Bιομηχανική Βιοτεχνολογία Μικροβιακή τεχνολογία 1
Μικροοργανισμοί στη βιομηχανία Χαρακτηριστικά Παραγωγή μεγάλης ποσότητας ενός προϊόντος το οποίο να μπορεί να απομονωθεί εύκολα Γενετική σταθερότητα Υψηλός ρυθμός ανάπτυξης σε μεγάλη κλίμακα και σε φθηνά θρεπτικά μέσα Υψηλή παραγωγικότητα στο επιθυμητό προϊόν Να μην είναι παθογόνος για τους ανθρώπους, ζώα και φυτά (GRAS, Generally Recognized As Safe) Να είναι επιδεκτικός σε γενετική τροποποίηση 2
το βελτιωμένο στέλεχος (η βελτίωση του στελέχους απαιτεί μερικά χρόνια δουλειάς) μπορεί να έχει 100 φορές υψηλότερη απόδοση Αντιβιοτικό Αρχική παραγωγή (όταν ανακαλύφθηκε) (units/ml) Παραγωγή βελτιωμένων στελεχών (units/ml) Αύξηση της Παραγωγής (φορές) Στρεπτομυκίνη 50 (1945) 5000 (1955) 100
Ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί: Απώλεια πλασμιδίου Ρυθμός ανάπτυξης κυτταρικών πληθυσμών r X r X r X 1 p x x ή p x p x x rx rx όπου: Ρυθμός ανάπτυξης κυττάρων που φέρουν πλασμίδιο Ρυθμός ανάπτυξης κυττάρων που δεν φέρουν πλασμίδιο p η πιθανότητα απώλειας πλασμιδίου ανά κυτταρική διαίρεση (p 1) μ + o ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων που φέρουν πλασμίδιο (h -1 ) μ - o ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων που δεν φέρουν πλασμίδιο (h -1 ) 4
Ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί: Απώλεια πλασμιδίου Κλάσμα κυττάρων που φέρουν πλασμίδιο F x x x Σε καλλιέργεια διαλείποντος έργου r X r X dx dt dx dt Ολοκληρώνοντας για αρχικές συνθήκες x + = x + 0 και x - = x - 0 για t=0 μετά από n γενιές F 1 a 1 a 2 p n a p1 p όπου: a n t ln 2 5
Παράδειγμα Stock καλλιέργεια κυττάρων που φέρουν πλασμίδιο του βακτηρίου Steptoccoccus cremoris διατηρείται με συχνή ανακαλλιέργεια για 28 μέρες. Μετά τις 28 μέρες το κλάσμα των κυττάρων που φέρουν πλασμίδιο βρέθηκε ίσο με 0.66. Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων που δεν φέρουν πλασμίδιο στη θερμοκρασία αποθήκευσης είναι 0.033 h -1 και αυτών που φέρουν πλασμίδιο 0.025 h -1. Αν όλα τα κύτταρα αρχικά περιείχαν πλασμίδιο, να εκτιμηθεί η πιθανότητα ανά γενιά απώλειας πλασμιδίου. 0.033h 0.025h F 0.66 t 28days n 1 1 t 672h t ln 2 Υπολογισμός α a a 0.033h 0.025h 1 1 1.32 Αριθμός γενεών κυττάρων που φέρουν πλασμίδιο για τις 28 μέρες t 672h 0.025h 1 n 24.2 6
F 1 1 a a 2 p n a p1 n 24.2 a 1.32 F 0.66 p 11.32 11.32 2 0.66 24.2 1.32 p1 141.49 p p p 24.2 p 2 0.109 p 0 p 141.49 p 0.001 0.0339 0.002 0.1816 0.0007-0.0095 0.00076-0.0008 0.00077 0.0006 0.000766 0.000017 24.2 p 2 0.109 p 7
