ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

1 ο Εργαστήριο PyMOL 08/11/18 ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ευάγγελος Τόπακας Username: biotech Password: applbiot1

Εργαστήριο Εφαρµοσµένης Βιοτεχνολογίας Θεµατικές ενότητες/υπολογιστικά προγράµµατα: - Απεικόνιση πρωτεϊνικών µορίων και ανάλυση της δοµής τους µε τη χρήση υπολογιστικών προγραµµάτων (PyMol). - Μεταβολική Μηχανική: Προσοµοίωση και έλεγχος µεταβολικών οδών µέσω του υπολογιστικού Προγράµµατος Copasi. - Βιοπληροφορική, βάσεις δεδοµένων γονιδιωµατικής. Βιβλιογραφικές Εργασίες (οµαδικές 2-4 ατόµων): Παραδίδεται γραπτή εργασία και γίνεται προφορική παρουσίαση διάρκειας 15 λεπτών στο τέλος της διάρκειας του εξαµήνου. Ο τελικός βαθµός θα προκύπτει από τη συνολική απόδοση σε αναλογία 50% εξετάσεις, 30% εργαστήριο, 20% βαθµολόγηση της εργασίας. Απαραίτητη προϋπόθεση για την προαγωγή του µαθήµατος είναι ο βαθµός 5 στις τελικές εξετάσεις. Η παρακολούθηση των εργαστηριακών µαθηµάτων και η εκπόνηση της εργασίας είναι υποχρεωτική. Σελίδα µαθήµατος: http://www.chemeng.ntua.gr/the_course/ Applied_Biotechnology

Τι είναι; PyMOL Είναι πρόγραµµα 3D απεικόνισης κρυσταλλικών δοµών πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA & trna) και υδατανθράκων όπως και µικρών µορίων (φαρµάκων, παρεµποδιστών, µεταβολιτών, ανόργανων αλάτων, διαλυτών κτλ). Αποτελεί βασικό εργαλείο της Πρωτεϊνικής Μηχανικής. Σκοπός: Εύρεση καταλυτικών µηχανισµών ενζύµων Βιοτεχνολογικής σηµασίας (Ενέργεια, Τρόφιµα, Υλικά), µορίων στόχων στη Βιοµηχανία Φαρµάκων, κτλ.

Κεντρικός Μεταβολισµός Άνθρακα του S. cerevisiae Καθορισµένη Στοιχειοµετρία Κινητικοί Παράµετροι Κεντρικά Μονοπάτια Γλυκόλυση Μεταφορείς Εξοζών Κόµβος Πυροσταφυλικού Μονοπάτι Φωσφορικών Πεντοζών Κύκλος Γλυοξυλικού Οξέος Κύκλος TCA (Krebs) Κύρια Προϊόντα Άνθρακα Βιοµάζα C1: CO 2 C2: Αιθανόλη, οξικό C3: Πυροσταφυλικό, γλυκερόλη!4

NYLON, Polymers O N N CH 2 x N O Poly-Amides O O O Succinic Anhydride n CH 3 O H 2 N O O O N NH 2 O 2 g-butyrolactone NMP HO Μοντέλο Βιοδιϋλιστηρίου OH 1,4-Butanediol διεργασιών ζύµωσης και βιοκατάλυσης O O O O OH Petrochemical HO O Succinic Acid Succindiamide Παραγωγή δοµικών µορίων µέσω από αειφόρο/ανανεώσιµη βιοµάζα Maleic Anhydride Specialty & Fine NMP Solvent Solvent H H 3 C O O O CH 3 O O N THF Solvent O DBE Tetrahydrofuran 2-Pyrrolidone PBS Polymers

