Αµνιο-PCR Η νέα προσέγγιση στην ταχεία προγεννητική διάγνωση των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών του εµβρύου Αγγελική Χατζάκη, PhD Γεωργία Χριστοπούλου, MSc Τµήµα Γενετικής και Μοριακής Βιολογίας Μαιευτήριο «ΜΗΤΕΡΑ»
Μελέτη δοµικών και αριθµητικών χρωµοσωµικών ανωµαλιών Κυτταρογενετική ΓΕΝΕΤΙΚΗ µελέτη της κληρονοµικότητας και της ποικιλοµορφίας σε όλους τους ζωντανούς οργανισµούς ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΘΡΩΠΟΥ =...στον άνθρωπο ΙΑΤΡΙΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ =...µε ιατρικό ενδιαφέρον Εφαρµογή στην κλινική διάγνωση και θεραπεία Κλινική Γενετική Μελέτη δοµής και λειτουργίας µεµονωµένων γονιδίων Μοριακή και Βιοχηµική Γενετική Πληθυσµιακή γενετική, γενετική επιδηµιολογία, αναπτυξιακή γενετική, ανοσογενετική κ.α
Ανθρώπινο γονιδίωµα: 3x10 9 bp Αριθµός γονιδίων: 20.000-40.000 Μέσο µέγεθος γονιδίου: 10.000 bp Αρα 30.000x10.000=3x10 8 bp Μόνο τo 1/10 χρήσιµο?? Tο πυρηνικό DNA των θηλαστικών είναι ετερογενές και αποτελείται από µοναδικές (µη επαναλαµβανόµενες) και µετρίως ή πολύ επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες.
Επαναλαµβανόµενο DNA Στον άνθρωπο µοναδικό DNA 60-70% του συνολικού γονιδιώµατος 30-40% µετρίως ή πολύ επαναλαµβανόµενο Mε εξαίρεση τα (ελάχιστα) γνωστά γονίδια που βρίσκονται σε περισσότερα από ένα αντίγραφα µέσα στο ανθρώπινο DNA, το υπόλοιπο µεγάλο µέρος του µετρίως και πολύ επαναλαµβανόµενου DNA απαρτίζεται από µη κωδικές αλληλουχίες.
Επαναλαµβανόµενο DNA Οι µετρίως επαναλαµβανόµενες περιοχές βρίσκονται διεσπαρµένες µέσα στις µοναδικές αλληλουχίες του ανθρώπινου DNA Πολύ επαναλαµβανόµενο κλάσµα τείνει να συγκεντρώνεται σε ευδιάκριτες και συνεχείς περιοχές.
Πολυµορφισµοί µήκους Επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες Ανήκουν στο µετρίως επαναλαµβανόµενο κλάσµα του ανθρώπινου πυρηνικού DNA SINEs και LINEs (short and long interspersed nuclear elements)
Πολυµορφισµοί µήκους STRs (short tandem repeats) Μικρές (1-6 6 bp) επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες διασκορπισµένες στο ανθρώπινο γονιδίωµα (short tandem repeats- STRs) microsatellite DNA έως 10 5 ανά γονιδίωµα βαθµός επανάληψης ανά γενετική θέση 10-10 3
Εντοπισµός υψηλά πολυµορφικών περιοχών STR που συστήνονται από την GDB για την ανάλυση του χρωµοσώµατος 21