Βυθισμένη καλλιέργεια (Submerged Fermentation, SmF) Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε υγρό θρεπτικό μέσο (περιεχόμενο νερό>95%). 8
Ζύμωση Στερεάς Κατάστασης (Solid State Fermentation) Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών (κυρίως υποστρώματα απουσία ελεύθερου νερού. μυκήτων) σε στερεά Trichoderma sps που έχουν αναπτυχθεί σε άχυρο σίτου Πηγές C στην ΖΣΚ: φυσικές πρώτες ύλες όπως υπολείμματα γεωργικών καλλιεργειών (άχυρο σίτου, άχυρο ρυζιού, άχυρο κριθαριού, άξονας σπάδικα αραβόσιτου, corn stover), υπολείμματα χυμοποίησης φρούτων (πούλπα μήλου), κλπ. 9
Ζύμωση Στερεάς Κατάστασης Πλεονεκτήματα - Μειονεκτήματα Πλεονεκτήματα Απλό μέσο καλλιέργειας/aπλή τεχνολογία/χαμηλό κόστος εγκατάστασης/χαμηλές ενεργειακές απαιτήσεις/ Λιγότερα απόβλητα Υψηλές αποδόσεις προϊόντων/απλός σχεδιασμός αντιδραστήρων (μικρότερα δοχεία) Μικρότερος κίνδυνος επιμόλυνσης λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης ύδατος Παρόμοιο περιβάλλον με αυτό που αναπτύσσονται φυσικά οι μύκητες Μειονεκτήματα Αργός ρυθμός ανάπτυξης μικροοργανισμών Προβλήματα μεταφοράς θερμότητας/μάζας Δυσκολία στον έλεγχο θερμοκρασίας/ph στον αντιδραστήρα Κλιμάκωση μεγέθους 10
Μηχανική Βιοδιεργασιών Εφαρμογή των αρχών της μηχανικής με στόχο τη βελτιστοποίηση βιοκαταλυτικών διεργασιών Βιοαντιδραστήρες & κινητική Υγρό Αέριο Φαινόμενα μεταφοράς Ρεολογία Ανάκτηση προϊόντων Ρύθμιση διεργασιών Οικονομοτεχνική ανάλυση
Τι είναι ο βιοαντιδραστήρας Βιοαντιδραστήρας: Δοχείο μέσα στο οποίο πραγματοποιείται μια βιολογική δράση, συνήθως ζύμωση (δράση ζωντανών κυττάρων) ή βιομετατροπή (χρήση ενζύμων). Αντιαφριστικό Οξύ/Βάση Θύρα εμβολιασμού Θύρα δειγματοληψίας Κινητήρας Είσοδος αέρα Άξονας Εξοδος αέρα Φίλτρο Μανδύας Αισθητήρες ph, T και O 2 Πτερωτή Έξοδος κρύου νερού Ανακλαστήρας ή πτερύγια εκτροπής ροής (buffles) Είσοδος αέρα (air sparger) Είσοδος κρύου νερού 12
Προϊόν: Pruteen (ζωοτροφή) Υποστρώματα: CΗ 3 ΟΗ, NH 3 Όγκος: 750 m 3, Ύψος: 42 m, Πλάτος: 11 m Καταλύτης: Methylophilus methylotrophus ICI, Μ. Βρετανία (1981) 13
Βασικές λειτουργίες Τυπικές λειτουργίες ζυμωτήρα Εμποδίζει την ανταλλαγή μικροοργανισμών ανάμεσα στο χώρο της ζύμωσης και το περιβάλλον (μολύνσεις) Διασφαλίζει την τροφοδότηση των κυττάρων με τα απαραίτητα για την επιβίωσή τους συστατικά Διατηρεί τις κρίσιμες μεταβλητές του περιβάλλοντος των κυττάρων στο επιθυμητό επίπεδο (T, ph) Άλλες λειτουργίες Επιτρέπει την παρακολούθηση ενδεικτικών για την πορεία της διεργασίας παραμέτρων Κρίσιμες παράμετροι Αποστείρωση Μεταφορά Ο 2 Μεταφορά θερμότητας Ανάδευση Ρύθμιση ph Αντιμετώπιση αφρισμού Εγγυάται την ασφάλεια των χειριστών κατά τη διάρκεια λειτουργίας της συσκευής