PyMOL Ο επίσηµος ιστότοπος του λογισµικού PyMOL είναι: http://www.pymol.org/ Πρόκειται για ένα πρόγραµµα ανοικτού λογισµικού το οποίο είναι ελεύθερα διαθέσιµο ΜΟΝΟ για ακαδηµαϊκή χρήση Λήψη παλαιότερης έκδοσης (v 0.99) και οδηγιών (*.pdf) από τον ιστότοπο του µαθήµατος «Εφαρµοσµένη Βιοτεχνολογία»: http:// www.chemeng.ntua.gr/the_course/applied_biotechnology Αρχείο LAB.rar (password: applbiot)

PyMOL Λήψη νεότερης έκδοσης (v 2.0) από το επίσηµο ιστότοπο µόνο για ακαδηµαϊκή χρήση: URL: http://pymol.org/ep USER: dec2018 PASSWORD: betasheet OS: Windows, Mac, Linux

Δυνατότητες Προγράµµατος Συµβατότητα: Το PyMOL υποστηρίζει συστήµατα Unix, Macintosh, Windows όπως και ios (ipad). Χειρισµός µέσω γραφικού περιβάλλοντος (Graphical User Interface, GUI) και µέσω εντολών (command line): Ο ταυτόχρονος χειρισµός δίνει στο χρήστη τη δυνατότητα τόσο απλής όσο και εξειδικευµένης χρήσης του προγράµµατος. Επιλογή ατόµων, διαίρεση και ένωση µοριακών δοµών: Δοµές µορίων µπορεί να κοπούν, να µοιραστούν και τελικά να ενωθούν πολύ σύντοµα, παράγοντας καινούργια αρχεία PDB. Ταινίες: Δυνατότητα δηµιουργίας animation και εξαγωγή αυτών σε διάφορα πρωτόκολλα όπως GIF ή mpeg χρησιµοποιώντας εξειδικευµένες εντολές.

Δυνατότητες Προγράµµατος Απεικόνιση των πρωτεϊνών µε διάφορους τρόπους όπως σε επιφάνειες, cartoon ή ribbons: Η δυνατότητα απεικόνισης των πρωτεϊνών µε τους τρεις αυτούς τρόπους γίνεται αρκετά εύκολα και σε ποιότητα ίδια µε εκείνη του Molscript. Φωτοσκίαση: Ένα πανίσχυρο ενσωµατωµένο πρόγραµµα (Ray-tracer) δίνει τη δυνατότητα στο PyMOL δηµιουργίας σκιάσεων και βάθους σε κάθε εικόνα, παράγοντας έτσι εικόνες εντυπωσιακών γραφικών. Εξαγωγή: Οι εικόνες του PyMOL µπορούν να εξαχθούν σε αρχεία PNG τα οποία µεταφέρονται απευθείας στο MS Powerpoint.

Cartoon µοντέλο Παραδείγµατα

Παραδείγµατα Χωροπληρωτικό µοντέλο

Μικτό µοντέλο Παραδείγµατα

Παραδείγµατα RNA DNA

Παραδείγµατα Μοριακά βίντεο

Παραδείγµατα Δοµή µιτοχονδριακού µεταφορέα ADP/ATP σε συναρµογή µε τον παρεµποδιστή του καρβοξυατρακτυλοζιδίου Το ATP παρέχει ενέργεια σε βιοσυνθετικές αντιδράσεις µέσα στο κυτταρόπλασµα µε την υδρόλυσή του προς ADP και ανόργανο φώσφορο. Η αναγέννηση του ATP από ADP γίνεται στο µιτοχόνδριο. Η µετακίνηση των παραπάνω από και προς το µιτοχόνδριο γίνεται µέσω ενός διαµεµβρανικού µεταφορέα [PDB: 1YM6 & 1YMJ]. http://www.youtube.com/watch?v=fboyaqnk3cw

