ΤΣΑΚΑΛΑΚΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA ΑΠΟ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟ ΙΣΤΟ ΣΕ ΚΥΒΟ ΠΑΡΑΦΙΝΗΣ (QIAGEN KIT) GENEKOR MEDICAL SA
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ (ΣΥΝΟΠΤΙΚΑ) Η διαδικασία απομόνωσης του DNA από καρκινικό ιστό σε κύβο παραφίνης περιλαμβάνει συνοπτικά 6 στάδια: Απομάκρυνση της παραφίνης: Γίνεται με συγκεκριμένο διάλυμα αποπαραφινοποίησης. Λύση κυττάρων: Γίνεται λύση των κυττάρων του δείγματος σε συνθήκες μετουσίωσης με πρωτεινάση Κ. Θέρμανση: Επώαση στους 90 ο C. Πρόσδεση DNA: Το DNA προσδένεται στην μεμβράνη της κολώνας και οι προσμείξεις απομακρύνονται. Πλύσιμο: Γίνεται απομάκρυνση των προσμείξεων που έχουν απομείνει. Έκλουση DNA: Το καθαρό DNA εκλούεται από την μεμβράνη της κολώνας. ΥΛΙΚΑ Το kit περιλαμβάνει : Κολώνες έκλουσης DNA Tubes συλλογής DNA (2 ml) Διάλυμα αποπαραφινοποίησης Διάλυμα ATL: Δημιουργεί τις συνθήκες για να δράσει η πρωτεινάση Κ. Είναι ρυθμιστικό διάλυμα. Διάλυμα λύσης AL Διάλυμα πλύσης 1 (AW1) Διάλυμα πλύσης 2 (AW2) Διάλυμα έκλουσης DNA (ATE) Πρωτεινάση Κ
Επιπλέον χρειάζονται: Νυστέρι για το ξύσιμο των κύβων παραφίνης. Αιθανόλη (96-100%). Tubes των 2ml (για τα στάδια λύσης). Tubes των 1,5ml (για τα στάδια της έκλουσης του DNA). Tips Υδατόλουτρο Φυγόκεντρος Vortex
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ (ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ) 1. Εφόσον ο παθολογοανατόμος εντοπίσει στο μικροσκόπιο τον καρκινικό ιστό πάνω στην τομή παραφίνης που έχει βαφτεί με χρώση αιμοτοξυλίνης ηωσίνης τον σημειώνει με μαρκαδόρο. 2. Στη συνέχεια συγκρίνουμε τον κύβο παραφίνης με την τομή παραφίνης στην οποία ο παθολογοανατόμος έχει σημειώσει το σημείο στο οποίο βρίσκεται ο καρκινικός ιστός και έτσι εντοπίζουμε το σημείο που βρίσκεται ο καρκινικός ιστός πάνω στον κύβο παραφίνης.
3. Χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο νυστέρι ξύνουμε τον κύβο παραφίνης στο σημείο που βρίσκεται ο καρκινικός ιστός 4. Τοποθετούμε τα ξύσματα του ιστού σε tubes των 2ml.
5. Προσθέτουμε 160 μl διάλυμα αποπαραφινοποίησης με σκοπό την απομάκρυνση της παραφίνης.
6. Προσθέτουμε 180 μl ρυθμιστικό διάλυμα ATL και 20 μl πρωτεινάση Κ. 7. Κάνουμε vortex 8. Τοποθετούμε τα tubes σε υδατόλουτρο στους 56 o C από μία ώρα έως όλη την νύχτα.
9. Τοποθετούμε τα tubes για επώαση στους 90 ο C για μία ώρα. 10. Κάνουμε σύντομη φυγοκέντρηση ώστε να απομακρυνθούν πιθανά σταγονίδια από το εσωτερικό του καπακιού του tube. 11. Προσθέτουμε 200 μl διάλυμα λύσης AL
12. Κάνουμε vortex 13. Προσθέτουμε 200 μl αιθανόλη (96 100 %)
14. Κάνουμε vortex 15. Κάνουμε σύντομη φυγοκέντρηση ώστε να απομακρυνθούν πιθανά σταγονίδια από το εσωτερικό του καπακιού του tube. 16. Προσεκτικά μεταφέρουμε όλο το ομογενοποίημα στις κολώνες έκλουσης του DNA (με tubes υποδοχείς των 2ml).
17. Κλείνουμε το καπάκι και κάνουμε φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για ένα λεπτό.
18. Αλλάζουμε το tube υποδοχέα της κολώνας και πετάμε το προηγούμενο που περιέχει τις προσμίξεις που διαπέρασαν την μεμβράνη της κολώνας. 19. Ανοίγουμε προσεκτικά το καπάκι της κολώνας και προσθέτουμε 500 μl διάλυμα πλύσης 1 (AW1).
20. Κλείνουμε το καπάκι της κολώνας και κάνουμε φυγοκέντρηση στις 8000 στροφές για ένα λεπτό. 21. Αλλάζουμε το tube υποδοχέα της κολώνας και πετάμε το προηγούμενο που περιέχει τις προσμίξεις που διαπέρασαν την μεμβράνη της κολώνας. 22. Ανοίγουμε προσεκτικά το καπάκι της κολώνας και προσθέτουμε 500 μl διάλυμα πλύσης 2 (AW2).
23. Κλείνουμε το καπάκι της κολώνας και κάνουμε φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για ένα λεπτό. 24. Αλλάζουμε το tube υποδοχέα της κολώνας και πετάμε το προηγούμενο που περιέχει τις προσμίξεις που διαπέρασαν την μεμβράνη της κολώνας. 25. Κάνουμε φυγοκέντρηση για 3 λεπτά σε μέγιστες στροφές για να στεγνώσει πλήρως η μεμβράνη.
26. Αλλάζουμε το tube υποδοχέα της κολώνας και πετάμε το προηγούμενο που περιέχει τις προσμίξεις που διαπέρασαν την μεμβράνη της κολώνας. Το νέο tube που τοποθετούμε στις κολώνες είναι των 1,5 ml. 27. Ανοίγουμε προσεκτικά το καπάκι της κολώνας και προσθέτουμε 20 100 μl διάλυμα έκλουσης του DNA στο κέντρο της μεμβράνης.
28. Κλείνουμε το καπάκι και αφήνουμε τις κολώνες για ένα λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου (15 25 o C ). 29. Κάνουμε φυγοκέντρηση για ένα λεπτό σε μέγιστες στροφές.
30. Πετάμε την μεμβράνη και το καθαρό DNA έχει εκλουστεί στο tube.