Φυτοχημική ανάλυση των καρπών του Sorbus domestica (Rosaceae) σε συνδυασμό με την αντιοξειδωτική ικανότητα και αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗΣ Γ. ΤΕΡΜΕΝΤΖΗ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΓΕΩΠΟΝΟΥ Φυτοχημική ανάλυση των καρπών του Sorbus domestica (Rosaceae) σε συνδυασμό με την αντιοξειδωτική ικανότητα και αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗΣ Γ. ΤΕΡΜΕΝΤΖΗ Φυτοχημική ανάλυση των καρπών του Sorbus domestica (Rosaceae) σε συνδυασμό με την αντιοξειδωτική ικανότητα και αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Φαρμακευτικής Τομέας Φαρμακογνωσίας Φαρμακολογίας Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 30 Μαΐου 2008 Εξεταστική Επιτροπή Αν. Καθηγητής Ευγένιος Κοκκάλου, Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Παύλος Κορδοπάτης, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Κων/νος Μπιλιαδέρης, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Β. Ρούσσης, Εξεταστής Καθηγητής Λ. Σκαλτσούνης, Εξεταστής Αν. Καθηγητής Κ. Βάγιας, Εξεταστής Αν. Καθηγητής Β. Δημόπουλος, Εξεταστής

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗΣ Γ. ΤΕΡΜΕΝΤΖΗ ΓΕΩΠΟΝΟΥ Φυτοχημική ανάλυση των καρπών του Sorbus domestica (Rosaceae) σε συνδυασμό με την αντιοξειδωτική ικανότητα και αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας- Χημείας Φυσικών Προϊόντων, του Τομέα Φαρμακογνωσίας Φαρμακολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αν. Καθηγητής Ευγένιος Κοκκάλου, Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Παύλος Κορδοπάτης, Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής Καθηγητής Κωνσταντίνος Μπιλιαδέρης, Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής Καθηγητής Βασίλειος Ρούσσης, Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Καθηγητής Λέανδρος Σκαλτσούνης, Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Αν. Καθηγητής Κωνσταντίνος Βάγιας, Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Αν. Καθηγητής Βασίλειος Δημόπουλος, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

Στην οικογένειά μου και σε αυτούς που πίστεψαν σε μένα περισσότερο από μένα.

Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας-Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τομέα Φαρμακογνωσίας-Φαρμακολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Ευχαριστώ ολόψυχα τον Αναπληρωτή Καθηγητή Ευγένιο Κοκκάλου, επιβλέποντα της παρούσας διδακτορικής διατριβής για την υπόδειξη του θέματος, την ουσιαστική και ανεκτίμητη συμβολή του σε όλα τα στάδια εκτέλεσης αυτής και για τη μοναδική ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με το αντικείμενο της Φαρμακογνωσίας. Ευχαριστώ θερμά τους Καθηγητές Παύλο Κορδοπάτη (Πανεπιστήμιο Πατρών) και Κωνσταντίνο Μπιλιαδέρη (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης), μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις και συμβουλές σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Πολλές ευχαριστίες στα μέλη της εξεταστικής επιτροπής, Καθηγητές Βασίλειο Ρούσση (Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών), Λέανδρο Σκαλτσούνη (Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών) και Αναπληρωτές Καθηγητές Βασίλειο Δημόπουλο (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) και Κωνσταντίνο Βάγια (Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών) για την αξιολόγηση της διδακτορικής διατριβής. Επίσης ευχαριστώ θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακευτικής Χημείας Α.Π.Θ. Βασίλειο Δημόπουλο για τη συνεργασία στην εκτίμηση αναστολής του ενζύμου αναγωγάση της αλδόζης και τον Επίκουρο Καθηγητή Φαρμακολογίας Ιωάννη Βιζιριανάκη για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας σε συστήματα κυτταροκαλλιεργειών δύο εκ των ενώσεων που απομονώθηκαν. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω την Δρ. Χρυσή Γαβριέλη, μέλος του εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας για την συνεχή συμπαράστασή της. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον ερευνητή του Μεσογειακού Αγρονομικού Ινστιτούτου Χανίων, Δρ. Παναγιώτη Κεφάλα, για την προσφορά του οργάνου LC-DAD- MS και για την λήψη των φασμάτων μάζας. Πολλές ευχαριστίες στην ερευνήτρια του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών, Δρ. Μαρία Ζερβού, για την λήψη των φασμάτων Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού, καθώς και για τις εποικοδομητικές και εύστοχες συζητήσεις μας. Ευχαριστώ τον ερευνητή της Ακαδημίας Αθηνών, Δρ. Σπύρο Γαρμπή για τη λήψη των φασμάτων TF-MS/MS. Πολλές ευχαριστίες στους Υποψήφιους Διδάκτορες Πολυξένη Αλεξίου, Ιωάννη Μπονοβόλια και Μάριο Σπανάκη για τη συμμετοχή τους στα πειράματα αξιολόγησης της δράσης αναστολής της αναγωγάσης της αλδόζης, της κυτταροτοξικότητας σε συστήματα κυτταροκαλλιεργειών και λήψης φασμάτων σε αέριο χρωματογράφο αντίστοιχα. Ευχαριστώ τον Δρ. Firas Qanaze για τη φιλική παρουσία του στο εργαστήριο κατά τον πρώτο χρόνο της εργασίας μου. Τέλος ευχαριστώ τον Δημήτρη, την Ελένη, τον Γιώργο, την Αθηνά και τον Βασίλη, που όλα αυτά τα χρόνια στάθηκαν δίπλα μου με κατανόηση και υπομονή.

Ήτανε παραμονή των Φωτών ξεύρεις πως είναι η καρδιά μου σε τέτοιαις επίσημαις ημέραις. Ενθυμήθηκα τον μακαρίτη τον πατέρα σου, κ ενθυμήθηκα, πως μια τέτοια παραμονή, σαν είδες του κόσμου τα παιδιά που κρατούσαν ταις σουρβιαίς και σούρβιζαν τους ανθρώπους μέσ στον δρόμο, πήρες και συ μια σκούπα και άρχησες να χτυπάς τον πατέρα σου πα στην ράχη και να τον σουρβίζης: Σούρβα, σούρβα! γερό κορμί, γερό σταυρί, όλο γειά και δύναμι, και του χρόν γεροί! Έτσι μικρό που ήσουνε, ήξευρες τα λόγια. Και το χάρηκεν ο μακαρίτης, και σε πήρε στην αγκαλιά του και σε φίλησε: Έχε την ευχή μου, και να μου τρανέψης! Και σ έδωκε μια πεντάρα, και μ εκούνησε με το δάχτυλο και με είπε. Αυτό το παιδί, γυναίκα, θα γένη! Πού το ήξευρε, πως ύστερ από τρεις μήνες θε να σ άφην ορφανό! Και που το ήξευρε, πως οι παραμοναίς των Φωτών θε ν άρχουνταν και θα περνούσαν και συ θα κακοπάθιαζες στην ξενητειά κι εγώ θε ν άκλαιγα μονάχη! Έτσι κ εκείνη την παραμονή. Ο Mιχαήλος που με ήξευρεν, επήγεν από νωρίς εις το βουνό και έφερε μια σουρβιά: Ένα μεγάλο κλωνί γεμάτο σφιχτά και πράσινα μάτια Μ αυτά τα σούρβα, μάνα, θα διούμεν απόψε την τύχη μας. Σαν ήρθεν ο Χρηστάκης στο σπίτι, εκαθήσαμε στο παραγώνι κ εχωρίσαμε την φωτιά σε δυο μεριαίς, και άρχησεν ο Μιχαήλος να βάζη τα σούρβα στην μέση πα στην καυτερή την πλάκα, για να διούμε την τύχη μας. Πρώτα πρώτα σ ωνομάτισεν εσένα, κ έκοψε σούρβο και το έβαλε. Και μόλις τώβαλεν, εβρόντηξε και πήδηξε κι εβγήκεν απ την στιά. Έχε την ευχή μου, Μιχαήλο! του είπα. Απόψε εύφρανες την καρδιά μου. Σαν είν ο Γιωργής μας γερός, είμασθ όλοι καλά! Ύστερα μ ωνομάτισεν εμένα. Ε! κ εγώ, πες, καλά πήγα. Ύστερα ωνομάτισε τον Χρηστάκη και διες εσύ! Το μάτι της σουρβιάς έμεινε πα στην πλάκα που τώβαλε, σιγανό και ακίνητο, ώστε που εμαύρισε κ εκάπνισε κ έγειρεν ολίγο και εκάηκε! Χριστός και Παναγιά, παιδάκι μου! του είπα. εν έβαλες καλό σούρβο! Κ επήρα την σουρβιάν από το χέρι του κ εδιάλεξα το πιο καλό το μάτι και άνοιξα καινούριο τόπο στην φωτιά και το έβαλα... Εκάπνισεν ολίγο, εμαύρισεν, ετανίσθη κ έμεινε στον τόπο! Τότ εγέλασεν ο Χρηστάκης δυνατά κ επήρεν ένα δαυλί και ανεκάτωσε τα κάρβουνα και είπε: Εγώ, μητέρα, είμαι βασταγερός άνθρωπος, το ξέρεις. Έτσι εύκολα δεν πηδώ να φύγω μέσ από λίγη ζέστη σαν και λόγου σας. Αν θέλης να ιδής την τύχη μου, φέρ εδώ! Και πήρε το κλωνί από το χέρι μου και το έβαλε μέσ στην φωτιά. Κ επυρώθηκαν τα σούρβα και ήρχησαν να βροντούν και να πηδούνε... Τώρα, λέγε μου εσύ ό,τι θέλεις. Σούρβα είναι σούρβα, το ξέρω. Και την τύχη την βλέπουν για την συνήθεια, όχι για την αλήθεια, κι αυτό σωστό. Μα όταν θυμηθώ τους κούφιους εκείνους κρότους και ταις μακρυναίς τουφεκιαίς που ύστερ από λίγαις ημέραις άρχησαν ν ακούγωνται τριγύρω στα χωριά, μου ξεσηκόνετ η καρδιά μου, και δεν μπορώ να ησυχάσω. Το πράγμα ήταν καθαρό και ξάστερο, μα μεις δεν το ψηφήσαμε, μόνο το πήραμ ελαφρυά κ εγελάσαμεν. Γεώργιος Βιζυηνός Ποιος ήτο ο φονεύς του αδερφού μου Σουρβιά: η σορβιά