Protein Data Bank (PDB) https://www.rcsb.org/ Εύρεση πρωτεϊνικών µορίων από την τράπεζα δεδοµένων: - Παροχή πληθώρας εργαλείων και πληροφοριών για τη µελέτη της δοµής βιολογικών µακροµορίων συσχετίζοντας την πρωτοταγή δοµή µε την λειτουργία τους. - Διατήρηση κοινού τρόπου αποθήκευσης δεδοµένων σε παγκόσµια κλίµακα -How enzymes work: https://pdb101.rcsb.org/ learn/videos/how-enzymes-work

Εύρεση Πρωτεϊνικών Δοµών Επιλογή πρωτεΐνης στόχου για δοµικές µελέτες. Παραγωγή και αποµόνωση της υπό µελέτη πρωτεΐνης χρησιµοποιώντας τεχνολογία ανασυνδυασµένου DNΑ. Βιοχηµικός χαρακτηρισµός και βιοτεχνολογική αξιολόγηση της παραγόµενης πρωτεΐνης. Προσπάθεια κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης. Εύρεση και αποµόνωση κρυστάλλου, αξιολόγηση και επίδραση ακτίνων Χ µε σκοπό την εύρεση της τρισδιάστατης δοµής. Μηχανιστικές µελέτες της πρωτεΐνης, σχέση δοµήςδράσης.

Επιλογή Πρωτεΐνης Επιλογή πρωτεΐνης στόχου για δοµικές µελέτες: Πρωτεΐνες µε υψηλή Βιοτεχνολογική σηµασία σε τοµείς έρευνας όπως στη βιοµηχανία φαρµάκων, καλλυντικών και παραγωγής ενέργειας (Βιοκαύσιµα) Εύρεση γονιδίου µε χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής χρησιµοποιώντας γνωστά γονιδιώµατα (public access).

Παραγωγή Πρωτεϊνών Παραγωγή της υπο µελέτη πρωτεΐνης µε τεχνολογία ανασυνδυασµένου DNΑ: Κλωνοποίηση και υπερέκφραση της πρωτεΐνης στόχου χρησιµοποιώντας µικροοργανισµούς ξενιστές (E. coli, P. pastoris κτλ) και αποµόνωση της σε ιδιαίτερα υψηλή ποσότητα και καθαρότητα κατάλληλη για κρυσταλλογραφικές µελέτες.

Βιοχηµικός Χαρακτηρισµός Λήψη δεδοµένων απαραίτητων για την ταξινόµηση µιας πρωτεΐνης µε βάση τα καταλυτικά της χαρακτηριστικά όπως και την εύρεση νέων ιδιοτήτων άγνωστων µέχρι σήµερα. 100 Enzyme Kinetics Data 80 Rate 60 40 20 0 0,026 0,024 0,022 0,02 0,018 0,016 0,014 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 0 2 4 6 1 / [Substrate] 1 / Rate 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 [Substrate]

Κρυστάλλωση Πρωτεϊνών Πρέπει οι πρωτεΐνες να αλληλεπιδράσουν µεταξύ τους Μόρια H 2 O παρεµποδίζουν την αλληλεπίδραση Εφαρµογή αλάτων τα οποία λόγω ισχυρής ιοντικής δύναµης έλκουν τα µόρια H 2 O, αφήνοντας έτσι τις πρωτεΐνες να αλληλεπιδράσουν **** ΑΡΓΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ****

Κρυστάλλωση Πρωτεϊνών Αλληλεπίδραση πρωτεϊνών µεταξύ τους αυξάνοντας τον βαθµό οργάνωσης του κρυσταλλικού πλέγµατος *** Αύξηση οπτικής διαπερατότητας ***

Δοκιµές Κρυστάλλωσης Χρήση πολλών συνθηκών κρυστάλλωσης (ρυθµιστικά διαλύµατα διαφόρων αλάτων) Τα άλατα/ουσίες µε σκοπό την µείωση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης µεταβάλλουν: ph, διηλεκτρική σταθερά δ/τος, εντροπία (µεγάλου ΜΒ πολυµερή) κτλ

