«Ρόλος του μεταβολισμού των mrnas σε μακρόβια στελέχη C.elegans καθώς και επίδραση φαρμακευτικών σκευασμάτων στην ανάπτυξη του νηματώδους σκώληκα»

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ & ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» «Ρόλος του μεταβολισμού των mrnas σε μακρόβια στελέχη C.elegans καθώς και επίδραση φαρμακευτικών σκευασμάτων στην ανάπτυξη του νηματώδους σκώληκα» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΡΟΥΜΕΛΙΩΤΗ ΦΑΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Α.Μ.: 214106 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΑΡΓΑΡΙΤΗΣ ΛΧ., Ομότιμος Καθηγητής Κυτταρικής Βιολογίας & Ραδιοβιολογίας, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, ΕΚΠΑ ( Επιβλέπων) ΑΛΕΠΟΡΟΥ-ΜΑΡΙΝΟΥ Β., Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Βιοχημικής & Μοριακής Γενετικής, Τομέας Γενετικής & Βιοτεχνολογίας, ΕΚΠΑ ΣΥΝΤΥΧΑΚΗ Π., Ερευνήτρια Γ, Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής της Γήρανσης, ΙΙΒΕΑΑ (Επιστημονική Υπεύθυνη) Αθήνα, 2012 1

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» «Ρόλος του μεταβολισμού των mrnas σε μακρόβια στελέχη C.elegans καθώς και επίδραση φαρμακευτικών σκευασμάτων στην ανάπτυξη του νηματώδους σκώληκα» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΡΟΥΜΕΛΙΩΤΗ ΦΑΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Α.Μ.: 214106 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΑΡΓΑΡΙΤΗΣ ΛΧ., Ομότιμος Καθηγητής Κυτταρικής Βιολογίας & Ραδιοβιολογίας, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, ΕΚΠΑ ( Επιβλέπων) ΑΛΕΠΟΡΟΥ-ΜΑΡΙΝΟΥ Β., Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Βιοχημικής & Μοριακής Γενετικής, Τομέας Γενετικής & Βιοτεχνολογίας, ΕΚΠΑ ΣΥΝΤΥΧΑΚΗ Π., Ερευνήτρια Γ, Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής της Γήρανσης, ΙΙΒΕΑΑ (Επιστημονική Υπεύθυνη) Τόπος Διεξαγωγής: Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής της Γήρανσης, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ) Αθήνα, 2012 2

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ανέκαθεν απασχολούσαν τον άνθρωπο τα ερωτήματα πώς και γιατί γερνάμε. Για πολλά χρόνια η γήρανση θεωρούταν μια διαδικασία στοχαστική κι αδύνατο να ρυθμίζεται από γονίδια, καθώς τα ίδια δε θα είχαν μπορέσει να εξελιχθούν και να μεταβιβαστούν λόγω του ότι η γήρανση εμφανίζεται μόνο στα ζώα σε αιχμαλωσία καθώς κι ότι ο άνθρωπος για πολλά χρόνια της εξελικτικής του ζωής δε βίωνε το γήρας. Όμως, με την αλματώδη πρόοδο της Βιοιατρικής έρευνας η διάρκεια ζωής του ανθρώπου έχει επιμηκυνθεί πολύ. Μαζί της έχουν αυξηθεί αισθητά και οι περιπτώσεις νευροεκφυλιστικών ασθενειών και καρκίνου, που σχετίζονται με το γήρας. Έτσι, τα τελευταία είκοσι χρόνια το ενδιαφέρον για τη διαδικασία της γήρανσης οδήγησε την ανακάλυψη γονιδίων και μονοπατιών που ρυθμίζουν το φαινόμενο αυτό. Πλέον, η γήρανση θεωρείται μια ρυθμιζόμενη διαδικασία. Ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη της αναδείχθηκε ο νηματώδης σκώληκας C. elegans, στον οποίο κι ανακαλύφθηκε το πρώτο μονοπάτι που σχετίζεται με τη γήρανση. Τα πειράματα που εκπονήθηκαν στο πλαίσιο της εργασίας αυτής αποτελούν μέρος της έρευνας της Ερευνήτριας Συντυχάκη Πόπης και της ερευνητικής ομάδας του Εργαστηρίου Μοριακής Γενετικής της Γήρανσης, για τη διερεύνηση των επιδράσεων του μεταβολισμού των mrnas στη διάρκεια ζωής και στην απόκριση στο στρες του νηματώδη. Επιπλέον, περιλάμβανε και τη δοκιμασία φαρμάκων για τη διερεύνηση της επίδρασής τους στην ανάπτυξη του C.elegans. Η μεταπτυχιακή διπλωματική αυτή εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Γενετικής της Γήρανσης, στον Τομέα Γενετικής και Γονιδιακής θεραπείας, στο Κέντρο Βασικής Έρευνας II του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών κατά τα ακαδημαϊκά έτη 2011-2012. Θα ήθελα θερμά να ευχαριστήσω την Ερευνήτρια κ. Πόπη Συντυχάκη για τις επιστημονικές γνώσεις, το άψογο κλίμα συνεργασίας, αλλά και την επιστημονική καθοδήγησή της όσον αφορά στην κριτική αντιμετώπιση των παραμέτρων που πρέπει ένας νέος ερευνητής να λαμβάνει υπ όψιν του. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτορα Φοίβο Μπορμπόλη για την πάντα πρόθυμη βοήθειά του, τη συμπαράστασή του και την ευχάριστη συνεργασία μας. Τους συναδέλφους και μέλη του εργαστηρίου Άννα Βλαντή, Άρη Ρουσσάκη, Στεφανία Πατέρα και Μιχάλη Φασσέα για τη βοήθειά τους και τη μετάδοση της εμπειρίας τους. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια κ. Αλεπόρου για τη συμμετοχή της στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Τέλος, δε θα μπορούσα να παραλείψω τον Καθηγητή μου από τα προπτυχιακά χρόνια και επιβλέποντα της διπλωματικής μου κ. Λουκά Χ. Μαργαρίτη για το ουσιαστικό ενδιαφέρον που έχει δείξει όλα αυτά τα χρόνια για την επιστημονική πρόοδο των φοιτητών του και για την αμέριστη συμπαράστασή του. Ανεκτίμητη υπήρξε επίσης η συμπαράσταση της οικογένειάς μου και η έμπρακτη στήριξή της. Φανή Ρουμελιώτη 3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Διπλωματική αυτή εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του ΜΔΕ «Εφαρμογές της Βιολογίας στην Ιατρική» στο εργαστήριο Μοριακής Γενετικής της Γήρανσης στο ΙΙΒΕΑΑ. Στόχος ήταν να διερευνηθεί η επίδραση του μεταβολισμού των mrnas στη φυσιολογία του C.elegans και πιο συγκεκριμένα στο γενετικό υπόβαθρο μακρόβιων στελεχών του. Τα μακρόβια αυτά στελέχη χαρακτηρίζονται από χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης, τα οποία έχουν γενικά συνδεθεί με αυξημένη διάρκεια ζωής. Δεδομένου ότι ο μεταβολισμός των mrnas αποτελεί επίπεδο ρύθμισης της μετάφρασης, σκοπός μας ήταν να διερευνήσουμε τι συνεπάγεται η έλλειψη γονιδίων, που αποτελούν το ολοένζυμο της αφαίρεσης της καλύπτρας του mrna, στο μακρόβιο φαινότυπο, στη γονιμότητα, στην ανάπτυξη και στην απόκριση στο θερμικό σοκ αυτών των στελεχών. Παράλληλα, διεξήχθη δοκιμή φαρμάκων που χρησιμοποιούνται ευρέως στη θεραπεία κατά της υπέρτασης, των αρρυθμιών και της κολπικής μαρμαρυγής στο C.elegans. Τα φάρμακα αυτά πολλές φορές συνοδεύονται από πλήθος παρενεργειών και ο ακριβής μηχανισμός δράσης τους δεν είναι γνωστός. Θελήσαμε σε πρώτο επίπεδο να διερευνήσουμε επιδράσεις και τυχόν ενδείξεις για το μηχανισμός δράσης τους στο φαινότυπο τόσο του Ν2 άγριου στελέχους όσο και του ced-4 μεταλλαγμένου στελέχους, στο οποίο δεν επιτελείται ένα βασικό στάδιο της απόπτωσης. Τα παραπάνω διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας μεταλλαγμένα στελέχη C.elegans, στελέχη από γενετικές διασταυρώσεις, RNAi μέθοδο και κλωνοποίηση κατάλληλων γονιδίων για τον έλεγχο των στόχων μας. 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος...3 Περίληψη...4 1. Εισαγωγή...8 1.1. Ο νηματώδης C.elegans...9 1.1.1. Επίδραση του περιβάλλοντος για την είσοδο στη dauer μορφή...10 1.1.2. Μονοπάτια που ρυθμίζουν την είσοδο στη dauer μορφή...11 1.1.2.1. TGFβ μονοπάτι...11 1.1.2.2. Μονοπάτι της γουανυλικής κυκλάσης...11 1.1.2.3 Το μονοπάτι της ινσουλίνης...12 1.1.2.4. Το μονοπάτι στεροειδούς ορμόνης...13 1.2. Η γήρανση...13 1.2.1. Μηχανισμοί γήρανσης...13 1.2.1.1. Το μονοπάτι σηματοδότησης της ινσουλίνης...14 1.2.1.2. Σηματοδότηση από τη γαμετική σειρά (germline)...17 1.2.1.3. Θερμιδικός περιορισμός και μακροβιότητα...17 1.2.1.4. Πρωτεϊνοσύνθεση...19 1.3. Σωμάτια Π...22 1.3.1. Σύσταση...23 1.3.2. Το σύμπλοκο αφαίρεσης της καλύπτρας...23 1.3.3. Η εξωνουκλεάση XRN1...26 1.3.4. Λειτουργία...26 1.3.4.1. Αποικοδόμηση mrna...26 1.3.4.2. Επιτήρηση mrna...28 1.3.4.3. Αποσιώπηση Γονιδίων...29 1.3.4.4. Μεταφραστική καταστολή...30 1.3.5. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Σωματίων Π και άλλων ριβονουκλεοπρωτεϊνικών Κοκκίων...30 1.3.5.1. Κοκκία Στρες...31 1.3.5.2. mrnp κοκκία γαμετικών κυττάρων...32 1.3.5.3. Νευρικά Κοκκία...33 1.3.6. Σωμάτια Π στον C.elegans...33 1.4. Ο C. elegans ως πρότυπο σύστημα μελέτης...35 1.4.1. Πλεονεκτήματα του C.elegans ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτη της Γήρανσης...35 1.4.2. Μειονεκτήματα του C.elegans ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτης της Γήρανσης...36 1.4.3. O C.elegans ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτη της επίδρασης φαρμάκων...37 1.5. Φάρμακα κατά των αρρυθμιών και της υπέρτασης...38 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...39 2.1 Βακτηριακά στελέχη...40 2.1.1. Βακτηριακά στελέχη για τη διατροφή του C.elegans...40 2.1.1.1. E. coli OP-50...40 2.1.1.2. E. coli HT115 (DE3)...40 5

2.1.2. Βακτηριακά στελέχη για κλωνοποίηση...40 2.1.3. Αποθήκευση βακτηριακών στελεχών...40 2.1.4. Θρεπτικά υλικά ανάπτυξης βακτηρίων...41 2.2. Θρεπτικά Υποστρώματα Καλλιέργειας και Ρυθμιστικά Διαλύματα Νηματώδων...41 2.2.1. Διαλύματα στοκ...41 2.2.2. Στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (Nematode Growth Medium NGM)...42 2.3. Συντήρηση, Αποθήκευση και Ψύξη Στελεχών C. elegans...42 2.4. Απαλλαγή Από Μολύνσεις...43 2.5. Αποσιώπηση Γονιδίων με RNAi Μέσω Σίτισης...43 2.6. Παραγωγή Αρσενικών Ατόμων...44 2.7. Διασταύρωση Στελεχών C. elegans...44 2.8. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)...44 2.9. PCR σε Ολόκληρους Νηματώδεις (Worm PCR)...46 2.10. Ηλεκτροφόρηση DNA σε Πήκτωμα Αγαρόζης...47 2.11. Δοκιμασία Προσδιορισμού Διάρκειας Ζωής...47 2.12. Δοκιμασίες Ανθεκτικότητας στο Στρες...47 2.12.1. Ανθεκτικότητα στο θερμικό σοκ...48 2.13. Δοκιμασία Γονιμότητας...48 2.14. Δοκιμασία Ανάπτυξης...48 2.15. Φορείς Κλωνοποίησης...49 2.15.1. pl4440 (ppd129.36)...49 2.15.2. pbluescript II KS(+)...50 2.15.3. prf4...50 2.15.4. pl2534 (ppd96.52)...51 2.15.5. ppd95.77...52 2.16. Πέψεις και Καθαρισμός DNA...53 2.17. Αντίδραση λιγάσης...53 2.18. Παρασκευή δεκτικών βακτηριακών κυττάρων E. coli...53 2.19. Μετασχηματισμός Δεκτικών Βακτηριακών Κυττάρων E. coli...54 2.20. Απομόνωση Πλασμιδιακού DNA...54 2.20.1. Μέθοδος βρασμού (Boiling-preps)...54 2.20.2. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης καθαρότητας...54 2.21. Δημιουργία Διαγονιδιακών Στελεχών με τη Μέθοδο των Μικροενέσεων...55 2.22. Απομόνωση Γενωμικού DNA...56 3.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...57 3.1 Μελέτη της επίδρασης του μεταβολισμού των mrnas στη φυσιολογία και στην απόκριση στο στρες σε μακρόβια στελέχη C. elegans...58 3.1.1. Μελέτη της επίδρασης του μεταβολισμού των mrnas στο γενετικό υπόβαθρο του μακρόβιου daf-2 μεταλλαγμένου στελέχους...58 3.2.1. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη διάρκεια ζωής του daf-2 μακρόβιου στελέχους....58 3.2.2. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη γονιμότητα του daf-2 μακρόβιου στελέχους....60 3.2.3. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στην ανάπτυξη του daf-2 μακρόβιου στελέχους....61 6

3.2.4. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στο σχηματισμό dauers στο γενετικό υπόβαθρο του daf-2 μακρόβιου στελέχους....62 3.2.5. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στην απόκριση στο θερμικό σοκ στο daf-2 μακρόβιο στέλεχος....63 3.3 Μελέτη της επίδρασης του μεταβολισμού του mrna στο γενετικό υπόβαθρο του μακρόβιου eat-2 μεταλλαγμένου στελέχους...65 3.3.1. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη διάρκεια ζωής του eat-2 μακρόβιου στελέχους....65 3.3.2. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη γονιμότητα του eat-2 μακρόβιου στελέχους....66 3.3.3. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στην ανάπτυξη του eat-2 μακρόβιου στελέχους....67 3.4 Κλωνοποίηση της πρωτεΐνης LGG-1 συζευγμένη με την Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη υπό τον έλεγχο του μυοειδικού υποκινητή Pmyo3....68 3.5. Μελέτη της επίδρασης φαρμάκων αντι-αρρυθμιακών και αντι-υπερτασικών στην ανάπτυξη του C.elegans...70 3.5.1. Αμιοδαρόνη (Amiodarone)...70 3.5.2. Προπαφαινόνη...71 3.5.3. Εναλαπρίλη...72 3.5.4. Valsartan...72 3.5.5. Αποτελέσματα για τα φάρμακα...73 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ...76 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...79 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...81 7

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8

1.1. Ο νηματώδης C. elegans Ο Caenorhabditis elegans ανήκει στο ζωικό φύλο των νηματώδων. Εντούτοις, είναι ένας μη παρασιτικός οργανισμός και ζει στο έδαφος, τρεφόμενος με οργανική ύλη σε αποσύνθεση και βακτήρια. Η ανάπτυξη του χαρακτηρίζεται από τέσσερα στάδια προνύμφης ή αλλιώς λάρβας (larval stages, L1-4) (Εικόνα 1), τα οποία περνούν από μια διαδοχική διαδικασία εκδύσεων που διαρκεί περίπου τρεις ήμερες και τελικά δίνει γένεση στο ενήλικο άτομο. Η ανατομία του νηματώδους είναι πλήρως γνωστή, ενώ η ποικιλομορφία στα πλαίσια ενός ισογενετικού πληθυσμού είναι μικρή, καθώς η ανάπτυξη του κάθε ατόμου είναι σχεδόν πανομοιότυπη(sulston and Horvitz, 1977). Ένα ενήλικο ερμαφρόδιτο άτομο αποτελείται από 959 μετα-μιτωτικά σωματικά κύτταρα και παράγει έναν ακαθόριστο, αλλά περιορισμένο, αριθμό σπερματοζωαρίων (περίπου 300). Τα ωοκύτταρα παράγονται ανάλογα με τη ζήτηση, ενώ τα μόνα διαιρούμενα κύτταρα του ενήλικου ατόμου είναι αυτά της γαμετικής σειράς. Το γονιδίωμα του νηματώδους είναι πλήρως αλληλουχημένο από το 1998, ενώ πληθώρα πληροφοριών διατίθεται μέσω ηλεκτρονικών βάσεων δεδομένων αλλά και σε έντυπη μορφή. Λόγω τον ιδιοτήτων του, ο C. elegans έχει εγκαθιδρυθεί ως ο πιο δημοφιλής οργανισμός μοντέλο για τη μελέτη της γήρανσης και της απόκρισης σε συνθήκες στρες. Εικόνα 1: Ο κύκλος ζωής του νηματώδους C. elegans. Ανατύπωση από www.wormatlas.org 9

1.1.1. Επίδραση του περιβάλλοντος για την είσοδο στη Dauer μορφή Στρεσογόνες περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως η έλλειψη τροφής ή η υψηλή αλατότητα μπορούν να προκαλέσουν ενδοτοκία, δηλαδή τη διατήρηση των αυγών και την εκκόλαψη τους στο εσωτερικό του ενήλικου ατόμου, μια διαδικασία που συχνά, αλλά όχι πάντα, συνοδεύεται από τον θάνατο του ενήλικου (Chen and Caswell-Chen, 2004). Ένας κύριος τρόπος όμως αντιμετώπισης των δυσμενών περιβαλλοντικών συνθηκών είναι η είσοδος των νηματώδων στη Dauer μορφή. Όταν στο περιβάλλον επικρατούν συνθήκες έλλειψης τροφής ή υπερπληθυσμός ή αυξημένη θερμοκρασία οι προνύμφες σταδίου L1 μπορούν να εισέλθουν σε ένα παράπλευρο μονοπάτι του κύκλου ζωής, που σταματά την ανάπτυξη στο δεύτερο στάδιο λάρβας και οδηγεί στη μορφή διάπαυσης (Dauer)(Cassada and Russell, 1975). Η μορφή αυτή μπορεί να ζήσει χωρίς τροφή για πολλές ημέρες, 4-8 φορές περισσότερο από τη φυσιολογική διάρκεια ζωής του νηματώδους(klass and Hirsh, 1976), ενώ όταν βρεθεί πηγή θρεπτικών, οι προνύμφες Dauer αρχίζουν να τρέφονται και επανέρχονται ως προνύμφες σταδίου 4 στο μονοπάτι ανάπτυξης προς ενήλικα άτομα(cassada and Russell, 1975). Οι προνύμφες Dauer θεωρούνται μη γηράσκουσες, καθώς η διάρκεια παραμονής του νηματώδους στο στάδιο αυτό δεν επηρεάζει τη διάρκεια ζωής από τη στιγμή που ο οργανισμός επανέρχεται στο φυσιολογικό μονοπάτι ανάπτυξης(klass and Hirsh, 1976). Η κύρια επίδραση για την είσοδο στη Dauer μορφή είναι η πυκνότητα του πληθυσμού και επιτελείται από μια φερομόνη, που επάγει την Dauer μορφή και εμποδίζει την έξοδο από αυτήν(golden and Riddle, 1982). Αντίθετα, σήμα για την ύπαρξη τροφής εμποδίζει την είσοδο στη Dauer μορφή και προάγει την έξοδο από αυτήν(golden and Riddle, 1984b). Οι σχετικές ποσότητες φερομόνης και φαγητού, απ ότι τα απόλυτα επίπεδα, είναι σημαντικά για την απόφαση αν ο νηματώδης θα εισέλθει στη Dauer μορφή(golden and Riddle, 1984a). Η αυξημένη θερμοκρασία επίσης επάγει το εξαρτώμενο από τη φερομόνη Dauer στάδιο. Οι μηχανισμοί κυτταρικών αποκρίσεων που επάγονται από τη dauer φερομόνη δεν έχουν διευκρινιστεί. Ωστόσο, έχει προταθεί ότι η dauer φερομόνη προσδένεται σε ένα ειδικό κυτταρικό υποδοχέα που εκφράζεται στους amphid νευρώνες (αισθητήριοι νευρώνες στο κεφάλι του ζώου), χωρίς ο ίδιος να έχει προσδιοριστεί. Όμως, η μοριακή ταυτότητα αυτών των υποδοχέων δεν έχει διευκρινιστεί. Η απόδειξη ότι η dauer φερομόνη αποτελείται από πολλά συστατικά προτείνει ότι κάθε συστατικό μπορεί να προσδένεται σε έναν ξεχωριστό υποδοχέα μετάγοντας σήμα που προάγει την είσοδο στη dauer μορφή(butcher et al., 2007). Αυτό μπορεί να εξηγεί, επίσης, γιατί δεν έχουν βρεθεί μέχρι σήμερα υποψήφιοι υποδοχείς φερομόνης παρά την εντατική γενετική ανάλυση της dauer ανάπτυξης. Η διαθεσιμότητα συνθετικής φερομόνης θα μπορούσε να διευκολύνει την ανακάλυψη αυτών των υποδοχέων. Θεωρείται ότι η dauer φερομόνη προσδένεται και ενεργοποιεί έναν υποδοχέα με επικράτεια εφτά διαμεμβρανικών τμημάτων και συνδεδεμένο με μια G πρωτεΐνη. Οι α υπομονάδες της G πρωτεΐνης GPA-2 και GPA-3 προάγουν την παραμονή στη dauer μορφή όταν ενεργοποιούνται, καταστέλλουν την επαγόμενη από φερομόνη παραμονή στη dauer μορφή κι εκφράζονται στους amphid νευρώνες. Η ικανότητα των αναλόγων του κυκλικού GMP να καταστέλλει την επαγόμενη από φερομόνη παραμονή στη dauer μορφή δείχνει ότι η φερομόνη μπορεί να ανταγωνίζεται, τουλάχιστον εν μέρει, τη γουανυλική κυκλάση. Πολλοί διαμεμβρανικοί υποδοχείς 10

