμπεριλαμβανομένου και του κυτταρικού θανάτου g K m k ' d όπου: μ g ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) μ m μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης όταν >>Ks, (h -1 ) Κ s σταθερά κορεσμού ή ημίσειας ταχύτητας συγκέντρωση υποστρώματος k d ειδικός ρυθμός θανάτου των κυττάρων (death-rate constant) (h -1 ) 26
g k1 dx g dx k Με ολοκλήρωση 1 kt Χ() =Χ 1 1 e e kt Λογιστική καμπύλη ανάπτυξης 27
Απουσία φαινομένων μεταφοράς μάζας, η ακτίνα μικροβιακού συσσωματώματος αυξάνει γραμμικά με το χρόνο dr k p ά Ο ρυθμός ανάπτυξης μίας αποικίας μύκητα εκφράζεται ως dm 2 dr 4R k 4R p 2 ή dm 2 3 όπου k p 36 1 3 με ολοκλήρωση M M 1 3 t 3 3 t 3 3 Η αρχική τιμή βιόμαζας Μ είναι συνήθως πολύ μικρή συγκριτικά με την τιμή του Μ και κατά συνέπεια το Μ μεταβάλλεται με το t 3 28
d V C Ρυθμός μεταβολής της ποσότητας του συστατικού i στο βιοαντιδραστήρα R i = + V R Συνολική βιόμαζα στο βιοαντιδραστήρα rfi Ρυθμός δημιουργίας i ανά μονάδα βιόμαζας με βάση την ενδογενή συγκέντρωση όπου: V R είναι ο συνολικός όγκος στον αντιδραστήρα Χ είναι η εξωγενής συγκέντρωση βιόμαζας C i είναι η εξωγενής συγκέντρωση του συστατικού i 29
με όρους ενδογενούς συγκέντρωσης χρησιμοποιούνται τα κλάσματα μάζας (π.χ. C i /) d C i 1 dc i ισχύει C i d 1 d προκύπτει d C i 1 dc i C i θεωρώντας ότι το V R είναι σταθερό d C i r fi C net στην εξίσωση ο όρος r fi θα πρέπει να εκφράζεται με όρους ενδογενούς συγκέντρωσης και ο όρος μ net C i / αντιπροσωπεύει την αραίωση λόγω ανάπτυξης. i 3
(-d) ολικό = (-d) κύτταρα + (-d) προϊόν + (-d) διατήρησης (1) O συντελεστής μετατροπής, Υ ορίζεται με βάση το ποσό κατανάλωσης κάποιου συστατικού (2) Συντελεστής μετατροπής υποστρώματος σε μικροβιακή μάζα Ο τρόπος κατανάλωσης του υποστρώματος () μεταβάλλεται με τις συνθήκες ανάπτυξης η τιμή του Y / δεν είναι σταθερή (3) Συντελεστής μετατροπής υποστρώματος σε προϊόν (4) Συντελεστής διατήρησης των κυττάρων 31
Από την εξίσωση (1) Λαμβάνοντας υπόψιν τις εξισώσεις (2), (3) και (4) d 1 d 1 ό Y / YP / dp m Επιπλέον ισχύουν 1 d 1 dp q P και 32
Προϊόντα από αναπτυσσόμενα κύτταρα (growth associated products) Προϊόντα από μη αναπτυσσόμενα κύτταρα (non growth associated products) Προϊόντα από αναπτυσσόμενα και μη αναπτυσσόμενα κύτταρα (mixed growth associated products) q p = αμ g + β 33
K dx m Y Y K Y Y dx m t Y Y Y K Y Y Y K Y m ln ln σιγμοειδούς τύπου καμπύλη μικροβιακής ανάπτυξης σε συνθήκες διαλείποντος έργου και η τιμή του Χ τείνει ασυμπτωτικά στην τιμή Y με ολοκλήρωση 34