Αποστείρωση: Πώς ορίζεται και γιατί είναι απαραίτητη; Αποστείρωση Μεταφορά Ο 2 Αποστείρωση: Καταστροφή ή απομάκρυνση όλων των μικροοργανισμών που είναι δυνατό να έρθουν σε επαφή με τα θρεπτικά συστατικά ή τον εξοπλισμό μιας διεργασίας Μεταφορά θερμότητας Ανάδευση Ρύθμιση ph Αντιμετώπιση αφρισμού Προβλήματα από την παρουσία ανεπιθύμητων μικροοργανισμών Παρεμπόδιση ανάπτυξης του παραγωγού στελέχους από τοξίνες Μείωση της απόδοσης της διεργασίας λόγω κατανάλωσης υποστρωμάτων ή αποικοδόμησης του προϊόντος από ένζυμα Αρνητική επίδραση στη διαδικασία ανάκτησης των προϊόντων
Στόχος Μεταφορά οξυγόνου Παροχή του απαραίτητου O 2 για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών Αποστείρωση Μεταφορά Ο 2 Μεταφορά θερμότητας Ανάδευση Ρύθμιση ph Μέθοδοι Διέλευση αέρα μέσα από τη μάζα του θρεπτικού μέσου Παράγοντες που επηρεάζουν τη μεταφορά Ο 2 Ρυθμός παροχής αέρα Ταχύτητα ανάδευσης Διάταξη αερισμού Γεωμετρία βιοαντιδραστήρα
Μεταφορά οξυγόνου: διαχύτες (spargers) Διαχύτης στομίου (nozzle sparger) Πορώδης διαχύτης Διάτρητος σωλήνας 17
Pοή αέρα σε αναδευόμενους βιοαντιδραστήρες ως συνάρτηση της ταχύτητας περιστροφής του ταράκτρου (Ν) και του ρυθμού ροής αέρα (F g ) Αύξηση ταχύτητας ανάδευσης βελτιώνει την τιμή του k L a Αύξηση ταχύτητας ανάδευσης, Ν Αύξηση παροχής αέρα F g Αύξηση της παροχής αέρα έχει μικρή επίδραση στην τιμή του k L a 18
Στόχος Μεταφορά θερμότητας Διατήρηση της βέλτιστης για την παραγωγή του επιθυμητού προϊόντος θερμοκρασίας Αποστείρωση Μεταφορά Ο 2 Μεταφορά Θερμότητας Ανάδευση Ρύθμιση ph Αντιμετώπιση αφρισμού Μέθοδοι Εξωτερικός μανδύας Εσωτερικό σπείρωμα με κλειστό κύκλωμα κυκλοφορίας Παράγοντες που επηρεάζουν το ρυθμό μεταφοράς θερμότητας Έκλυση θερμότητας από τον αναπτυσσόμενο μικροοργανισμό Είσοδος/έξοδος αέριων ή υγρών ρευμάτων Μηχανική ανάδευση Ρυθμός απωλειών ενέργειας στο περιβάλλον
Αποστείρωση Μεταφορά Ο 2 Σκοπός της ανάδευσης Μεταφορά θερμότητας Ανάδευση Ρύθμιση ph Αντιμετώπιση αφρισμού ανακάτεμα διαλυτών συστατικών του θρεπτικού μέσου διασπορά αερίων (π.χ. αέρας) μέσα σε υγρό με τη μορφή μικρών φυσαλίδων διατήρηση στερεών σωματιδίων (π.χ. κυττάρων) σε αιώρηση διασπορά μη αναμείξιμων υγρών με σχηματισμό γαλακτώματος ή αιωρήματος σταγονιδίων ενίσχυση της μεταφοράς θερμότητας από και προς το υγρό μέσο