γουανυλικής κυκλάσης(birnby et al., 2000) εκφράζονται στους amphid νευρώνες και θα μπορούσαν να ρυθμίζουν αποκρίσεις στη φερομόνη. 1.1.2. Μονοπάτια που ρυθμίζουν την είσοδο στη dauer μορφή Γενετική ανάλυση μεταλλαγμένων στελεχών που είτε προωθούν τη dauer μορφή [dauerconstitutive (Daf-c)] ή δε σχηματίζουν dauers [dauer-defective (Daf-d)] έχει αποκαλύψει το σημαντικό ρόλο εξελικτικά συντηρημένων μονοπατιών όπως της γουανυλικής κυκλάσης, του TGF-β μονοπατιού, του ινσουλινόμορφου μονοπατιού και ορμονικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος στη ρύθμιση της εισόδου στη Dauer μορφή. Την τελευταία δεκαετία, συστατικά αυτών των μονοπατιών έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί αποκαλύπτοντας το πολύπλοκο δίκτυο και την αλληλεπίδραση αυτών στο σχηματισμό του dauer σταδίου. 1.1.2.1. TGFβ μονοπάτι Το μονοπάτι του TGFβ, που ρυθμίζει την είσοδο στη dauer μορφή καθορίζεται από τα γονίδια Daf-c daf-1, 4, 7, 8, και 14 και τα Daf-d γονίδια daf-3 και daf-5(patterson and Padgett, 2000). Οι προσδέτες της TGFβ οικογένειας προσδένονται κι ενεργοποιούν ετερομερείς υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας με ενεργότητα κινάσης σερίνης/θρεονίνης έχοντας ως αποτέλεσμα τη φωσφορυλίωση κι ενεργοποίηση των SMAD μεταγραφικών παραγόντων που μεταφέρονται στον πυρήνα και ρυθμίζουν τη μεταγραφή. Με εξαίρεση το DAF-7, που εκφράζεται πρωταρχικά στον ASI amphid νευρώνα, όλα τα συστατικά αυτού του μονοπατιού εκφράζονται ευρέως. Μωσαϊκή ανάλυση και πειράματα συμπλήρωσης με ιστοειδική έκφραση δείχνουν ότι ο DAF-4 λειτουργεί μη αυτόνομα για να ρυθμίσει την είσοδο στη dauer μορφή(estevez et al., 1993). Τα γονίδια daf-3, daf-8 και daf-14 κωδικοποιούν SMAD μεταγραφικούς παράγοντες(patterson et al., 1997) και το γονίδιο daf-5 κωδικοποιεί ένα Sno/Ski ομόλογο ογκοπρωτεΐνης, που προσδένεται στο DAF-3(da Graca et al., 2004). Σε συμφωνία με το ρόλο στα θηλαστικά των SMADs ως θετικών ρυθμιστών του μονοπατιού του TGFβ, τα DAF-8 and DAF-14 απαιτούνται για τη μεσολαβούμενη από το DAF-7/TGFβ αναστολή της dauer εισόδου. Όμως, αντίθετα, το DAF-3 φαίνεται να αναστέλλεται από την ενεργοποίηση του μονοπατιού DAF-7/TGFβ. 1.1.2.2. Μονοπάτι της γουανυλικής κυκλάσης Το Daf-c γονίδιο daf-11 καθορίζει ένα μονοπάτι που εμποδίζει την είσοδο στη dauer μορφή, τουλάχιστον εν μέρει, παράλληλα με ένα μονοπάτι που ορίζεται από τα γονίδια daf- 1, 4, 7, 8 και 14. Τα daf-11 μεταλλαγμένα στελέχη έχουν προβλήματα στην αντίληψη χημικών ουσιών. Το daf-11 κωδικοποιεί για μια διαμεμβρανική γουανυλική κυκλάση (cgmp), που εκφράζεται στους χημειοαισθητήριους νευρώνες ASJ, ASK, AWB, and AWC (Yu et al., 1997). Συστατικά ενός cgmp καναλιού ιόντων είναι υποψήφια μόρια καταρροϊκά του DAF-11. Τα tax-2 και tax-4 κωδικοποιούν υπομονάδες ενός καναλιού ιόντων που ρυθμίζει την αντίληψη της θερμοκρασίας, των χημικών ουσιών και την ανάπτυξη των νευρώνων. Τα tax- 11

2 και tax-4 εκφράζονται στους αισθητήριους νευρώνες και έχουν αλληλεπικαλυπτόμενα μοτίβα έκφρασης με το daf-11, δείχνοντας ότι μπορεί να λειτουργούν μαζί στα ίδια κύτταρα. Ο tax-4 dauer φαινότυπος δεν αναιρείται από την 8-bromo-cGMP προτείνοντας ότι το TAX-4 είναι ένας στόχος του μονοπατιού μεταγωγής σήματος -εξαρτώμενο από cgmp- του DAF-11. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι ο DAF-11 αναστέλλει την είσοδο στη dauer μορφή τουλάχιστον εν μέρει ενεργοποιώντας τα TAX-2 και TAX-4 μέσω αυξημένης σύνθεσης cgmp. Τα tax-4 μεταλλαγμένα στελέχη έχουν ένα λιγότερο σοβαρό φαινότυπο Daf-c απ ότι τα daf-11 μεταλλαγμένα στελέχη, δείχνοντας ότι ο DAF-11 πιθανότατα ενεργοποιεί πολλαπλά καταρροϊκά μόρια που συμβάλλουν στην καταστολή της εισόδου σ τη dauer μορφή. 1.1.2.3 Το μονοπάτι της ινσουλίνης Ένα τρίτο μονοπάτι που ρυθμίζει το σχηματισμό dauer αρχικά καθορίστηκε από τα Daf-c γονίδια daf-2 και daf-23 (αλλήλιο του age-1) και το Daf-d γονίδιο daf-16(gottlieb and Ruvkun, 1994) και λειτουργεί παράλληλα με τα μονοπάτια της γουανυλικής κυκλάσης και του TGFβ. Μεταλλαγές που αφορούν σε αυτό το μονοπάτι διαφέρουν φαινοτυπικά από άλλες Daf-c μεταλλαγές στο ότι μεταλλαγές στα αλλήλια των daf-2 and age-1 οδηγούν στη dauer μορφή μη αναστρέψιμα. Επιπλέον, αντίθετα από τα μεταλλαγμένα στελέχη για τα μονοπάτια της γουανυλικής κυκλάσης και του TGFβ, τα daf-2 μεταλλαγμένα στελέχη εμφανίζουν επιμηκυμένη διάρκεια ζωής. Η αναστολή της εισόδου στη dauer μορφή επιτελείται μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα ινσουλίνης DAF-2 και γεγονότων καταρροϊκά του(kimura et al., 1997) (βλ. 1.3.1.1). Ο DAF-18, το ορθόλογο του C. elegans για τη phosphoinositide 3-phosphatase PTEN, ανταγωνίζεται την AGE-1/PI3K (Ogg and Ruvkun, 1998)(Εικόνα 2). Έχει δειχθεί ότι ο DAF- 2/InsR και η AGE-1/PI3K(Morris et al., 1996) λειτουργούν μη αυτόνομα όσον αφορά στην καταστολή της εισόδου στη dauer μορφή. Το Daf-c γονίδιο daf-28 κωδικοποιεί για μέλη της οικογένειας της ινσουλίνης (INS), που προωθούν το ινσουλινόμορφο μονοπάτι μεταγωγής σήματος. Ανατύπωση από www.wormbook.org Εικόνα 2: To ινσουλινόμορφο μονοπάτι μεταγωγής σήματος, ένα από τα μονοπάτια που ρυθμίζει την είσοδο στη dauer μορφή στο C. elegans. 12

1.1.2.4. Το μονοπάτι στεροειδούς ορμόνης Το Daf-c γονίδιο daf-9 και το Daf-d γονίδιο daf-12 λειτουργούν καταρροϊκά των περισσότερων πρωτεϊνών που ρυθμίζουν το σχηματισμό dauer(gerisch et al., 2001). Τα μεταλλαγμένα στελέχη daf-9 και daf-12 έχουν παρόμοιους πλειοτροπικούς ρόλους στη μετανάστευση των κυττάρων της γονάδας, που είναι μοναδικοί ανάμεσα στα Daf μεταλλαγμένα στελέχη. Έτσι τα daf-9 and daf-12 καθορίζουν ένα ρυθμιστικό μονοπάτι διακριτό από αυτά της γουανυλικής κυκλάσης, του TGFβ και του ινσουλινόμορφου μονοπατιού. Το γονίδιο daf-9 κωδικοποιεί μια κυτοχρωμική P450 υδροξυλάση (Jia et al., 2002)παρόμοια της στεροειδούς υδροξυλάσης και το daf-12 κωδικοποιεί ένα πυρηνικό υποδοχέα-μεταγραφικό παράγοντα. Η Dauer μορφή στα daf-9 μεταλλαγμένα στελέχη απαιτεί το DAF-12 δείχνοντας ότι κανονικά ο DAF-9 αναστέλλει τη λειτουργία του DAF-12. Ενδογενείς στεροειδείς ουσίες, που είναι μεταβολίτες του DAF-9 και υψηλής συγγένειας προσδέτες για το DAF-12 έχουν προσδιοριστεί. 1.2. Η γήρανση 1.2.1. Μηχανισμοί γήρανσης Από τη δεκαετία του 1980 ήδη, το «πρόβλημα» της γήρανσης άρχισε να μελετάται εντατικά με τη χρήση των ισχυρών εργαλείων της μοριακής γενετικής(guarente et al., 2008; Kenyon, 2005; Partridge and Gems, 2006; Partridge et al., 2005; Tatar et al., 2003). Ως γήρανση ορίζεται η προοδευτική παρακμή των φυσιολογικών λειτουργιών ενός κυττάρου ή ενός οργανισμού, που οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα επιβίωσης και αναπαραγωγής με το πέρας της ηλικίας και τελικά στο θάνατο(ackermann et al., 2007; Hughes and Reynolds, 2005; Medawar, 1952; Partridge and Barton, 1993; Partridge and Gems, 2006; Rose, 1991; Williams, 1957). Χρησιμοποιώντας το νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans, τη μύγα του ξυδιού Drosophila melanogaster και τον ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae ως οργανισμούςμοντέλα, σημειώθηκε μεγάλη επιτυχία στην απομόνωση μεταλλαγών που επιμηκύνουν τη διάρκεια ζωής μέχρι και δέκα φορές(kenyon et al., 1993; Lin et al., 2000; Lin et al., 1998; Rogina et al., 2000; Tatar et al., 2001). Από τις μελέτες αυτές προέκυψαν τέσσερα, τουλάχιστον, πολύ σημαντικά συμπεράσματα. Πρώτον, αν και ο αριθμός των γονιδίων που εμπλέκονται στον καθορισμό της διάρκειας ζωής είναι μεγάλος, μεταλλαγές σε κύρια μονοπάτια μετάδοσης σήματος μπορούν να επιδράσουν σημαντικά στην διάρκεια ζωής. Δεύτερον, αρκετοί μηχανισμοί καθορισμού της διάρκειας ζωής εμφανίζονται συντηρημένοι μεταξύ των ειδών, από τα ασπόνδυλα μέχρι τα θηλαστικά. Τρίτον, μεταλλαγές που επηρεάζουν τη διάρκεια ζωής συχνά εμφανίζουν ανταγωνιστική πλειοτροπική δράση στην αναπαραγωγή ή άλλα χαρακτηριστικά ευζωίας, χωρίς όμως αυτό να αποτελεί τον κανόνα. Τέλος, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, η επέκταση της ζωής συνοδεύεται από την καθυστέρηση της εμφάνισης ηλικιοεξαρτώμενων φαινοτύπων και ασθενειών, π.χ. απώλεια μνήμης και ικανοτήτων ή νευροεκφυλιστικές και άλλες ασθένειες. Ακολούθως συνοψίζονται οι κύριοι μηχανισμοί που φέρονται να επηρεάζουν τόσο τη διάρκεια όσο και την ποιότητας της ζωής κατά ένα εξελικτικά συντηρημένο τρόπο. 13

1.2.1.1. Το μονοπάτι σηματοδότησης της ινσουλίνης Πολλές μεταλλαγές που επιμηκύνουν τη διάρκεια ζωής διαταράσσουν ενδοκρινικά μονοπάτια μετάδοσης σήματος. Το καλύτερα μελετημένο από αυτά τα μονοπάτια είναι αυτό της ινσουλίνης και του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα IGF-1 (Insulin-like Growth Factor 1) (Εικόνα 3), το οποίο έχει βρεθεί να επηρεάζει τη διάρκεια της ζωής σε σκώληκες, μύγες και θηλαστικά(tatar et al., 2003). Το μονοπάτι αυτό συνδέθηκε για πρώτη φορά με τη διάρκεια της ζωής στον νηματώδη σκώληκα C. elegans, όπου μεταλλάξεις στα γονίδια age-1 και daf-2, που κωδικοποιούν για συστατικά του μονοπατιού βρέθηκαν να διπλασιάζουν τη διάρκεια ζωής του ζώου(kenyon et al., 1993). Ο υποδοχέας DAF-2, με ενεργότητα κινάσης, είναι ο μοναδικός υποδοχέας ινσουλίνης και IGF-1, στον C. elegans(kimura et al., 1997). Η πρόσδεση ενός ινσουλινόμορφου πεπτιδίου (Insulin-Like Peptide ILP) προκαλεί την ενεργοποίηση της επικράτειας κινάσης του υποδοχέα και την φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της κινάσης AGE-1 (PI3K)(Morris et al., 1996). Η ενεργοποιημένη AGE-1 παράγει 3-φωσφοϊνοσιτίδια (PtdIns-3,4-P2 και PtdIns- 3,4,5-P3), δευτερογενή μηνύματα απαραίτητα για την ενεργοποίηση καταρροϊκών κινασών, οι οποίες περιλαμβάνουν τις PDK-1, SGK-1, AKT-1 και AKT-2(Hertweck et al., 2004; Paradis et al., 1999; Paradis and Ruvkun, 1998). Οι κινάσες αυτές ρυθμίζουν την τοπολογία του μεταγραφικού παράγοντα DAF-16/FOXO(Lin et al., 1997; Ogg et al., 1997) φωσφορυλιώνοντάς τον σε κατάλοιπα Thr54, Ser240, Thr242 και Ser314. Η φωσφορυλιωμένη μορφή του DAF-16 παραμένει ανενεργή στο κυτταρόπλασμα (αυτή η αρνητική ρύθμιση εν μέρει πραγματοποιείται από 14-3-3 πρωτεϊνες (Li et al., 2007)που προσδένονται σε διμερή μορφή σε μοτίβα φωσφο-σερίνης/θρεονίνης στο φωσφορυλιωμένο DAF-16), αποφωσφορυλίωσή του όμως προκαλεί την μετατόπισή του στον πυρήνα, όπου και επηρεάζει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων είτε ως ενεργοποιητής ή ως καταστολέας(henderson and Johnson, 2001; Lee et al., 2001; Lin et al., 2001). Η κανονική λειτουργία επομένως του μονοπατιού της ινσουλίνης αποτρέπει την παρουσία του DAF-16 στον πυρήνα (Εικόνα 3). Η λειτουργία του DAF-16 είναι απαραίτητη για το σχηματισμό του εναλλακτικού σταδίου λάρβας dauer κατά την ανάπτυξη και για τη μακροβιότητα των daf-2 μεταλλαγμάτων(kenyon et al., 1993) κατά την ενήλικη ζωή του νηματώδη σκώληκα. Το γονιδίωμα του C.elegans περιέχει περισσότερα από 30 γονίδια που κωδικοποιούν για ινσουλινόμορφα πεπτίδια, τα οποία δρουν είτε ως αγωνιστές είτε ως ανταγωνιστές του υποδοχέα DAF-2 και καθορίζουν το βαθμό ενεργοποίησης του μονοπατιού ως απόκριση σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα, όπως η διαθεσιμότητα της τροφής και οι συνθήκες ανάπτυξης(li et al., 2003; Pierce et al., 2001). Τα γονίδια-στόχοι του τελικού αποδέκτη DAF- 16 ρυθμίζουν βασικές διαδικασίες του σκουληκιού όπως το μεταβολισμό, την αναπαραγωγή, την ανάπτυξη αλλά και τη μακροζωία. Μεταλλαγές που μειώνουν τη δράση του μονοπατιού σε κατάλληλους ιστούς (βλ. παρακάτω) ή σε κατάλληλη χρονική περίοδο (μετα-αναπτυξιακά) και οδηγούν τον DAF-16 στον πυρήνα μπορούν να καθυστερήσουν τη διαδικασία γήρανσης και να διπλασιάσουν τη διάρκεια ζωής του C. elegans(dillin et al., 2002a). Η σηματοδότηση της ινσουλίνης και του IGF-1 φαίνεται να μην περιορίζεται στα αυτόνομα πλαίσια ενός κυττάρου. Γενετικά μωσαϊκά C. elegans, τα οποία φέρουν έλλειψη του 14

