ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Αιμιλία Χατζηγιάννη Αν. Καθηγήτρια
ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Μέθοδος πολλαπλασιασμού μικροοργανισμών με την αναπαραγωγή τους σε θρεπτικά υλικά σε συγκεριμένες εργαστηριακές συνθήκες
ΣΚΟΠΟΣ/ΣΗΜΑΣΙΑ Αναγνώριση της ύπαρξης, του τύπου και ποσότητας μικροβίων σε ένα δείγμα βακτήρια μύκητες παράσιτα Entamoeba Plasmodium Leishmania Trypanosoma Trichomonas Αιτιολογική διάγνωση λοιμώξεων Χορήγηση κατάλληλης θεραπείας Περιορισμός μετάδοσης Επιδημιολογία
Παράδειγμα: Outbreak of E. coli O157:H7 associated with lettuce served at fast food chains in the Maritimes and Ontario, Canada, Dec 2012 31 περιπτώσεις εργαστηριακά επιβεβαιωμένες, με καλλιέργεια εντερίτιδας E. coli O157:H7 13 (42%) νοσηλεία - 1 (3%) αιμολυτικό ουραιμικό σύνδρομο Σε επόμενη συνέντευξη + 10 Σε λιγότερο από μία εβδομάδα συστάθηκε ειδική επιτροπή που επιβεβαίωσε την κατανάλωση μαρουλιού από μια αλυσίδα fast food ως πηγή της λοίμωξης και ο προμηθευτής απέσυρε όλη την ποσότητα μαρουλιού που είχε διαθέσει CCDR: Volume 40 S-1, October 9, 2014
Τα μικρόβια καλλιεργούνται σε: Θρεπτικά υλικά (βακτήρια, μύκητες, παράσιτα) Τεχνητά θρεπτικά υλικά (παρασκευάζονται στο εργαστήριο) Κυτταροκαλλιέργειες (βακτήρια, ιοί) Εμβρυοφόρα αυγά κότας (ιοί) Πειραματόζωα
Θρεπτικά Υλικά Περιέχουν θρεπτικές ουσίες και παράγοντες κατάλληλους για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των μικροβίων Νερό Πηγή ενέργειας και άνθρακα (πρωτεΐνες, υδατάνθρακες) Άλατα Πηγή αζώτου Ιχνοστοιχεία Επιτρέπουν την απομόνωση, διαχωρισμό και ταυτοποίηση των παθογόνων μικροοργανισμών και τον έλεγχο ευαισθησίας σε αντιμικροβιακά Αποστειρώνονται πριν τη χρήση τους με θερμότητα (κλίβανος υγρής αποστείρωσης: 121 ο C, 2 atm, 15-20 min) ή διήθηση
Τύποι Θρεπτικών Υλικών ανάλογα με σύσταση και χημική σύνθεση νερό, εκχύλισμα κρέατος πεπτόνες και χλωριούχο νάτριο *Άγαρ στερεοποιητικό (τήξη 80 ο /πήξη 30 ο - εκχύλισμα από θαλάσσια φύκη- διαφανές και δεν επηρεάζει την ανάπτυξη μικροβίων (αποικίες, διαχωρισμός μικτών)
Στερεά θρεπτικά υλικά Σε τρυβλία Διαχωρισμός αποικιών Ημιποσοτική καλλιέργεια Φυσιολογικά στείρα βιολ. υγρά και ιστοί συνοδεύονται από καλλιέργεια σε υγρό Θρ.Υλ.
Σπορά σε στερεά θρεπτικά υλικά
Υγρά θρεπτικά υλικά Δεν διαχωρίζουν μικτούς πληθυσμούς Αραιώνονται ανασταλτικές ουσίες του δείγματος Για ανάπτυξη μεγάλων ποσοτήτων μικροβίου Αραιώσεις (ποσοτικά)
Εμβολιασμός σε υγρά θρεπτικά υλικά
ΗΜΙΡΡΕΥΣΤΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Θρεπτικά συστατικά διαλυμένα σε αποσταγμένο νερό και άγαρ 0.5% Motility άγαρ (για έλεγχο κινητικότητας)
1. ΒΑΣΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ. Θρεπτικός ζωμός (500 g κρέας σε 1 lt νερό, 10 g πεπτόνες, 5 g NaCl, ph 7.3. ), Θρεπτικό Άγαρ ( 2.5% άγαρ σε θρεπτικό ζωμό) Πεπτονούχο νερό ( Peptone 1%, sodium chloride 0.5%) {Staphylococcus και Enterobacteriaceae} 2. ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ. + αίμα, ορός, ή αυγό (αιματούχο άγαρ [5-10% αίμα (defibrinated) προβάτου ή αλόγου, Lowenstein- Jensen] 3. ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ. Περιέχουν ουσίες που επιτρέπουν την ανάπτυξη ενός είδους βακτηρίου, ενώ ταυτόχρονα οι ίδιες ουσίες αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων βακτηρίων (MacConkey agar για εντεροβακτηριοειδή -χολικά οξέα εμποδίζουν gram+). Μπορεί να χρησιμοποιηθούν αντιβιοτικά για αναστολή ανάπτυξης 4. ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ. περιέχουν δείκτη που αλλάζει με την ανάπτυξη συγκεκριμένων μικροβίων (αιματούχο-αιμόλυση, MacConkey agar neutral red Lac(+) Gram - κόκκινες αποικίες Lac(-) Gram (-) άχρωμες αποικίες 5. ΥΛΙΚΑ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ. Cary-Blair medium, Amies medium, Stuart medium. 6. ΥΛΙΚΑ ΦΥΛΑΞΗΣ. Egg saline medium, chalk cooked meat broth.
Επώαση 37 ο C Αερόβια CO2 Αναερόβια
Ποιο θρεπτικό υλικό χρησιμοποιούμε??? Ανάλογα με το δείγμα Ανάλογα με την κλινική υποψία
Αξιολόγηση αποικιών σε στερεά θρεπτικά υλικά Μορφολογία : μέγεθος, σχήμα, ύψος, περιφέρεια, σύσταση, χρώμα, πυκνότητα, επιφάνεια σχήμα ύψος περιφέρεια
ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΣΤΟ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΑΙΜΟΛΥΣΗ β πλήρης α ατελής γ όχι αιμόλυση ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΧΡΩΣΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΛΕΝΝΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΥΡΩΔΙΑΣ
E coli
Klebsiella pneumoniae on BAP
Χρώμα Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus and Staphyloccocus epidermidis
proteus mirabilis Ερπισμός
Μεταβολές στο θρεπτικό υλικό κ.α. Αιμόλυση Παραγωγή χρώματος σε διαχωριστικά θρεπτικά υλικά Μυρωδιά P.aeruginosa: «γιασεμί» Proteus mirabilis:«καμένη σοκολάτα» Streptococcus milleri group:«καραμέλα» Eikenella corrodens:«χλωρίνη» Βλέννη
fermenters fermenters
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Μορφολογία αποικίας Χρώση Gram αποικία Βιοχημικές δοκιμασίες Ορολογικές δοκιμασίες
Σταφυλόκοκκος Στρεπτόκοκκος ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΟΑΓΚΟΥΛΑΣΗΣ (ΠΗΚΤΑΣΗΣ) Βιοχημική ταυτοποίηση
ΣΕΙΡΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