Διατάξεις ανάμιξης Επιλογή ανάλογα με το ιξώδες Τάρακτρα (impellers) Ιξώδες μέσου vs Τύπος ταράκτρου 21
Ρύθμιση ph Αποστείρωση Μεταφορά Ο 2 Μεταφορά θερμότητας Στόχος Διατήρηση του βέλτιστου για την παραγωγή του επιθυμητού προϊόντος ph Ανάδευση Ρύθμιση ph Αντιμετώπιση αφρισμού Μέθοδοι Δυνατότητα αυτόματης ρύθμισης Προσθήκη διαλυμάτων οξέος και βάσεως Χρήση ουσιών με ρυθμιστική ικανότητα (buffering capacity) στο μέσο ανάπτυξης Χρήση κατάλληλης πηγής αζώτου (π.χ. NH 3 ή αλάτων με NH 4+ )
Αντιμετώπιση αφρισμού Αποστείρωση Μεταφορά Ο 2 Στόχος Πρόληψη μολύνσεων και απωλειών του περιεχομένου του βιοαντιδραστήρα Μεταφορά θερμότητας Ανάδευση Ρύθμιση ph Αντιμετώπιση αφρισμού Μέθοδοι Δυνατότητα αυτόματης ρύθμισης Προσθήκη αντιαφριστικών ουσιών (ελάχιστη δυνατή ποσότητα) Χρήση αντιαφριστικών πτερυγίων Ρύθμιση ανάδευσης Ρύθμιση παροχής αέρα
Ταξινόμηση με βάση τον τρόπο λειτουργίας Διαλείποντος έργου (Batch) Θύρα εμβολιασμού Φίλτρο αέρα Αντλία αέρα Δειγματολήπτης Ημιδιαλείποντος έργου (Fed-batch) Φίλτρο και σωλήνας αέρα Σωλήνας Αντλία μέσου Φίλτρο αέρα Αντλία αέρα Δειγματολήπτης Είσοδος φρέσκου θρεπτικού Είσοδος αέρα Δοχείο τροφοδοσίας Αναδευτήρας Φίλτρο και σωλήνας αέρα Σωλήνας Αντλία μέσου Φίλτρο αέρα Αντλία αέρα Σωλήνας εκροής Έξοδος θρεπτικού μέσου, κυττάρων, προϊόντων Είσοδος αέρα Αναδευτήρας Είσοδος φρέσκου θρεπτικού Σωλήνας εκροής Δοχείο τροφοδοσίας Είσοδος αέρα Αναδευτήρας Συνεχούς έργου (Continuous) 24
Χαρακτηριστικά καλλιεργειών διαλείποντος, ημιδιαλείποντος και συνεχούς έργου Χαρακτηριστικά Διαλείποντος έργου Ημιδιαλείποντος έργου Συνεχούς έργου Σύστημα καλλιέργειας Κλειστού τύπου Ενδιάμεσου τύπου Ανοιχτού τύπου Προσθήκη φρέσκου θρεπτικού μέσου Όχι Ναι Ναι Όγκος καλλιέργειας Σταθερός Αυξανόμενος Σταθερός Κίνδυνος επιμόλυνσης Ελάχιστος Ενδιάμεσος Μέγιστος Φάσεις ανάπτυξης Λογαριθμική φάση ανάπτυξης Συγκέντρωση κυτταρικής μάζας Λανθάνουσα, λογαριθμική, στασιμότητας και θανάτου Λανθάνουσα, λογαριθμική, στασιμότητας και θανάτου Λογαριθμική Μικρότερη Μεγαλύτερη Μέγιστη και συνεχής Μεταβάλλεται χρονικά Μεταβάλλεται χρονικά Σταθερή Απόδοση προϊόντος Χαμηλή Ενδιάμεση Υψηλή 25
Διεργασίες ημιδιαλείποντος έργου Παράδειγμα παραγωγής ζύμης αρτοποιϊας Ύπαρξη ρυθμοκαθοριστικού σταδίου στο μεταβολισμό του πυροσταφυλικού μέσω της αναπνευστικής δραστηριότητας. Πάνω από μια κρίσιμη τιμή του S (30-40 g/l) παρατηρείται αερόβια παραγωγή αιθανόλης με σκοπό την αναγέννηση του NAD +. Σε διεργασία διαλείποντος έργου: Για την επίτευξη μεγάλης συγκέντρωσης κυττάρων απαιτείται μεγάλη συγκέντρωση υποστρώματος Οι απαιτήσεις σε Ο 2 δεν μπορούν να καλυφθούν Παράγεται αιθανόλη λόγω μεταβολικής υπερχύλισης (φαινόμενο Crabtree) μειώνοντας την απόδοση και προκαλώντας αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης