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ...1 ABSTRACT...3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ...5 ΤΟ ΓΕΝΟΣ SRBUS KAI ΑΛΛΑ ΓΕΝΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ RSACEAE......5 Το γένος Sorbus.....5 Tο είδος S. domestica (Οικιακή σορβιά ή Service tree)..5 Βοτανικά Χαρακτηριστικά 5 Το είδος S. domestica- Γεωγραφική εξάπλωση.5 Το φυτό και η Παράδοση...6 Βιβλιογραφικές αναφορές για τη σύσταση του καρπού, των σπερμάτων, του φλοιού και των φύλλων ειδών του γένους Sorbus.7 Φαρμακολογικές ιδιότητες που έχουν αναφερθεί για τους καρπούς Sorbus...11 Φυτοχημικές και φαρμακολογικές αναφορές σχετικά με τη χημική σύσταση των καρπών άλλων ειδών της υποοικογένειας Maloideae (Rosaceae), όπως το μήλο (Malus) και η Aronia... 13 ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ- ΕΝΕΡΓΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ.16 Ελεύθερες ρίζες.16 Εύρεση ελευθέρων ριζών στη φύση..17 Ο κύριος ρόλος του οξυγόνου στην αερόβια ζωή..19 Η τοξικότητα του οξυγόνου...20 Σημαντικές ενεργές μορφές οξυγόνου...21 Δημιουργία ελεύθερων ριζών σε βιολογικά συστήματα...24 Mοριακοί μηχανισμοί προσβολής και τοξικότητας από ελεύθερες ρίζες..25 Άμυνα του οργανισμού έναντι της τοξικότητας του οξυγόνου και της προσβολής από ελεύθερες ρίζες: Οξειδωτικό stress 28 Εμπλοκή της δράσης των ελευθέρων ριζών-οξειδωτικού stress σε παθολογικές καταστάσεις...29 Α. Φλεγμονή 30 Β. Επιπλοκές του σακχαρώδους διαβήτη 30 Γ. Καρδιαγγειακό, υπέρταση, υπερχοληστερολαιμία, αγγειοπάθειες.32 Δ. Νευρωνική εκφύλιση...33 Παγίδες ελευθέρων ριζών (Αντιοξειδωτικά).34 Τα αντιοξειδωτικά και η Βιομηχανία τροφίμων 34 Συμπεράσματα...35 Ιστορικά στοιχεία...36 ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΦΑΙΝΟΛΕΣ.37 Δομές Φαινολών 37 Α) Φλαβονοειδή...37 Β) Φαινολικά οξέα...38 Φλαβονοειδή και Φαινολικά οξέα στα φυτά.38 Βιοσύνθεση των φαινολικών ενώσεων στα φυτά 40 Βιοσύνθεση Υδροξυκινναμωμικών οξέων..41 Βιοσύνθεση Υδροξυβενζοϊκών οξέων.42 Βιοσύνθεση Φλαβονοειδών.42

Λειτουργικότητα των Φλαβονοειδών και Φαινολικών οξέων στα φυτά.43 Φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά των φαινολικών ενώσεων.45 Αντιοξειδωτική δράση των φαινολών...46 Αντιοξειδωτική δύναμή των φλαβονοειδών και διαφοροποιήσεις αυτής ανάλογες με τη δομή των μορίων.46 Αντιοξειδωτική δύναμή των φαινολικών οξέων και διαφοροποιήσεις αυτής ανάλογες με τη δομή των μορίων 49 Άλλες δράσεις που αποδίδονται στις φυσικές φαινόλες 51 Αναστολή ενζύμων..51 Δράση κατά καρδιοαγγειακών παθήσεων...52 Δράση κατά της LDL και φαρμακοκινητική των φλαβονοειδών 52 Αντιφλεγμονώδης δράση.53 Αγγειακές δράσεις των φλαβονοειδών 53 Κυτταροτοξικές και αντικαρκινικές δράσεις των φλαβονοειδών 54 Άλλες αναφερόμενες δράσεις των φλαβονοειδών...55 ΠΡΟΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ.56 IN VITR ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΛΕΓΧΟΥ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ 57 (Ι) Δοκιμή Σάρωσης ελευθέρων ριζών με χρήση της Μεθόδου DPPH.57 (ΙΙ) Η Δοκιμή του Θειοβαρβιτουρικού οξέος (ΤΒΑ).57 (IΙΙ) Δοκιμή Σάρωσης Ριζών Υδροξυλίου H...59 (ΙV) Μέτρηση της αντιοξειδωτικής δράσης στην οξείδωση της ανθρώπινης LDL..60 (V) Δοκιμή TEAC..60 (VI) Δοκιμή FRAP (Ferric-reducing antioxidant Power)..61 (VII) Έλεγχος της Αντιοξειδωτικής Δράσης μιας ουσίας με τη μέθοδο QSAR (Ποσοτική Σχέση Δομής - Δράσης) 62 (VIIΙ) Έλεγχος της αντιοξειδωτικής δράσης με τη μέθοδο της Χημειοφωταύγειας της λουμινόλης.63 Ο ΔΙΑΒΗΤΗΣ ΤΥΠΟΥ ΙΙ & ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΑΝΑΓΩΓΑΣΗ ΤΗΣ ΑΛΔΟΖΗΣ (ΑLR2)...58 Παθοφυσιολογία του σακχαρώδη διαβήτη και επιπλοκές στον οργανισμό..58 Το ένζυμο αναγωγάση της αλδόζης...59 Αναστολείς της ALR2...64 Αναστολείς της ALR2 που απομονώθηκαν στη φύση..67 Φλαβονοειδή και σχέσεις δομής-δράσης.67 Φαινολικά οξέα 69 Άλλοι αναστολείς της ALR2...70 Φυσικές φαινόλες κατά του διαβήτη.71 Η σορβιτόλη και η απόπτωση των κυττάρων 71 ΣΚΟΠΟΣ...73 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ.. 74 To Φυτικό Υλικό. Συλλογή- Εκχυλίσεις...74 Συλλογή και Διεργασία του Φυτικού Υλικού..74 Οι διαλύτες και τα αντιδραστήρια...74 Η διαδικασία της εκχύλισης 74 Παρασκευαστικές μέθοδοι για την απομόνωση και έλεγχο των περιεχόμενων ουσιών 76 Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας..76

Χρωματογραφία στήλης 78 Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης..79 Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους- Ορατού..79 Όξινη υδρόλυση...79 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance, NMR).80 Ποιοτική και Ποσοτική Καταγραφή του Φαινολικού Περιεχομένου με τη Χρήση του Συστήματος LC-DAD-MS (ESI+)- Λήψη φασμάτων μάζης 80 Το σύστημα LC-DAD-MS (ESI+)..80 Πρότυπα δείγματα για ποσοτική και ποιοτική ανάλυση.81 MS-MS ανάλυση (Nano-ESI-QqTF MS-MS Analysis)..82 Υπολογισμός του Ολικού Φαινολικού Περιεχομένου (Total Phenolic Content, TPC) με τη μέθοδο Folin Ciocalteau..83 Οι μέθοδοι ελέγχου της Αντιοξειδωτικής Δύναμης...84 Η μέθοδος ελέγχου της σάρωσης της ρίζας 2,2-Διφαίνυλο-1-πικρυλυδραζυλίου (DPPH ) 84 H μέθοδος της Χημειοφωταύγειας της Λουμινόλης, επαγόμενης από το σύμπλοκο CoII-EDTA..85 Έλεγχος αναστολής του ενζύμου αναγωγάση της αλδόζης..87 Προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας ουσιών με τη χρήση των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού (MEL) 89 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ...90 Ποιοτική ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου με το σύστημα LC-DAD-MS (ESI+).90 Γενικές παρατηρήσεις.90 LC-DAD-MS ανάλυση υδροξυβενζοϊκών οξέων και παραγώγων..90 LC-DAD-MS ανάλυση φαινυλοπροπανοϊκών οξέων και παραγώγων 91 LC-DAD-MS ανάλυση φλαβονοειδών και παραγώγων..91 A2, Διχλωρομεθάνιο, Άγουροι καρποί..100 ΕΝΩΣΗ 1.101 ΕΝΩΣΗ 6.102 ΕΝΩΣΗ 25...104 ΕΝΩΣΗ 26...107 ΕΝΩΣΗ 29...108 ΕΝΩΣΗ 30...110 ΕΝΩΣΗ 33...112 B2, Διχλωρομεθάνιο, Καρποί που ωρίμασαν καλά πάνω στο δέντρο...114 ΕΝΩΣΗ 2.115 ΕΝΩΣΕΙΣ 34-38......116 C2, Διχλωρομεθάνιο, Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και ωρίμασαν για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου 121 D2, Διχλωρομεθάνιο, Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν για τρεις εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου 122 A3, Διαιθυλαιθέρας, Άγουροι Καρποί...123 ΕΝΩΣΗ 3.124 ΕΝΩΣΗ 4.124 ΕΝΩΣΗ 5.125

