Εφαρμογές τεχνολογιών Μοριακής Βιολογίας στην Γενετική Πεφάνη Δάφνη 06.03.2019 Επίκουρη καθηγήτρια Εργαστήριο Βιολογίας
Τεχνικές μοριακής βιολογίας Επιτρέπουν την μελέτη της δομής του DNA και της έκφρασης γονιδίων Συμβάλουν στην κατανόηση του ρόλου των πρωτεϊνών Κατανόηση της λειτουργίας του κυττάρου και του οργανισμού
Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια προκειμένου να τα προστατέψουν από την εισβολή ξένου DNA. Αναγνωρίζουν ειδικές ακολουθίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA Είναι τα βιολογικά «ψαλίδια» Μια από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιείται συνήθως είναι η EcoRI που απομονώνεται από το βακτήριο Εsherichia coli
Περιοριστικές ενδονουκλεάσες
Τα ένζυμα περιορισμού δημιουργούν δίκλωνα ή μονόκλωνα άκρα
Κατασκευή συνεκτικών άκρων σε δυο μόρια DNA και σύνδεση μεταξύ τους
Διαχωρισμός DNA με ηλεκτροφόρηση Το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο Αν το βάλουμε σε ένα μέσο στα άκρα του οποίου εφαρμοστεί ηλεκτρική τάση, τότε το DNA θα μετακινηθεί προς τον θετικό πόλο Επειδή το ρεύμα είναι δεδομένο ως προς την ισχύ και τη διάρκειά του, μόρια DNA μικρότερου μεγέθους θα διανύσουν μεγαλύτερη απόσταση
Διαχωρισμός DNA με ηλεκτροφόρηση
Κλωνοποίηση Η εισαγωγή μορίου DNA σε φορέα, ο οποίος εισάγεται σε έναν οργανισμό ξενιστή για να πολλαπλασιαστεί
Μετασχηματισμός
Κλωνοποιήση ενός τμήματος DNA
Φορείς κλωνοποίησης πλασμίδια (ενσωματώνουν έως 20kb ξένου DNA) DNA φάγων (ενσωματώνουν έως 25kb ξένου DNA) Ένα πλασμίδιο για να είναι ικανός φορέας κλωνοποίησης πρέπει να έχει τα εξής χαρακτηριστικά: Να μπορεί να αντιγράφεται αυτόνομα μέσα στο κύτταρο ξενιστή Να διαθέτει γονίδιο (ή γονίδια) ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά Να περιέχει την ακολουθία που αναγνωρίζει η ενδονουκλεάση, που θα χρησιμοποιηθεί μια μόνο φορά
Φορείς κλωνοποίησης BACs ( Bacterial Artificial Chromosomes) (ενσωματώνουν έως 350kb ξένου DNA) YACs (Yeast Artificial Chromosomes) (ενσωματώνουν έως 1000kb ξένου DNA)
Γονιδιωματική Βιβλιοθήκη Σύνολο κλώνων που περιλαμβάνουν μόρια φορέων που περιέχουν τμήματα γονιδιωματικού DNA
cdna Βιβλιοθήκη Περιέχει τα συμπληρωματικά αντίγραφα DNA (cdna) των διαφορετικών μορίων mrna ενός ιστού To cdna περιέχει μόνο τις κωδικές αλληλουχίες Διαφορές στην αλληλουχία των cdna λόγω χρήσης εναλλακτικών υποκινητών ή σημείων συναρμογής Ιστοειδική έκφραση του γονιδίου
cdna Βιβλιοθήκη
Σύνθεση δίκλωνου cdna από mrna με τη χρήση της αντίστροφης μεταγραφάσης
Γονιδιωματική vs cdna βιβλιοθήκη
Διαλογή Βιβλιοθήκης με υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων Βασική αρχή υβριδοποίησης: H δίκλωνη έλικα αποδιατάσσεται και επαναδιατάσεται
Διαλογή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης με ιχνηθέτη σημασμένο μόριο DNA
Διαλογή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης με ιχνηθέτη σημασμένο μόριο DNA H ραδιενεργή σήμανση του ιχνηθέτη γίνεται με αποδιάταξη της διπλής έλικας του DNA και ενίσχυση του ιχνηθέτη με τυχαίους εκκινητές και ραδιοσημασμένα dntps
Διαλογή cdna βιβλιοθήκης με χρήση σημασμένου αντισώματος
Διαλογή cdna βιβλιοθήκης με χρήση σημασμένου αντισώματος
Ανάλυση κατά Southern Εντοπισμός αλληλουχιών συμπληρωματικών προς ένα σημασμένο ιχνηθέτη
Ανάλυση κατά Southern Ανίχνευση ελλειμμάτων Υβριδοποίηση με ανιχνευτή ειδικό για τον υποδοχέα του ανδρογόνου που βρίσκεται στο Χρωμόσωμα Χ
Ανάλυση κατά Southern Ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές για την ανίχνευση μεταλλάξεων
Ανάλυση κατά Northern
Ανάλυση κατά Νorthern
Fluorescent In situ Hybridisation (FISH)
Fluorescent In situ Hybridisation (FISH) Φασματικός καρυότυπος (SKY FISH):Χρήση 24 διαφορετικών ανιχνευτών χρωμάτων σημασμένων με διαφορετικό συνδυασμό χρωστικών ειδικών για το κάθε ανθρώπινο χρωμόσωμα Ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών
Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Ταυτόχρονη στόχευση και πολλαπλασιασμός του προς μελέτη γονιδίου