Επιλογή τρόπου λειτουργίας ΔΙΑΛΕΙΠΟΥΣΑ Σχετική απλότητα και χαμηλότερο κόστος εξοπλισμού Χαμηλότερος κίνδυνος μολύνσεων Μικρότερος κίνδυνος μετάλλαξης Ευελιξία στον προγραμματισμό της βιομηχανικής παραγωγής Μικρότερη ευαισθησία σε έκτακτα περιστατικά και διαταραχές ΣΥΝΕΧΗΣ Μικρότερος χρόνος μη παραγωγικών διαδικασιών (downtime) Ομοιογενές προϊόν Ευκολότερος έλεγχος ρυθμού ανάπτυξης Αύξηση παραγωγικότητας διεργασιών Μεγαλύτερο μέγεθος βιοαντιδραστήρων Μείωση παραγωγικότητας λόγω χρόνου προσαρμογής Δυσκολότερη διατήρηση ασηπτικών συνθηκών Έλλειψη συμμόρφωσης με απαιτήσεις ποιότητας (ξεχωριστές παρτίδες) Πιθανή ελάττωση απόδοσης λόγω απώλειας πλασμιδίων Κάποια προϊόντα δεν παράγονται ικανοποιητικά Πιθανή διαφοροποίηση απόδοσης λόγω μεταβολής ρεύματος τροφοδοσίας
Τύποι βιοαντιδραστήρων Από τη μεγάλη ποικιλία βιοαντιδραστήρων που έχουν σχεδιαστεί, οι ακόλουθοι τύποι είναι οι περισσότερο διαδεδομένοι: Πλήρους αναμίξεως (stirred tank bioreactor) Στήλης φυσαλίδων (bubble column bioreactor) Aνοδικού ρεύματος αέρα (airlift bioreactor) Κλίνης (bed bioreactor) Μεμβρανών (membrane bioreactor) Ζύμωσης στερεάς κατάστασης (solid-state fermentor)
Βιοαντιδραστήρες πλήρους αναμίξεως & στήλης φυσαλίδων Καλός έλεγχος και ρύθμιση μεταβλητών Μεγάλος αριθμός ερευνητικών εργασιών Αντιβιοτικά Αμινοξέα Βιομηχανικά ένζυμα Χαμηλό κόστος κατασκευής Ικανοποιητική μεταφορά μάζας & θερμότητας Ζύμη αρτοποιίας Κιτρικό οξύ 29
Βιοαντιδραστήρες ανοδικού ρεύματος αέρα Ικανοποιητική ανάδευση Πολύ καλή μεταφορά μάζας Προστασία ευαίσθητων κυττάρων Ζωϊκά κύτταρα Επεξεργασία βιομηχανικών αποβλήτων 30
Βιοαντιδραστήρες κλίνης Σταθερής κλίνης (packed bed) Ρευστοποιημένης κλίνης (fluidized bed) Ρευστοποιημένης κλίνης (fluidized bed) Μεγάλη συγκέντρωση βιοκαταλύτη Αντιμετώπιση αναστολής από προϊόν Παραγωγή οξικού οξέος (ξίδι) Παραγωγή βιοαερίου από στερεά απόβλητα Δυνατότητα συνεχούς λειτουργίας Αυξημένη διεπιφάνεια Εύκολη ρύθμιση ph και Τ Δυνατότητα χρήσης κολλοειδών υποστρωμάτων Επεξεργασία υγρών αποβλήτων Πιλοτική παραγωγή μπύρας χωρίς αιθανόλη (alcohol-free) Πιλοτική παραγωγή anti-hiv αντισωμάτων