ΕΝΩΣΗ 16...127 ΕΝΩΣΗ 19...130 ΕΝΩΣΗ 20...133 ΕΝΩΣΗ 24...135 ΕΝΩΣΗ 27...137 ΕΝΩΣΗ 43...139 ΕΝΩΣΗ 46...141 ΕΝΩΣΗ 49...144 ΕΝΩΣΗ 58...146 Β3, Διαιθυλαιθέρας, Καρποί που ωρίμασαν καλά πάνω στο δέντρο 150 ΕΝΩΣΗ 14...151 ΕΝΩΣΗ 21...152 ΕΝΩΣΗ 55...154 C3, Διαιθυλαιθέρας, Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου 157 ΕΝΩΣΗ 22...158 ΕΝΩΣΗ 59...159 D3, Διαιθυλαιθέρας, Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν για τρεις εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου 161 ΕΝΩΣΗ 11...162 ΕΝΩΣΗ 23...163 ΕΝΩΣΗ 42...164 ΕΝΩΣΗ 44...166 ΕΝΩΣΗ 57...168 Ε3, Διαιθυλαιθέρας, Πολτός καρπών 170 ΕΝΩΣΗ 60..171 ΕΝΩΣΗ 61...172 Α4, Οξικός αιθυλεστέρας, Άγουροι καρποί...173 ΕΝΩΣΗ 13...174 ΕΝΩΣΗ 15...176 ΕΝΩΣΗ 41...178 ΕΝΩΣΗ 48...180 ΕΝΩΣΗ 51...181 Β4, Οξικός αιθυλεστέρας, Καρποί που ωρίμασαν καλά πάνω στο δέντρο...184 ΕΝΩΣΗ 50...185 ΕΝΩΣΗ 52...186 C4, Οξικός αιθυλεστέρας, Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου.189 ΕΝΩΣΗ 47...190 D4, Οξικός αιθυλεστέρας, Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν για τρεις εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου.192 ΕΝΩΣΗ 53...193 Ε4, Οξικός αιθυλεστέρας, Πολτός καρπών...195 ΕΝΩΣΗ 39...196 ΕΝΩΣΗ 56...197 Α5, Βουτανόλη, Άγουροι Καρποί..200

ΕΝΩΣΕΙΣ 7&8.201 ΕΝΩΣΗ 10...204 ΕΝΩΣΗ 12...205 ΕΝΩΣΗ 45...207 ΕΝΩΣΕΙΣ 28, 31, 32 207 ΕΝΩΣΗ 54...210 Β5, Βουτανόλη, Καρποί που ωρίμασαν καλά πάνω στο δέντρο...213 ΕΝΩΣΗ 40...214 Ε5, Βουτανόλη, Πολτός καρπών...216 ΕΝΩΣΗ 17...217 C6, Νερό, Καρποί που ωρίμασαν για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου..218 ΕΝΩΣΗ 9.219 ΕΝΩΣΗ 62...221 Ε6, Νερό, Πολτός καρπών.223 Ποσοτική ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου των δειγμάτων.226 Συμπεράσματα από την LC-DAD-MS ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου των καρπών.230 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΝΩΣΕΩΝ & ΠΛΗΡΗΣ ΔΙΕΥΚΡΙΝΗΣΗ ΔΟΜΗΣ.232 ΣΧΗΜΑΤΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΤΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ.233 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΚΑΘΑΡΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ..243 Υδροξυβενζοϊκά οξέα & παράγωγα 243 ΕΝΩΣΗ 4...243 ΕΝΩΣΗ 3...252 ΕΝΩΣΗ 63 258 ΕΝΩΣΗ 64.264 ΕΝΩΣΗ 65.272 Υδροξυφαινυλοπροπανοειδή οξέα & παράγωγα.278 ΕΝΩΣΗ 66.278 ΕΝΩΣΗ 9...282 ΕΝΩΣΗ 67.291 ΕΝΩΣΗ 68.300 ΕΝΩΣΗ 69.307 ΕΝΩΣΗ 70.312 Φλαβονοειδή 334 ΕΝΩΣΗ 71.334 ΕΝΩΣΗ 72.338 ΕΝΩΣΗ 73.343 ΕΝΩΣΗ 45.350 ΕΝΩΣΗ 74.356 ΕΝΩΣΗ 75.365 ΕΝΩΣΗ 76.373 Διφαινύλια...378 ΕΝΩΣΗ 77.379 ΕΝΩΣΗ 78.402 Οκταϋδροανθρακένιο...421 ΕΝΩΣΗ 79.421

Τριγλυκερίδιο...435 ΕΝΩΣΗ 80.435 Η ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΔΥΝΑΜΗ ΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ & Η ΣΧΕΣΗ ΑΥΤΗΣ ΜΕ ΤΟ ΟΛΙΚΟ ΦΑΙΝΟΛΙΚΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ...442 Ολικό φαινολικό περιεχόμενο των εκχυλισμάτων (ΤΡC)...442 Ικανότητας σάρωσης ελευθέρων ριζών των διαφόρων εκχυλισμάτων του καρπού της σορβιάς 442 Συσχέτιση μεταξύ ολικού φαινολικού περιεχομένου και αντιοξειδωτικής ικανότητας...445 Σύγκριση μεταξύ των δύο μεθόδων εκτίμησης της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων...447 Εκχυλίσματα, κλάσματα και αντιοξειδωτικά αναφοράς 447 Αντιοξειδωτική δύναμη σε σχέση με την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των περιεχομένων χημικών δομών 448 ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΝΑΓΩΓΑΣΗ ΤΗΣ ΑΛΔΟΖΗΣ (ALR2)..458 Έλεγχος των κλασμάτων του καρπού S. domestica ως προς την αναστολή της δράσης του ενζύμου ALR2 458 Συμπεράσματα από την ικανότητα των κλασμάτων να αναστέλλουν την ARL2 σε σχέση με το φαινολικό τους περιεχόμενο...460 Ικανότητα του Διέξυλ 3,3 -(2,2,6,6 -τετραϋδροξυδιφαίνυλ-4,4 -διύλ) διπροπανοϊκού εστέρα (ΕΝΩΣΗ 78) να αναστέλλει το ένζυμο ΑLR2... 464 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΕΡΥΘΡΟΛΕΥΧΑΙΜΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΟΝΤΙΚΟΥ.465 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.466 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..469

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο καρπός του φυτού Sorbus domestica (Rosaceae) χρησιμοποιείται εμπειρικά σε πολλές περιοχές της Ευρώπης σαν αντιοξειδωτικός παράγοντας σε ποτά και στην παραδοσιακή ιατρική σαν υπογλυκαιμικό και προληπτικό των δευτερογενών συμπτωμάτων του διαβήτη. Παρόλα αυτά δεν υπήρχε καμία επιστημονική αναφορά σχετικά με αυτές τις αναφερόμενες δράσεις. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε λεπτομερής ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου των καρπών, έλεγχος διαφόρων εκχυλισμάτων σχετικά με την αντιοξειδωτική ικανότητα (δοκιμή ρίζας DPPH και χημειοφωταύγειας της λουμινόλης), καθώς και έλεγχος αναστολής του ενζύμου αναγωγάση της αλδόζης. Το τελευταίο αυτό είναι υπεύθυνο για την εκδήλωση των δευτερογενών επιπλοκών σε διαβητικούς, όπου συγχρόνως έχουμε και γένεση ελευθέρων ριζών (κυτταρικό οξειδωτικό στρες). Για όλα τα παραπάνω ελέγχθηκαν πέντε διαφορετικοί τύποι καρπών για συγκριτικούς λόγους: (Α) Άγουροι καρποί, (Β) Καρποί που ωρίμασαν καλά πάνω στο δέντρο, (C) Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου, (D) Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν καλά για τρεις εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου & (E) Πολτός αώρων καρπών συσκευασμένος εν κενώ. Σαν παραδοσιακό φάρμακο χρησιμοποιούνται μόνο οι δύο τελευταίες κατηγορίες καρπών και γι αυτό είχε αξία ο συγκριτικός έλεγχος των πέντε κατηγοριών. Η ποιοτική και ποσοτική φυτοχημική ανάλυση των αρχικών εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε σε σύστημα LC-DAD-MS (ESI+), όπου η διευκρίνιση της δομής έγινε με τον μηχανισμό θραυσμάτωσης. Παράλληλα απομονώθηκαν ενώσεις για τις οποίες δεν ήταν δυνατή η ταυτοποίηση με το παραπάνω σύστημα και διευκρινίστηκε η δομή τους και με τη βοήθεια διαφόρων τεχνικών Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (φάσματα NMR) και HR-MS/MS. Η απομόνωση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε με παρασκευαστικές τεχνικές όπως υγρή χρωματογραφία στήλης (CC), υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Από την φυτοχημκή ανάλυση διευκρινίσθηκαν ογδόντα ενώσεις που ανήκουν στις κατηγορίες των υδροξυβενζοϊκών οξέων, υδροξυφαινυλοπροπανοϊκών οξέων και παραγώγων, φλαβονοειδών και διφαινυλίων. Από τις ενώσεις που διευκρινίστηκαν, είκοσι ήταν νέες δομές: έξι διμερή της κερκετίνης, δύο διμερή της καιμφερόλης, δύο νέοι γλυκοζίτες της κερκετίνης, ένας σόρβυλο-εξοζίτης της κερκετίνης, ένας εξοζυλιωμένος 3- Ο- εστέρας της κερκετίνης, ένας 7-Ο-φερουλικός εστέρας της ακακετίνης, μία 7-Ο- 1

