Ανάλυση µεµβρανικών λιπιδίων µε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας

60

ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΛΙΠΙ ΙΩΝ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑ ΑΣ Σκοπός της άσκησης : η εφαρµογή της χρήσης µιας φυσικής ιδιότητας, όπως η διαλυτότητα, για το διαχωρισµό των συστατικών ενός µείγµατος µε τη µέθοδο της χρωµατογραφίας. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Η χρωµατογραφία είναι µία τεχνική που χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό των ενός µίγµατος στα συστατικά του. Το όνοµα της προέρχεται από το γεγονός πώς οι πρώτες ουσίες που διαχωρίστηκαν µε την τεχνική αυτή ήταν χρωστικές. Σήµερα χρησιµοποιείται τόσο σε ερευνητικά όσο και σε κλινικά εργαστήρια για το διαχωρισµό πεπτιδίων, αιµονοξέων, πρωτεϊνών, λιπιδίων, υδατανθράκων, νουκλεϊκών οξέων και σε ορισµένες περιπτώσεις για τον προσδιορισµό του µοριακού βάρους των πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι χρωµατογραφίας ανάλογα µε την αρχή στην οποία στηρίζονται, όπως χρωµατογραφία προσρόφησης (absorption chromatography), µε υποτύπους τη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (ion exchange chromatography) και την εκλεκτική χρωµατογραφία ή χρωµατογραφία συγγενείας (affinity chromatography) και χρωµατογραφία διαχωρισµού (partition chromatography) µε υποτύπους τη χρωµατογραφία χαρτιού (paper chromatography), τη χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας (thin layer chromatography), τη χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού (molecular exclusion chromatography) ή µοριακής διήθησης (gel filtration) την αέριο χρωµατογραφία (gas chromatography) και την ηλεκτροφόρηση (electrophoresis). 61

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ Η χρωµατογραφία διαχωρισµού χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό ενώσεων µε παραπλήσιες φυσικές και χηµικές ιδιότητες. Ένα χρωµατογραφικό σύστηµα αποτελείται από δύο διακριτά µέρη, την κινητή (mobile phase) και την ακίνητη φάση (stationary phase). Τα διάφορα µόρια διαχωρίζονται γιατί η σχετικές κινήσεις τους πάνω ή µέσα στην ακίνητη φάση, είναι αποτέλεσµα της συνισταµένης µιας κινητήριας δύναµης (λόγω της κινητής φάσης) και επιβραδυντικών επιδράσεων (λόγω της ακίνητης φάσης). Οι δύο πιο κοινοί τύποι της χρωµατογραφίας διαχωρισµού είναι η χρωµατογραφία χαρτιού και η χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας. Χρωµατογραφία χαρτιού Το χαρτί που χρησιµοποιείται στη χρωµατογραφία περιέχει κυτταρίνη σε µεγάλο ποσοστό και έχει µεγάλη ικανότητα να κατακρατεί νερό. Έτσι το χαρτί αποτελεί το φορέα της υδατικής φάσης (στατική φάση) στο σύστηµα των δύο φάσεων ενώ η οργανική φάση (κινητή φάση) το διατρέχει. Η τεχνική χρωµατογραφίας σε χαρτί, αν και αναπτύχθηκε αργότερα από τη χρωµατογραφία σε στήλη, είναι πιο εύκολη και πιο γρήγορη. Χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας Η χρωµατογραφία χαρτιού είναι πιο γρήγορη από τη χρωµατογραφία στήλης, έχει όµως το µειονέκτηµα να εφαρµόζεται σε υλικά, παράγωγα της κυτταρίνης (cellulose) που δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν για διαχωρισµό µη πολικών µορίων, όπως τα λιπίδια. Αυτό ήταν η αφορµή για την ανάπτυξη της χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας (thin layer chromatography), που έχει τα πλεονεκτήµατα της χρωµατογραφίας σε χαρτί αλλά χρησιµοποιεί υλικά, είτε ανόργανα είτε οργανικά στα οποία µπορούν να διαχωριστούν, οποιασδήποτε φύσης µόρια. Τέτοια υλικά που µπορούν να απλωθούν σε πολύ λεπτές οµοιόµορφες στοιβάδες είναι τα ανόργανα οξείδιο του πυριτίου (silica gel), οξείδιο του αλουµινίου και πυριτικό µαγνήσιο, καθώς και τα οργανικά κυτταρίνη, πολυαµίδιο και σκόνη πολυαιθυλενίου. Το πάχος της λεπτής στοιβάδας πάνω σε µια γυάλινη συνήθως ή πλαστική επιφάνεια είναι περίπου 0,25-0,50 mm και χρησιµοποιείται αποκλειστικά για το διαχωρισµό µικρών µορίων. 62