Ύψος: 21 m Όγκος: 390 m 3 Βιοαντιδραστήρες ρευστοποιημένης κλίνης Υπόστρωμα: απόβλητα εργαστασίου παραγωγής ζύμης Βιοκαταλύτης: ακινητοποιημένα βακτηριακά κύτταρα σε άμμο Συνθήκες: αναερόβιες Gist-brocades, Delft - Ολλανδία
Βιοαντιδραστήρες μεμβρανών Βιοαντιδραστήρας κοίλων ινών Απομάκρυνση παρεμποδιστικού προϊόντος ή άλλων παρεμποδιστών Δυνατότητα συνεχούς λειτουργίας Ενζυμικοί βιοαντιδραστήρες Ανάπτυξη ζωικών κυττάρων Ανάπτυξη αρχαιοβακτηρίων 33
Βιοαντιδραστήρες για ΖΣΚ Αντιδραστήρας περιστρεφόμενου τυμπάνου Στατικός εξωτερικός κύλινδρος με διπλό τοίχωμα Έξοδος αέρα Κινητήρας Είσοδος αέρα Έξοδος αέρα Διάτρητος κύλινδρος στον οποίο τοποθετείται το στερεό θρεπτικό μέσο Είσοδος αέρα Kalogeris E, Fountoukides G, Kekos D, Macris BJ (1999). Bioresource Technol 67:313 315 Αντιδραστήρας δίσκων Είσοδος αέρα 34
Φωτοβιοαντιδραστήρες Επίπεδου τύπου φωτοβιοαντιδραστήρες Σύστημα οριζοντίων φωτοβιοαντιδραστήρων Φωτοβιοαντιδραστήρες στήλης Ελικοειδείς φωτοβιοαντιδραστήρες 35
Επιλογή & σχεδιασμός βιοαντιδραστήρων Κριτήρια - Περιορισμοί Μικροοργανισμός (είδος, φυσιολογία, γενετική αστάθεια) Υπόστρωμα (τύπος, παρεμπόδιση) Προϊόν (φάση παραγωγής, αξία) Κάθε περίπτωση αποτελεί ένα μοναδικό πρόβλημα και πρέπει να εξετάζεται με βάση τους συγκεκριμένους περιορισμούς
Στάδια παραγωγής βιοτεχνολογικού προϊόντος Αριστοποίηση συνθηκών παραγωγής Ανάπτυξη σε κωνική φιάλη Ανάπτυξη σε βιοαντιδραστή ρα Κλίμακα εργαστηριακή (200 ml -200 L) Φιαλίδιο καλλιέργειας (λυοφυλιωμένη/κατεψυγμένη/ υπό ψύξη) Έλεγχος των βέλτιστων συνθηκών παραγωγής Παραγωγή σε βιομηχανική κλίμακα σε πιλοτική κλίμακα ( έως 500 L) 37
τα ακτινοβακτήρια είναι στην πρώτη γραμμή των βιομηχανικά εκμεταλλευόμενων οργανισμών για αρκετές δεκαετίες νηματοειδή βακτήρια G+ Αποικίες στελεχών στρεπτομυκήτων που παράγουν αντιβιοτικά σημαντικές βιοσυνθετικές ικανότητες, π.χ. παραγωγή αντιβιοτικών (τα 2/3 των γνωστών αντιβιοτικών) άλλοι μεταβολίτες των ακτινοβακτηρίων χρησιμοποιούνται ως εντομοκτόνα, παρασιτοκτόνα, ή αντικαρκινικοί παράγοντες άλλα προϊόντα τους είναι τα μετασχηματισμένα στεροειδή, ισομεράση της γλυκόζης ικανότητα αποικοδόμησης αλειφατικών και αρωματικών υδρογονανθράκων γενετική αστάθεια: μπορεί να χαθεί η ιδιότητα παραγωγής του επιθυμητού προϊόντος
Παραγωγή του αντιβιοτικού ακτινοροδίνη υπό μορφή σταγονιδίων στην επιφάνεια αποικίας Streptomyces coelicolor. Η ακτινοροδίνη είναι ένα από τα τέσσερα αντιβιοτικά που παράγει το είδος και μετράει ετησίως 6 δις δολάρια!!!. Streptomyces coelicolor