Πολυµορφισµοί µήκους-εφαρµογές Πληθυσµιακές µελέτες Χαρτογράφηση γονιδίων σε χρωµοσωµικές θέσεις µε ανάλυση σύνδεσης Προσυµπτωµατική και προγεννητική διάγνωση µονογονιδιακών νοσηµάτων Ταχεία προγεννητική διάγνωση χρωµοσωµιακών ανωµαλιών (ανευπλοειδίες) Εντοπισµός φορέων Βιολογικοί δείκτες για µελέτες συσχέτισης Προσωπική ταυτοποίηση Ελεγχος πατρότητας Ελεγχος συµβατότητας δότη-λήπτη για µεταµοσχεύσεις, έλεγχος ελάχιστης υπολειµµατικής νόσου (minimal residual disease - MMR)
Αµνιο-PCR Αποµόνωση γενετικού υλικού από AF ή CVS Εκλεκτική ενίσχυση προεπιλεγµένης DNA περιοχής µε ποσοτικό φθορίζων PCR (QF-PCR) Ανίχνευση µε αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας DNA (ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer) Αριθµός αντιγράφων (ανευπλοειδίες) Μέγεθος (µοριακό βάρος)
PCR polymerase chain reaction Αρχή της µεθόδου
PCR-amplification fragment length polymorphism
Σχηµατική αναπαράσταση QF-PCR µε χρήση υψηλά πολυµορφικών STR περιοχών Adinolfi et al., 1997
Amnio-PCR Amplification of D21S11 STR for trisomy 21 detection NI tris NI tris tris NI NI NI: non informative / tris: trisomy 21 detected
Αµνιο-PCR, πλεονεκτήµατα Ταχύτητα (24-48 48h) / ευκολία / αξιοπιστία / ευαισθησία / ευελιξία / χαµηλό κόστος λειτουργίας Μικρότερη απαιτούµενη αρχική ποσότητα εµβρυϊκού υλικού (CVS ή AF) υνατότητα ανίχνευσης πρόσµιξης από µητρικά κύτταρα υνατότητα ταυτοποίησης µονοζυγωτικών/διζυγωτικών εµβρύων υνατότητα επέκτασης της µεθόδου µε ενσωµάτωση πολλών πληροφοριακών δεικτών STR ανά χρωµόσωµα υνατότητα παραλλήλου ελέγχου φορείας σε συχνά µονογονιδιακά νοσήµατα (π.χ. µετάλλαξη F508 στο γονίδιο CFTR γιά έλεγχο κυστικής ίνωσης)
Αµνιο-PCR, µειονεκτήµατα Απώλεια πληροφοριακότητας σε 0.3% του συνόλου των παθολογικών δειγµάτων Μωσαϊκά Άλλες αριθµητικές χρωµοσωµατικές ανωµαλίες (και πολυπλοειδίες) οµικές χρωµοσωµατικές ανωµαλίες (αναστροφές, µεταθέσεις, µικροδιπλασιασµοί, µικροελλείµµατα, µικροενθέσεις) υνατότητα µείωσης του παραπάνω ποσοστού σε 0.19% άν συµπεριληφθούν πληροφοριακοί δείκτες STR στο χρωµόσωµα Χ (XHPRT για διάγνωση σ. Turner) Υψηλό κόστος εξοπλισµού Εξειδικευµένο προσωπικό
PCR-amplification fragment length polymorphism
Σχηµατική αναπαράσταση QF-PCR µε χρήση υψηλά πολυµορφικών STR περιοχών Adinolfi et al., 1997
Εντοπισµός υψηλά πολυµορφικών περιοχών STR που συστήνονται από την GDB για την ανάλυση του χρωµοσώµατος 21