Δοκιµές Κρυστάλλωσης Αν µετά από εκατοντάδες/χιλιάδες δοκιµές δεν κρυσταλλώνεται η πρωτεΐνη µας και είναι τεράστιας επιστηµονικής σηµασίας η γνώση της 3D δοµής της τότε µεταβάλλουµε την βαρύτητα των συνθηκών ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΙΚΡΟΒΑΡΥΤΗΤΑΣ

Αυτόµατη Κρυστάλλωση

Εύρεση Κρυστάλλων http://www.youtube.com/user/sblnewcastle#p/u/5/yycb4pu0dnu

Αποµόνωση Κρυστάλλων Χρήση κρίκου και δοκιµή αιώρησης του κρυστάλλου σε ελάχιστη ποσότητα κρυοπροστατευτικού διαλύµατος. Δοκιµή σταθερότητας σε ρεύµα παγωµένου αζώτου (~ -196 o C).

Επίδραση Ακτινοβολίας Το µήκος κύµατος των ακτίνων-χ είναι συγκρίσιµο µε τις διατοµικές αποστάσεις (10-9 m, 1 Å) οπότε είναι δυνατή η περίθλαση των ακτίνων από δείγµατα κρυστάλλων -> ανάλυση σε ατοµική κλίµακα

Εφαρµογή Ακτίνων Χ Για τη διευκρίνηση της πρωτεϊνικής δοµής, το µόριο βοµβαρδίζεται µε φωτόνια υψηλής ενέργειας τα οποία ανακλώνται στα ηλεκτρονικά νέφη των ατόµων

Σύγχροτρο-Δακτύλιοι Αποθήκευσης Χρήση ισχυρής πολωµένης δέσµης φωτονίων µήκους κύµατος ακτινοβολίας Χ για την διευκρίνιση της δοµής πρωτεϊνών.

Πρωτεϊνικό Αποτύπωµα Χρήση λογισµικών για την εύρεση παραµέτρων οι οποίες αποτελούν τη βάση για τον εντοπισµό των ατόµων της πρωτεΐνης στον τρισδιάτατο χώρο. Οι κουκίδες είναι το αποτέλεσµα της αλληλεπίδρασης ακτίνων Χ µε τα ηλεκτρονικά νέφη των ατόµων της πρωτεΐνης. Αποτίµηση γεωµετρικών συσχετίσεων µεταξύ των κουκίδων Αποτίµηση έντασης κουκίδων http://www.youtube.com/user/sblnewcastle#p/u/1/yiruthdnx6i

Σχεδιασµός Πρωτεινικου Μοντέλου

Συνοπτικά

Βασικές γνώσεις πρωτεϊνών

Υδρόφιλα Αµινοξέα Συµβάλλουν στη φόρτιση της πρωτεΐνης Συµβάλλουν στη δηµιουργία δεσµών υδρογόνου

Υδρόφοβα Αµινοξέα

Δηµιουργία Πεπτιδικών Δεσµών

Δηµιουργία Πεπτιδικών Αλυσίδων

Αρχιτεκτονική Πρωτεϊνών 4 Επίπεδα Δοµών

β-πτυχωτά Φύλλα

α-έλικες

Τριτοταγής Δοµή Low Density Lipoprotein (LDL)

Τεταρτοταγής Δοµή

Παράθυρα PyMOL

Παράθυρο Viewer

Παράθυρο εξωτερικού GUI

Φόρτωση PDB αρχείου

Περιστροφή Trackball

Παρατήρηση µίας α-αµυλάσης Δηµιουργία φακέλου µε την ονοµασία PyMOL. Άνοιγµα ιστοσελίδας www.pdb.org µέσω Mozilla Firefox. Εισαγωγή στο πεδίο PDB or keyword: <1ppi>. Κατέβασµα του PDB αρχείου στην επιφάνεια εργασίας και µεταφορά του στον παραπάνω φάκελο. Άνοιγµα αρχείου (διπλό κλικ).