εξοζυλιωμένη 3,6,5,7-τετραϋδρόξυ φλαβανόλη, ένα τριμερές παράγωγο του βανιλλικού οξέος, ένας ανυδρίτης του πρωτοκατεχικού οξέος, ένα πολύπλοκο πολυφαινολικό φαινυλοπροπανοειδές, δύο διφαινύλια και ένα παράγωγο οκταϋδροανθρακενίου. Επίσης απομονώθηκε ένα ακόρεστο τριγλυκερίδιο, του οποίου η δομή επιβεβαιώθηκε μερικώς μόνο με φάσματα NMR. Όλες οι κατηγορίες καρπών περιείχαν υψηλά ποσοστά εστέρων φαινυλοπροπανοϊκών οξέων με κινικό οξύ. Οι άγουρες κατηγορίες Α και C και ο πολτός των καρπών Ε περιείχαν υψηλά ποσοστά φλαβονοειδών και χαμηλά ποσοστά υδροξυβενζοϊκών οξέων. Το αντίστροφο διαπιστώθηκε για τις ώριμες κατηγορίες Β και D, όπου σύμφωνα με τον ποσοτικό προσδιορισμό κυριαρχούσαν τα υδροξυβενζοϊκά οξέα. Τα διφαινύλια απομονώθηκαν από την κατηγορία των καρπών που ωρίμασαν πάνω στο δέντρο και, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, αυτού του χημικού τύπου ενώσεις λειτουργούν στο φυτό ως φυτοαλεξίνες σε περιπτώσεις μυκησιακών προσβολών. Από τον αντιοξειδωτικό έλεγχο των διαφόρων εκχυλισμάτων με τις δύο τεχνικές αξιολόγησης φάνηκε ότι καλύτερη δράση εμφάνισαν οι καρποί των κατηγοριών A και C (άγουροι) καθώς και ο πολτός Ε, ενώ οι ώριμες κατηγορίες Β και D είχαν συγκριτικά μικρότερη δράση. Τα αποτελέσματα αυτά σχετίζονται με το φαινολικό περιεχόμενο των καρπών, αφού τα φλαβονοειδή είναι ισχυρότερα αντιοξειδωτικά από τα φαινολικά οξέα. Στην περίπτωση ελέγχου της αναστολής του ενζύμου αναγωγάση της αλδόζης, όλες οι κατηγορίες καρπών εμφάνισαν παραπλήσια δράση. Τα εκχυλίσματα του αιθέρα και οξικού αιθυλεστέρα όλων των καρπών είχαν πολύ καλή ικανότητα αναστολής του ενζύμου. Από τα βιβλιογραφικά δεδομένα προκύπτει ότι φλαβονοειδή και φαινυλοπροπανοειδείς εστέρες του κινικού οξέος έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν το ένζυμο αναγωγάση της αλδόζης in vitro. H δράση αυτή λοιπόν φαίνεται να σχετίζεται άμεσα με τις ενώσεις που απαντούν στα εκχυλίσματα με εξαίρεση τα διφαινύλια, τα οποία ελέγχθηκαν μετά την απομόνωσή τους και δεν εμφάνισαν αξιόλογη δράση. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη φυτοχημική μελέτη του φαινολικού περιεχομένου των καρπών του Sorbus domestica, καθώς και η πρώτη απόδειξη ότι οι καρποί θα μπορούσαν να δράσουν ταυτόχρονα σαν αντιοξειδωτικά και σαν αναστολείς των μακροχρόνιων δευτερογενών επιπλοκών του διαβήτη. 2

ABSTRACT Sorbus domestica (Rosaceae) fruits are empirically used in many regions of Europe as antioxidants in drinks and beverages and in traditional medicine as hypoglycaemic agents and as remedy against the long term diabetic complications. However, there were not any scientific references concerning these activities. In the present research work fruit extracts were tested about their phenolic content, the antioxidant potential (DPPH and luminol chemiluminescence tests) and their ability to inhibit the aldose reductase enzyme (ALR2). This enzyme is postulated to be associated with the development of the long term diabetic complications, where also cellular oxidative stress is implied. For all these purposes five different fruit types were tested for comparison reasons: (A) unripe fruits, (B) fruits well matured on tree, (C) fruits collected unripe and left for maturation for one week at room temperature, (D) fruits collected unripe and left for maturation for three weeks at room temperature & (E) vacuum-packed pulp from unripe fruits. nly categories (D) and (E) are used as traditional remedy, thus the comparative study is important. The qualitative and quantitative phytochemical analysis of the initial extracts was realized at an LC-DAD-MS (ESI+) system, were structure elucidation was achieved by the fragmentation mechanism. Furthermore, in cases where structure elucidation was not possible with this system, compounds were isolated and clarified also with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and High Resolution MS/MS spectra. Preparative techniques, such as Column Chromatography (CC), High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) and Thin Layer Chromatography (TLC), were applied for the isolation of the compounds. Phytochemical analysis resulted to the elucidation of eighty compounds that belong to the categories of hydroxybenzoic acids, hydroxyphenylpropanoid acids and derivatives, flavonoids and biphenyls. Among these compounds twenty were new structures: six quercetin dimmers, two kaempferol dimmers, two new quercetin glycosides, a quercetin sorbyl-hexoside, a hexosylated 3--quercetin ester, a 7-- acacetin feruloyl ester, a 7-hexosylated 3,6,5,7-tetrahydroxyflavanol, a trimeric vanillic acid derivative, a protocatechuic acid anhydrite, a complex polyphenolic phenylpropanoid, two biphenyls and an octahydroanthracene derivative. Furthermore an unsaturated tridlyceride was isolated and its structure was partially confirmed only with NMR spectra. All fruit categories were rich in quinic acid phenylpropanoid esters. Unripe categories (A) and (C) and fruit pulp (E) are rich in flavonoids and relatively poor in 3

hydrobenzoic acids, while the opposite stands for the well matured categories (B) and (D), where, according to the quantitative analysis, these fruits are rich in hydrobenzoic acids. Biphenyls were isolated only from fruits well matured on tree and, according to literature, such structures are phytoalexins with antimicrobial function. The antioxidant potential of different extracts was evaluated by the use of two techniques and fruit categories (A) and (C) (unripe), as well as fruit pulp (E) showed strong antioxidant capacity. n the other hand, well matured categories (B) and (D) were comparatively weaker antioxidants. These results correlate with the phenolic content, since flavonoids are stronger antioxidants than phenolic acids. Concerning the evaluation of the extracts capacity to inhibit the enzyme aldose reductase, all fruit categories showed a similar potential. All fruits diethyl ether and ethyl acetate extracts strongly inhibited the enzyme. Previous studies have proven that compounds that belong to the categories of flavonoids and quinic acid phenylpropanoid esters generally inhibit in vitro the enzyme aldose reductase. Thus, this capacity of the extracts seems that straightly relates with compounds in the extracts, with the exception of the biphenyls, which were tested after isolation and did not show effective aldose reductase inhibition capacity. This research work is the first phytochemical study of the phenolic content of Sorbus domestica fruits, as well as the first scientific establishment that fruits could act at the same time as antioxidants and inhibitors of the long term diabetic complications. 4