STR περιοχές που αναλύονται στα χρωµοσώµατα 21,18,13 και Χ/Υ Mult-A F R Dye PCR product size F primer sequence R primer sequence D21S11 24 24 NED 214-242bp 5' TAT GTG AGT CAA TTC CCC AAG TGA 3' 5' GTT GTA TTA GTC AAT GTT CTC CAG 3' D18S535 20 25 PET 126-160bp 5' TCA TGT GAC AAA AGC CAC AC 3' 5' AGA CAG AAA TAT AGA TGA GAA TGC A 3' D13S634 24 24 6-FAM 385-440bp 5' GGC AGA TTC AAT AGG ATA AAT AGA 3' 5' GTA ACC CCT CAG GTT CTC AAG TCT 3' AMXY 24 24 6-FAM X:106bp / Y:112bp 5' CCC TGG GCT CTG TAA AGA ATA GTG 3' 5' ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG 3' Mult-B D21S1411 25 23 NED 256-340bp 5' GTA GAT ACA TAA ATA TGA TGA ATG C 3' 5' TAT TAA TGT GTG TCC TTC CAG GC 3' D18S386 24 24 6-FAM 330-400bp 5' CTC TTC CAT GAA GTA GCT AAG CAG 3' 5' TGA GTC AGG AGA ATC ACT TGG AAC 3' D13S631 20 19 PET 189-223bp 5' GGC AAC AAG AGC AAA ACT CT 3' 5' TAG CCC TCA CCA TGA TTG G 3' CF ( F508) 24 24 6-FAM 94-97bp 5' GTT TTC CTG GAT TAT GCC TGG CAC 3' 5' GTT GGC ATG CTT TGA TGA CGC TTC 3' Mult-C D21S1412 19 19 6-FAM 384-414bp 5' CGG AGG TTG CAG TGA GTT G 3' 5' GGG AAG GCT ATG GAG GAG A 3' X22 20 20 NED 189-242bp 5' TAA TGA GAG TTG GAA AGA AA 3' 5' CCC ATT GTT GCT ACT TGA GA 3' MBP-A/B 20 20 PET locusa: 119-140bp 5' ATT TAC CTA CCT GTT CAT CC 3' 5'GGA CCT CGT GAA TTA CAA TC 3' locusb: 210-230bp
Ταχεία προγεννητική διάγνωση αριθµητικών ανωµαλιών των χρωµοσωµάτων 13,18,21 µε ανάλυση 2 πολυµορφικών STR περιοχών ανά χρωµόσωµα είγµα 1, φυσιολογικό 18 21 13 13 21 18
Ταχεία προγεννητική διάγνωση αριθµητικών ανωµαλιών των χρωµοσωµάτων 13,18,21 µε ανάλυση 2 πολυµορφικών STR περιοχών ανά χρωµόσωµα είγµα 2, τρισωµία 21 18 21 13 13 21 18
Ταχεία προγεννητική διάγνωση αριθµητικών ανωµαλιών των χρωµοσωµάτων 13,18,21 µε ανάλυση 2 πολυµορφικών STR περιοχών ανά χρωµόσωµα είγµα 3, τρισωµία 18 18 21 13 13 21 18
Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Σύνολο δειγµάτων 23/5/2005 έως 30/9/2005 Σύνολο δειγµάτων προγεννητικής διάγνωσης 23/5/2005 έως 30/9/2005 842 827 Αµνιακό υγρό 611 Χοριακές λάχνες 216 Ιστός προϊόντος αποβολής 11 Αίµα 4
Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Αποτελέσµατα QF-PCR AF CVS Φυσιολογικά 601 210 Τρισωµία 21 5 2 Τρισωµία 18 1 4 σ. Klinefelter 1 0 Μη πληροφοριακά λόγω µητρικής πρόσµιξης 3 0 ΣΥΝΟΛΟ 611 216
Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Αποτελέσµατα QF-PCR Φυσιολογικό Καρυότυπος mos46,x isoq/45,x/46xxp - Υλικό AF Φυσιολογικό 45,X CVS Φυσιολογικό mos47,xx+21 [10]/46, XX [6] 3/827 827=0. =0.36 CVS 36% 2 CVS και 1 AF
Τµήµα Κυτταρογενετικής και Μοριακής Βιολογίας «ΜΗΤΕΡΑ» Αποτελέσµατα F508 (CF) (κυστική ίνωση) AF CVS ιστός προϊόντος αποβολής Ν/Ν 603 212 10 F508/Ν 8 4 1 Σύνολο ετερόζυγων F508/N 13/838=1.55% Συχνότητα F508 στον Ελληνικό πληθυσµό 2.27% x 2 = 1.993 / P=0.157, στατιστικά µησηµαντική απόκλιση