QUANTA Lite TM ssdna ELISA 708525 μονόκλωνου DNA ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM ssdna ELISA 708525 μονόκλωνου DNA ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM ssdna ELISA είναι μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ανίχνευση των αυτοαντισωμάτων αντι-μονόκλωνου DNA (ssdna). Το κιτ QUANTA Lite TM ssdna ELISA σε συνδιασμό με το QUANTA Lite TM dsdna ELISA ειναι σχεδιασμένο για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των αντι ssdna αντισωμάτων στον ανθρώπινο ορό και βοηθά στη διάγνωση του συστηματικού ερυθηματώδoυς λύκου(sle) και άλλων ρευματικών νόσων. Η δοκιμασία από μόνη της δεν είναι προσδιοριστική άλλα είναι μία παράμετρος στή διαγνωστική διαδικασία. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA) ευρίσκονται σε μεγάλο εύρος μολύνσεων του συνδετικού ιστού και έτσι χρησιμοποιούνται σαν ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης. 1 Τα αντισώματα διπλής έλικας εμφανίζονται σχεδόν αποκλειστικά σε ασθενείς με SLE και έτσι αποτελεί ένα σημαντικό δείκτη αντισωμάτων για τη νόσο. Η παρουσία αντισωμάτων dsdna δείχνει ισχυρώς SLE, όμως η απουσία αντισωμάτων dsdna δεν συνεπάγεται την απουσία SLE σε όλες τις περιπτώσεις. 2 Τα αυτοαντισώματα ssdna εμφανίζονται σε αρκετές ρευματικές και σε άλλες νόσους. 3,4 Ο υψηλότερος τίτλος αντισωμάτων ssdna συναντάται σε ασθενείς με SLE. 4 Στους ασθενείς με SLE που είναι θετικοί στα αυτοαντισώματα ssdna, έχει αναφερθεί ότι ο τίτλος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καταγράψει τις αλλαγές στην δράση της ασθένειας και να απαντήσει στη φαρμακευτική θεραπεία. 5,6 Eνώ τα αντισώματα ssdna δεν είναι ειδικά για το SLE, μπορεί να είναι το μοναδικό θετικό ορολογικό εύρημα σε μερικούς ασθενείς με SLE, οι οποίοι απέτυχαν να επιδείξουν ένα συγκεκριμένο τίτλο ΑΝΑ. 7 Πολλοί από αυτούς τους ασθενείς με υψηλό τίτλο αντισωμάτων ssdna εμφανίζουν δερματικές ασθένειες ευαίσθητες στο φως. Περίπου το 25% των ασθενών με δισκοειδη λύκο (discoid lupus) έχουν αντι-ssdna και είναι σε κίνδυνο να αναπτύξουν συστεμικά χαρακτηριστικά. 3 Έχει αποδειχθεί η παρουσία των αντι-ssdna μόνο σε ασθενείς που έχουν σοβαρή λοίμωξη από δισκοειδη λύκο (discoid lupus) με σπειραματονεφρίτιδα. 3 Τέτοιες μελέτες δείχνουν ότι ο καθορισμός για το αντίσωμα ssdna μπορεί να είναι ένα σημαντικό διαγνωστικό τεστ για την αξιολόγηση των ασθενών με discoid lupus ή σε ασθενείς που υπάρχει υποψία ότι έχουν ΑΝΑ αρνητικό SLE. 3 Τα αντισώματα που αντιδρούν με το θερμικά νοθευμένο ssdna αντιδρούν με τις πυριμιδίνες καθώς επίσης και με το φωσφορικό σάκχαρο της σπονδυλικής στήλης του μορίου DNA. 1,4 Από τεχνικής απόψεως ακόμα είναι αδύνατον να μετρηθούν σε ένα μόνο τεστ αληθινά αντισώματα ssdna (με βάσεις της πουρίνης και της πουριμιδίνης να είναι το μόνο αντιγόνο). Η τεχνική της ELISA που δουλεύει με αυτή την ανάλυση είναι αντικειμενική και τα αποτελέσματα μπορούν να βγουν σε ένα ημι-ποσοτικό τρόπο. Η διαδικασία της ELISA μπορεί άνετα να χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει μεγάλους και μικρούς αριθμούς δειγμάτων ασθενών στο προφίλ σχηματισμού μαζί με άλλες αναλύσεις ρευματικών ασθενειών όπως το dsdna, ιστόνη και εξαγόμενα πυρηνικά αντισώματα (ΕΝΑ). Αρχη Μεθοδου Ένα υψηλής καθαρότητας αντιγόνο ssdna από θύμο μόσχου, μετουσιωμένο μέσω θερμότητας, δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου, υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν το αντιγόνο στην αμιγή του κατάσταση. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντι- ssdna αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο ssdna (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα ssdna) 3. ssdna ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ssdna, προαραιωμένο, 1.2ml 4. ssdna ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ssdna, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 1