υποδοχέα DAF-2 σε ένα από τα δύο κύτταρα, κατά το στάδιο των δύο κυττάρων, είναι μακρόβια(apfeld and Kenyon, 1998), υποδεικνύοντας πως τα κύτταρα που φέρουν την έλλειψη στέλνουν κάποιο σήμα μακροβιότητας σε κύτταρα αγρίου τύπου. Ένας από τους ιστούς που φαίνεται να έχει την ικανότητα να στέλνει τέτοια σήματα είναι το έντερο που λειτουργεί και ως ο λιπώδης ιστός του ζώου. Αυξημένη ενεργότητα του DAF-16/FOXO στο λιπώδη ιστό του σκουληκιού και της Drosophila αρκεί για να αυξήσει τη διάρκεια ζωής τους(giannakou et al., 2004; Hwangbo et al., 2004; Libina et al., 2003), ενώ έλλειψη του υποδοχέα ινσουλίνης/igf-1 στο λιπώδη ιστό είναι ικανή να προκαλέσει αυξημένη μακροβιότητα σε ποντίκια(bluher et al., 2003). Ενδείξεις υπάρχουν και για την αποστολή σημάτων μακροβιότητας από το νευρικό σύστημα του C. elegans, με τα αποτελέσματα όμως να παρουσιάζουν σημαντικές αντιφάσεις(apfeld and Kenyon, 1998; Libina et al., 2003; Wolkow et al., 2000). Πολλά στελέχη του νηματώδη με μεταλλαγές σε αισθητήριους νευρώνες, συμπεριλαμβανομένων και στελεχών με μεταλλαγές σε υποθετικά χημειοαισθητήριους υποδοχείς, είναι μακρόβια(alcedo and Kenyon, 2004; Apfeld and Kenyon, 1999). Η παρατηρούμενη επέκταση της ζωής εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον DAF-16(Alcedo and Kenyon, 2004; Apfeld and Kenyon, 1999) και συνδέεται με τον πυρηνικό εντοπισμό του(lin et al., 2001). Πολλοί αισθητήριοι νευρώνες παράγουν ινσουλινόμορφα πεπτίδια(pierce et al., 2001), τουλάχιστον κάποια από τα οποία έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν τη μακροβιότητα(li et al., 2003; Murphy et al., 2003; Pierce et al., 2001). Επομένως, η αντίληψη του περιβάλλοντος πιθανώς επηρεάζει τη διάρκεια της ζωής τροποποιώντας τη δραστηριότητα του μονοπατιού της ινσουλίνης και του IGF-1. Η ρύθμιση της διάρκειας της ζωής μέσω της αντίληψης του περιβάλλοντος είναι πάντως ένα εξαιρετικά πολύπλοκο αντικείμενο. Για παράδειγμα κάποιοι, αλλά όχι όλοι οι γευστικοί και οσφρητικοί νευρώνες επηρεάζουν τη διάρκεια ζωής, άλλοι θετικά και άλλοι αρνητικά(alcedo and Kenyon, 2004). Δεν είναι ξεκάθαρο αν αντίστοιχοι μηχανισμοί υφίστανται και στα θηλαστικά, αλλά η παρατήρηση της αύξησης των επιπέδων ινσουλίνης σε ανθρώπους λόγω της μυρωδιάς του φαγητού(lindemann, 2001) προκαλεί σίγουρα ενδιαφέρον. Εικόνα 3: Το μονοπάτι DAF-2/DAF-16. (Α) Παρουσία ενός προσδέτη-αγωνιστή, όπως το ινσουλινόμορφο πεπτίδιο DAF-28, ενεργοποιείται ο υποδοχέας DAF-2, ο οποίος με τη σειρά του ενεργοποιεί την κινάση AGE-1, που καταλύει τη μετατροπή της διφωσφορικής ινοσιτόλης (PIP2) σε τριφωσφορική ινοσιτόλη (PIP3). Η PIP3 15

προσδένεται στο σύμπλοκο AKT1/AKT2 και οδηγεί στην έκθεση δύο θέσεων φωσφορυλίωσης. Ταυτόχρονα, μέσω της πρόσδεσης PIP3, η κινάση PDK-1 επιστρατεύεται στη μεμβράνη, όπου φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την AKT-1. Η κινάση AKT-1 με τη σειρά της φωσφορυλιώνει τον μεταγραφικό παράγοντα DAF-16, εξασφαλίζοντας τη διατήρησή του στο κυτταρόπλασμα. (Β) Παρουσία ενός προσδέτη-ανταγωνιστή, όπως ο INS- 1 (ή σε μεταλλάγματα απώλειας λειτουργίας daf-2), το μονοπάτι είναι ανενεργό, ο DAF-16 δεν φωσφορυλιώνεται και μπορεί να μετατοπιστεί στον πυρήνα όπου ρυθμίζει την έκφραση μίας ομάδας γονιδίων απόκρισης σε στρες και αντιμικροβιακών γονιδίων. Πέρα από τον DAF-16, η μακροβιότητα των daf-2 μεταλλαγμένων ατόμων εξαρτάται απόλυτα και από τον μεταγραφικό παράγοντα απόκρισης στο θερμικό σοκ HSF-1(Hsu et al., 2003; Morley and Morimoto, 2004). Όπως και ο DAF-16, ο HSF-1 καθυστερεί τη γήρανση και προωθεί τη μακροβιότητα μέσω της ενεργοποίησης συγκεκριμένων γονιδίων μακροβιότητας, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που κωδικοποιούν για μικρές πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος (Heat-Shock Proteins, HSPs)(Hsu et al., 2003). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η έκθεση ενός οργανισμού σε χαμηλά επίπεδα στρες, ένα φαινόμενο που συχνά αποκαλείται «όρμιση» (hormesis), προκαλεί ευεργετικά αποτελέσματα και μακροβιότητα σε πολλά είδη, συμπεριλαμβανομένων και των θηλαστικών(apfeld et al., 2004; Hercus et al., 2003; Lithgow et al., 1995). Από την άλλη μεριά, η ενεργότητα του DAF- 16 ρυθμίζεται και από παράγοντες ανεξάρτητους από το μονοπάτι της ινσουλίνης, όπως οι κινάσες JNK-1(Oh et al., 2005) και MST(Lehtinen et al., 2006). Άλλες κινάσες που απαιτούνται εν μέρει για την μακροβιότητα των daf-2 μεταλλαγμάτων είναι η ΑΜΡΚ(Apfeld et al., 2004), η p38 MAPK(Troemel et al., 2006) και οι κινάσες της σηματοδότησης RAS(Nanji et al., 2005). Το μονοπάτι της ινσουλίνης αποκρίνεται σε ορμονικά ή περιβαλλοντικά σήματα (στρες ή διατροφικά) αλληλεπιδρώντας με αυτούς τους παράγοντες/μονοπάτια και η συνδυασμένη/συνεργατική δράση του DAF-16 με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες καθορίζει το μεταγραφικό προφίλ του κάθε κυττάρου και ιστού, ανάλογα με τις συνθήκες. Εικόνα 4: Μεταγραφικοί στόχοι του μεταγραφικού παράγοντα DAF-16. Ανατύπωση από Kenyon C., 2005 16

Πολλά από τα καταρροϊκά γονίδια του μονοπατιού της ινσουλίνης και του IGF-1 έχουν αναγνωριστεί στον C. elegans(lee et al., 2003a; Murphy et al., 2003). Μεταξύ αυτών συμπεριλαμβάνονται γονίδια που κωδικοποιούν για αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες (π.χ. υπεροξειδική δισμουτάση, καταλάση, μεταλλοθειονίνη), για πρωτεΐνες του μεταβολισμού (π.χ. απολιποπρωτεΐνες, ένζυμα του γλυοξυλικού κύκλου και του μεταβολισμού αμινοξέων), συνοδές πρωτεΐνες (chaperones) (κυρίως μικρές πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος) και αντιβακτηρικές πρωτεΐνες (Εικόνα 4). Η ενεργότητα αυτών των πρωτεϊνών φαίνεται ότι τελικά επηρεάζει τη διαδικασία γήρανσης μέσω των μεταβολικών αλλαγών και τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης. 1.2.1.2. Σηματοδότηση από τη γαμετική σειρά (germline) Απόρροια των σύγχρονων εξελικτικών θεωριών είναι ότι η μακροβιότητα συνδέεται με μειωμένη γονιμότητα λόγω της ύπαρξης ισοζυγίου μεταξύ γαμετικών και σωματικών κυττάρων. Αν και τα πειραματικά δεδομένα απορρίπτουν μία τέτοια απόλυτη σχέση(dillin et al., 2002a), το αναπαραγωγικό σύστημα φαίνεται να έχει όντως την ικανότητα να επηρεάζει τη διάρκεια της ζωής. Απομάκρυνση των προγονικών κυττάρων της γαμετικής σειράς του C. elegans έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση της διάρκειας ζωής κατά 60%(Hsin and Kenyon, 1999), η οποία αύξηση μάλιστα δεν οφείλεται στη στειρότητα, καθώς απομάκρυνση ολόκληρου του αναπαραγωγικού συστήματος (γαμετική σειρά και σωματική γονάδα) δεν έχει το ίδιο αποτέλεσμα, ούτε μεταλλαγές που προκαλούν στειρότητα οδηγούν πάντα σε μακροζωία(tekippe and Aballay, 2010). Αντιθέτως, η επίδραση της γαμετικής σειράς στη διάρκεια ζωής είναι ορμονικής φύσης και εξαρτάται κυρίως από ένα μονοπάτι μετάδοσης σήματος στεροειδών ορμονών. Σε αυτό εμπλέκονται ο μεταγραφικός παράγοντας DAF-12 της οικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων(hsin and Kenyon, 1999) και η πρωτεΐνη DAF-9, ομόλογη του κυττοχρώματος P450, που πιστεύεται ότι εμπλέκεται στη σύνθεση του προσδέτη του υποδοχέα DAF-12(Gerisch and Antebi, 2004). Η απομάκρυνση των γαμετικών κυττάρων οδηγεί επίσης στον πυρηνικό εντοπισμό του DAF- 16 κυρίως στο έντερο(lin et al., 2001), το οποίο εξυπηρετεί παράλληλα και τον ρόλο του λιπώδη ιστού(libina et al., 2003). Ο τρόπος με τον οποίο τα γαμετικά κύτταρα στέλνουν σήματα στο έντερο δεν είναι ξεκάθαρος, αλλά φαίνεται να εμπλέκει τα βλαστοκύτταρα της γαμετικής σειράς, καθώς η παρεμπόδιση της διαίρεσής τους σε ενήλικα άτομα αυξάνει τη διάρκεια ζωής(arantes-oliveira et al., 2002). Η ρύθμιση της διάρκειας της ζωής από τη γαμετική σειρά ενός ζώου ίσως παρέχει έναν τρόπο συγχρονισμού του ρυθμού γήρανσης και της αναπαραγωγικής περιόδου. Αν για παράδειγμα, κατά την εξέλιξη, συνέβαινε μία μετάλλαξη που καθυστερεί την ανάπτυξη της γαμετικής σειράς, η αναπαραγωγική περίοδος θα καθυστερούσε, παράλληλη όμως καθυστέρηση θα υπήρχε και στον ρυθμό γήρανσης. Συνεπώς το ζώο θα εξακολουθούσε να είναι στην ακμή του κατά την περίοδο της αναπαραγωγικής του ωρίμανσης. 1.2.1.3. Θερμιδικός περιορισμός και μακροβιότητα Ο θερμιδικός περιορισμός, μια σημαντική μείωση στην πρόσληψη θερμίδων χωρίς ουσιαστική στέρηση θρεπτικών, μπορεί να επιβραδύνει τον εγγενή ρυθμό γήρανσης στη ζύμη, τους νηματώδεις, τις μύγες, τα τρωκτικά και πιθανώς στα πρωτεύοντα(mattison et al., 17

2012; Sohal and Weindruch, 1996). Γενικά, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο η μειωμένη πρόσληψη θερμίδων μεταφράζεται σε μακροζωία. Στα τρωκτικά πάντως, σχετίζεται με τη μειωμένη πρόσληψη θερμίδων per se και όχι με τη ελάττωση του λίπους ή των μεταβολικών ρυθμών(masoro, 2000). Μελέτες στο νηματώδη C.elegans, έχουν αποκαλύψει δύο εξελικτικά συντηρημένους μεταγραφικούς παράγοντες, η δράση των οποίων είναι απαραίτητη για την απόκριση μακροζωίας στον θερμιδικό περιορισμό, τους PHA-4(Panowski et al., 2007) και SKN- 1(Bishop and Guarente, 2007). Ο PHA-4 εμπλέκεται επίσης στη δημιουργία του φάρυγγα κατά την ανάπτυξη του σκώληκα και αποτελεί μέλος της οικογένειας των forkhead μεταγραφικών παραγόντων, παρουσιάζοντας μεγάλη ομοιότητα με τις πρωτεΐνες FOXA των θηλαστικών, οι οποίες πέρα από τον ρόλο τους στην ανάπτυξη, ρυθμίζουν το μεταβολισμό της γλυκόζης σε μεταγενέστερα στάδια της ζωής. Ο SKN-1 παρουσιάζει ομοιότητες με τους μεταγραφικούς παράγοντες NRF2 των θηλαστικών και συμμετέχει στη δημιουργία του εντέρου κατά την ανάπτυξη του C. elegans. Το γονίδιο skn-1 εκφράζεται στο έντερο και σε ένα μόλις ζεύγος νευρώνων, γνωστούς ως ASIs, οι οποίοι μεταφέρουν σήματα από το περιβάλλον και αποστέλλουν διάφορα ορμονικά σινιάλα σε όλο το σώμα. Η λειτουργία του στους νευρώνες αυτούς, αλλά όχι στο έντερο, είναι απαραίτητη για την απόκριση μακροβιότητας στον θερμιδικό περιορισμό. Αντίθετα, η δράση του PHA-4 στο έντερο, και όχι στο φάρυγγα, είναι αυτή που καθορίζει τη διάρκεια ζωής σε συνθήκες θερμιδικού περιορισμού. Ο παράγοντας PHA-4 αποτελεί στόχο ενός κύριου μονοπατιού αντίληψης θρεπτικών, αυτό της κινάσης TOR. Η κινάση TOR αποτελεί τον κύριο αισθητήρα αμινοξέων και θρεπτικών που προωθεί την ανάπτυξη και μπλοκάρει καταβολικά μονοπάτια, όπως η αυτοφαγία, όταν η τροφή βρίσκεται σε περίσσια. Η αναστολή δράσης του μονοπατιού TOR αυξάνει τη διάρκεια ζωής πολλών ειδών, από τη ζύμη μέχρι τα ποντίκια(harrison et al., 2009; Jia et al., 2004; Kaeberlein et al., 2005; Kapahi et al., 2004; Vellai et al., 2003) και βελτιώνει τη απόκριση σε περιβαλλοντικό στρες(hansen et al., 2007). Η απόκριση αυτή, τουλάχιστον στον C. elegans, είναι ανεξάρτητη από τον DAF-16/FOXO(Hansen et al., 2007; Jia et al., 2004; Vellai et al., 2003), αλλά απαιτεί μεταγραφικές αλλαγές, οι οποίες διαμεσολαβούνται από τον μεταγραφικό παράγοντα PHA-4/FOXA(Yuan et al., 2009). Ως απόκριση στην παρουσία θρεπτικών, η κινάση TOR ρυθμίζει θετικά τη μετάφραση, ενεργοποιώντας την κινάση της S6 ριβοσωμικής υπομονάδας (S6K) και παρεμποδίζοντας τη δράση της πρωτεΐνης που δεσμεύει τον παράγοντα έναρξης της μετάφρασης 4E (eif4e binding protein 1), ενός αναστολέα της πρωτεϊνοσύνθεσης (Εικόνα 5). Σε συνθήκες περιορισμένων θρεπτικών, η ενεργότητά της μειώνεται, προκαλώντας αντίστοιχη μείωση στο επίπεδα της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η πτώση των επίπεδων πρωτεϊνοσύνθεσης έχει βρεθεί να προκαλεί αύξηση της διάρκειας ζωής στη ζύμη, τις μύγες, τους σκώληκες και τα θηλαστικά (βλ. παρ. 1.3.1.4). Παράλληλα, η αναστολή της δράσης της διεγείρει την αυτοφαγία, τουλάχιστον σε σκώληκες και μύγες(bjedov et al., 2010; Hansen et al., 2008; Toth et al., 2008). 18

Ανατύπωση από Aric N. Rogers, Pankaj Kapahi, Ageing, 2006 Εικόνα 5: Το μονοπάτι TOR. Αν και το μονοπάτι TOR έχει αναγνωριστεί πλέον ως ο κύριος μηχανισμός μακροβιότητας σε απόκριση στο θερμιδικό περιορισμό, άλλοι παράγοντες που έχουν προταθεί να συμμετέχουν σε αυτόν είναι οι σιρτουΐνες και τα επίπεδα της αναπνοής. 1.2.1.4. Πρωτεϊνοσύνθεση Η πρωτεϊνοσύνθεση αποτελεί μια ζωτικής σημασίας για τα κύτταρα διαδικασία, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε όλες τις βιολογικές διεργασίες και επηρεάζεται από τη γήρανση. Σε πολλούς οργανισμούς, η ενεργότητα βασικών μεταφραστικών παραγόντων φθίνει με το πέρας της ηλικίας, οδηγώντας στη μείωση του ρυθμού σύνθεσης των πρωτεϊνών(makrides, 1983; Rattan and Clark, 1996). Γερασμένα ποντίκια τείνουν να εμφανίζουν αυξημένο αριθμό μεγάλων πολυσωμάτων και μειωμένο αριθμό μικρών, σε σύγκριση με νεαρά άτομα, κάτι που έρχεται σε συμφωνία με μία μείωση στο ρυθμό της μετάφρασης(makrides and Goldthwaite, 1984). Αντίστοιχα, μελέτες στη D. melanogaster δείχνουν μία ηλικιοεξαρτώμενη μείωση στον αριθμό των πολυσωμάτων(webster and Webster, 1983). Επιπλέον, τα επίπεδα της μετάφρασης των mrnas ελαττώνονται ως απόκριση στις περισσότερες, αν όχι σε όλες, τις μορφές κυτταρικού στρες(holcik and Sonenberg, 2005). Η σημασία της ελάττωσης της μετάφρασης πάντως στην κυτταρική γήρανση παραμένει ασαφής, καθώς δεν είναι ξεκάθαρο αν πρόκειται για μία ευεργετική προσαρμογή στη μειωμένη μιτοχονδριακή λειτουργία και κατ επέκταση μειωμένη παραγωγή ενέργειας λόγω της γήρανσης, ή αν συμβάλει άμεσα στη διαδικασία της γήρανσης. Ο ουσιώδης ρόλος της πρωτεϊνοσύνθεσης στην ανάπτυξη καθιστά δύσκολη την αποσαφήνιση του ρόλου της ειδικά στη γήρανση. Η χειραγώγηση της μετάφρασης των mrnas γενικά προκαλεί, κατά πάσα πιθανότητα, πλειοτροπικά αποτελέσματα, 19