Παραγωγή αντιβιοτικών το παράδειγμα της στρεπτομυκίνης (1/3) Μικροοργανισμός: Streptomyces griseus (απομονώθηκε από χώμα) Επικράτεια (Domain) :Bacteria Φύλο (Phylum) : Actinobacteria Τάξη (Order): Actinomycetales Οικογένεια (Family): Streptomycetaceae Γένος (Genus) : Streptomyces Είδος (Species) : S. griseus Το προϊόν: Στρεπτομυκίνη (δευτερογενής μεταβολίτης) Αντιβιοτικό, που εισήχθη το 1945 στην θεραπευτική και θεωρείται μια από τις μεγάλες νίκες του 20ου αιώνα κυρίως κατά της φυματίωσης Η ανακάλυψή της οφείλεται στον Shelman Walksman (Βραβείο Nobel Ιατρικής το 1952) 40
Παραγωγή αντιβιοτικών το παράδειγμα της στρεπτομυκίνης (2/3) Το θρεπτικό μέσο (Woodruff & McDaniel ή Hockenhull) Πηγή C: γλυκόζη, άμυλο κλπ. Πηγή Ν: διάφορα υποπροϊόντα αγροτικών βιομηχανικών (π.χ. Soy meal, corn steep liquor, distiller s dry soluble κλπ.) Αλλά στοιχεία: ΝaCl Συνθήκες ζύμωσης Τ=28 ο C, ph=7.0-8.0 Ισχυρή ανάδευση Υψηλός αερισμός (περίπου 1 vvm) 41
Παραγωγή αντιβιοτικών το παράδειγμα της στρεπτομυκίνης (3/3) Φάση 1: Αύξηση ph στην τιμή 7.5 (δράση των πρωτεασών του μικροοργανισμού στο soy meal με αποτέλεσμα την απελευθέρωση NH 3 ) Ταχεία αύξηση της βιομάζας Ελάχιστη έως μηδενική κατανάλωση γλυκόζης Μηδενική παραγωγή στρεπτομυκίνης Φάση 2: Κατανάλωση γλυκόζης και NH 3 Μικρή αύξηση της βιομάζας Παραγωγή στρεπτομυκίνης Φάση 3: Πλήρης κατανάλωση υδατανθράκων Παύση παραγωγής στρεπτομυκίνης και λύση των κυττάρων Αύξηση της τιμής του ph 42
Γενικά χαρακτηριστικά η S. cerevisiae εμπλέκεται, στην παραγωγή αλκοολούχων ποτών, ψωμιού κλπ. αναπτύσσονται αερόβια και αναερόβια οι θρεπτικές απαιτήσεις των ζυμών δεν είναι μεγάλες τα μέταλλα Κ και Mg απαιτούνται ως : συμπαράγοντες γλυκολικών ενζύμων και άλλων 100 ενζύμων αντίστοιχα για τη σταθερότητα των νουκλεϊκών οξέων και των κυτταρικών μεμβρανών
Γενικά χαρακτηριστικά Το γένος Lactobacillus είναι μέλος της Οικογένειας Lactobacillaceae. θετικοί κατά Gram βάκιλλοι δυνητικά αναερόβιοι ή μικροαερόφιλοι οι λακτοβάκιλλοι είναι απαραίτητοι και αναντικατάστατοι στη βιομηχανία L. plantarum L. lactis L. bulgaricus
Οι τροφικές απαιτήσεις τους είναι πολύπλοκες, απαραίτητα είναι: οι υδατάνθρακες τα αμινοξέα τα πεπτίδια τα νουκλεϊκά οξέα οι βιταμίνες οι λακτοβάκιλλοι αναπτύσσονται σε : ποικίλα περιβάλλοντα χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου υψηλές συγκεντρώσεις διαλυτών υδατανθράκων, προϊόντα πρωτεϊνικής διάσπασης