7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 8 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. 2

Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 ssdna ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος ssdna Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος ssdna High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 3

4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυ NCCLS για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του ssdna ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του ssdna ELISA Low. Η τιμή του ssdna ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X ssdna oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. ssdna ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθησμού κ.λ.π. Οι ακόλουθες πληροφορίες χρησιμεύουν ως παράδειγμα για την καλύτερη ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 4

Αφότου αμφότερα ssdna καί κάποια dsdna αυτοαντισώματα αντιδρούν με το ssdna αντιγόνο του κιτ, τα δείγματα πρέπει να δοκιμασθούν κατά dsdna. Αυτά τα αποτελέσματα, σε μονάδες WHO, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την αξιολόγηση των επιπέδων ssdna. Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα της ανάλυσης INOVA QUANTA Lite TM dsdna ELISA με εκείνα της ανάλυσης INOVA QUANTA Lite TM ssdna ELISA, είναι δυνατόν να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με την ύπαρξη αντισωμάτων ssdna με υπολογισμό της αναλογίας (ssdna/dsdna). Αναλογία < 0,5 υποδεικνύει απουσία αντισωμάτων ssdna. Αναλογία > 0,5 υποδεικνύει την παρουσία αντισωμάτων ssdna. Σημείωση. Μόνο όταν το αποτέλεσμα είναι ssdna θετικό και η σχέση ssdna / dsdna σε μονάδες είναι >0.5 πρέπει το δείγμα να θεωρηθεί θετικό. Π.Χ.1: Δοκιμασία 1. dsdna συγκέντρωση αντισωμάτων 120 WHO U/ml Δοκιμασία 2. ssdna συγκέντρωση αντισωμάτων 160 WHO U/ml Σχέση αντισωμάτων ssdna (ssdna / dsdna): 160/120=1.33 (+) Αποτέλεσμα : Το δείγμα είναι θετικό κατά αντισωμάτων ssdna Π.Χ.2: Δοκιμασία 1. dsdna συγκέντρωση αντισωμάτων 270 WHO U/ml Δοκιμασία 2. ssdna συγκέντρωση αντισωμάτων 130 WHO U/ml Σχέση αντισωμάτων ssdna (ssdna / dsdna): 130/270=0.48 (-) Αποτέλεσμα : Το δείγμα είναι αρνητικό κατά αντισωμάτων ssdna Π.Χ.3: Δοκιμασία 1. dsdna συγκέντρωση αντισωμάτων 80 WHO U/ml Δοκιμασία 2. ssdna συγκέντρωση αντισωμάτων 80 WHO U/ml Σχέση αντισωμάτων ssdna (ssdna / dsdna): 80/80=1 (+) Αποτέλεσμα : Το δείγμα είναι θετικό κατά αντισωμάτων ssdna Εάν το αποτέλεσμα της δοκιμασίας ssdna προσδιορίζεται σάν θετικό τότε οι μονάδες ssdna χωρίζονται στις εξείς κατηγορίες. <68.6 U/ml Αρνητικό κατά αντισωμάτων ssdna 68.6-229 U/ml Ασθενώς θετικό κατά αντισωμάτων ssdna >229 U/ml Ισχυρώς θετικό κατά αντισωμάτων ssdna Ίσως είναι δύσκολο να προσδιορισθει η δράση ssdna σε δείγματα με υψηλές θετικές τιμές (π.χ. >2.0 Oπτική πυκνότητα ) καί στα δύο ssdna και dsdna. Συστήνεται δείγματα με υψηλές τιμές και στα δύο ssdna και dsdna να αραιώνονται περαιτέρω 1:4 καί 1:20 σε αραιωτικό δειγμάτων (HRP) ώστε να προσδιορισθεί εάν η δράση ssdna είναι υψηλότερη από του dsdna. Ο υπολογισμός πρέπει να γίνει στήν ιδια αραίωση δείγματος. Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Αφού τα αντισώματα IgG θεωρούνται ότι είναι κλινικά τα πιο σημαντικά, αυτή η ανάλυση χρησιμοποιεί μία ειδική σφαιρίνη IgG. Τα αντισώματα IgM του ssdna που δεν έχουν μετρηθεί με αυτή την ανάλυση μπορεί να συναγωνιστούν με τα αντισώματα IgG στην σύνδεση. Εάν υπάρχει υποψία ότι παρεμβαίνουν τα αντισώματα IgM, αναλύστε ξανά το δείγμα σε υψηλότερη αραίωση στο HRP Sample Diluent. Μια απότομη μείωση στην τιμή του δείγματος δείχνει την παρουσία του συναγωνιζόμενου αντισώματος IgM. Αυτή η νέα τιμή θα δώσει έναν πιο ακριβή καθορισμό για την ποσότητα των αντισωμάτων IgG του ssdna στο δείγμα του ασθενή. 2. Η παρουσία άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων συσσωρευμάτων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο μη-συγκεκριμένου συμπλέγματος και να παράγει ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. 3. Εφόσον τα αντισώματα και της μονής έλικος DNA (ssdna) και μερικά από το διπλής ελικος DNA (dsdna) μπορούν να αντιδράσουν με τα αντιγόνα του ssdna αυτού του kit, θα πρέπει επίσης να εξεταστούν και τα δείγματα των ασθενών κατά dsdna, και αυτά τα αποτελέσματα θα πρέπει να ληφθούν υπόψιν, όταν αξιολογούνται τα επίπεδα του ssdna. 4. Μια ποικιλία παραγόντων καθορίζει την διαδικασία της ανάλυσης. Αυτοί περιλαμβάνουν την ακρίβεια και την αναπαραγωγικότητα την τεχνικής των πιπεττών, το φωτόμετρο που χρησιμοποιείται για να μετρήσει τα αποτελέσματα, και την τάση συγχρονισμού κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. Απαιτείται μεγάλη προσοχή στην σύσταση για να βγουν ακριβή και επαναληπτικά αποτελέσματα. 5. Η μέθοδος QUANTA Lite TM ssdna ELISA δεν είναι μια μέθοδος που μπορεί να ισχύσει από μόνη της για τα αντισώματα ssdna. Πρέπει να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τη μέθοδο QUANTA Lite TM dsdna ELISA της INOVA Diagnostics, Inc. s με σκοπό να μετρηθούν τα αντισώματα του ssdna. Μην χρησιμοποιείτε τεστ για αντίσωμα dsdna κάποιας άλλης κατασκευαστικής εταιρείας εφόσον ο προσδιορισμός των μεθόδων INOVA ssdna ELISA και dsdna ELISA έχουν συνδυαστεί. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα του QUANTA Lite TM ssdna ELISA να εντοπίζει τα αντισώματα IgG της γλιαδίνης αξιολογήθηκε σε σύγκριση με ένα ELISA τεστ που διατίθεται στο εμπόριο. Τα αποτελέσματα του ELISA τεστ καθορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 5

Φυσιολογικές Τιμές Επιλέχθηκαν εκατόν δέκα επτά τυχαία δείγματα κανονικού ορού και εξετάστηκαν με τη μέθοδο QUANTA Lite TM ssdna ELISA εξάρτηση kit. Από αυτά τα δείγματα, επτά είχαν 69 ή και περισσότερες μονάδες (ένα θετικό αποτέλεσμα σε αυτό το σύστημα ELISA). Πέντε από αυτά τα επτά δείγματα ήταν επίσης θετικά με μια εμπορική μέθοδο αναφοράς για τα αντισώματα αντι-ssdna, και για αυτό το λόγο εξαιρέθηκαν από τον κανονικό πληθυσμό. Ο μέσος όρος για τα δείγματα του πληθυσμού ήταν 27, με μια κανονική παρέκκλιση των 21. Το εύρος του πληθυσμού ήταν 12 στους 186. Αυτή η δοκιμή έδειξε ότι ο μέσος όρος του κανονικού δείγματος είναι 2.0 κανονικές παρεκκλίσεις υπό της αποκοπής. Σχετική Ευαισθησία και Ειδικότητα Τριάντα-δύο τυχαία θετικά δείγματα ΑΝΑ εξετάστηκαν και με την μέθοδο QUANTA Lite TM ssdna ELISA και με μια άλλη εμπορική μέθοδο (Αναφοράς). Δέκα οκτώ δείγματα ήταν θετικά με την μέθοδο αναφοράς και 12 δείγματα ήταν αρνητικά και με τις δύο μεθόδους. Δύο δείγματα ήταν θετικά με την μέθοδο αναφοράς αλλά αρνητικά με την μέθοδο της INOVA. Αυτά τα δύο δείγματα εξετάστηκαν αρνητικά με μια διαφορετική μέθοδο που είναι διατεθειμένη στο εμπόριο. Αυτά τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω: INOVA + - + 18 2 Σχετική Ευαισθησία 90% Αναφοράς Σχετική Ειδικότητα 100% - 0 12 Σχετική Δράση 94% Για να εξετάσουμε περαιτέρω την ειδικότητα της στερεάς φάσης του ssdna, μια ποικιλία από υψηλά τιτλοποιημένους, μάρτυρες αυτοαντισωμάτων εξετάστηκαν με τη μέθοδο QUANTA Lite TM ssdna. Αυτοί οι μάρτυρες περιελάμβαναν τους υψηλούς μάρτυρες από την ακόλουθη μέθοδο INOVA QUANTA Lite TM ELISA: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, Thyroid Microsomal και Thyroglobulin, Histone και Mitochondria M2. Όλοι οι παραπάνω μάρτυρες έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα στην ανάλυση του ssdna. Αντίδραση ssdna σε Διάφορες Ασθένειες του Συνδετικού Ιστού Αριθμός Ασθενών % Θετικά SLE 43 58 Σύνδρομο Sjogren s 21 62 Σκληρόδερμα 15 80 Πολυμυοσίτιδα 6 17 Φαρμακοεπαγώμενος Λύκος 20 80 Ρευματική Αρθρίτιδα 11 45* * 2 από τα 5 θετικά δείγματα ήταν θετικά μόνο στην γραμμή ορίου (69 και 99 μονάδες). Είκοσι πέντε από του ασθενείς με SLE ήταν θετικοί στο ssdna. Έξι από αυτούς τους ασθενείς με SLE με θετικό ssdna ήταν διφορούμενοι με μια μέθοδο ELISA (INOVA) ευαίσθητου διπλού ελικοειδούς DNA (dsdna). Δεκατρείς από 21 ασθενείς με σύνδρομο του Sjogren s ήταν θετικοί στο ssdna. Όλοι οι 21 ασθενείς ήταν θετικοί για SS-A, SS-B ή και SS-A και SS-B με τη μέθοδο ELISA (INOVA). Τρία από αυτά τα δείγματα του Sjogren s ήταν ssdna θετικά, ενώ τελείως αρνητικά με την ευαίσθητη μέθοδο dsdna ELISA (INOVA). Δώδεκα από δεκαπέντε ασθενείς που είναι θετικοί στο Scl-70 ήταν θετικοί στο ssdna και μόνο 1 από τους 6 ασθενείς με πολυμυοσίτιδα ήταν θετικός. Όλοι αυτοί οι ασθενείς με πολυμυοσίτιδα ήταν θετικοί για τα αυτοαντισώματα στο Jo-1 με τη μέθοδο ELISA (INOVA). Ο ένας ασθενής με πολυμυοσίτιδα που ήταν θετικός στο ssdna (112U) ήταν τελείως αρνητικός για αντισώματα στο dsdna με τη μέθοδο ELISA (INOVA). Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η ακρίβεια και η αναπαραγωγικότητα της ανάλυσης εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία έξι διπλών δειγμάτων, αρνητικό, ελαφρώς θετικό, και ισχυρά θετικό, σε τέσσερις ξεχωριστές δοκιμασίες. Ο μέσος όρος των ισχυρά θετικών ήταν 814 μονάδες, των ελαφρώς θετικών ήταν 300 μονάδες και των αρνητικών ήταν 72 μονάδες. Η κανονική απόκλιση και ο συντελεστής απόκλισης για καθένα δείγμα συνοψίζονται παρακάτω. Αρνητικό Ισχυρά θετικό Μέτρια θετικό SD CV SD CV SD CV Ολικά 4.7 6.6% 36 4.5% 8.0 2.7% Κατά τη διάρκεια τωνεξετάσεων 4.7 6.5% 35 4.3% 6.8 2.7% Ανάμεσα στις εξετάσεις 4.6 6.3% 24 3.0% 8.7 2.9% 6

Βιβλιογραφία 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167-239, 1982. 2. Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964. 3. Provost TT, Herrera-Esparza R and Diaz LA: Nucleoprotein autoantibodies in lupus erythematosus. J. Invest. Dermatol. 85: 133-139, 1985. 4. Koffler D, et al: Occurence of single-stranded DNA in serum of patients with systemic lupus erythematosus and other diseases. J. Clin. Invest. 52: 196-204, 1973. 5. Land A: Evaluation of the simultaneous estimation of antidsdna and antissdna antibodies for clinical purposes. Clin. Exp. Immunol. 31: 472-481, 1978. 6. Gripenberg M, et al: Assessment of class-specific antibodies against denatured DNA in patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Immunol. 5: 314, 1985. 7. Maddison PJ, Provost TT and Reichlin M: Serological findings in patients with "ANA" negative systemic lupus erythematosus. Medicine(Baltimore) 60: 87-94, 1981. 8. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628525GRC June 2009 Revision 11 7