Η χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας, όπως και η χρωµατογραφία σε χαρτί. διεξάγεται µε τον παρακάτω τρόπο: Μια µικρή σταγόνα του µίγµατος, τοποθετείται κοντά στο ένα από τα δύο ελεύθερα περιθώρια του χαρτιού ή της λεπτής στοιβάδας. Ο διαλύτης, στην περίπτωση του χαρτιού είναι συχνά νερό ενώ στη λεπτή στοιβάδα είναι µείγµα οργανικών µορίων. Στη συνέχεια η πλάκα τοποθετείται σε ένα δοχείο που είναι γεµάτο µε τους ατµούς του οργανικού διαλύτη µε την πλευρά που έχει την κηλίδα στο κάτω µέρος του δοχείου (εικ. 1). Ο οργανικός διαλύτης που βρίσκεται στον πυθµένα του δοχείου, αρχίζει να µεταναστεύει µε τριχοειδείς δυνάµεις µόλις έρθει σ επαφή µε το υλικό της χρωµατογραφίας. Αµέσως το δοχείο σκεπάζεται και αρχίζει η διαδικασία της χρωµατογραφίας µέχρι να φθάσει ο διαλύτης στην κορυφή. Καθώς ο οργανικός διαλύτης περνά από την κηλίδα του δείγµατος συµβαίνει ένας διαχωρισµός υγρού από υγρό. Από τα διάφορα συστατικά που είναι διαλυµένα στην κηλίδα του δείγµατος µερικά θα διαλύονται πιο εύκολα από άλλα στον οργανικό διαλύτη (οργανική φάση) S Εικόνα 1. Ανερχόµενη χρωµατογραφία. Το µίγµα των ουσιών τοποθετείται στη θέση M. Στη συνέχεια µεταφέρεται στο δοχείο µε το διαλύτη, ο οποίος ανεβαίνει µε τη βοήθεια τριχοειδών δυνάµεων. Τα συστατικά του µίγµατος, διαχωρίζονται όταν ο διαλύτης φτάσει στο σηµείο S, εξ αιτίας της διαφορετικής ταχύτητας µετανάστευσης και η χρωµατογραφία ολοκληρώνεται. M και αυτά θ αρχίσουν να κινούνται πιο γρήγορα προς τα πάνω καθώς θα παρασύρονται από την οργανική φάση (εικ. 1). Έτσι επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός. Μερικές φορές το χρωµατογράφηµα σε χαρτί αναπτύσσεται καλύτερα και γρηγορότερα αν ο οργανικός διαλύτης αντί να περνάει από το χαρτί ανεβαίνοντας µε τριχοειδή φαινόµενα (ascending chromatography) τοποθετηθεί σ ένα δοχείο στην κορυφή του δοχείου χρωµατογραφίας 63

και το χαρτί κρεµαστεί προς τα κάτω οπότε λόγω της βαρύτητας βοηθιέται η τριχοειδής δράση και ο διαλύτης κατεβαίνει γρηγορότερα (descending chromatography). Μια τροποποίηση της χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας ή και χαρτιού είναι να γίνει αυτή σε µία αντί σε δύο διαστάσεις. Στην περίπτωση αυτή το δείγµα τοποθετείται στη µία άκρη ενός τετράγωνου χαρτιού και αρχίζει η διαδικασία της ανάπτυξης της χρωµατογραφίας κατά την κατακόρυφη διεύθυνση όπως αναφέραµε παραπάνω (εικ. 2). Μετά την ξήρανση η πλάκα στρέφεται κατά 90 0 C και αρχίζει η ανάπτυξη της χρωµατογραφίας κατά την οριζόντια διεύθυνση χρησιµοποιώντας ένα άλλο οργανικό διαλύτη, Με τον τρόπο αυτό έχουµε και ένα πρόσθετο δεύτερο διαχωρισµό. Τα χαρακτηριστικά στο δεύτερο αυτό σύστηµα και το τελικό αποτέλεσµα θα είναι ακόµα µεγαλύτερος διαχωρισµός που δεν είναι δυνατόν µε τη χρησιµοποίηση µόνο ενός είδους διαλύτη. S S (α) (β) Εικόνα 2. Χρωµατογραφία χαρτιού δύο διαστάσεων. Μία κηλίδα από το µίγµα τοποθετείται στο Μ και αφήνεται µέχρι ο διαλύτης να ανέβει στο σηµείο S διαχωρίζοντας τα συστατικά του µίγµατος (α). Στο (β) το χαρτί στρέφεται κατά 90 0 και ένας άλλος διαλύτης ανεβαίνει ως το σηµείο S προκαλώντας έναν επί πλέον διαχωρισµό των συστατικών. ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΗΛΙ ΩΝ Όπως είπαµε και στην αρχή µε τους διάφορους τύπους χρωµατογραφίας µπορούµε να διαχωρίσουµε µία µεγάλη ποικιλία µιγµάτων ουσιών διαλέγοντας τους 64