επισκιάζοντας την όποια πιθανή, ευθεία συνεισφορά της στη γήρανση. Παρόλη τη δυσκολία, μελέτες κυρίως σε ασπόνδυλους οργανισμούς, όπως ο C. elegans και η D. melanogaster, έχουν αρχίσει να ρίχνουν φως στη σύνδεση μεταξύ πρωτεϊνοσύνθεσης και γήρανσης. Αλλαγές στο πρότυπο της πρωτεϊνοσύνθεσης συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής και κυτταρικής ανάπτυξης, τη διαφοροποίηση και τη γήρανση. Κεντρικό ρόλο στον έλεγχο της πρωτεϊνοσύνθεσης κατέχουν μονοπάτια μετάδοσης σήματος, όπως αυτό της ινσουλίνης και του IGF-1, της κινάσης TOR και της p38 MAPK, τα οποία στοχεύουν ποικιλία συστατικών της μεταφραστικής μηχανής(proud, 2004; Wang et al., 1998). Πολλοί σηματοδοτικοί μηχανισμοί των κυττάρων συγκλίνουν στη ρύθμιση του ρυθμού της μετάφρασης, ως απόκριση σε μία ευρεία ποικιλία ερεθισμάτων, μέσω της επιρροής τους στην ενεργότητα ή τη διαθεσιμότητα σημαντικών ρυθμιστών της(proud, 2004). Στη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης εμπλέκονται τρία κύρια και αυστηρώς ρυθμιζόμενα συμβάντα: η έναρξη της μετάφρασης του mrna, η επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και η λήξη της μετάφρασης. Η έναρξη είναι το βήμα που καθορίζει τον ρυθμό της μετάφρασης των mrnas και γι αυτό αποτελεί τον πιο κοινό στόχο μεταφραστικού ελέγχου(gingras et al., 1999). Ο καθολικός έλεγχος της πρωτεϊνοσύνθεσης επιτυγχάνεται εν γένει μέσω αλλαγών στα επίπεδα φωσφορυλίωσης παραγόντων έναρξης της μετάφρασης, ή ρυθμιστών αυτών. Ο ρυθμός της σύνθεσης πρωτεϊνών καθορίζεται κυρίως μέσω της ρύθμισης δύο ξεχωριστών διαδικασιών: τη στρατολόγηση της 40S ριβοσωμικής υπομονάδας στο 5 άκρο του mrna και της πρόσδεσης του εναρκτήριου-μεθειονυλο-trna στην 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Οι διαδικασίες αυτές συντονίζονται από τη δράση των παραγόντων έναρξης eif4e και eif2/eif2b αντίστοιχα. Η φωσφορυλίωση της α-υπομονάδας του eif2 οδηγεί σε αποδόμηση του συμπλόκου eif2/eif2b και ανακύκλωση του eif2(gebauer and Hentze, 2004). Παρομοίως, η διαθεσιμότητα του ενεργού eif4e ρυθμίζεται μέσω της φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών πρόσδεσής του (4E-BPs)(Richter and Sonenberg, 2005). Στον C. elegans συναντώνται πέντε ισομορφές του eif4e (IFE-1 - IFE-5). Οι IFE-1, IFE-3 και IFE-5 εκφράζονται στη γαμετική σειρά, ενώ οι IFE-2 και IFE-4 κυρίως σε σωματικά κύτταρα. Οι IFE-3 και IFE-4 δεσμεύουν μόνο καλύπτρες 7-μονομεθυλο-γουανίνης ( m7 G-cap), ενώ οι IFE-1, IFE-2 και IFE-5 μπορούν να προσδέσουν τόσο καλύπτρες 7-μονομεθυλο-γουανίνης, όσο και καλύπτρες 2,2,7-τριμεθυλο-γουανίνης ( m2,2,7 G-cap)( Keiper et al., 2000). Η πλειοψηφία των mrnas του νηματώδους φέρουν καλύπτρες 2,2,7-τριμεθυλο-γουανίνης, τις οποίες αποκτούν μέσω της διαδικασίας του trans-ματίσματος(van Doren and Hirsh, 1990). Η έλλειψη της ισομορφής IFE-2 έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της διάρκειας ζωής του ζώου, κάτι που δεν συμβαίνει στην περίπτωση των υπόλοιπων ισομορφών του eif4e(syntichaki et al., 2007). Μεταλλάγματα ife-2 εμφανίζουν μειωμένο ρυθμό σύνθεσης πρωτεϊνών σε σχέση με ζώα αγρίου τύπου(syntichaki et al., 2007) κάτι που, σε συνδυασμό με την επικράτηση της ισομορφής αυτής στα σωματικά κύτταρα του σκώληκα, υποδεικνύει ότι η μείωση του ρυθμού πρωτεϊνοσύνθεσης συγκεκριμένα στα σωματικά κύτταρα προκαλεί επέκταση της διάρκειας ζωής(tavernarakis, 2007). Αντίστοιχη σύνδεση με τη διάρκεια της ζωής έχει παρατηρηθεί και για άλλους παράγοντες έναρξης της μετάφρασης(chen et al., 2007; Hansen et al., 2007; Panowski et al., 2007). Παρομοίως, η ελάττωση των επιπέδων διαφόρων ριβοσωμικών πρωτεϊνών, ή της S6K κινάσης κατά την ενήλικη ζωή επεκτείνει τη ζωή του νηματώδους. Σε όλες τις προαναφερθείσες περιπτώσεις η μακροζωία συνοδεύεται από μειωμένο ρυθμό σύνθεσης 20

πρωτεϊνών σε σχέση με τα ζώα αγρίου τύπου(hansen et al., 2007; Panowski et al., 2007). Επιπροσθέτως, πολλά γονίδια που κωδικοποιούν για συστατικά του συμπλέγματος των eif, καθώς και συστατικά των 40S και 60S ριβοσωμικών υπομονάδων αναγνωρίστηκαν σε σάρωση RNAi που είχε ως στόχο γονίδια, η απενεργοποίηση των οποίων μετα-αναπτυξιακά επιμηκύνει τη διάρκεια ζωής του σκώληκα(chen et al., 2007; Curran and Ruvkun, 2007). Η σχέση αυτή μεταξύ μειωμένων επιπέδων πρωτεϊνοσύνεσης και μακροβιότητας φαίνεται εξελικτικά συντηρημένη, καθώς η παρεμπόδιση της μετάφρασης με διάφορους τρόπους έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της διάρκειας ζωής και στη ζύμη, τις μύγες και τα θηλαστικά(kaeberlein et al., 2005; Kapahi et al., 2004; Selman et al., 2009; Steffen et al., 2008). Ο τρόπος με τον οποίο η ελάττωση των επιπέδων της μετάφρασης οδηγεί σε αυξημένη διάρκεια ζωής δεν είναι ξεκάθαρος. Η πρωτεϊνοσύνθεση αποτελεί μία από τις πιο ενεργειοβόρες κυτταρικές διαδικασίες, καταναλώνοντας περίπου το 50% της συνολικής ενέργειας των κυττάρων(proud, 2002). Η μείωση του ρυθμού σύνθεσης πρωτεϊνών επομένως, κάτω από μη ευνοϊκές συνθήκες στρες, έχει ως αποτέλεσμα την εξοικονόμηση σημαντικών ποσών ενέργειας, η οποία ακολούθως μπορεί να διοχετευτεί σε διαδικασίες συντήρησης και επισκευής των κυττάρων, συμβάλλοντας έτσι στη μακροβιότητα. Επιπλέον, η αρνητική ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης, υπό κατάλληλες συνθήκες, πιθανώς αποτρέπει τη σύνθεση ανεπιθύμητων πρωτεϊνών, που θα μπορούσαν να παρεμποδίσουν την κυτταρική απόκριση στο στρες. Αξιοσημείωτα, η προκαλούμενη από στρες, καθολική μείωση της μετάφρασης συνοδεύεται συχνά από αλλαγή στο πρότυπο αυτής, ευνοώντας τη μετάφραση επιλεγμένων mrnas, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες απαραίτητες για την επιβίωση κάτω από στρεσογόνες συνθήκες. Ο μηχανισμός μέσω του οποίου συμβαίνει αυτή η αλλαγή προτύπου όμως δεν είναι γνωστός και η φυσιολογική σημασία της ελάττωσης του ρυθμού πρωτεϊνοσύνθεσης κατά τη γήρανση παραμένει υπό διερεύνηση(tavernarakis, 2007). Τα επίπεδα της πρωτεϊνοσύνθεσης των κυττάρων όμως δε ρυθμίζονται μόνο μέσω της λειτουργίας της μεταφραστικής μηχανής. Ο μεταβολισμός του mrna αποτελεί έναν επιπλέον τρόπο ελέγχου του γενικού ρυθμού σύνθεσης πρωτεϊνών, αλλά και της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης ως απόκριση σε ποικιλία ερεθισμάτων. Στη διαδικασία αυτή διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο συγκεκριμένα αγγελιοφόρα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά κοκκία (mrnps), αποκαλούμενα Σωμάτια Π (γνωστά και ως Σωμάτια GW σε ανθρώπινα κύτταρα)(coller and Parker, 2005; Cougot et al., 2004; Sheth and Parker, 2003). Τέλος, σημαντικός είναι ο ρόλος των σιρτουΐνων (NAD + -εξαρτώμενες αποακετυλάσες πρωτεϊνών) ( Dang et al., 2009; Kenyon, 2005; Liu et al., 2010) όπως επίσης των μιτοχονδρίων (Curran and Ruvkun, 2007; de Jong et al., 2004; Dillin et al., 2002b; Feng et al., 2001; Hamilton et al., 2005; Hansen et al., 2005; Lee et al., 2003b; Lemieux et al., 2001; Tsang et al., 2001; Ventura et al., 2005; Wong et al., 1995) και των τελομερών (Joeng et al., 2004) στη ρύθμιση του μηχανισμού της γήρανσης. Στόχος της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας: Δεδομένου του ρόλου της πρωτεϊνοσύνθεσης στη ρύθμιση της γήρανσης και μάλιστα ότι χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης συμβάλλουν στην επιμήκυνση της διάρκειας ζωής θελήσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο του μεταβολισμού των mrnas στη γήρανση και στην απόκριση στο 21

στρες του C. elegans. Πιο συγκεκριμένα, μελετήσαμε το ρόλο των γονιδίων dcap-1 και dcap- 2, που αποτελούν το ολοένζυμο αφαίρεσης της καλύπτρας στο 5 άκρο του mrna. Το ολοένζυμο αυτό ανταγωνίζεται για πρόσδεση στο 5 άκρο τον παράγοντα έναρξης της μετάφρασης eif4e, αποτελώντας έτσι ένα μηχανισμό ρύθμισης της πρωτεϊνοσύνθεσης. Παράλληλα με την παραπάνω μελέτη διεξήγαμε δοκιμή φαρμάκων κατά των αρρυθμιών και της υπέρτασης στην ανάπτυξη του νηματώδη με σκοπό την εύρεση μηχανισμών της δράσης τους. 1.3. Σωμάτια Π Τα πυρηνικά mrna μετάγραφα φέρουν έναν μανδύα πρωτεϊνικής φύσεως, ο οποίος καθιστά δυνατή την έξοδό τους από τον πυρήνα και υπαγορεύει σε μεγάλο βαθμό τη μοίρα του κάθε μορίου(moore, 2005). Κάποια mrnas προορίζονται απευθείας για μετάφραση, μία διαδικασία που μετασχηματίζει τον πρωτεϊνικό μανδύα και οδηγεί στην συγκρότηση πολυσώματος. Μετά το πέρας της μετάφρασης, τα mrnas αυτά αποαδενυλιώνονται, τα πολυσώματα αποσυγκροτούνται και τα μετάγραφα αποδομούνται ή αποθηκεύονται. Άλλα mrnas προορίζονται για μεταχρονολογημένη μετάφραση, και μεταφέρονται ή/και αποθηκεύονται έως ότου αναπτυξιακά ή περιβαλλοντολογικά ερεθίσματα προκαλέσουν τη μετάφρασή τους. Και στις δύο περιπτώσεις, τα μεταφραστικά κατασταλμένα mrnas αποθηκεύονται σε ριβονουκλεοπρωτεϊνικά κοκκία, τα οποία δεν περιβάλλονται από μεμβράνη και είναι ορατά μέσω οπτικής μικροσκοπίας. Τα Σωμάτια Π (Processing Bodies PBs) αποτελούν μία ξεχωριστή κλάση κυτταροπλασματικών mrna κοκκίων, που περιλαμβάνει συστατικά του μηχανισμού 5-3 αποδόμησης φυσιολογικών, αλλά και ελαττωματικών mrnas με πρόωρα ή ανερμηνεύσιμα κωδικόνια (βλ. παρακάτω). Επίσης τα σωμάτια Π αποτελούν τόπους αποδόμησης ή αποθήκευσης μεταγραφικά κατασταλμένων mrnas, λόγω της πρόσδεσής τους με κάποια πρωτεΐνη-καταστολέα ή κάποιο συστατικό του μηχανισμού RNA παρεμπόδησης (RNA interference). Η αρχική υπόνοια για την ύπαρξη τοπικής ρύθμισης της αποικοδόμησης των mrnas προέκυψε από τον εστιακό εντοπισμό της 5-3 εξωνουκλεάσης των θηλαστικών XRN1(Bashkirov et al., 1997). Μεταγενέστερες μελέτες που υποδείκνυαν την εστιακή κατανομή επιπρόσθετων παραγόντων που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση των mrnas, όπως τα ένζυμα αφαίρεσης της καλύπτρας DCP1/DCP2 και οι πρωτεΐνες LSm(Eystathioy et al., 2002; Eystathioy et al., 2003; Ingelfinger et al., 2002; van Dijk et al., 2002; van Dijk et al., 2003) καθιέρωσαν ένα μοντέλο χωρικά διακριτών εστιών αποικοδόμησης των mrnas. Η επιβεβαίωση του μοντέλου προέκυψε από λειτουργικές μελέτες στη ζύμη, οι οποίες υποδείκνυαν τη συσσώρευση μεταγράφων που περιέχουν ανθεκτικές στις 5-3 εξωνουκλεάσες, ολιγο-g περιοχές στις εστίες αυτές, οδηγώντας στον χαρακτηρισμό τους ως Σωμάτια Π(Sheth and Parker, 2003). Παρομοίως, η έλλειψη της εξωνουκλεάσης XRN1 βρέθηκε να προκαλεί τη συσσώρευση mrnas στα Σωμάτια Π σε κύτταρα θηλαστικών(cougot et al., 2004). Τα σωμάτια αυτά έχουν ομοιογενές σφαιρικό σχήμα με διάμετρο που, τουλάχιστον σε κύτταρα θηλαστικών, κυμαίνεται από 100 έως 300nm(Eystathioy et al., 2002; Yang et al., 2004) και αυξάνονται σε μέγεθος και αριθμό ως απόκριση σε στρες(kedersha et al., 2005; Teixeira et al., 2005; Wilczynska et al., 2005). Η δυναμική τους φύση, που ουσιαστικά αντικατοπτρίζει την αντιστρεπτή είσοδο και έξοδο 22

πρωτεϊνών και mrnas(bhattacharyya et al., 2006; Brengues et al., 2005; Coller and Parker, 2005; Kedersha et al., 2005; Teixeira et al., 2005; Wilczynska et al., 2005), υποδεικνύεται και από τις αλλαγές που παρατηρούνται στο μέγεθος και τον αριθμό τους κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, με την παρουσία τους να είναι έντονη προς το τέλος της φάσης S και κατά την G2, ενώ είναι χαρακτηριστική η απουσία τους σε μιτωτικά διαιρούμενα κύτταρα(eystathioy et al., 2002; Yang et al., 2004). 1.3.1. Σύσταση Ο καθορισμός των συστατικών των Σωματίων Π έχει προκύψει κυρίως από μελέτες συμπληρωματικότητας σε κύτταρα ανώτερων και κατώτερων ευκαρυωτών(bashkirov et al., 1997; Eystathioy et al., 2002; Eystathioy et al., 2003; Ingelfinger et al., 2002; van Dijk et al., 2002; van Dijk et al., 2003). Στα Σωμάτια Π εντοπίζονται ένζυμα απαραίτητα για όλα τα βήματα του γενικού μονοπατιού αποικοδόμισης mrna των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων μίας αποαδενυλάσης (CCR4), ενός ενζυμικού συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας (DCP1/DCP2, HELDS, hedc3, p54/rck)(fenger-gron et al., 2005; Yu et al., 2005) και μίας εξωνουκλεάσης (XRN1). Τα Σωμάτια Π περιέχουν επίσης το επταμερές Lsm1-7, που ρυθμίζει ποικίλες πλευρές της συγκρότησης ριβονουκλεοπρωτεϊνικών σωματίων(ingelfinger et al., 2002), καθώς και συστατικά του μονοπατιού της εξαρτώμενης από ανερμηνεύσιμα κωδικόνια αποδόμησης mrna (nonsense mediated decay) (π.χ. SMG-5, SMG-7 και UPF-1)(Fukuhara et al., 2005; Unterholzner and Izaurralde, 2004). Σε κύτταρα θηλαστικών έχουν εντοπιστεί επιπλέον συστατικά του μηχανισμού RNA παρεμπόδισης (π.χ. Argonaute και mirnas)(liu et al., 2005b; Sen and Blau, 2005), η προσδένουσα τον eif4e πρωτεΐνη 4-ET και η GW182, πρωτεΐνη απαραίτητη για την εξαρτώμενη από mirnas αποσιώπηση(jakymiw et al., 2005; Liu et al., 2005a; Rehwinkel et al., 2005). Η παρουσία του παράγοντα έναρξης της μετάφρασης eif4e, άλλα και της παρεμποδίζουσας τη μετάφραση RNA ελικάσης p54/rck4(cougot et al., 2004; Kedersha et al., 2005), υποδεικνύει τα Σωμάτια Π ως θέσεις τόσο μεταφραστικού ελέγχου όσο και αποικοδόμησης των mrnas. Τέλος, μέχρι τη στιγμή της συγγραφής της παρούσης εργασίας δεν έχει αναφερθεί η ύπαρξη ριβοσωμικών υπομονάδων στα Σωμάτια Π, ενισχύοντας τη θέση τους ως εστίες μεταφραστικής καταστολής και αποικοδόμησης των mrnas και προσδίδοντάς τους έναν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. 1.3.2. Το σύμπλοκο αφαίρεσης της καλύπτρας Ο μηχανισμός αφαίρεσης της καλύπτρας του 5 άκρου των mrnas διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη λειτουργία των Σωματίων Π. Σε κύτταρα ζύμης και θηλαστικών, η καταλυτική δράση του μηχανισμού επιτελείται από την καταλυτική υπομονάδα του ενζύμου αφαίρεσης της καλύπτρας DCP2 και τον συνενεργοποιητή DCP1(Cohen et al., 2005; Lykke-Andersen, 2002; Steiger et al., 2003; van Dijk et al., 2002; Wang et al., 2002) (Εικόνα 6). Επιπλέον, υπάρχουν και επιπρόσθετοι παράγοντες που καταλύουν την αφαίρεση της καλύπτρας, όπως ο DCPS, που υδρολύει την καλύπτρα στο μονοπάτι της 3-5 αποικοδόμησης των mrnas, το πυρηνικό ένζυμο X29 και ιικά ένζυμα(blanc et al., 1992; Ghosh et al., 2004; Parrish et al., 2007; Tang et al., 2005; Wang and Kiledjian, 2001), τα οποία όμως δεν 23