ΤΟ ΓΕΝΟΣ SRBUS KAI ΑΛΛΑ ΓΕΝΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ RSACEAE Το γένος Sorbus Το γένος Sorbus ανήκει στην κλάση Magnoliate, υποκλάση Rosidae, υπεροικογένεια Rosanae, οικογένεια Rosaceae, υποοικογένεια Maloideae όπως η μηλιά (γένος Malus), η αχλαδιά (γένος Pyrus), η κυδωνιά (γένος Cydonia), ο κράταιγος (γένος Crataegus) και οι καρποί του γένους Aronia. Το γένος περιλαμβάνει φυλλοβόλα δέντρα και θάμνους με φύλλα κατ εναλλαγή, απλά (έλλοβα ή πριονωτά) ή περιττόληκτα φτερωτά. Τα άνθη είναι αρρενοθήλεα, σε σύνθετους, κορυφαίους, σκιαδόμορφους βότρεις (κορύμβους). Εντάσσονται 80 είδη του Β. ημισφαιρίου, 10 της Ευρώπης και 5 είδη υπάρχουν στη χώρα μας: S. aucuparia, S. domestica, S. torminalis, S. graeca, & S. umbellata. Το είδος S. domestica (Οικιακή σορβιά ή Service tree) Βοτανικά Χαρακτηριστικά Δέντρο ύψους 15-20 μ. με μεγάλη και ισχυρή κόμη. Ξηρόφλοιο. Αναπτύσσεται σε βαθιά, νωπά και πλούσια σε θρεπτικές ουσίες εδάφη. Φωτόφιλο, με αρκετά μεγάλες απαιτήσεις σε θερμότητα και από μικρή ηλικία ανθεκτικό στη σκιά. Φύλλα: Κατ εναλλαγή, σύνθετα, φτερωτά, περιττόληκτα, με 9-19 επιμήκη, λογχοειδή, βραχύκορφα και σχεδόν άμισχα φυλλάρια. Οι παρυφές είναι έντονα πριονωτές. Η πάνω επιφάνεια είναι βαθυπράσινη, η κάτω σταχτοπράσινη, σε νεαρή ηλικία ελαφρά τριχωτή. Οφθαλμοί: Επιμήκως κωνικοί, γυαλιστεροί, πράσινοι με κόκκινη επίχρωση, κολλώδεις. Άνθη: Σε όρθιους, λευκούς ή κοκκινωπούς, σύνθετους, πιληματώδεις κορύμβους. Ωοθήκη 5χωρη, συνήθως με 5 στύλους. Ανθίζει τον Μάιο. Καρπός-Σπέρματα: Καρπός ραγοειδής, ωοειδής ή αχλαδοειδής, διαμέτρου 12-14χιλ., ώριμος κίτρινος με κόκκινες παρειές, φαγώσιμος. 5 σπέρματα, καστανά, ισχυρά γωνιώδη. Ωριμάζει τον Σεπτέμβριο του χρόνου ανθήσεως. (Ν. Η. Αθανασιάδης, Δασική Βοτανική, 1986) Γεωγραφική εξάπλωση Η οικιακή σορβιά ευδοκιμεί στη μέση και νότια Ευρώπη (Ιταλία, Ισπανία, Γαλλία, σχεδόν σε όλα τα Βαλκάνια, καθώς και στη Γερμανία, το Λουξεμβούργο, το Βέλγιο και τη Δανία), Β. Αφρική και Μικρά Ασία. Στην Β. Ευρώπη, όπως για παράδειγμα στη Μ. Βρετανία, ενδημικό είναι το συγγενές είδος S. aucuparia, όμως τα τελευταία χρόνια έχουν καταγραφεί και εκεί πληθυσμοί δέντρων S. domestica στα δάση (Hampton & Kay, 1995). 5

Ευδοκιμεί σχεδόν σε όλη την Ελλάδα και κυρίως στις ορεινές περιοχές της Μακεδονίας και Θράκης. Ευδοκιμεί σε υψόμετρο 800-1000μ.. Το φυτό και η Παράδοση Η Σορβιά κατέχει σημαντικότατη θέση στις παραδόσεις, τόσο στην Ελλάδα, όσο και στην υπόλοιπη Ευρώπη. Οι Κέλτες το θεωρούσαν ιερό και πίστευαν πως το ξύλο της σορβιάς φυλακίζει τα κακά πνεύματα, ενώ η ελληνική μυθολογία αποδίδει τις μαντικές ικανότητες του Τειρεσία στο ραβδί σορβιάς που κρατούσε. Τα κάλαντα της παραμονής της πρωτοχρονιάς σε πολλές περιοχές της Μακεδονίας λέγονται ακόμα σούρβα. Οι περισσότεροι δεν γνωρίζουν την προέλευση αυτής της ονομασίας, αλλά ο Γεώργιος Βιζυηνός στο έργο του «Ποίος ήτον ο Φονεύς του Αδελφού μου» αναφέρει αναλυτικά το έθιμο που αφορά την τύχη που έφερνε η σορβιά στην έναρξη του νέου έτους. Οι κάτοικοι της Β. Αμερικής (Καναδάς) χρησιμοποιούν εκχυλίσματα από μαλακούς βλαστούς του αυτοφυούς γένους Sorbus αmericana ως παραδοσιακό φάρμακο κατά των συμπτωμάτων του σακχαρώδους διαβήτη (diabetes mellitus) (McCune & Johns, 2002). Τοπικές έρευνες στη Σλοβακία αναφέρουν ότι οι καρποί της οικιακής σορβιάς θεωρούνται από τους ντόπιους πολύτιμοι, αφού χρησιμοποιούνται στην παραδοσιακή ιατρική για ίαση ασθενειών του πεπτικού, κατά της αναιμίας και σαν δυναμωτικό. Εκχύλισμα των καρπών επίσης χρησιμοποιείται παραδοσιακά σαν διουριτικός παράγοντας στις λιθονεφρίτιδες και σαν αιμοστατικό (Velgosova & Velgos, 1998; Pagan & Paganova, 2000). Σήμερα ο καρπός της αυτοφυούς στην Ελλάδα Οικιακής Σορβιάς μένει ανεκμετάλλευτος, αφού στην Ελλάδα δεν υπάρχει οργανωμένη παραγωγή και εκμετάλλευση. Από προφορικές πηγές γνωρίζουμε πως ντόπιοι πληθυσμοί στα Πομακοχώρια της Ροδόπης το χρησιμοποιούν παραδοσιακά σαν στυπτικό και υπογλυκαιμικό παράγοντα. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε όλες τις αναφορές, γραπτές ή προφορικές, σχετικά με την κατανάλωση του καρπού της οικιακής σορβιάς σαν παραδοσιακό φάρμακο, αυτός κρίνεται κατάλληλος για κατανάλωση, μόνο σε υπερώριμο στάδιο, όταν δηλαδή οι καρποί έχουν μαλακώσει αρκετά, ο φλοιός τους έχει γίνει σκούρος και η σάρκα έχει πάρει ένα σκούρο καστανό χρώμα. Οι κάτοικοι της Ροδόπης δεν αφήνουν τον καρπό να ωριμάσει πάνω στο δέντρο. Συλλέγουν τους καρπούς από το δέντρο όταν αυτοί είναι ακόμα άγουροι, σκληροί και κίτρινοι γύρω στα τέλη Αυγούστου και τους αφήνουν να υπερωριμάσουν μετασυλλεκτικά σε σκιερό και ξηρό μέρος για τρεις εβδομάδες τουλάχιστο. Μάλιστα σε 6

τοπικά φαρμακεία μπορεί κανείς να βρει πολτό τέτοιων καρπών που παρασκευάζεται με βρασμό του φυτικού υλικού, χωρίς την προσθήκη συντηρητικών και συσκευάζεται υπό κενό σε αποστειρωμένα βαζάκια. Αυτά τα σκευάσματα πωλούνται σε ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη τύπου 2. Από προφορικές μαρτυρίες γνωρίζουμε ότι ασθενείς που κατανάλωναν συστηματικά αυτόν τον πολτό παρατηρούσαν σταδιακή μείωση των επιπέδων γλυκόζης σε βαθμό που χρειαζόταν επαναρρύθμιση των χορηγουμένων δόσεων αντιδιαβητικών ιδιοσκευασμάτων. Βιβλιογραφικές αναφορές για τη σύσταση του καρπού, των σπερμάτων, του φλοιού και των φύλλων ειδών του γένους Sorbus. Για το είδος Sorbus domestica ελάχιστες αναφορές υπάρχουν στη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά με τη σύσταση και τις φαρμακολογικές ιδιότητες του καρπού του. Μία μόνο έρευνα του lschager et al., 2004 αναφέρει την ύπαρξη υδροξυκινναμωμικών οξέων, φλαβονολών, φλαβανολών και ολιγομερών και πολυμερών προανθοκυανιδινών. Η ποιοτική ανάλυση στη συγκεκριμένη έρευνα πραγματοποιήθηκε σε καρπούς Οικιακής σορβιάς που συλλέχθηκαν στη Γερμανία και εκχυλίστηκαν στη μεθανόλη. Ακολούθησε κατανομή με οξικό αιθυλεστέρα και έτσι αναλύθηκαν σε Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα και υδατικό εκχύλισμα. Στο εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα και σε σύγκριση με πρότυπες ενώσεις ανιχνεύθηκαν χλωρογενικό οξύ, νεοχλωρογενικό οξύ, επικατεχίνη και το φλαβονοειδές κερκετίνη. Επίσης αναφέρεται στο ίδιο δείγμα η παρουσία των διμερών προκυανιδινών Β2 και Β5, της τριμερούς προκυανιδίνης C1 και μιας τετραμερούς προκυανιδίνης. Στο υδατικό εκχύλισμα επιβεβαιώθηκε η παρουσία των υδρόφιλων πολυμερών προανθοκυανιδινών με συλλογή των επιμέρους κορυφών του χρωματογραφήματος και ανάλυση σε Υγρή χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, όπου χρωματογραφικά χαρακτηριστικά των ουσιών συγκρίθηκαν με βιβλιογραφικά δεδομένα. Οι ενώσεις που αναφέρονται στη συγκεκριμένη εργασία, ήδη είχαν αναφερθεί ως συστατικά του καρπού του μήλου, το οποίο ανήκει και στην ίδια υποοικογένεια με την οικιακή σορβιά (Maloideae) (Treutter, 2001). Αν και η προαναφερθείσα, είναι η μοναδική φυτοχημική εργασία δημοσιευμένη σε διεθνές επιστημονικό περιοδικό σχετικά με τους καρπούς του S. domestica, υπάρχουν πολλές αναφορές σχετικά με το συγγενές είδος S. aucuparia (rowanberries), το οποίο είναι εξαιρετικά διαδεδομένο στην Ευρώπη. Μάλιστα σε πολλές χώρες είναι καλλιεργούμενο και ο καρπός του είναι εμπορεύσιμος. Ευδοκιμεί στις ίδιες περιοχές με το S. domestica, όμως είναι αυτοφυές και στις χώρες της Β. Ευρώπης και στη Σκανδιναβία. 7