κατάλληλους διαλύτες και στερεά υλικά ώστε να αξιοποιείται αναλυτικά η διαφορά που υπάρχει στις φυσικές ιδιότητες των συστατικών των µιγµάτων. Επειδή οι ουσίες που διαχωρίζουµε είναι συνήθως άχρωµες, για να γίνει η εµφάνιση των κηλίδων της χρωµατογραφίας, χρησιµοποιούµε διάφορες τεχνικές. Έτσι µπορούµε να κατεργαστούµε π.χ. την πλάκα µε το χρωµατογράφηµα µ ένα αντιδραστήριο που αντιδρά µε τα συστατικά που έχουµε διαχωρίσει. Μερικές ενώσεις φθορίζουν όταν εκτεθούν σε υπεριώδη ακτινοβολία, γι αυτό µπορούµε να χρησιµοποιήσουµε το υπεριώδες φως για να δούµε τις κηλίδες, ενώ άλλες το απορροφούν και φαίνονται σα σκοτεινές κηλίδες στο φθορίζον χαρτί. Μπορούµε επίσης να ψεκάσουµε τις διαχωρισµένες ενώσεις µε διάφορα αντιδραστήρια τα οποία αντιδρούν µε αυτές και δίνουν χρώµα στις αντίστοιχες κηλίδες. Τέτοια αντιδραστήρια είναι η νινυδρίνη που αντιδρά µε αµινοξέα, θειικό οξύ και θέρµανση προκαλούν µαύρισµα κηλίδων από οποιεσδήποτε οργανικές ενώσεις, ανισαλδεϋδη για υδατάνθρακες και πολλά άλλα. Η ταυτοποίηση των διαφόρων ενώσεων µπορεί να γίνει µε τη χρήση πρότυπων διαλυµάτων (standards) µε γνωστά Rf. Η έκλουση επιτυγχάνεται µε κόψιµο των κηλίδων από το χαρτί ή µε ξύσιµο των κηλίδων από την λεπτή στοιβάδα και αφού µπουν σε κατάλληλο διαλύτη µε αυτή τη διαδικασία µπορεί να γίνει ακόµα και ποσοτικός προσδιορισµός. ΣΧΕΤΙΚΗ ΑΠΟΣΤΑΣΗ Με τον όρο σχετική απόσταση (Rf) εννοούµε το κλάσµα της απόστασης που διανύει µια ουσία σε µια χρωµατογραφία διαχωρισµού προς το συνολικό µήκος που διατρέχει ο διαλύτης. Η τιµή του Rf εξαρτάται από την ουσία, το υλικό της χρωµατογραφίας (ακίνητη φάση) και από τον διαλύτη (κινητή φάση) και κυµαίνονται από 0,0-1,0. 65

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Μίγµα λιπιδίων Πιπέτα 10 µl Πλάκες χρωµατογραφίας (silica gel) Θάλαµος χρωµατογραφίας Κλίβανος Ψεκαστήρας Μολύβι Χάρακας ΙΑΛΥΜΑΤΑ Χλωροφόρµιο Μεθανόλη ιάλυµα χλωροφορµίου - µεθανόλης 1:1 ιάλυµα ανάπτυξης της χρωµατογραφίας (50 ml χλωροφόρµιο, 21 ml µεθανόλη, 3 ml Η 2 O). Θειικό οξύ 50% ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Χρησιµοποιούνται πλάκες χρωµατογραφίας του εµπορίου επιστρωµένες µε πήκτωµα πυριτίου (silica gel). (1). Χαράζουµε µε µολύβι πολύ ελαφρά µία ευθεία που να απέχει 2,5 cm από την κάτω πλευρά της πλάκας. Σχεδιάζουµε πάνω στη γραµµή 4 κουκίδες σε ίσες αποστάσεις και τις αριθµούµε. (2). Με τη βοήθεια αυτόµατης πιπέτας τοποθετούµε το δείγµα των λιπιδίων πάνω στις κουκίδες. 66

(3). Αφού τελειώσουµε µε την τοποθέτηση των δειγµάτων µας µεταφέρουµε και τοποθετούµε µε προσοχή την πλάκα στην ειδική θέση µέσα στο θάλαµο χρωµατογραφίας όπου έχουµε βάλει το διάλυµα εµφάνισης. Η ελεύθερη επιφάνεια του διαλύµατος πρέπει να φθάνει περίπου σε ύψος 1 cm κάτω από τη γραµµή τοποθέτησης των δειγµάτων. (4). Κλείνουµε αεροστεγώς το θάλαµο χρωµατογραφίας και αφήνουµε τη χρωµατογραφία ν αναπτυχθεί σε θερµοκρασία δωµατίου για 45 min περίπου. (5). Μετά την ανάπτυξη µεταφέρουµε την πλάκα σε κλίβανο που έχουµε ρυθµίσει προηγουµένως στη θερµοκρασία των 100-110 0 C για 1-2 λεπτά ώστε να στεγνώσει η πλάκα. (6). Μεταφέρουµε τη στεγνή πλάκα σε εστία και την ψεκάζουµε µε 50% διάλυµα Η 2 SO 4. (7). Μεταφέρουµε πάλι την πλάκα στον κλίβανο και την αφήνουµε στους 100-110 0 C έως ότου εµφανιστούν καλά οι κηλίδες. (8). Υπολογίζουµε τις σχετικές αποστάσεις Rf κάθε κηλίδας λιπιδίων. 67

68