οι λακτοβάκιλλοι ανήκουν στη φυσική χλωρίδα του εντέρου των ανθρώπων και των ζώων απαντούν στη φυτική ύλη αλλά σε περιορισμένο αριθμό γιατί εδώ επικρατούν τα είδη του Leuconostoc άριστο ph = 4,5-6,4 (οξεόφιλοι) ο μεταβολισμός των λακτοβακίλλων για την αναγέννηση του ATP είναι ζυμωτικός: προϊόν το γαλακτικό οξύ και μικρές ποσότητες άλλων τελικών προϊόντων η υψηλή παραγωγή τους σε γαλακτικό μειώνει τις τιμές του ph του περιβάλλοντος αναστέλλοντας την αύξηση άλλων βακτηρίων και επιβάλλοντας την επικράτησή τους σε διαφορετικά περιβάλλοντα
Streptomyces thermophilus Lactobacillus bulgaricus Ο S. thermophilus αναπτύσσεται ταχύτατα παράγει γαλακτικό οξύ και (α) μειώνει το ph (β) παράγει μυρμηκικό και φολικό οξύ, (β) καταναλώνει το οξυγόνο και παράγει CO 2 βοηθώντας την ανάπτυξη του L. bulgaricus Ο L. bulgaricus υδρολύει τις πρωτεϊνες απελευθερώνοντας αμινοξέα, βαλίνη, η οποία βοηθά την ανάπτυξη του S. thermophilus Παράγεται περισσότερο γαλακτικό οξύ και ακεταλδεϋδη από κάθε καλλιέργεια μόνη της 47
Πανάρχαια διαδικασία Επικρατέστερη άποψη: Τυχαία ανακάλυψη κάπου στη Μέση Ανατολή Μεταφορά γάλακτος σε ασκούς από στομάχια αιγοπροβάτων Ευνοικοί παράγοντες: Υπολείμματα πυτιάς, Θερμό κλίμα, Ήπια ανάδευση Γάλα Tυρί Λακτόζη Καζεϊνη Λιπαρά LAB + Rennet Γαλακτικό οξύ Πεπτίδια και ελεύθερα αμινοξέα Ελεύθερα λιπαρά οξέα Άρωμα Γεύση Λακτόνες
Γενικά χαρακτηριστικά Ευκαρυωτικοί /πολυκύτταροι οργανισμοί Ετερότροφοι οργανισμοί με υψηλή κυτταρική οργάνωση Διαθέτουν κυτταρικό τοίχωμα άκαμπτο & ανθεκτικό Αυστηρά αερόβιοι οργανισμοί (αλλά μπορούν να ζήσουν σε περιβάλλον με μειωμένη συγκέντρωση οξυγόνου ή ακόμα και απουσία του) η γενετική τους τροποποίηση δεν είναι εύκολη Έχουν χρησιμοποιηθεί ήδη από τον 6o π.χ αιώνα για την παραγωγή κρασιού και άλλων τροφίμων στη Σουμερία και Βαβυλωνία
βιταμίνες παράγονται η Β ομάδα, Β12 και βιταμίνη D, φολικό οξύ, παντοθενικό, πυριδοξίνη, ριβοφλαβίνη και θειαμίνη. αντιβιοτικά είναι γνωστή εδώ και 60 χρόνια η παραγωγή πενικιλίνης από το P. chrysogenum παραγωγή ενζύμων παραγωγή ενζύμων κυτταρινάσες από Trichoderma rasei πρωτεάσες από A. οryzae γλυκοαμυλάσες : α-αμυλάση από Α. foetidus και A. nidulans παραγωγή οργανικών οξέων κιτρικό από Penicillium και A. Niger (το κιτρικό χρησιμοποιείται στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων) ιτακονικό οξύ : A. itaconicus, A. terreus γλυκονικό οξύ : A. niger, P. purpurogenum,p. chrysogenum μουκοφαινολικό οξύ : P. stoloniferum
Παραγωγή ανθρώπινης ινσουλίνης 51
Διάγραμμα ροής παραγωγής ινσουλίνης 52
Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR) 53
Louis Pasteur Messieurs, c est les microbes qui auront le dernier mot! 54