To είδος S. aucuparia έχει συμπεριληφθεί ως φαρμακευτικό φυτό στην 10η Γαλλική Φαρμακοποιεία, λόγω της υψηλής περιεκτικότητας των καρπών σε σορβιτόλη. Η σορβιτόλη είναι γνωστό αντιδιαρροϊκό φάρμακο και χορηγείται σε τέτοιες περιπτώσεις και σαν σκεύασμα σε πολλές χώρες (Brunetton, 1993). Σε έρευνα που έγινε σχετικά με την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση του χυμού από καρπούς του S. aucuparia διαπιστώθηκε η παρουσία 3-Ο-γαλακτοζίτη της κερκετίνης, 3- Ο-γλυκοζίτη της κερκετίνης, δύο 3-Ο-διεξοζιτών της κερκετίνης, πεντοζυλεξοζίτη της κερκετίνης, εξοζυλπεντοζίτη της κερκετίνης και δύο διεξοζιτών της καιμφερόλης. Η συνολική περιεκτικότητα σε αυτά τα φλαβονοειδή που ανιχνεύθηκαν ήταν 291mg/L, ενώ οι διεξοζίτες της κερκετίνης ήταν σε ποσοστό 78% των συνολικών φλαβονοειδών του χυμού. Σε σχέση πάντως με τα φλαβονοειδή, στα δείγματα των χυμών που ελέγχθηκαν κυρίαρχες φαινόλες ήταν το χλωρογενικό και νεοχλωρογενικό οξύ σε συγκεντρώσεις 544 και 273 mg/l αντίστοιχα. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε συστήματα HPLC- MS n και HPLC-DAD αντίστροφης φάσης (Gil-Izquierdo & Mellenthin, 2001). Σε συγκριτική μελέτη που αφορά την περιεκτικότητα των καρπών έντεκα μικρών οπωροφόρων σε άγλυκα και γλυκοζίτες κερκετίνης, μυρικετίνης και καιμφερόλης, ανιχνεύτηκαν άγλυκα κερκετίνης και καιμφερόλης σε εκχυλίσματα των καρπών S. aucuparia μετά από υδρόλυση ώστε να απομακρυνθούν τα σάκχαρα. Επίσης σε ακατέργαστα εκχυλίσματα καρπών διαπιστώθηκε η παρουσία διεξοζίτη της κερκετίνης, δεοξυεξοζυλεξοζίτη της κερκετίνης, εξοζίτη της κερκετίνης και εξοζυλπεντοζίτη της καιμφερόλης. Σε όλες τις περιπτώσεις τα φλαβονοειδή διευκρινίστηκαν από τους χρόνους κατακράτησης σε στήλη αντίστροφης φάσης, τις απορροφήσεις τους στο υπεριώδες ορατό και τις θραυσματώσεις τους σε συστήματα MS, MS-MS και MS 3. H ταυτότητα των σακχάρων διευκρινίστηκε μετά από την υδρόλυση των ουσιών και στη συνέχεια με έγχυση σε σύστημα GC-MS (Ηakkinen & Auriola, 1998). Σε άλλη συγκριτική έρευνα για την περιεκτικότητα 25 εδώδιμων μικρών καρπών στα φλαβονοειδή κερκετίνη, μυρικετίνη και καιμφερόλη, φαίνεται ότι οι καρποί του S. aucuparia έχουν πολύ ψηλή περιεκτικότητα σε ολικά φλαβονοειδή (μετά από υδρόλυση) και κυρίως σε κερκετίνη (63mg/kg) σε σχέση με άλλους καρπούς. Επίσης διαπιστώθηκε η μεγάλη περιεκτικότητα των καρπών σε βιταμίνη C σε σχέση με άλλους μικρούς καρπούς, όπως τα μυρτίδια και οι φράουλες, αποδεικνύοντας πως ο καρπός είναι μία σημαντική πηγή βιταμίνης C για την καθημερινή δίαιτα. Στην ίδια έρευνα ελέγχθηκαν και οι καρποί του υβριδίου του S. aucuparia με ένα είδος του γένους Crataegus, που ονομάζεται sweet 8

rowan για το οποίο βρέθηκε ακόμα μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε κερκετίνη (85mg/kg), αλλά πολύ μικρότερη σε βιταμίνη C (Hakkinen et al., 1999). Σε μελέτη σχετικά με την περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή και φαινολικά οξέα 19 μικρών καρπών μελετήθηκαν συγκριτικά τα ποσοστά των φλαβονολών, των φαινολικών οξέων, του ελλαγικού οξέος και άλλων υδροξυβενζοϊκών οξέων στο μεθανολικό εκχύλισμα καρπών από αυτοφυή δέντρα S. aucuparia και καρπών από καλλιεργούμενα sweet rowans. Η σχετική περιεκτικότητα και των δύο δειγμάτων σε υδροξυβενζοϊκά οξέα, συμπεριλαμβανομένου και του ελλαγικού, ήταν πολύ χαμηλή, ενώ τα υδροξυκινναμωμικά οξέα βρέθηκαν σε πολύ μεγάλες περιεκτικότητες (70.6% και 76.1% του συνολικού περιεχομένου των ουσιών που μελετήθηκαν). Κυρίαρχο οξύ και στις δύο περιπτώσεις ήταν το φερουλικό οξύ (52.6% και 52.7% αντίστοιχα). Τα δύο είδη του γένους Sorbus ήταν καρποί που περιείχαν από τα υψηλότερα ποσοστά υδροξυκινναμωμικών οξέων σε σύγκριση με τους άλλους μικρούς καρπούς. Η περιεκτικότητά τους όμως σε φλαβονοειδή ήταν μειωμένη σε σχέση με τα άλλα δείγματα. Το ολικό φαινολικό περιεχόμενο για τους καρπούς S. aucuparia ήταν περίπου 200mg/100g ξηρού βάρους καρπών, ενώ για κάποια είδη του γένους Vaccinium, η αντίστοιχη τιμή ήταν περίπου 350mg/100g ξηρού βάρους (Hakkinen et al., 1999). Η περιεκτικότητα του χλωρογενικού οξέος στους καρπούς είναι ιδιαίτερα υψηλή σε σχέση με άλλα είδη. Το χλωρογενικό οξύ αποτελεί το κύριο φαινολικό συστατικό των καρπών (Clifford, 1999). Και άλλες έρευνες συμφωνούν ότι στους καρπούς του S. aucuparia κυριαρχούν τα υδροξυκινναμωμικά οξέα, χωρίς όμως να λείπουν και οι αρκετά μεγάλες συγκεντρώσεις σε φλαβονοειδή. Οι Kahkonen et al., 2001 έδειξαν ότι από 26 δείγματα καρπών μικρών οπωροφόρων οι καρποί του S. aucuparia είχαν αισθητά μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε υδροξυκινναμωμικά οξέα από όλα τα υπόλοιπα δείγματα, σχεδόν σε τριπλάσιες τιμές από τα μυρτίδια και τα μήλα και 13 φορές μεγαλύτερες από τις φράουλες. Αλλά και τα ολικά φλαβονοειδή είναι σε αυξημένες συγκεντρώσεις στον καρπό, περίπου 16 φορές περισσότερο από τις φράουλες και 3 φορές περισσότερο από τα μήλα. Τα ποσοστά όμως των ανθοκυανινών και των υδροξυβενζοϊκών οξέων, ενώ σε αυτή την εργασία ελλαγικό οξύ δεν ανιχνεύτηκε. Τελικά, τα ολικά φαινολικά στον καρπό του S. aucuparia ήταν σχεδόν διπλάσια από τα μήλα και περίπου στα ίδια επίπεδα με τα μυρτίδια και τις φράουλες. Ομοίως και η συγκριτική φυτοχημική μελέτη των Maata-Riihinen et al., 2004 απέδειξε πως το χλωρογενικό και νεοχλωρογενικό οξύ ήταν από τα κύρια συστατικά των καρπών του S. aucuparia σε αντίθεση με τα υπόλοιπα μικρά οπωροφόρα που ελέγχθηκαν. 9