Απομόνωση της αλληλουχίας στόχου με χρήση συμπληρωματικών εκκινητών
Στάδια της PCR
Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
Παραλλαγές της PCR RT-PCR (Reverse Transcritpion PCR): Χρησιμοποιείται για την παραγωγή αντιγράφων cdna από mrna Multiplex PCR: Ταυτόχρονη ενίσχυση πολλαπλών στόχων Nested PCR: Δύο κύκλοι αντιδράσεων. Στον δεύτερο κύκλο ως υπόστρωμά χρησιμοποιείται το προϊόν του πρώτου κύκλου. Real Time PCR: -ποσοτική εκτίμηση των αντιγράφων mrna -ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mrna
Real Time PCR Η διαδικασία ενίσχυσης μιας αλληλουχίας DNA / cdna με τη μέθοδο της PCR με ταυτόχρονη ανίχνευση του παραγόμενου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο σε όλη τη διάρκεια της αντίδρασής (Real Time PCR)
Real Time PCR -Χρησιμοποιούνται ειδικές χρωστικές που ενσωματώνονται στο προϊόν της αντίδρασης και εκπέμπουν φθορίζον σήμα που ανιχνεύεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης - Η χρωστική Syber Green ενσωματώνεται στο δίκλωνο DNA - Φθορίζοντες ανιχνευτές - Yδρολυόμενοι φθορίζοντες ανιχνευτές (Taq man probes)
Χρωστική Syber Green Όταν η χρωστική βρίσκεται ελεύθερη στο διάλυμα δεν παράγεται φθορισμός. Η ενσωμάτωσή της στο DNA κατά τη σύνθεσή του σε συνδυασμό με τη διέγερσή της με ακτινοβολία κατάλληλου μήκους κύματος, έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή φθορισμού. Η ένταση του φθορισμού αυτού είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του παραγόμενου προϊόντος
Φθορίζοντες ανιχνευτές -Ειδικά σημασμένοι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές υβριδοποιούνται σε γειτονικές περιοχές -Όταν οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται τότε λόγο της κοντινής απόστασης εκπέμπεται σήμα λόγω μεταφοράς ενέργειας μεταξύ των φωτοευαίσθητων μορίων
Υδρολυόμενοι φθορίζοντες ανιχνευτές -Οι ανιχνευτές φέρουν στο 5 άκρο ένα φθορίζον μόριο και στο 3 άκρο ένα μόριο χρωστικής. Το δεύτερο μόριο χρωστικής, εξουδετερώνει το σήμα από το πρώτο. -Ο πολυμερισμός κατά την αντίδραση ενίσχυσης, οδηγεί στην αποκοπή του άκρου του ανιχνευτή, από την 5 - >3 εξωνουκλεολυτική δράση της πολυμεράσης, και κατ έπέκταση στη διακοπή της αλληλοεξουδετέρωσης του σήματος, με αποτέλεσμα την παραγωγή φθορισμού
Γραφική Παράσταση πολλαπλασιασμού σε πειράματα Real Time PCR
Χρήση της PCR στην ανίχνευση πολυμορφισμών Ποικίλου αριθμού διαδοχικές επαναλήψεις (Variable Number of Tandem Repeats, VNTRs) Εφαρμογές: Ιατροδικαστική, test πατρότητας
Χρήση της PCR στην ανίχνευση πολυμορφισμών Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)
Τεχνολογίες υψηλής ανάλυσης-omics Αν και κάθε κύτταρο ενός οργανισμού φέρει το ίδιο DNA Διαφορετικά γονίδια εκφράζονται σε κάθε διαφορετικό ιστό διαφορετικά RNA Ποιοτική και ποσοτική διαφορά
Συγκρίνοντας το προφίλ γονιδιακής έκφρασης διαφορετικών κυττάρων μπορούμε να διακρίνουμε κατά πόσον αυτά διαφέρουν μεταξύ τους
Microarrays Κάθε μικροσυστοιχία αποτελείται από χιλιάδες spots. Κάθε spot περιέχει πολλαπλά αντίγραφα μιας μοναδικής αλληλουχίας DNA που αντιστοιχεί σε ένα γονίδιο (1 spot 1 γονίδιο) Αν οι ανιχνευτές είναι cdna: Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες cdna Μπορούμε να εντοπίσουμε διαφορές μεταξύ δύο ειδών κυττάρων, π.χ. καρκινικών κυττάρων vs.υγιών κυττάρων
Microarrays Με τις μικροσυστοιχίες μπορούμε να εντοπίσουμε ποια γονίδια εκφράζονται διαφορετικά σε δύο είδη κυττάρων. Δεν μπορούμε να εντοπίσουμε ποια γονίδια φέρουν μετάλλαξη η τι είδους βλάβη έχουν
Tissue Microarrays Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση μοριακών στόχων σε επίπεδο DNA, RNA ή πρωτεΐνης σε ιστούς από βιοψίες ασθενών με αυτοματοποιημένο τρόπο Σε αντίθεση με τις DNA μικροσυστoιχίες στις οποίες κάθε spot αναπαριστά ένα μοναδικό cdna ή ολιγονουκλεοτίδιο, εδώ κάθε spot είναι μια τομή από έναν παθολογικό η φυσιολογικό ιστό