εμπλέκονται στη δομή και τη λειτουργία των Σωματίων Π και για το λόγο αυτό δε θα συζητηθούν περαιτέρω. Η αντίδραση αφαίρεσης της καλύπτρας που καταλύεται από το ένζυμο DCP2 παράγει ως προϊόντα 7-μονομεθυλο-διφωσφορική γουανοσίνη ( m7 GDP) (ή 2,2,7-τριμεθυλοδιφωσφορική γουανοσίνη m2,2,7 GDP) και ένα 5 μονοφωσφορυλιωμένο μόριο RNA. Η διαδικασία αυτή θεωρείται μη αναστρέψιμη και κατευθύνει το μόριο mrna προς αποικοδόμηση μέσω της δράσης της 5-3 εξωνουκλεάσης XRN1. Η πρωτεΐνη DCP2 περιέχει στο N-τελικό της άκρο ένα μοτίβο Nudix/MutT, συχνό σε πυροφωσφατάσες, η παρουσία του οποίου είναι απαραίτητη για την επιτέλεση της λειτουργίας του( Dunckley and Parker, 1999; Lykke-Andersen, 2002; van Dijk et al., 2002; Wang et al., 2002). Βιοχημικές μελέτες υποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη DCP2 της ζύμης, του C. elegans και του ανθρώπου φέρει την ικανότητα αφαίρεσης τόσο m7 G-, όσο και m2,2,7 G-καλυπτρών, αλλά εμφανίζει φτωχή ενεργότητα για μη μεθυλιωμένες G-καλύπτρες. Επιπλέον η πρωτεΐνη DCP2 αδυνατεί να αφαιρέσει επαρκώς την καλύπτρα μικρών RNAs ή RNAs υβριδοποιημένων με ένα ολιγονουκλεοτίδιο DNA στο 5 άκρο τους in vitro ( Cohen et al., 2005; Piccirillo et al., 2003; Steiger et al., 2003; van Dijk et al., 2002). Τα δεδομένα αυτά προτείνουν ένα μοντέλο κατά το οποίο η πρωτεΐνη DCP2 πρέπει να αλληλεπιδράσει με δύο τρόπους με ένα μόριο mrna προκειμένου να επιτελέσει επαρκώς τη λειτουργία του: πρώτον μέσω της m7 G- ή m2,2,7 G- καλύπτρας και δεύτερον μέσω του 5 άκρου του ίδιου του μορίου. Το μοντέλο αυτό μάλιστα έχει ισχυροποιηθεί από κρυσταλλογραφικές μελέτες( Deshmukh et al., 2008; She et al., 2008). Επομένως, η αλληλεπίδραση οποιουδήποτε μορίου με την καλύπτρα ή το ίδιο το 5 άκρο του mrna, όπως το σύμπλοκο eif4f, αναμένεται να προστατεύει την καλύπτρα από την αφαίρεση. Το γεγονός αυτό καθιστά τη μετάφραση και την αφαίρεση της καλύπτρας δύο ανταγωνιστικές διαδικασίες. Η αναστολή της μετάφρασης όμως δε συνεπάγεται αυτόματα την αφαίρεση της καλύπτρας, καθώς κάποια mrnas διατηρούνται σε μία μεταφραστικά ανενεργή κατάσταση, χωρίς να αποδομούνται(brengues et al., 2005; Teixeira et al., 2005). Η προώθηση ή όχι της αποικοδόμησης πιθανώς εξαρτάται από τη δράση ενισχυτών της λειτουργίας αφαίρεσης της καλύπτρας, οι οποίοι είτε αλληλεπιδρούν απευθείας με το σύμπλοκο eif4f, απομακρύνοντάς το, είτε αναστέλλουν την μετάφραση με τρόπο που ενισχύει την απομάκρυνση του συμπλόκου eif4f, χωρίς ευθεία αλληλεπίδραση με αυτό. Εναλλακτικά, η αφαίρεση της καλύπτρας μπορεί να προωθείται από cis-στοιχεία των μορίων mrna, τα οποία προσελκύουν τον υπεύθυνο μηχανισμό(franks and Lykke- Andersen, 2007). Από την άλλη πλευρά, η πρωτεΐνη DCP1 της ζύμης αποτελεί έναν σημαντικό συμπαράγοντα του ενζύμου DCP2(Beelman and Parker, 1994; Sakuno et al., 2004; Steiger et al., 2003). Σύμφωνα με κρυσταλλογραφικές μελέτες, η πρωτεΐνη DCP1 κατατάσσεται στην οικογένεια των EVH1/WH1 πρωτεϊνών(she et al., 2004). Το μοτίβο EVH1/WH1 διαμεσολαβεί αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών, αλληλεπιδρώντας συνήθως με πλούσιους σε προλίνες προσδέτες, προωθώντας με τον τρόπο αυτό τη συγκρότηση πρωτεϊνικών συμπλόκων και τη σύνδεση διαφορετικών πρωτεϊνών(ball et al., 2002). Η αναζήτηση συντηρημένων αμινοξέων μεταξύ των ομόλογων πρωτεϊνών διαφόρων ειδών έχει αποκαλύψει δύο σημαντικές περιοχές, οι οποίες είναι απαραίτητες για τη λειτουργία του συμπλόκου DCP1-DCP2 και εντοπίζονται προς το N-τελικό άκρο της πρωτεΐνης(she et al., 2004). Επιπροσθέτως, οι μελέτες αυτές αποκάλυψαν και ένα υδρόφοβο τμήμα, κοντά στις δύο συντηρημένες περιοχές, που σχηματίζεται από τις πλευρικές αλυσίδες των 24

αμινοξέων στη μία πλευρά του μορίου, το οποίο αποτελεί πιθανή θέση αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη DCP2. Τροποποιήσεις στο N-τελικό άκρο του ενζύμου DCP2, οι οποίες παρεμποδίζουν την αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη DCP1, έχουν ως αποτέλεσμα μειωμένη ενεργότητα αφαίρεσης της καλύπτρας τόσο in vitro όσο και in vivo(she et al., 2008). Η διέγερση της δράσης του ενζύμου DCP2 από τον συνενεργοποιητή DCP1 φαίνεται να οφείλεται σε μία μετατόπιση της δομής του από μία ανενεργή «ανοιχτή» κατάσταση σε μία ενεργή «κλειστή», η οποία προσανατολίζει το N-τελικό άκρο του ενζύμου προς το ενεργό του κέντρο, καθιστώντας το καταλυτικά ενεργό(deshmukh et al., 2008; She et al., 2008). Η διαδικασία αυτή πιθανώς να αποτελεί ένα σημαντικό κυτταρικό μηχανισμό ρύθμισης της δράσης του ενζύμου DCP2. Λόγω της φύσης των μοτίβων EVH1/WH1 που συχνά διαμεσολαβούν τη σύνδεση συνεργαζόμενων πρωτεϊνών, μέσω αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, η πρωτεΐνη DCP1 πιθανώς επιτελεί και μία πρόσθετη λειτουργία συνδέοντας την πρωτεΐνη DCP2 με άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες συμμετέχουν στον έλεγχο της λειτουργίας αφαίρεσης της καλύπτρας. Επιπλέον, τα αμινοξέα που διαμεσολαβούν την αλληλεπίδραση μεταξύ DCP1 και DCP2 στη ζύμη δεν εμφανίζονται συντηρημένα σε μεγάλο βαθμό σε μετάζωα(deshmukh et al., 2008; She et al., 2006; She et al., 2008), ενώ σε ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η αλληλεπίδραση μεταξύ DCP1 και DCP2 φαίνεται να διαμεσολαβείται από μία τρίτη πρωτεΐνη, παρούσα μόνο σε μετάζωα, την GE-1/HELDS/EDC-4, η οποία διεγείρει τόσο τη δράση του ενζύμου DCP2, όσο και την αλληλεπίδρασή του με την πρωτεΐνη DCP1(Fenger-Gron et al., 2005; Xu et al., 2006; Yu et al., 2005). Το αν η εν λόγω πρωτεΐνη αποτελεί βασικό συστατικό του συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας των μεταζώων ή έναν ακόμα ενισχυτή της λειτουργίας αυτής παραμένει αδιευκρίνιστο. Εικόνα 6: Το σύμπλοκο αφαίρεσης της καλύπτρας. Πάνω βέλη: ισοζύγιο συγκρότησης/αποσυγκρότησης του συμπλόκου. Η ενεργότητα αφαίρεσης της καλύπτρας του διμερούς Dcp1/Dcp2 (+) ενισχύεται (+++) με την παρουσία επιπλέον συστατικών του συμπλέγματος. Rck/p54: DEAD box ελικάση, Helds, Edc3: ενισχυτές της λειτουργίας αφαίρεσης της καλύπτρας. Δεν απεικονίζονται πιθανά ενδιάμεσα σύμπλοκα που περιέχουν υποσύνολα των πρωτεϊνών. Ανατύπωση από Bail, S. & Kiledjian, M. Nat Struct Mol Biol 13, 7-9 (2006). 25

1.3.3. Η εξωνουκλεάση XRN1 Οι 5-3 εξωριβουνοκλεάσες συγκροτούν μία συντηρημένη οικογένεια ενζύμων των ευκαρυωτών και διαδραματίζουν σημαντικούς ρόλους στη μεταγραφή, το μεταβολισμό του RNA και το μηχανισμό RNA παρεμπόδισης. Στους μύκητες και τα ζώα έχουν αναγνωριστεί δύο εξωριβονουκλεάσες, οι XRN1 και XRN2 (RAT1). Η εξωνουκλεάση XRN2 εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων και εμπλέκεται σε διαδικασίες όπως η μεταγραφή κάποιων γονιδίων(el Hage et al., 2008; Kaneko et al., 2007; Kawauchi et al., 2008; Kim et al., 2004; Luo et al., 2006; West et al., 2004) και η μεταφορά μορίων RNA από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα(amberg et al., 1992; Kenna et al., 1993). Η εξωνουκλεάση XRN1 από τη άλλη εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και συμμετέχει σε διαδικασίες όπως η αποικοδόμηση μορίων mrna που δε φέρουν καλύπτρα στο 5 -άκρο τους, ο μηχανισμός εξαρτώμενης από ανερμηνεύσιμα κωδικόνια αποδόμησης mrna και ο μηχανισμός RNA παρεμπόδισης, ενώ η λειτουργία της είναι απαραίτητη για την ορθή ανάπτυξη του οργανισμού(bousquet-antonelli et al., 2000; Coller and Parker, 2004; Gatfield and Izaurralde, 2004; Newbury, 2006; Parker and Song, 2004). Αποτελεί βασικό συστατικό του μηχανισμού 5-3 αποικοδόμησης των mrna μεταγράφων, δρώντας καταρροϊκά του συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας και επιτελώντας αυτή καθ αυτή τη διαδικασία της αποικοδόμησης(caponigro and Parker, 1996; Mitchell and Tollervey, 2000), ενώ ήταν το πρώτο συστατικό που βρέθηκε να εντοπίζεται σε διακριτά κυτταροπλασματικά κοκκία κυττάρων θηλαστικών(bashkirov et al., 1997), εισάγοντας την ιδέα ύπαρξης χωρικά διακριτών εστιών αποικοδόμησης των mrnas, οι οποίες μεταγενέστερα ονομάστηκαν Σωμάτια Π. Ο κεντρικός ρόλος που διαδραματίζει η εξωνουκλεάση XRN1 στη λειτουργία των Σωματίων Π αντικατοπτρίζεται στην παρατηρούμενη αύξησή τους σε μέγεθος και αριθμό της σε συνθήκες έλλειψής της(cougot et al., 2004). Στο νηματώδη C. elegans, η λειτουργία του ενζύμου έχει βρεθεί να είναι απαραίτητη και κατά την ανάπτυξη, συμμετέχοντας στη διαδικασία της μετακίνησης επιθηλιακών πεδίων προς την κοιλιακή πλευρά του εμβρύου(newbury and Woollard, 2004). Η κρυσταλλογραφική δομή της πρωτεΐνης XRN1 της ζύμης αποκάλυψε την ύπαρξη ενός αυστηρά συντηρημένου ενεργού κέντρου και τεσσάρων επικρατειών, οι οποίες είναι σημαντικές για την καταλυτική ενεργότητα του ενζύμου, αν και εντοπίζονται μακριά από το ενεργό του κέντρο και εμφανίζουν χαμηλό βαθμό συντήρησης μεταξύ των ειδών. Οι επικράτειες αυτές πιθανώς συγκροτούν μια πλατφόρμα για την επιστράτευση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την XRN1 κατά την επιτέλεση της λειτουργίας της στον μεταβολισμό του RNA(Chang et al., 2011; Coller and Parker, 2004). 1.3.4. Λειτουργία 1.3.4.1. Αποικοδόμηση mrna Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η αποικοδόμηση του κύριου όγκου των mrnas συμβαίνει μέσω δύο εναλλακτικών μονοπατιών (Εικόνα 7). Το πρώτο βήμα, το οποίο καθορίζει το ρυθμό και στα δύο αυτά μονοπάτια είναι η αφαίρεση της πολυ-α ουράς μέσω της δράσης αποαδενυλασών(parker and Song, 2004). Ακολούθως, τα mrnas δύναται να υποστούν 3-5 εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση, που καταλύεται από το εξώσωμα(houseley et al., 2006; 26

Parker and Song, 2004; Wilusz and Wilusz, 2004). Εναλλακτικά, μετά την αποαδενυλίωση, ακολουθεί η απομάκρυνση της καλύπτρας του 5 άκρου τους, μέσω της δράσης του ενζυμικού συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας, καθιστώντας τα μόρια ευαίσθητα στην 5-3 αποικοδόμησή τους από την εξωνουκλεάση XRN1. Η αφαίρεση της καλύπτρας αποτελεί μία μη αναστρέψιμη και για το λόγο αυτό αυστηρώς ρυθμιζόμενη διαδικασία, η οποία απαιτεί τη δράση πολλών πρωτεϊνών, οι οποίες είναι συνολικά γνωστές ως συνενεργοποιητές της αφαίρεσης της καλύπτρας. Αν και οι συνεργοποιητές εμφανίζονται αυστηρώς συντηρημένοι κατά την εξέλιξη, η ακριβής λειτουργία πολλών εξ αυτών παραμένει άγνωστη. Όλες οι πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μονοπάτι της 5-3 αποικοδόμησης έχουν βρεθεί να εντοπίζονται στα Σωμάτια Π(Andrei et al., 2005; Bashkirov et al., 1997; Behm-Ansmant et al., 2006a; Bloch et al., 2006; Brengues et al., 2005; Chu and Rana, 2006; Coller and Parker, 2005; Cougot et al., 2004; Eystathioy et al., 2002; Eystathioy et al., 2003; Fenger-Gron et al., 2005; Ferraiuolo et al., 2005; Ingelfinger et al., 2002; Kedersha et al., 2005; Kshirsagar and Parker, 2004; Lykke-Andersen, 2002; Sheth and Parker, 2003; Sheth and Parker, 2006; Teixeira et al., 2005; van Dijk et al., 2002; Yang et al., 2006; Yang et al., 2004; Yu et al., 2005), σε αντίθεση με το εξώσωμα, υποδεικνύοντας ένα βαθμό διαμερισματοποίησης των μονοπατιών αποικοδόμησης του mrna στα πλαίσια του κυτταροπλάσματος. Η παρουσία των πρωτεϊνών αυτών στα Σωμάτια Π αποτελεί την πρώτη ένδειξη για τη λειτουργία τους ως θέσεις αποικοδόμησης των mrnas. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από μία σειρά παρατηρήσεων. Αρχικά, η παρεμπόδιση της μεταγραφής μέσω της έκθεσης των κυττάρων σε ακτινομυκίνη D ή ριβονουκλεάση A, οδηγεί στην απώλεια των Σωματίων Π, φωτογραφίζοντας το mrna ως το περιοριστικό παράγοντα για τη συγκρότηση τους(cougot et al., 2004; Teixeira et al., 2005). Επιπλέον, η έλλειψη αποαδενυλάσης έχει επίσης ως αποτέλεσμα την απώλεια των Σωματίων Π(Andrei et al., 2005; Sheth and Parker, 2003), σε αντίθεση με την έλλειψη της εξωνουκλεάσης XRN1 ή της υπομονάδας του συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας DCP1, που οδηγούν σε αύξηση του μεγέθους και του αριθμού τους(andrei et al., 2005; Cougot et al., 2004; Sheth and Parker, 2003; Teixeira et al., 2005). Τέλος, στα Σωμάτια Π έχουν εντοπιστεί και ενδιάμεσα της αποικοδόμησης των mrnas(cougot et al., 2004; Sheth and Parker, 2003; Teixeira et al., 2005). Οι παραπάνω παρατηρήσεις καθιστούν ξεκάθαρη τη δυνατότητα αποικοδόμησης mrnas στο εσωτερικό των Σωματίων Π. Τα συστατικά που τα συγκροτούν όμως εντοπίζονται στην πλειοψηφία τους και διάχυτα στο κυτταρόπλασμα(bashkirov et al., 1997; Cougot et al., 2004; Eystathioy et al., 2002; Eystathioy et al., 2003; Ingelfinger et al., 2002; Lykke- Andersen, 2002; Sheth and Parker, 2003; van Dijk et al., 2002; Yang et al., 2006; Yu et al., 2005), ενώ έχει παρατηρηθεί και η δυναμική ανταλλαγή τους μεταξύ των σωματίων και της κυτταροπλασματικής δεξαμενής(kedersha et al., 2005), γεννώντας απορίες σχετικά με τη δυνατότητα 5-3 αποικοδόμησης των mrnas και έξω από τα πλαίσια των σωματίων αυτών. Ένα τέτοιο ενδεχόμενο είναι πολύ πιθανό και ίσως μάλιστα η διαδικασία της αποικοδόμησης να ξεκινά από το κυτταρόπλασμα, οδηγώντας στη συγκρότηση των Σωματίων Π, μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ ενδιαμέσων της αποικοδόμησης των mrnas, ενζύμων αποικοδόμησης και συμπαραγόντων. Η συνεστίαση αποικοδομούμενων μεταγράφων και ενζύμων αποικοδόμησης στην περίπτωση αυτή θα εξυπηρετούσε την αύξηση του ρυθμού αποικοδόμησης και τη μείωση του πιθανού ανταγωνισμού μεταξύ των 27

αποικοδομούμενων τμημάτων RNA και λειτουργικών mrna για περιορισμένες πρωτεΐνες του κυττάρου εμπλεκόμενες στη ρύθμιση του mrna. Εικόνα 7: Ευκαρυωτικά μονοπάτια αποικοδόμησης mrna. Ανατύπωση από Parker, R. & Song, H. Nat Struct Mol Biol 11, 121-7 (2004) 1.3.4.2. Επιτήρηση mrna Κατά την εξέλιξη, τα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν εξοπλιστεί με μηχανισμούς επιτήρησης και ελέγχου της ποιότητας των mrnas, προκειμένου να διασφαλίσουν τη μετάφραση μόνο πλήρως επεξεργασμένων μορίων, τα οποία δεν περιέχουν λάθη(fasken and Corbett, 2005). Ο σημαντικότερος εξ αυτών είναι ο μηχανισμός της εξαρτώμενης από ανερμηνεύσιμα κωδικόνια αποδόμησης mrna (non-sense mediated decay), ο οποίος αναγνωρίζει και αποδομεί mrnas που περιέχουν πρόωρα κωδικόνια λήξης, περιορίζοντας έτσι τη σύνθεση δυνητικά τοξικών πεπτιδικών τμημάτων. Η επαγωγή του μονοπατιού από ένα πρόωρο κωδικόνιο λήξης οδηγεί στο σχηματισμό του αποκαλούμενου συμπλόκου επιτήρησης πάνω στο mrna(amrani et al., 2006; Conti and Izaurralde, 2005; Lejeune and Maquat, 2005). Αν και ο τρόπος συγκρότησης του συμπλόκου δεν είναι ξεκάθαρος, ο σχηματισμός του είναι γνωστό ότι προκαλεί την επιστράτευση ενζύμων που εμπλέκονται στο γενικό μηχανισμό αποδόμησης mrna, συνδέοντας έτσι την πρόωρη λήξη της μετάφρασης με την ταχεία αποδόμηση του ελαττωματικού μεταγράφου. Στον S. cerevisiae το σύμπλοκο επιτήρησης επιστρατεύει ένζυμα αφαίρεσης της καλύπτρας και 5-3 αποικοδόμησης, αλλά μπορεί επίσης να επιταχύνει την 3-5 αποικοδόμηση, μέσω της δράσης του εξωσώματος(cao and Parker, 2003; Mitchell and Tollervey, 2003). Ένα παρόμοιο μονοπάτι εξαρτώμενης από ανερμηνεύσιμα κωδικόνια αποδόμησης mrna πιστεύεται πως λειτουργεί και στους ανθρώπους(chen and Shyu, 2003; Couttet and Grange, 2004; Lejeune et al., 2003). Αντιθέτως, στη D. melanogaster η διαδικασία της εξαρτώμενης από ανερμηνεύσιμα κωδικόνια αποδόμησης ξεκινά με το ενδονουκλεολυτικό κόψιμο κοντά στο πρόωρο κωδικόνιο λήξης και τα τμήματα RNA που προκύπτουν αποδομούνται από τα 28