Επίσης βρέθηκαν μεγάλα ποσοστά κερκετίνης, ίχνη καιμφερόλης και μικρές ποσότητες ανθοκυανών. Υβρίδια που δημιουργήθηκαν με διασταυρώσεις του S. aucuparia με είδη των γενών Aronia, Mespilus, Pyrus και Malus καλλιεργούνται συστηματικά στη Ρωσία και Φιλανδία γιατί αποδείχθηκαν πολύ ανθεκτικά στις χαμηλές θερμοκρασίες. Υποκαθιστούν έτσι καρπούς που η καλλιέργειά τους σε τόσο ψυχρά κλίματα δεν είναι δυνατή. Η περιεκτικότητα αυτών των υβριδίων σε φαινολικά ποικίλλει. Πάντως υπάρχουν υβρίδια που καλλιεργούνται σε δυσμενείς συνθήκες που περιέχουν μεγάλα ποσοστά ανθοκυανινών, φλαβονολών και οξέων. Σε όλες τις περιπτώσεις και πάλι ανάμεσα στα οξέα κυριαρχεί το χλωρογενικό. Οι φλαβονόλες είναι γενικά σε χαμηλότερα των οξέων ποσοστά. Οι πιο εντυπωσιακές μεταβολές στη σύσταση αφορούν τις ανθοκυανίνες. Το υβρίδιο bilberry περιέχει 705.3mg ανθοκυανινών/ 100g καρπών, ενώ το υβρίδιο rosina 5.7mg ανθοκυανινών/ 100g καρπών (Hukkanen et al., 2006). Mελέτες έχουν επίσης ασχοληθεί με τη σύσταση των λιπαρών οξέων από σπέρματα του S. aucuparia. Από αυτές προκύπτει ότι από τη σύσταση των λιπαρών των σπερμάτων απουσιάζει εντελώς το α-λινολενικό οξύ, το οποίο βρίσκεται σε αφθονία στους καρπούς όλων των σπερμάτων, ακόμα και σε γένη που ανήκουν στην ίδια υπεροικογένεια Rosanae. Ένα ακόμη χαρακτηριστικό για τα σπέρματα όλων των γενών της οικογένειας Rosaceae είναι η πλήρης απουσία γ-λινολενικού οξέος. Αντίθετα η σύσταση του ελαίου χαρακτηρίζεται από τα μεγάλα ποσοστά ολεϊκού οξέος. Βασικό συστατικό του ελαίου είναι επίσης το λινολεϊκό οξύ. Βρέθηκαν επίσης σε μικρότερα ποσοστά παλμιτικό και στεαρικό οξύ (Johansson et al., 1997). Φαίνεται λοιπόν ότι τα σπέρματα της σορβιάς μπορούν να αποτελέσουν μια πλούσια πηγή λιπαρών οξέων, κυρίως ολεϊκού και λινολεϊκού για εφαρμογή στην βιομηχανία τροφίμων και την κοσμετολογία. Από το φλοιό και τα φύλλα διαφόρων ειδών του γένους Sorbus, καθώς και από άλλα είδη της οικογένειας Rosaceae απομονώθηκαν φυτοαλεξίνες που λειτουργούν σαν αντιμυκητιακοί παράγοντες. Η πρώτη φυτοαλεξίνη που απομονώθηκε από την οικογένεια ήταν το βενζοϊκό οξύ από τους φλοιούς και φύλλα των γενών Malus, Pyrus κ.α. Rosaceae. Σε μεγάλες ποσότητες όμως απομονώθηκαν φυτοαλεξίνες που έχουν δομή διφαινυλίων (Εικόνα 1, 1-6) και διβενζοφουρανίων (Εικόνα 1, 7-21). Από τα διφαινύλια το πιο γνωστό είναι η αουκουπαρίνη (1) που θεωρείται βασικός παράγοντας της αντιμυκητιακής προστασίας φυτών Rosaceae (Kokubun et al, 1995; Kokubun & Harborne, 1995). 10

Εικόνα 1 Η αουκουπαρίνη (1) και άλλες φυτοαλεξίνες που απομονώθηκαν από το φλοιό και τα φύλλα του S. aucuparia. 1-5: διφαινύλια, 6-20: διβενζοφουράνια (Kokubun & Harborne, 1995). Φαρμακολογικές ιδιότητες που έχουν αναφερθεί για τους καρπούς Sorbus Σχετικά με το αντιοξειδωτικό δυναμικό του S. domestica, υπάρχει μόνο μία βιβλιογραφική αναφορά που υπολογίζει την αντιοξειδωτική ικανότητα τριών εκχυλισμάτων των καρπών (ενός δείγματος που έχει βρεθεί ότι περιέχει υδροξυκινναμωμικά οξέα, ενός δείγματος που περιέχει προκυανιδίνες και του υδατικού εκχλίσματος των καρπών που θεωρείται ότι περιέχει τις πολυμερείς προανθοκυανιδίνες) με τη δοκιμή της οξειδάσης της ξανθίνης (XD test). Από τις μετρήσεις υπολογίστηκε ότι και τα τρία δείγματα ανέστειλαν σε ποσοστό περίπου 80% την οξειδάση της ξανθίνης in vitro (lschager et al., 2004). Η αντιοξειδωτική ικανότητα διαφόρων εκχυλισμάτων των καρπών του Sorbus aucuparia έχει υπολογιστεί σε διάφορες ερευνητικές εργασίες. Οι Hukkanen et al., 2006 υπολόγισαν το αντιοξειδωτικό δυναμικό διαφορετικών υβριδίων Sorbus με τις μεθόδους FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) και της ρίζας DPPH (2,2-Διφαινυλο-1- πικρυλυδραζύλιο). Όλα τα υβρίδια έδειξαν υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα και με τις δύο μεθόδους. Δεν βρέθηκε όμως στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ αντιοξειδωτικού δυναμικού των εκχυλισμάτων και ολικού φαινολικού περιεχομένου (Total Phenolic Content). Στο ίδιο συμπέρασμα καταλήγουν και οι Kahkonen et al., 2001. Παρόλα αυτά, 11

βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εκχυλισμάτων των καρπών και της περιεκτικότητάς τους σε φλαβονόλες (R 2 =0.78, P<0.01, n=34), καθώς και σε υδροξυκινναμωμικών οξέων (R 2 =0.54, P<0.01, n=34). Σε μια άλλη μελέτη αντιοξειδωτικής δύναμης νωπών καρπών, κρασιών και ηδύποτων, βρέθηκε ότι οι καρποί του S. aucuparia έχουν συγκριτικά ισχυρή ικανότητα να περιορίζουν την in vitro λιπιδική υπεροξείδωση (LDL oxidation). Και πάλι τα αποτελέσματα δεν είναι σε αναλογία με το ολικό φαινολικό περιεχόμενο (Total Phenolic Content, TPC), αλλά αυτή η ικανότητα αποδόθηκε στις υψηλές συγκεντρώσεις του καρπού σε υδροξυκινναμωμικά οξέα (Heinonen et al, 1998). Ένα ακόμα είδος Sorbus, το S. americana, ενδημικό της Β. Αμερικής, έχει μελετηθεί για την αντιοξειδωτική ικανότητα, τόσο εκχυλισμάτων των καρπών, όσο και των μαλακών βλαστών του. Το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα από καρπούς του S. americana έδειξε χαμηλή αντιοξειδωτική δύναμη (IC 50 >100mg/mL) σύμφωνα με τη δοκιμή της ρίζας DPPH (Αcuna et al., 2002). Σε άλλη έρευνα βρέθηκε πως εκχυλίσματα μαλακών βλαστών του ίδιου φυτού έχουν την ικανότητα να σαρώνουν υπεροξειδικές ρίζες που παράγονται από DCF/AAPH [2,2-diazobis(2-amidinopropane) dihydrochloride] σε ποσοστό περίπου αντίστοιχο με αυτό του Trolox και του ασκορβικού οξέος. Με τη δοκιμή της ρίζας DPPH τα ίδια εκχυλίσματα εμφάνισαν μέτρια αντιοξειδωτική δύναμη (McCune & Johns, 2002). Έχει αναφερθεί ότι η κατανάλωση των καρπών του S. domestica γίνεται μετά από υπερωρίμανση των καρπών, ειδικά όταν πρόκειται αυτοί να χρησιμοποιηθούν σαν παραδοσιακά φάρμακα. Αυτό εγείρει το ερώτημα της ενδεχόμενης συσχέτισης των φαρμακολογικών ιδιοτήτων που αποδίδονται στους καρπούς με τους μύκητες που αναπτύσσονται φυσιολογικά κατά την υπερωρίμανση και σχεδόν σάπισμα των καρπών. Σε ανάλυση λοιπόν των μυκήτων αυτών σε υπερώριμούς καρπούς οικιακής σορβιάς βρέθηκαν 22 διαφορετικά είδη μυκήτων σε υγιείς και αποστειρωμένους καρπούς από τα οποία το κυρίαρχο ήταν το Cladosporium cladosporioides ακολουθούμενο από τα Alternaria alternata (Fr.) Keissier και Penicillium expansum. Σε καρπούς που είχαν υποστεί μηχανική καταπόνηση, τα κυρίαρχα είδη που ανιχνεύτηκαν ήταν τα Penicillium cameum, Penicillium expansum και Penicillium crustosum. Αποτέλεσμα της παρουσίας αυτών των μυκήτων είναι ο σχηματισμός δευτερογενών μεταβολιτών, όπως μυκοτοξινών και άλλων ενώσεων με φαρμακολογικές εφαρμογές (Labuda et al., 2005). Για παράδειγμα ανιχνεύτηκε ο μεταβολίτης επικοραζίνη που έχει αντιβιοτικές ιδιότητες (Deffieux et al., 1978), ροροδίνη και βερρουκαρίνη, για τις οποίες έχουν αναφερθεί αντικαρκινικές ιδιότητες (Murakami et 12