νεοσχηματισμένα 5 και 3 άκρα τους, μέσω της δράσης της XRN1 (Pacman) και του εξωσώματος αντίστοιχα(fenger-gron et al., 2005). Η συμμετοχή των ενζύμων του γενικού μηχανισμού αποδόμησης των mrnas στο μονοπάτι εξαρτώμενης από ανερμηνεύσιμα κωδικόνια αποδόμησης mrna καθιστά τα Σωμάτια Π πιθανούς τόπους δράσης του εν λόγω μηχανισμού επιτήρησης. Δεδομένης όμως της προαναφερθείσας ποικιλομορφίας, αλλά και εγγενών διαφορών στη λειτουργία του μονοπατιού μεταξύ των οργανισμών(fukuhara et al., 2005; Gatfield et al., 2003; Unterholzner and Izaurralde, 2004), η εξαγωγή ενός γενικού συμπεράσματος καθίσταται μάλλον αδύνατη. 1.3.4.3. Αποσιώπηση Γονιδίων Τα sirnas και mirnas αποτελούν δύο τάξεις μικρών RNAs εμπλεκόμενων στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε επίπεδο μεταγενέστερο της μεταγραφής(bartel, 2004; Filipowicz, 2005). Αν και διαφέρουν ως προς το μηχανισμό βιογένεσής τους, οι ρυθμιστικές ιδιότητες και των δύο εξαρτώνται από τη λειτουργία αντιπροσώπων της συντηρημένης οικογένειας πρωτεϊνών Argonaute, με τις οποίες συσχετίζονται ως μέλη του συμπλόκου RISC (RNA- Induced Silencing Complex)(Bartel, 2004; Filipowicz, 2005). Οι πρωτεΐνες Argonaute προωθούν την αποδόμηση ή/και τη μεταφραστική καταστολή των mrnas που εμφανίζουν πλήρη ή μερική συμπληρωματικότητα με τα εκάστοτε εμπλεκόμενα mirnas ή sirnas(bartel, 2004; Filipowicz, 2005). Τα sirnas εμφανίζουν πλήρη συμπληρωματικότητα με τους στόχους τους, και (όπως και τα φυτικά mirnas) καθοδηγούν της πρωτεΐνες Argonaute να κόψουν το mrna στόχο στην συμπληρωματική περιοχή. Ακολούθως, τα προκύπτοντα τμήματα RNA οδηγούνται στο γενικό μηχανισμό αποδόμησης mrna(orban and Izaurralde, 2005). Αντιθέτως, η πλειοψηφία των ζωικών mirnas εμφανίζει μερική συμπληρωματικότητα με τους στόχους της και προκαλεί την αποσιώπηση των αντίστοιχων γονιδίων μέσω δύο, τουλάχιστον, ξεχωριστών μηχανισμών: καταστέλλοντας τη μετάφραση ή/και προωθώντας την αποδόμηση του mrna(behm-ansmant et al., 2006a; Behm-Ansmant et al., 2006b). Στις περισσότερες περιπτώσεις όμως, η αποδόμηση των μεταγράφων δεν προκύπτει από ενδονουκλεολυτικό κόψιμο μέσω της δράσης των πρωτεϊνών Argonaute, αλλά κατευθύνοντάς τα προς το γενικό μηχανισμό αποδόμησης mrna(bagga et al., 2005; Behm-Ansmant et al., 2006a; Behm-Ansmant et al., 2006b; Giraldez et al., 2006; Wu et al., 2006). Η ταχεία αποικοδόμηση των στόχων των mirnas απαιτεί τη δράση των πρωτεϊνών Argonaute, αλλά και συστατικών των Σωματίων Π, όπως η πρωτεΐνη GW182, η αποαδενυλάση CCR4, τα ένζυμα αφαίρεσης της καλύπτρας DCP1/DCP2 και η εξωνουκλεάση XRN1(Bagga et al., 2005; Behm-Ansmant et al., 2006a; Behm-Ansmant et al., 2006b). Επιπλέον, οι πρωτεΐνες Argonaute, mirnas και στόχοι αυτών έχουν εντοπιστεί στα Σωμάτια Π(Bhattacharyya et al., 2006; Liu et al., 2005b; Pauley et al., 2006; Pillai et al., 2005; Sen and Blau, 2005), παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις για την εμπλοκή των εν λόγω σωματίων στην αποσιώπηση μέσω RNA. Παρά την ισχυρά τεκμηριωμένη σύνδεση μεταξύ της αποσιώπησης μέσω RNA και των Σωματίων Π όμως, η ακεραιότητα των σωματίων αυτών δε φαίνεται να αποτελεί προϋπόθεση για τη σωστή λειτουργία του μηχανισμού(chu and Rana, 2006; Jakymiw et al., 2005; Liu et al., 2005a; Rehwinkel et al., 2005), υποδεικνύοντας πως η συσσώρευση των πρωτεϊνών Argonaute, των sirnas, των mirnas και των mrna στόχων τους στα Σωμάτια Π είναι μάλλον η συνέπεια και όχι η αιτία της αποσιώπησης. 29

1.3.4.4. Μεταφραστική καταστολή Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα ζωικά mirnas δύνανται να προκαλέσουν καταστολή της μετάφρασης χωρίς παράλληλη μείωση των επιπέδων mrna, δηλαδή ανεξάρτητα από την αποδόμηση του μετάγραφου(valencia-sanchez et al., 2006). Αν και ο τρόπος με τον οποίο τα mirnas προκαλούν μία τέτοιου τύπου καταστολή δεν είναι απόλυτα κατανοητός, πολλά συστατικά των Σωματίων Π έχουν εμπλακεί σε αυτή τη διαδικασία(behm-ansmant et al., 2006a; Behm-Ansmant et al., 2006b; Chu and Rana, 2006; Liu et al., 2005a). Η εμπλοκή των Σωματίων Π τόσο στην αποδόμηση, όσο και στη μεταφραστική καταστολή μέσω mirna υποδηλώνει μία σύνδεση μεταξύ των δύο διαδικασιών. Το ποσοστό της συμβολής της κάθε διαδικασίας στην τελική αποσιώπηση φαίνεται να διαφέρει για κάθε μετάγραφο και πιθανώς επηρεάζεται από τις πρωτεΐνες που συσχετίζονται με το κάθε mrna(behm- Ansmant et al., 2006b). Πέρα από το ρόλο τους στη μεταφραστική καταστολή μέσω mirnas όμως, συστατικά των Σωματίων Π εμπλέκονται και στην καταστολή της μετάφρασης που παρατηρείται κάτω από διάφορες καταστάσεις της φυσιολογίας ενός οργανισμού. Στον S. cerevisiae, η στέρηση γλυκόζης οδηγεί σε ταχεία απώλεια των πολυσωμάτων, αύξηση του μεγέθους και του αριθμού των Σωματίων Π και συσσώρευση κατασταλμένων mrnas σε αυτά(brengues et al., 2005; Coller and Parker, 2005; Teixeira et al., 2005). Επιπλέον, πρωτεΐνες με γνωστό ρόλο στη μεταφραστική καταστολή, όπως οι CPEB και eif-4e-t, εντοπίζονται στα Σωμάτια Π σε κύτταρα θηλαστικών(andrei et al., 2005; Chu and Rana, 2006; Ferraiuolo et al., 2005; Kedersha et al., 2005; Wilczynska et al., 2005). Η σχέση μεταξύ μεταφραστικής καταστολής και σχηματισμού Σωματίων Π υπογραμμίζεται από την παρατήρηση ότι η σταθεροποίηση των mrnas στα πολυσώματα μέσω της χρήσης κυκλοεξιμιδίου (που παρεμποδίζει την επιμήκυνση κατά τη μετάφραση) οδηγεί σε απώλεια των Σωματίων Π(Anderson and Kedersha, 2006; Andrei et al., 2005; Brengues et al., 2005; Cougot et al., 2004; Sheth and Parker, 2003; Teixeira et al., 2005), ενώ αντίθετα, ουσίες ή μεταλλαγές που παρεμποδίζουν την έναρξη της μετάφρασης προωθούν το σχηματισμό Σωματίων Π(Anderson and Kedersha, 2006; Teixeira et al., 2005; Wilczynska et al., 2005). Η έξοδος από τη μετάφραση αποτελεί επομένως προϋπόθεση για την είσοδο ενός mrna στα Σωμάτια Π, υποδεικνύοντας και πάλι πως ο σχηματισμός τους και η ύπαρξή τους εξαρτάται από την παρουσία μη μεταφραζόμενων mrnas. Η απόλυτη εξάρτηση του σχηματισμού των Σωματίων Π από την παρουσία μη μεταφραζόμενων mrnas θα μπορούσε να οφείλεται στην παρουσίαση επιπλέον επιφανειών αλληλεπίδρασης ή στην αύξηση της συγγένειας μεταξύ των συστατικών τους λόγω της πρόσδεσης μορίων RNA. 1.3.5. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Σωματίων Π και άλλων ριβονουκλεοπρωτεϊνικών κοκκίων Πέρα από τα Σωμάτια Π, επιπλέον ριβονουκλεοπωτεϊνικά κοκκία, που περιέχουν μεταγραφικά κατασταλμένα mrnas, έχουν παρατηρηθεί σε κύτταρα ανώτερων ευκαρυωτών, υπό συνθήκες στρες, κατά την ωογένεση, αλλά και σε νευρικά κύτταρα(anderson and Kedersha, 2006; St Johnston, 2005). Τα κοκκία αυτά μοιράζονται με τα Σωμάτια Π μία κοινή λειτουργία, αυτή της αποθήκευσης μη μεταφραζόμενων mrnas. 30

1.3.5.1. Κοκκία Στρες Στα κύτταρα των θηλαστικών, κάτω από συνθήκες στρες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, το θερμικό σοκ και το οξειδωτικό στρες, παρατηρείται η παρεμπόδιση της μετάφραση του κύριου όγκου των mrnas, τα οποία συγκεντρώνονται σε κυτταροπλασματικές δομές, γνωστές ως Κοκκία Στρες (Stress Granules)(Anderson and Kedersha, 2006; Kedersha et al., 2005; Kedersha et al., 1999; Kimball et al., 2003; St Johnston, 2005; Wilczynska et al., 2005). Η διαδικασία αυτή είναι αναστρέψιμη, καθώς μετά από την αποκατάσταση των περιβαλλοντικών συνθηκών τα κοκκία αυτά αποδομούνται. Η κύρια ιδιότητα που διαχωρίζει τα Κοκκία Στρες από τα Σωμάτια Π είναι η παρουσία σε αυτά παραγόντων έναρξης της μετάφρασης και 40S ριβοσωμικών υπομονάδων(anderson and Kedersha, 2006; Kedersha et al., 2005; Kedersha et al., 1999; Kimball et al., 2003; St Johnston, 2005; Wilczynska et al., 2005). Παρά τις διαφορές όμως μεταξύ των δύο τύπων κοκκίων, έχει παρατηρηθεί μια δυναμική σύνδεση μεταξύ τους, καθώς μοιράζονται κάποια κοινά συστατικά και είδη mrnas(anderson and Kedersha, 2006; Kedersha et al., 2005; Wilczynska et al., 2005), ενώ Σωμάτια Π και Κοκκία Στρες έχουν βρεθεί να αλληλεπιδρούν απευθείας και να συντήκονται σε ζωντανά κύτταρα(kedersha et al., 2005; Wilczynska et al., 2005). Επιπλέον, τα Κοκκία Στρες συμπεριφέρονται όπως και τα Σωμάτια Π κάτω από συνθήκες που σταθεροποιούν τα πολυσώματα, όπου αποδομούνται, αλλά και υπό συνθήκες που προκαλούν την απελευθέρωση των mrnas από τα πολυσώματα, όπου αυξάνουν σε μέγεθος και αριθμό(anderson and Kedersha, 2006; Andrei et al., 2005; Brengues et al., 2005; Cougot et al., 2004; Kedersha et al., 2005; Sheth and Parker, 2003; Teixeira et al., 2005; Wilczynska et al., 2005). Η παρουσία παραγόντων έναρξης της μετάφρασης στα Κοκκία Στρες, αλλά όχι στα Σωμάτια Π, καθιστά πιθανή την περίπτωση τα mrnas που απελευθερώνονται από τα πολυσώματα κάτω από συνθήκες στρες να κατευθύνονται αρχικά στα Κοκκία Στρες και κατά την ανάνηψη του κυττάρου, τα mrnas αυτά είτε να επανατροφοδοτούνται στη μεταφραστική μηχανή είτε να στρατολογούν πρωτεΐνες που υπαγορεύουν τη μεταφορά τους σε Σωμάτια Π(Kedersha et al., 2005) (Εικόνα 8). 31

Εικόνα 8: Υποθετικό μοντέλο της σχέσης μεταξύ Κοκκίων Στρες και Σωματίων Π. Πρωτεΐνες που απαντώνται μόνο στα Κοκκία Στρες απεικονίζονται με κίτρινο, πρωτεΐνες που απαντώνται και στα Κοκκία Στρες και στα Σωμάτια Π με πράσινο, ενώ πρωτεΐνες που απαντώνται μόνο στα Σωμάτια Π με μπλε. Ανατύπωση από Kedersha, N. et al. J Cell Biol 169, 871-84 (2005). 1.3.5.2. mrnp κοκκία γαμετικών κυττάρων Κατά τη διαδικασία της ωογένεσης, πολλά μεταφραστικά κατασταλμένα mrnas μεταφέρονται σε αυτή την κατάσταση σε διάφορες περιοχές του ωοκυττάρου, σχηματίζοντας ριβονουκλεοπρωτεϊνικά κοκκία, που εξυπηρετούν διάφορες λειτουργίες. Κάποια από αυτά π.χ. μεταφέρονται στον οπίσθιο πόλο του κυττάρου, όπου και σχηματίζουν πολικά σωμάτια, σημαντικά για τον καθορισμό της γαμετικής σειράς σε πολλούς οργανισμούς(anderson and Kedersha, 2006; St Johnston, 2005). Τα κοκκία αυτά περιέχουν βασικά συστατικά των Σωματίων Π, που συμμετέχουν στην αποδόμηση, τη μεταφραστική καταστολή και τη μεταφορά των mrnas(anderson and Kedersha, 2006; Boag et al., 2005; Chuma et al., 2009; Gallo et al., 2008), υποδεικνύοντας πως τα γαμετικά κοκκία πιθανώς αποτελούν ανάλογες δομές με τα Σωμάτια Π των σωματικών κυττάρων. Η μεταφορά μητρικών mrnas συζευγμένων με έναν μερικώς δομημένο, αλλά ανενεργό μηχανισμό αποδόμησης πιθανώς διευκολύνει την αποδόμηση των mrnas αυτών κατά τη μετάβαση σε ζυγωτό(lin et al., 2006). 1.3.5.3. Νευρικά Κοκκία Τα νευρικά κύτταρα εμφανίζουν υψηλό βαθμό πολικότητας, η εγκαθίδρυση της οποίας απαιτεί τη μεταφορά μορίων mrna σε συγκεκριμένες περιοχές του κυττάρου, όπως οι νευράξονες και οι δενδρίτες(st Johnston, 2005). Κατά τη μεταφορά τα mrnas αυτά παραμένουν μεταγραφικώς κατασταλμένα και συγκροτούν ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια, τα οποία, σε αντίθεση με τα Σωμάτια Π, περιέχουν μικρές και μεγάλες ριβοσωμικές υπομονάδες(anderson and Kedersha, 2006; Krichevsky and Kosik, 2001; St Johnston, 2005). Πέρα από αυτή τη βασική διαφορά, τα νευρικά κοκκία μεταφοράς 32

μοιράζονται πολλά κοινά δομικά συστατικά με τα Σωμάτια Π και αλληλεπιδρούν με αυτά(anderson and Kedersha, 2006; Cougot et al., 2008; Zeitelhofer et al., 2008). Μάλιστα, μετά από διέγερση των συνάψεων δενδρίτων νευρώνων θηλαστικών με γλουταμικό οξύ, περίπου το 60% των νευρικών Σωματίων Π αποδομούνται, υποδεικνύοντας ότι η διέγερση προκαλεί τη μετάφραση των mrnas που βρίσκονται αποθηκευμένα σε αυτά(zeitelhofer et al., 2008). Οι παρατηρήσεις αυτές εγείρουν την πιθανότητα τα μεταφραστικά κατασταλμένα mrnas που μεταφέρονται στους δενδρίτες από νευρικά κοκκία μεταφοράς να αποθηκεύονται σε νευρικά Σωμάτια Π, απ όπου απελευθερώνονται και μεταφράζονται με την ενεργοποίηση των συνάψεων. 1.3.6. Σωμάτια Π στον C. elegans Η πλειοψηφία των δεδομένων που αφορούν στα Σωμάτια Π έχει προκύψει από μελέτες σε κύτταρα ζύμης ή σε καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων. Οι περιορισμένες μελέτες που έχουν γίνει στο νηματώδη C. elegans έχουν καταφέρει να αναγνωρίσουν ομόλογα των παραγόντων μεταβολισμού του mrna που εντοπίζονται στα Σωμάτια Π, αλλά η λειτουργία τους έχει μελετηθεί μόνο κατά την ωογένεση και την εμβρυογένεση(lall et al., 2005; Navarro et al., 2001; Newbury and Woollard, 2004; Noble et al., 2008). Η παρουσία τους κατά τις διαδικασίες αυτές είναι έντονη σε κυτταροπλασματικά σωμάτια γαμετικών κυττάρων (ή σε πρόγονα κύτταρα αυτών), γνωστά ως Κοκκία Π (P-granules), τα οποία αποτελούν συσσωματώματα πρωτεϊνών και μητρικών mrnas των οποίων η μετάφραση ελέγχεται αναπτυξιακά(schisa et al., 2001). Όλα τα αναγνωρισμένα πρωτεϊνικά συστατικά των Κοκκίων Π σχετίζονται με το μεταβολισμό του mrna, την αποσταθεροποίηση και αποδόμηση ή την προστασία και αποθήκευσή του(strome, 2005). Κάποια από αυτά εντοπίζονται στα Κοκκία Π καθ όλη τη διάρκεια ζωής του νηματώδους, ενώ άλλα εμφανίζουν μια πιο παροδική σχέση με αυτά σε συγκεκριμένα στάδια του κύκλου ζωής. Πριν από τη γονιμοποίηση και αμέσως μετά από αυτή περίπου 200 Κοκκία Π βρίσκονται διασκορπισμένα στο κυτταρόπλασμα. Το ζυγοτό (P 0 ) διαιρείται σε ένα μεγαλύτερο σωματικό βλαστομερές (AB) και ένα μικρότερο γαμετικό βλαστομερές (P 1 ). Το βλαστομερές P 1 και τα θυγατρικά του P 2 και P 3 συνεχίζουν να διαιρούνται ασύμμετρα, μέχρι τη γένεση του P 4, που αποτελεί το κύτταρο-υδριτή της γαμετικής σειράς στο στάδιο των 16/24 κυττάρων. Σε κάθε ασύμμετρη διαίρεση τα Κοκκία Π συγκεντρώνονται και μεταβιβάζονται στο επόμενο γαμετικό βλαστομερές έτσι ώστε σε κάθε στάδιο η πλειοψηφία αυτών να εντοπίζεται σε ένα μόνο κύτταρο( Strome, 2005). Ο μικρός αριθμός των Κοκκίων Π που παραμένει στα σωματικά βλαστομερή αποδομείται(derenzo et al., 2003; Spike and Strome, 2003; Zhang et al., 2009). Παράλληλα, η κατανομή τους αλλάζει καθώς αρχίζουν να προσδένονται στην περιφέρεια του πυρήνα, με αποτέλεσμα ο πυρήνας P4 να είναι περικυκλωμένος από ογκώδη Κοκκία Π τα οποία παραμένουν προσδεμένα με τον πυρηνικό φάκελο μέχρι την ωρίμανση των γαμετών(gruidl et al., 1996). Τα μητρικά mrnas διατηρούνται επίσης στα γαμετικά βλαστομερή, με τη αποδόμησή τους να ξεκινά στο στάδιο των 4 κυττάρων μόνο στα σωματικά βλαστομερή(seydoux and Fire, 1994). Πέρα από την παρουσία τους στα Κοκκία Π κατά την εμβρυογένεση, κάποια από τα συστατικά τους (π.χ. DCAP-1, DCAP-2) εντοπίζονται και σε άλλα, μικρότερα κοκκία, πολυπληθέστερα στα σωματικά βλαστομερή(audhya et al., 2005; Boag et al., 2005; Lall et al., 2005; Navarro et al., 2001; Squirrell et al., 2006), τα οποία αντιστοιχούν σε Σωμάτια 33