al., 2001). Πρέπει να αναφερθεί ότι και ένας μεγάλος αριθμός μυκοτοξινών εμφανίζουν αντιβιοτικές ιδιότητες τόσο σε βακτήρια, όσο και σε μύκητες. Επιδημιολογικές μελέτες αναφέρουν ότι κατανάλωση μεγάλων ποσοτήτων φρούτων και λαχανικών σχετίζονται με μειωμένο ρίσκο καρκινογένεσης (Steinmetz & Potter, 1991). Σε έρευνα κατά την οποία μελετήθηκε η ικανότητα 43 ειδών χυμών μικρών οπωροφόρων να επάγουν τη διαφοροποίηση HL-20 λευχαιμικών κυττάρων, βρέθηκε ότι ανάμεσα στους χυμούς που εμφάνισαν πολύ ισχυρή ικανότητα διαφοροποίησης ήταν και αυτός του Sorbus sambucifolia, γηγενούς είδους της Α. Ασίας. Άλλοι καρποί που εμφάνισαν αξιόλογη δράση ήταν τα ακτινίδια, τα μυρτίδια και ένα είδος τριανταφυλλιάς (Yoshizawa et al., 2000). Σε άλλη μελέτη ελέγχθηκαν χυμοί από τους 43 καρπούς σχετικά με την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό διαφόρων σειρών καρκινικών κυττάρων. Βρέθηκε πως καρποί από το Sorbus sambucifolia, και πάλι μαζί με καρπούς από μυρτίδια, τριαντάφυλλο και ακτινίδιο, όχι μόνο ισχυρά παρεμπόδισαν τον πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη όλων των καρκινικών σειρών που δοκιμάστηκαν, αλλά και αποδείχθηκαν λιγότερο τοξικοί στα φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα (Yoshizawa et al., 2000). Έρευνες δείχνουν ότι μεθανολικό εκχύλισμα από φλοιό του είδους Sorbus commixta επηρεάζει την εμφάνιση αθηρωματικής πλάκας σε επίμυες που ακολουθούσαν επιβαρυντική δίαιτα και μακροπρόθεσμα καθυστερούσαν ή ανέστειλαν την αρτηριοσκλήρυνση (Sohn et al., 2005; Sohn et al, 2005). Επίσης έχει δειχθεί με πειράματα σε επίμυες ότι βουτανολικό εκχύλισμα από την ίδια δρόγη έχει τη δυνατότητα να χαλαρώνει του αγγειακούς μαλακούς μύες μέσω του επηρεαζόμενου από το ενδοθήλιο νιτρικού οξέος (Υin et al, 2005). Φυτοχημικές και φαρμακολογικές αναφορές σχετικά με τη χημική σύσταση των καρπών άλλων ειδών της υποοικογένειας Maloideae (Rosaceae), όπως το μήλο (Malus) και η Aronia. Για διάφορα είδη μήλου (Malus) το οποίο ανήκει και αυτό στην οικογένεια Rosaceae, όπως και το γένος Sorbus, υπάρχουν πολλές μελέτες και αναφορές σχετικά με το φαινολικό του περιεχόμενο. Διαπιστώθηκε η ύπαρξη πολλών φαινολικών στον καρπό του μήλου. Έχουν απομονωθεί εστέρες φαινυλοπροπανοϊκών οξέων με κινικό οξύ, όπως το χλωρογενικό και νεοχλωρογενικό οξύ, που είναι από τα κύρια συστατικά εκχυλισμάτων του μήλου. Άκόμη, έχουν βρεθεί απλά υδροξυκινναμωμικά οξέα, όπως καφεϊκό, φερουλικό, σιναπικό κ.α.. 13

Έχουν επίσης βρεθεί άγλυκα και γλυκοζίτες φλαβονοειδών, κυρίως κερκετίνης και καιμφερόλης. Από τους γλυκοζίτες, βρέθηκαν κυρίως μονογλυκοζίτες και διγλυκοζίτες των φλαβονολών. Ο καρπός του μήλου είναι πλούσιος σε προκυανιδίνες, ανθοκυάνες, κατεχίνες και επικατεχίνες, ουσίες με ισχυρή αντιοξειδωτική δύναμη (Berregi et al., 2003; Sanchez-Rabaneda et al., 2004; smianski et al., 2007; Shoji et al., 2006; Justesen et al., 1998). Τέλος από ιστοκαλλιέργειες μηλιάς, όπως και της σορβιάς, απομονώθηκαν διφαινύλια και παράγωγα αυτών (φυτοαλεξίνες) (Borejsza-Wysocki et al., 1999). Μια πολύ ενδιαφέρουσα ένωση και με δράση στο διαβήτη που απομονώθηκε από τον καρπό του μήλου είναι η φλορετίνη και ο γλυκοζίτης της φλοριδζίνη (Εικόνα 2) (DeSimon et al., 1992; Crespy et al., 2001). H φλοριδζίνη έχει βρεθεί ότι είναι ένα αποτελεσματικός υπογλυκαιμικός παράγοντας που παρεμποδίζει την απορρόφηση της γλυκόζης στο έντερο μέσω της οδού των συμμεταφορέων νατρίου, όπως και παρεμποδίζει την επαναπορρόφηση της γλυκόζης από τα νεφρά (Boccia et al., 1999; Burcelin et al., 1998). H φλοριδζίνη επαναφέρει τη φυσιολογική σχέση της ινσουλίνης με τη γλυκόζη στο συκώτι και άλλους περιφερικούς ιστούς, όπως φαίνεται σε διαβητικές σειρές εοιμύων (Rossetti et al., 1987). Από την άλλη, πειραματική μελέτη αποδεικνύει ότι οι ίδιες ενώσεις μειώνουν δυσλειτουργίες των β-κυττάρων του παγκρέατος σε διαβητικά πειραματόζωα (Rossetti et al., 1987). Τέλος φαίνεται ότι χορήγηση φλοριζδίνης επαναφέρει σε φυσιολογικά επίπεδα την ανοχή στη γλυκόζη και την ευαισθησία στην ινσουλίνη, ενώ διακοπή της θεραπείας επαναφέρει σταδιακά την κατάσταση αντοχής στην ινσουλίνη (Zhang et al., 1998). Εικόνα 2 φλορετίνη φλοριδζίνη Ηφλορετίνη και φλοριδζίνη, φαινολικά συστατικά του καρπού του μήλου. Στην φλοριδζίνη αποδίδονται πολλές φαρμακολογικές ιδιότητες Σε επιδημιολογικές μελέτες σχετικά με τα ευεργετικά αποτελέσματα της συστηματικής κατανάλωσης μήλων αναφέρεται ότι γυναίκες που κατανάλωναν 14

συστηματικά τουλάχιστο μια μερίδα, είχαν μικρότερη πιθανότητα να αναπτύξουν καρκίνο των πνευμόνων από εκείνες που δεν κατανάλωναν. Αυτή η παρατήρηση έγινε επίσης και για την κατανάλωση κρεμμυδιού, ενώ δεν φαίνεται το ίδιο για άλλα φρούτα ή αφεψήματα, όπως για παράδειγμα το τσάι. Αυτή η δράση τελικά αποδόθηκε στα υψηλά ποσοστά φλαβονοειδών του μήλου και του κρεμμυδιού και κυρίως κερκετίνης (Feskanich et al., 2000; Le Marchand et al., 2000). Ακόμη, καθημερινή κατανάλωση μήλου από γυναίκες βρέθηκε να μειώνει το ρίσκο καρδιαγγειακών παθήσεων κατά 35% περίπου πριν και μετά την εμμηνόπαυση (Sesso et al., 2003; Arts et al., 200). Συστηματική κατανάλωση μήλου έχει επίσης βρεθεί ότι μειώνει την πιθανότητα εμφάνιση βρογχίτιδας και άσθματος και βελτιώνει την λειτουργία των πνευμόνων (Woods et al., 2003; Butland et al., 2000). Η κατανάλωση μήλων έχει επίσης σχετιστεί με μειωμένο ρίσκο εμφάνισης διαβήτη τύπου 2 (Knekt et al., 2002). Εκχυλίσματα μήλου, κυρίως φλοιών, σε πειραματόζωα έδειξαν σημαντική αντιοξειδωτική δύναμη που μπορεί να εμποδίσει την ανάπτυξη ηπατικού καρκίνου και καρκίνου του παχέος εντέρου (Wolfe et al., 2003; Eberhardt et al. 2000), ενώ φάνηκε ότι παρεμποδίζουν την λιπιδική υπεροξείδωση (Mabley et al., 2005) ασκώντας θετική επίδραση στη μείωση της χοληστερόλης σε υπερχοληστερινεμικά πειραματόζωα (Aprikian et al., 2001). Σε είδη του γένους Aronia, συγγενούς του Sorbus, που έχουν αναλυθεί σχετικά με το φαινολικό τους περιεχόμενο των καρπών, βρέθηκε πως έχουν αρκετές ομοιότητες στο φυτοχημικό τους περιεχόμενο με τους καρπούς του Sorbus aucuparia. Είναι πλούσιοι σε υδροξυκινναμκά οξέα και κυρίως χλωρογενικό και νεοχλωρογενικό οξύ, καθώς και σε κερκετίνη και ανθοκυάνες (Maata-Riihinen et al., 2004; Weinges et al., 1997). Χυμός από καρπούς της Α. melanocarpa έδειξε υπογλυκαιμική δράση σε διαβητικά πειραματόζωα (Valcheva-Kuzmanoova et al., 2007) και αντίστοιχη αντιυπερλιπιδαιμική δράση σε υπερχοληστερινεμικά πειραματόζωα (Valcheva-Kuzmanoova et al., 2007). 15