Π(Gallo et al., 2008). Τα κοκκία αυτά κατανέμονται ισομερώς κατά τις πρώτες κυτταρικές διαιρέσεις, αλλά στρατολογούν διαφορετικά συστατικά στα σωματικά έναντι των γαμετικών βλαστομερών. Η στρατολόγηση των συστατικών αυτών συμπίπτει χρονικά με την αποδόμηση των μητρικών mrnas στα σωματικά βλαστομερή και πιθανώς εμπλέκεται σε αυτή, αντικατοπτρίζοντας διαφορές στη λειτουργία τους μεταξύ σωματικών και γαμετικών προγονικών κυττάρων(gallo et al., 2008). Αν και Κοκκία Π και Σωμάτια Π μοιράζονται κάποια κοινά πρωτεϊνικά συστατικά, αποτελούν δύο ξεκάθαρα διακριτά και αλληλεπιδρώντα ήδη ριβονουκλεοπρωτεϊνικών κοκκίων των αναπτυσσόμενων ωοκυττάρων και των νεαρών εμβρύων με τη λειτουργία τους να εμπλέκεται στον καθορισμό και τη διαφοροποίηση των γαμετικών κυττάρων(audhya et al., 2005; Kawasaki et al., 1998; Lall et al., 2005; Squirrell et al., 2006; Updike and Strome, 2010).H κατανομή και η λειτουργία των Σωματίων Π στα σωματικά κύτταρα ενήλικων νηματωδών, η συμπεριφορά τους κατά τη γήρανση και ο ρόλος τους στην επιβίωση και τη μακροβιότητα του οργανισμού δεν είναι γνωστά. Εικόνα 9: Σχηματική αναπαράσταση εμβρύων 1, 2, 4 και 28 κυττάρων. Τα κοκκία Π αναπαριστώνται ως κόκκινες τελείες. Ανατύπωση από Gallo, C.M., Munro, E., Rasoloson, D., Merritt, C. & Seydoux, G. Dev Biol 323, 76-87 (2008). Πίνακας 1. Αναγνωρισμένοι παράγοντες μεταβολισμού mrna του C. elegans. Όνομα Λειτουργία Ομόλογο ζύμης/ανθρώπου DCAP-1 Ρυθμιστική υπομονάδα του ενζύμου αφαίρεσης της καλύπτρας Dcp1p/DCP1 DCAP-2 Καταλυτική υπομονάδα του ενζύμου αφαίρεσης της καλύπτρας Dcp2p/DCP2 XRN-1 5-3 εξωριβονουκλεάση Xrn-1p/XRN1 CGH-1 Συνενεργοποιητής αφαίρεσης καλύπτρας/μεταφραστικός Dhh1p/RCK(p54) καταστολέας CAR-1 Μεταφραστικός καταστολέας Scd6p/RAP55 PATR-1 Συνενεργοποιητής αφαίρεσης καλύπτρας/μεταφραστικός Pat1p καταστολέας EDC-3 Συνενεργοποιητής αφαίρεσης καλύπτρας Edc3p/EDC3 AIN-1 Διεμεσολαβούμενη από mirna αποσιώπηση γονιδίων GW182 AIN-2 Διεμεσολαβούμενη από mirna αποσιώπηση γονιδίων GW182 LSM-1 Ομοιάζουσα με Sm πρωτεΐνη Lsm1p/LSM1 Τα γονίδια που επιλέχθηκαν προς μελέτη στην παρούσα εργασία αποτελούν ομόλογα γονιδίων της ζύμης και των θηλαστικών στο νηματώδη C. elegans, που κωδικοποιούν για 34

βασικά συστατικά των Σωματίων Π, υπεύθυνα για την επιτέλεση ουσιωδών λειτουργιών τους. Συγκεκριμένα πρόκειται για τις δύο υπομονάδες του συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας, που κωδικοποιούνται από τα γονίδια dcap-1 και dcap-2 και την κύρια 5-3 εξωριβονουκλεάση που εντοπίζεται στα Σωμάτια Π και κωδικοποιείται από το γονίδιο xrn- 1. Το γονίδιο dcap-1 κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη μεγέθους 332 αμινοξέων, ορθόλογη της πρωτεΐνης DCP1p της ζύμης και της ανθρώπινης DCP1A ενώ το γονίδιο dcap-2 του C. elegans κωδικοποιεί για δύο ισομορφές (770 και 786 αμινοξέων) ορθόλογες της πρωτεΐνης DCP2. H απομονωμένη πρωτεΐνη DCAP-1 του νηματώδους δεν διαθέτει ενεργότητα αφαίρεσης της καλύπτρας in vitro, σε αντίθεση με την πρωτεΐνη DCΑP-2 που εμφανίζει ενεργότητα αφαίρεσης τόσο m 7 GpppG-, όσο και m 2,2,7 GpppG m - καλύπτρων mrna in vitro( Cohen et al., 2005). Οι δύο πρωτεΐνες αποτελούν τις βασικές υπομονάδες του ενζύμου αφαίρεσης της καλύπτρας και η ταυτόχρονη απενεργοποίηση των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 μέσω RNAi οδηγεί, έστω και σε μικρό βαθμό, σε εμβρυική θνησιμότητα υποδεικνύοντας τη συνεργατική τους λειτουργία(lall et al., 2005). Ο ανταγωνισμός μεταξύ του συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας και του παράγοντα έναρξης της μετάφρασης eif4e για την πρόσδεση της καλύπτρας του 5 άκρου των mrnas, που πιθανώς καθορίζει αν ένα μόριο θα μεταφραστεί ή θα αποδομηθεί, καθιστά της πρωτεΐνες DCAP-1 και DCAP-2 βασικούς ρυθμιστές της λειτουργίας των Σωματίων Π(Cougot et al., 2004; Eulalio et al., 2007; Parker and Sheth, 2007). Το γονίδιο xrn-1 κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη 1571 αμινοξέων, ορθόλογη της 5-3 εξωνουκλεάσης XRN1p της ζύμης, η λειτουργία της οποίας είναι απαραίτητη για την ολοκλήρωση του μονοπατιού 5-3 αποδόμησης των mrnas(caponigro and Parker, 1996; Mitchell and Tollervey, 2000; Newbury and Woollard, 2004). 1.4. Ο C. elegans ως πρότυπο σύστημα μελέτης 1.4.1. Πλεονεκτήματα του C. elegans ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτη της Γήρανσης Η χρήση του νηματώδους C. elegans ως μοντέλο για τη μελέτη της γήρανσης προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα. Ίσως το κυριότερο εξ αυτών είναι ο ιδιαίτερα σύντομος κύκλος ζωής του, καθώς το προσδόκιμο ζωής είναι περίπου 14 ημέρες, ενώ η μέγιστη διάρκεια ζωής αγγίζει τις 25-30 ημέρες σε στερεή καλλιέργεια, σε πιάτα με άγαρ επιστρωμένα με την κατάλληλη βακτηριακή καλλιέργεια, στους 25 C(Klass, 1977). Η διατήρηση του νηματώδους μπορεί να γίνει σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 15 C έως 27 C (συνηθέστερα στους 20 C) ενώ υπάρχουν και πρωτόκολλα για υγρή καλλιέργειά του. Η ανάπτυξή του είναι ταχεία, με τα αυγά να αναπτύσσονται σε ενήλικα άτομα σε μόλις 3 ήμερες, ενώ η αναπαραγωγική περίοδος της ζωής ολοκληρώνεται σε μεγάλο βαθμό μέσα στις 5 πρώτες μέρες της ενήλικης ζωής και ουσιαστικά τελειώνει μέχρι τη δέκατη μέρα(klass, 1977). Ένα σκουλήκι παράγει κατά μέσο όρο 300 απογόνους, κάτι που σημαίνει ότι μέσα σε διάστημα μίας εβδομάδας μπορεί να δημιουργηθεί ένας πληθυσμός 100.000 ατόμων από ένα μόλις άτομο. Ο τρόπος αναπαραγωγής του C. elegans προσφέρει ένα σχεδόν τέλειο σύστημα για γενετικές μελέτες. Η ερμαφρόδιτη φύση του (ΧΧ άτομα) και η αυθόρμητη αυτογονιμοποίηση παρέχουν τη δυνατότητα εύκολης απόκτησης υπολειπόμενων μεταλλαγών σε ομόζυγη κατάσταση, ενώ η παραγωγή και αρσενικών ατόμων (ΧΟ) σε μικρή 35

συχνότητα καθιστά δυνατή και εύκολη τη διασταύρωση στελεχών για τη διεξαγωγή πειραμάτων συμπληρωματικότητας, την κατασκευή διπλά μεταλλαγμένων στελεχών και άλλες διαδικασίες. Η ερμαφρόδιτη αναπαραγωγή, που συνεπάγεται την παραγωγή ισογενετικών απογόνων, ξεπερνά και το πρόβλημα της ενδογαμίας, που συνοδεύει τη διατήρηση ισογενετικών πληθυσμών αμφιγονικών οργανισμών μοντέλων και μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή καχεκτικών ατόμων, καθιστώντας αδύνατη τη μελέτη ποσοτικών φαινοτύπων, όπως η διάρκεια ζωής. Επιπλέον, η δυνατότητα διατήρησης στελεχών σε παγωμένη κατάσταση μειώνει την πιθανότητα εγκαθίδρυσης τυχαίων μεταλλαγών και κατ επέκταση την ποικιλομορφία ενός στελέχους μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, καθώς τα στελέχη δεν εξελίσσονται ενδοεργαστηριακά. Ο νηματώδης C.elegans προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα και όσον αφορά στη μοριακή γενετική. Η δημιουργία διαγονιδιακών ζώων μέσω μικροένεσης του επιθυμητού DNA στη γονάδα είναι μία σχετικά εύκολη διαδικασία(epstein and Shakes, 1995; Hope, 1999). Το εξωγενές DNA διατηρείται ως μία εξωχρωμοσωμική συστοιχία, έως ότου εξωτερική παρέμβαση (π.χ. ακτινοβόληση με υπεριώδη ακτινοβολία) προκαλέσει την ενσωμάτωσή του στο γονιδίωμα. Επιπλέον, η διαφάνεια του σκώληκα διευκολύνει σε μεγάλο βαθμό μικροσκοπικές μελέτες, επιτρέποντας την in vivo παρατήρηση χιμαιρικών πρωτεϊνών συντηγμένων με φθορίζοντα μόρια (π.χ. GFP). Το μεγαλύτερο ίσως πλεονέκτημα που φέρει ο νηματώδης C.elegans σε σχέση με άλλους οργανισμούς μοντέλα είναι η δυνατότητα εύκολου ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης συστημικά μέσω της τεχνολογίας RNAi. Μικροένεση του επιθυμητού δίκλωνου RNA ή διατροφή των ζώων με βακτήρια που εκφράζουν δίκλωνο RNA έχει ως αποτέλεσμα την ειδική απενεργοποίηση του στοχευόμενου γονιδίου σε όλο το ζώο(timmons et al., 2001). Η μεθοδολογία αυτή επιτρέπει τη διεξαγωγή σαρώσεων ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανακάλυψη γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορους φαινοτύπους, ιδιαίτερα δε στη γήρανση. 1.4.2. Μειονεκτήματα του C.elegans ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτης της Γήρανσης Παρά τον μεγάλο αριθμό πλεονεκτημάτων που προσφέρει, η χρήση του C.elegans ως μοντέλο για τη μελέτη της γήρανσης παρουσιάζει και κάποια προβλήματα. Ένα από τα σημαντικότερα είναι το μικρό του μέγεθος, το οποίο συνεπάγεται την αναγκαιότητα συλλογής μεγάλου πληθυσμού ατόμων προκειμένου να διεξαχθούν βιοχημικές μελέτες. Το πρόβλημα αυτό γίνεται ιδιαίτερα έντονο, καθώς η διατήρηση ενός ικανού για βιοχημικές μελέτες αριθμού γερασμένων ατόμων είναι ιδιαίτερα επίπονη. Ως αποτέλεσμα, ο αριθμός των βιοχημικών μελετών σε γερασμένα σκουλήκια είναι περιορισμένος. Ένα επιπλέον πρόβλημα που πηγάζει από το μικρό μέγεθος του νηματώδους είναι η έλλειψη γνώσεων σχετικά με την παθολογία του οργανισμού σε προχωρημένο στάδιο ζωής και την αιτία του θανάτου. Τα άτομα θεωρούνται νεκρά όταν παύουν να κινούνται και να αποκρίνονται στο άγγιγμα. Λεπτομερείς μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχουν ρίξει λίγο φως στην υπόθεση, δείχνοντας πως γερασμένοι σκώληκες εμφανίζουν διαφορετικό βαθμό εκφυλισμού σε διαφορετικούς ιστούς, με το νευρικό σύστημα να διατηρείται ιδιαιτέρως καλά, ενώ το μυϊκό και το αναπαραγωγικό εκφυλίζονται αρκετά γρήγορα(herndon et al., 2002). 36

Το βασικότερο ίσως πρόβλημα που παρουσιάζεται κατά τη χρήση του νηματώδους ως μοντέλο για τη μελέτη της γήρανσης είναι η μεγάλη εξελικτική του απόσταση από τον άνθρωπο, καθώς ο τελευταίος κοινός πρόγονος εντοπίζεται εκατοντάδες εκατομμύρια χρόνια πριν. Παρόλα αυτά, για τη συντριπτική πλειοψηφία των γονιδίων που έχουν βρεθεί να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη γήρανση του C.elegans έχουν εντοπιστεί ομόλογα και στα θηλαστικά. Ακόμα πιο σημαντικό είναι το γεγονός ότι βασικά για τη φυσιολογία των θηλαστικών συστήματα απουσιάζουν στο νηματώδη, με χαρακτηριστικότερο παράδειγμα το ανοσολογικό. Επιπλέον, από τις μεταλλαγές που επηρεάζουν τη γήρανση στον σκώληκα, αυτές που έχουν συγκεντρώσει το περισσότερο ενδιαφέρον αφορούν σε γονίδια που εμπλέκονται και στην είσοδο στο μονοπάτι που οδηγεί στην ανάπτυξη της προνύμφης Dauer, γεγονός που προκαλεί ενδοιασμούς στη εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων, καθώς η κατάσταση διάπαυσης μπορεί να έχει πολύ μικρή σχέση με τη γήρανση των θηλαστικών. Προκειμένου να ξεπεραστεί το εν λόγω πρόβλημα ενδείκνυται η μελέτη των γονιδίων αυτών μετά την ολοκλήρωση της ανάπτυξης των ατόμων. 1.4.3. O C.elegans ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτη της επίδρασης φαρμάκων Παρά τη φαινομενική του απλότητα ο C.elegans έχει εξελιχθεί σε ένα σημαντικό μοντέλο για τη βιοιατρική έρευνα, ιδιαίτερα στο λειτουργικό χαρακτηρισμό καινούριων στόχων φαρμάκων χρησιμοποιώντας γενωμικές τεχνολογίες (microarray τεχνολογία, RNAi μέθοδος). Η κυτταρική πολυπλοκότητα και η εξελικτική συντήρηση μονοπατιών που ευθύνονται για ασθένειες στο C.elegans και σε ανώτερους οργανισμούς, μαζί με την απλότητα του και το μικρό κόστος καλλιέργειας, τον κάνουν ένα αποτελεσματικό in vivo μοντέλο για σάρωση μεγάλης κλίμακας συστατικών φαρμάκων και για την εύρεση των στόχων τους. Έχουν ταυτοποιηθεί ομόλογα γονίδια στον άνθρωπο και στο C.elegans σε ποσοστό 60-80% ανάλογα την εφαρμοσμένη προσέγγιση βιοπληροφορικής. Η σύγκριση, δε, των γονιδιωμάτων του ανθρώπου και του C.elegans επιβεβαιώνει ότι τα περισσότερα γονίδια για ανθρώπινες ασθένειες και τα μονοπάτια που ευθύνονται γι αυτές υπάρχουν και στο νηματώδη. Η εύκολη καλλιέργεια του νηματώδους σκώληκα, η γρήγορη αναπαραγωγή του με μεγάλο αριθμό απογόνων, το μικρό του μέγεθος (οι περισσότερες μελέτες γίνονται σε πλάκες με μικροπηγαδάκια), η διαφάνεια του σώματος του καθώς και το ότι αποτελεί έναν απλό πολυκύτταρο οργανισμό (959 σωματικά κύτταρα κι ένα νευρικό σύστημα με 302 νευρώνες) τον καθιστούν ένα ιδεατό σύστημα για τη διεξαγωγή φαρμακολογικών μελετών. Στις περισσότερες περιπτώσεις δεν υπάρχει μια ακριβής αντιστοιχία μεταξύ ανθρώπινων παθολογικών καταστάσεων και φαινοτύπων στο C.elegans. Δεδομένου όμως ότι ακόμα και μοντέλα θηλαστικών δεν μπορούν συχνά να προβλέψουν τη δράση ενός φαρμάκου στον άνθρωπο είναι από προκλινικής άποψης μη ρεαλιστικό να περιμένουμε ένα ασπόνδυλο σύστημα να προβλέπει με ακρίβεια το πώς δρα ένα φάρμακο κι αν είναι ασφαλές για τον ανθρώπινο οργανισμό. Τα μη θηλαστικά πρότυπα συστήματα μελέτης θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην πρώιμη έρευνα, ώστε να δίνουν γρήγορες απαντήσεις για τη λειτουργία ενός γονιδίου και την εύρεση θεραπευτικών στόχων. Ο C.elegans αποτελεί σίγουρα ένα τέτοιο ιδανικό μοντέλο. 37

Η απλότητα του σώματος του C.elegans δεν αντιβαίνει της υψηλής πολυπλοκότητας σε κυτταρικό και φυσιολογικό επίπεδο. Κατά την αλληλεπίδραση ενός φαρμάκου με ένα στόχο του σε δοκιμασία στο C.elegans πρέπει να ληφθούν τα εξής υπ όψιν: πρώτον, το φάρμακο πρέπει να εισέλθει στο σώμα (μερικές φορές αυτό μπορεί να επιτευχθεί μέσω του δέρματος, αλλά τις περισσότερες φορές το φάρμακο πρέπει να ενεθεί και να εισέλθει στο έντερο). Πρέπει να είναι βιοδιαθέσιμο, ώστε να περάσει μέσω των μεμβρανών του πεπτικού συστήματος και να φτάσει στον ιστό-στόχο. Εκεί, το φάρμακο θα πρέπει να μπορεί να αλλάξει τη δραστηριότητα του φαρμακολογικού του στόχου και να αντιμετωπίσει τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς όχι μόνο σε επίπεδο κυττάρου αλλά και σε επίπεδο ιστού, ώστε τελικά να προκαλέσει μια μετρήσιμη φαρμακολογική επίδραση. Έτσι, φάρμακα με in vivo δραστηριότητα θα προκαλέσουν απόκριση στο C.elegans και θα υπάρχει η ευκαιρία για την εύρεση συνεργιστικών με άλλα μονοπάτια επιδράσεων ή παρενεργειών. 1.5. Φάρμακα κατά των αρρυθμιών και της υπέρτασης Στο σύγχρονο κόσμο χρησιμοποιούνται ευρέως φάρμακα κατά της υπέρτασης, των αρρυθμιών και της κολπικής μαρμαρυγής. Τα φάρμακα αυτά πολλές φορές έχουν πλήθος παρενεργειών κι αποτελεί αντικείμενο έρευνας της φαρμακολογίας η τροποποίηση των πλευρικών ομάδων τους, ώστε να ασκούν την ίδια φαρμακολογική δράση με μικρότερο πλήθος ανεπιθύμητων ενεργειών. Επιπλέον, πολλές φορές ο μηχανισμός δράσης τους είναι άγνωστος ή όχι επαρκώς χαρακτηρισμένος με αποτέλεσμα η διεξαγωγή δοκιμασιών τους σε μοντέλα οργανισμούς να συμβάλλει στη διαλεύκανσή τους. Τα φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή περιγράφονται αναλυτικά στο κεφάλαιο των Αποτελεσμάτων. 38

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 39

2.1 Βακτηριακά στελέχη 2.1.1. Βακτηριακά στελέχη για τη διατροφή του C.elegans Οι σκώληκες τρέφονται με συγκεκριμένα στελέχη βακτηρίων. Τα πιο συνηθισμένα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιούνται για τη διατροφή του C.elegans είναι τα ακόλουθα: 2.1.1.1.E. coli OP-50 Το στέλεχος OP-50 χρησιμοποιείται για την καθημερινή συντήρηση και την ανάπτυξη των σκουληκιών. Είναι αυξότροφο σε ουρακίλη και καθώς το NGM (βλ. παρ. 2.12) δεν περιεχεί πηγή ουρακίλης, τα βακτήρια δεν αναπτύσσονται σε υπερβολικό βαθμό. Το στέλεχος είναι επίσης ανθεκτικό στη στρεπτομυκίνη, η οποία προστίθεται στο NGM για την αποφυγή μολύνσεων. 2.1.1.2. E. coli HT115 (DE3) Το στέλεχος ΗΤ115 στερείται RNάσης III (rnc - ) και για το λόγο αυτό είναι κατάλληλο για παραγωγή δίκλωνου RNA. Επιπλέον, φέρει το γονίδιο της T7 RNA πολυμεράσης κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου lacz. Το διαγονίδιο έχει ενσωματωθεί σε ένα τροποποιημένο προφάγο λdh3, ο οποίος με τη σειρά του είναι ενσωματωμένος στο χρωμόσωμα του βακτηρίου. Στον προφάγο περιέχεται επίσης γονίδιο ανθεκτικότητας σε τετρακυκλίνη. Μετά από επαγωγή με IPTG, που ενεργοποιεί τον υποκινητή του γονιδίου lacz, η παραγόμενη T7 RNA πολυμεράση μπορεί να μεταγράψει οποιοδήποτε γονίδιο βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο κατάλληλου υποκινητή. Ο φορέας κλωνοποίησης ppd129.36 (pl4440) είναι κατάλληλος για το μετασχηματισμό του στελέχους HT115 και κατευθύνει την παραγωγή δίκλωνου RNA εντός των βακτηριακών κυττάρων. 2.1.2. Βακτηριακά στελέχη για κλωνοποίηση Κλωνοποίηση πλασμιδιακού DNA αμέσως μετά από αντίδραση σύνδεσης (ligation, βλ. παρ. 2.6) πραγματοποιήθηκε σε δεκτικά κύτταρα του κλασικού στελέχους E. coli DH5α. Μετά την ολοκλήρωση του ελέγχου ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA που προορίζεται για RNAi, χρησιμοποιήθηκαν για μετασχηματισμό δεκτικά κύτταρα E. coli HT115 (DE3). 2.1.3. Αποθήκευση βακτηριακών στελεχών Η αποθήκευση βακτηριακών στελεχών πραγματοποιείται υπό τη μορφή στοκ γλυκερόλης στους -80 C. Για την παρασκευή τους 1 όγκος 100% γλυκερόλης προστίθεται σε 2 όγκους βακτηριακής καλλιέργειας. Ακολουθεί ισχυρή ανάδευση. Τα αποθηκευμένα βακτηριακά στελέχη μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν εμβολιάζοντας μικρή ποσότητα σε θρεπτικό υλικό ανάπτυξης βακτηρίων. 40

2.1.4. Θρεπτικά υλικά ανάπτυξης βακτηρίων Πίνακας 2: Υγρά θρεπτικά υλικά ανάπτυξης βακτηρίων. LB (Luria-Bertani) broth SOC Medium Συγκέντρωση Συγκέντρωση Συστατικό Συστατικό (g/l) (g/l) NaCl 10 Τρυπτόνη 20 Εκχύλισμα μαγιάς 5 Εκχύλισμα μαγιάς 5 Συγκέντρωση (mm) Τρυπτόνη 10 NaCl 0,5 10 Προσαρμογή του ph=7 με προσθήκη KCl 2,5 NaOH 1N MgCl 2 10 MgSO 4 20 Γλυκόζη 3,6 20 Για την παρασκευή στερεού θρεπτικού LB προστίθεται άγαρ σε τελική συγκέντρωση 1,5% w/v και το θρεπτικό διαμοιράζεται σε τρυβλία διαμέτρου 94 mm ανά 25 ml. Προστιθέμενα αντιβιοτικά Αμπικιλλίνη (στοκ 100 mg/ml): Σκόνη αμπικιλλίνης διαλύεται σε αποστειρωμένο dh 2 O και φυλάσσεται στους -20 C. Δρα σε τελική συγκέντρωση 50-100 μg/ml. Τετρακυκλίνη (στοκ 10 mg/ml): Σκόνη τετρακυκλίνης διαλύεται σε υδατικό διάλυμα αιθανόλης 70% (v/v) και φυλάσσεται στους -20 C. Δρα σε τελική συγκέντρωση 10-15 μg/ml. Οποιοδήποτε αντιβιοτικό προστίθεται μετά την αποστείρωση του θρεπτικού. 2.2. Θρεπτικά Υποστρώματα Καλλιέργειας και Ρυθμιστικά Διαλύματα Νηματώδων 2.2.1. Διαλύματα στοκ Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα καλίου (K PO4) 1Μ, ph=6.0: Παρασκευάζονται ξεχωριστά τα διαλύματα K 2 HPO 4 (1Μ) και KH 2 PO 4 (1Μ) και αναμιγνύονται ούτως ώστε το τελικό διάλυμα να έχει ph=6.0. Αποστειρώνεται πριν τη χρήση. Διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου. Χοληστερόλη 5 mg/ml: Διάλυση σε απόλυτη αιθανόλη. Διατηρείται στους 4 C. MgSO 4 1M: Αποστειρώνεται πριν τη χρήση. Διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου. CaCl2 1M: Αποστειρώνεται πριν τη χρήση. Διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου. Αμπικιλλίνη 100 mg/ml: Σκόνη αμπικιλλίνης διαλύεται σε αποστειρωμένο dh2o. Δρα σε τελική συγκέντρωση 50-100 μg/ml. Διατηρείται στους -20 C. Νυστατίνη 100 mg/ml: 1g νυστατίνης διαλύεται σε 10 ml 70% αιθανόλης. Το εναιώρημα που προκύπτει πρέπει να ανακινείται σχολαστικά πριν τη χρήση. Διατηρείται στους 4 C. 41

2.2.2. Στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (Nematode Growth Medium NGM) Πίνακας 3: Σύσταση θρεπτικού υποστρώματος NGM. (Α) Προστίθενται πριν από την αποστείρωση (Β) Προστίθενται μετά από την αποστείρωση Συστατικό Ποσότητα ανά λίτρο Τελική Συγκέντρωση NaCl 3 g 50 mm Πεπτόνη 1 2.5 g 0.25% (w/v) Άγαρ 17 g 1.7% (w/v) Στρεπτομυκίνη (Streptomycin 0.2 g 200 µg/ml sulfate) K PO 4 ph 6 25 ml 25 mm 2 Χοληστερόλη 1 ml 5 µg/ml MgSO 4 1 ml 1 mm CaCl 2 1 ml 1 mm 3 Αμπικιλλίνη 500-1000 μl 50-100 μg/ml 4 Νυστατίνη 1 ml 100 μg/ml 1 5-7,5g για την παρασκευή θρεπτικού στοκ 2 Αντιβιοτικό. Προστίθεται σε θρεπτικό που προορίζεται για επίστρωση του βακτηριακού στελέχους E. coli OP-50 3 Αντιβιοτικό. Προστίθεται σε θρεπτικό που προορίζεται για επίστρωση του βακτηριακού στελέχους E. coli HT115 4 Μυκητοστατικό. Προστίθεται σε συνδυασμό με την στρεπτομυκίνη σε θρεπτικό που προορίζεται για τρυβλία στοκ. Ανά λίτρο θρεπτικού προστίθενται τα υλικά του Α μέρους του πίνακα και μετά την αποστείρωση, εφόσον η θερμοκρασία δεν ξεπερνά τους 55 C, προστίθενται τα υλικά του Β μέρους. Ο όγκος συμπληρώνεται στο 1L με αποστειρωμένο dh 2 O. Το θρεπτικό μοιράζεται, πριν στερεοποιηθεί, με περισταλτική αντλία σε τρυβλία διαμέτρου 6 cm ανά 13ml ή σε τρυβλία 3 cm ανά 3ml. 2.3. Συντήρηση, Αποθήκευση και Ψύξη Στελεχών C.elegans Η συστηματική ανάπτυξη των διαφόρων Πίνακας 4: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος M9 στελεχών C. elegans, γίνεται σε τρυβλία Συστατικό Συγκέντρωση NGM επιστρωμένα με βακτήρια E. coli OP- NaCl 5 g/l 50, στους 15, 20 ή 25 C κατ επιλογή. Για την Na 2 HPO 4 6 g/l ανανέωση των στελεχών, πραγματοποιείται KH 2 PO 4 3 g/l μετεμβολιασμός νέων τρυβλίων, είτε με MgSO 4 1Μ * 1ml/L ασηπτική αποκοπή ενός κομματιού από το * Προστίθεται μετά την αποστείρωση άγαρ (chunk) και τοποθέτησή του ανεστραμμένο στην επιφάνεια ενός νέου τρυβλίου, είτε με επιλεκτική μεταφορά μερικών νηματωδών σε αυτό με πεπλατυσμένο πλατινένιο σύρμα. Η βραχυπρόθεσμη αποθήκευση των στελεχών πραγματοποιείται με εμβολιασμό τρυβλίων στοκ και φύλαξή τους στους 15 C, όπου μπορούν να διατηρηθούν περίπου 70 ημέρες. Μακροπρόθεσμη αποθήκευση στελεχών C. elegans μπορεί να πραγματοποιηθεί υπό τη μορφή παγωμένων στοκ γλυκερόλης. Στην κατάσταση αυτή επιβιώνουν μόνο σκουλήκια 42

σταδίου L1-L2. Για την ψύξη ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία: τρυβλία που περιέχουν αρκετά σκουλήκια στο επιθυμητό αναπτυξιακό στάδιο ξεπλένονται με παγωμένο διάλυμα Μ9 και στο προκύπτον εναιώρημα προστίθεται ίσος όγκος παγωμένου διαλύματος ψύξης. Το εναιώρημα μοιράζεται σε ειδικά σωληνάρια (cryotubes) που φυλάσσονται στους -80 C. Πίνακας 5: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος ψύξης. * (Α) Προστίθενται πριν την αποστείρωση Συστατικό Ποσότητα ανά λίτρο Τελική Συγκέντρωση NaCl 5.85 g 100 mm Glycerol 300g ( ~ 200 ml) 30% (w/v) dh 2 O 947 ml (Β) Προστίθενται μετά την αποστείρωση K PO 4 ph 6 50 ml 50 mm 0.1Μ MgSO 4 *Διατηρείται στους 4 C 3 ml 0.3 mm 2.4. Απαλλαγή Από Μολύνσεις Η απαλλαγή από περιστασιακές μολύνσεις έγινε με χρήση διαλύματος χλωρίνης (πίνακας 2.16). Σταγόνες διαλύματος τοποθετούνται στην περιφέρεια ελεύθερου από μολύνσεις τρυβλίου NGM. Σε κάθε σταγόνα μεταφέρονται 5-10 αναπαραγωγικώς ενεργά άτομα. Οι σταγόνες ανανεώνονται τακτικά μέχρι την πλήρη Πίνακας 6: Σύσταση διαλύματος χλωρίνης αποσύνθεση των σωμάτων των σκουληκιών και την απελευθέρωση των αυγών. Παρατεταμένη παραμονή των αυγών στο διάλυμα μπορεί να παρεμποδίσει την εκκόλαψή τους. Μετά την Συστατικό Χλωρίνη 5M NaOH Συγκέντρωση (v/v) 20% 10% εκκόλαψη τα προκύπτοντα άτομα μεταφέρονται σε νέο τρυβλίο. 2.5. Αποσιώπηση Γονιδίων με RNAi Μέσω Σίτισης Η συστεμική αποσιώπηση γονιδίων του νηματώδους με RNAi μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω της διατροφής των ατόμων με στελέχη E. coli HT115, μετασχηματισμένα με το πλασμίδιο pl4440 που φέρει κλωνοποιημένο τμήμα του επιθυμητού γονιδίου, προκειμένου να παράγει το αντίστοιχο δίκλωνο RNA. Η διαδικασία παρασκευής τρυβλίων για RNAi έχει ως εξής: Το επιθυμητό βακτηριακό στέλεχος εμβολιάζεται σε υγρό θρεπτικό LB που περιέχει τετρακυκλίνη και αμπικιλλίνη και επωάζεται στους 37 C για 16 ώρες υπό ανάδευση. Μέρος της καλλιέργειας αυτής χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό υγρού θρεπτικού LB που περιέχει αμπικιλλίνη (αναλογία εμβολίου:καλλιέργειας 1:10). Ακολουθεί επώαση στους 37 C υπό ανάδευση για 2-3 ώρες, έως ότου η καλλιέργεια φτάσει σε εκθετική φάση ανάπτυξης και επαγωγή της έκφρασης του δίκλωνου RNA με προσθήκη IPTG σε τελική συγκέντρωση 0,2-1 mm. Η καλλιέργεια επωάζεται για άλλες 3 ώρες στου 37 C υπό ανάδευση και επιστρώνεται σε τρυβλία NGM (0,5 ml καλλιέργειας/τρυβλίο), τα οποία επωάζονται στους 37 C για 16 ώρες. Εναλλακτικά, η επαγωγή της παραγωγής του δίκλωνου 43

RNA μπορεί να γίνει με προσθήκη IPTG απευθείας στα τρυβλία NGM πριν από την επίστρωση των βακτηρίων. Προς αποφυγή (ή απαλλαγή) μολύνσεων προστίθεται προαιρετικά στα τρυβλία NGM τετρακυκλίνη σε τελική συγκέντρωση 10 μg/ml, πριν την επίστρωση της βακτηριακής καλλιέργειας. 2.6. Παραγωγή Αρσενικών Ατόμων Τα αρσενικά άτομα του νηματώδους (γονότυπος X0) προκύπτουν από το μη διαχωρισμό των φυλετικών αδερφών χρωματίδων κατά τη μείωση και απαντώνται σε πολύ μικρό ποσοστό υπό φυσιολογικές συνθήκες, αλλά η συχνότητα παραγωγής τους αυξάνεται υπό συνθήκες στρες. Η διασταύρωση ενός αρσενικού ατόμου με ένα ερμαφρόδιτο έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεγάλου αριθμού αρσενικών απόγονων ( ~ 50%). Η παραγωγή αρσενικών ατόμων στο εργαστήριο μπορεί να πραγματοποιηθεί με συλλογή των τυχαία παραγόμενων αρσενικών ατόμων και διασταύρωσή τους με ερμαφρόδιτα άτομα του ίδιου στελέχους. Ο αρχικός αριθμός αρσενικών μπορεί να αυξηθεί μέσω της έκθεσης ερμαφρόδιτων ατόμων προνυμφικού σταδίου L4 στους 30 C για 4-6 ώρες. Οι αρσενικοί απόγονοι μεταφέρονται σε νέο τρυβλίο με περίσσεια ερμαφρόδιτων L4 του ίδιου στελέχους προκειμένου να εξασφαλιστεί η παραγωγή περισσότερων αρσενικών στην επόμενη γενιά. Τα προκύπτοντα αρσενικά άτομα χρησιμοποιούνται κανονικά για διασταυρώσεις. 2.7. Διασταύρωση Στελεχών C.elegans Οι διασταυρώσεις στελεχών C.elegans πραγματοποιούνται σε τρυβλία NGM επιστρωμένα με μικρή ποσότητα βακτηρίων OP-50 σε περιορισμένη έκταση προκειμένου να αυξηθεί η συχνότητα επαφής των ατόμων. Τα άτομα τοποθετούνται σε αναλογία αρσενικώνερμαφρόδιτων 4:1-5:1. Τα ερμαφρόδιτα άτομα τοποθετούνται ως προνύμφες σταδίου L3- L4, ώστε να προληφθεί η αυτογονιμοποίηση. Η επιτυχία της διασταύρωσης διαπιστώνεται από την παρουσία μεγάλου αριθμού αρσενικών ατόμων στην F1 γενιά. Ακολούθως απομονώνονται ερμαφρόδιτα άτομα της F1 γενιάς και οι απόγονοι αυτών (F2). Ο έλεγχος για την ύπαρξη των επιθυμητών μεταλλάξεων γίνεται είτε απευθείας στα F2 άτομα, είτε στους απογόνους τους (γενιά F3). 2.8. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία παρατίθενται στον πίνακα. Πίνακας 7: Εκκινητές. Όνομα Dcp-1cd/1 Dcp-1cd/2 Dcap-2 RT Frw Αλληλουχία CTCCAGAAAATCG ACATCGC GACGCCGATTGAG TGCAC GAGCCGCCATCAA GTGTAC Περιοριστική Θέση - - - Περιγραφή Πρόσθιος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου dcap-1 από γενωμικό DNA. Προσδένεται 58 bp μετά το κωδικόνιο έναρξης ATG του dcap1 Ανάστροφος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου dcap-1 από γενωμικό DNA. Προσδένεται 20bp πριν το κωδικόνιο λήξης του dcap-1. Πρόσθιος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου dcap-2 από γενωμικό DNA. Για έλεγχο μαζί με τον Dcap-2 RT Rev της έλλειψης του γονιδίου dcap-2. 1930bp στο N2, 330bp στο dcap-2 44

μεταλλαγμένο στέλεχος. Dcap-2 RT Rev GTACCAATGAGCA AGTTCAAGATG - Ανάστροφος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου dcap-2 από γενωμικό DNA. Dcap-2/5 Frw Εat-2 Frw Eat-2 Rev Lgg-1 Frw Lgg-1 Rev CGTCGAAGGGATC TTCCAG GCTAGTCGATTTTC ATCATCG GGCTAACCTTCAA ATAGCAAAC GGAGATCTAAGTG GGCTTACAAGGAG GGGAATTCGTCTT CTTCGTTTATTCAT G - - - BglII EcoRI Πρόσθιος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου dcap-2. Προσδένεται στις 380bp του dcap-2. Για την ανίχνευση της έλλειψης στο dcap-2 γονίδιο μαζί με τον εκκινητή Dcap-2 RT Rev. Δίνει PCR κομμάτι 1670bp στο Ν2 και καμία ζώνη στο μεταλλαγμένο dcap-2 στέλεχος. Πρόσθιος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου eat-2. Μαζί με τον Eat-2 Rev δίνουν ένα προϊόν 1018bp. Μέσα σ αυτό το κομμάτι υπάρχει μια περιοριστική θέση BamHI στις 109bp και στο μεταλλαγμένο αλλήλιο ad465 υπάρχει και μια θέση περιορισμού για την SfcI στις 834bp. Ανάστροφος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου eat-2 από γενωμικό DNA. Έτσι, σε πέψη του προϊόντος της PCR με τα ένζυμα BamHI-SfcI ένα κομμάτι 912bp για το N2 στέλεχος και 726bp για το eat-2 μεταλλαγμένο στέλεχος. Πρόσθιος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου lgg-1. Προσδένεται μετά το κωδικόνιο έναρξης ATG του γονιδίου lgg-1 για ενίσχυση του γονιδίου μαζί με τον Lgg-1 Rev και στη συνέχεια την κλωνοποίησή του στο φορέα ppd95.77::gfp(new). Ανάστροφος εκκινητής για την ενίσχυση του γονιδίου lgg-1. Προσδένεται περίπου στο τέλος της 3 αμετάφραστης περιοχής του γονιδίου lgg-1 για ενίσχυση του γονιδίου μαζί με τον Lgg-1 Frw και στη συνέχεια την κλωνοποίησή του στο φορέα ppd95.77::gfp(new). Οι εκκινητές διαλύονται σε TE, σε συγκέντρωση 100 pmol/μl. Για την ενίσχυση τμημάτων DNA που προορίζονταν για κατασκευές RNAi χρησιμοποιήθηκε Taq πολυμεράση. Η σύνθεση και το πρόγραμμα μίας τυπικής αντίδρασης PCR με Taq πολυμεράση παρουσιάζονται στους πίνακες 2.4 και 2.5 αντίστοιχα. Για την ενίσχυση τμημάτων DNA που προορίζονταν για έκφραση στο νηματώδη χρησιμοποιήθηκε High Fidelity πολυμεράση της εταιρίας Fermentas. Ο καθαρισμός των προϊόντων της PCR έγινε με χρήση του Wizard SV kit της εταιρίας Promega. Ο υπολογισμός της θερμοκρασίας υβριδοποίησης κάθε εκκινητή έγινε με βάση τον τύπο Tm=69,3+0,41(%GC)- 650, όπου L: μήκος εκκινητή και %GC: το L ποσοστό ζευγών βάσεων γουανίνης-κυτοσίνης του εκκινητή. Πίνακας 8: Σύσταση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Συστατικό Συγκέντρωση Μήτρα DNA 10-100 ng πλασμιδιακό DNA/ 100-400 ng χρωμοσωμικό DNA Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 1X dntps 200 μm MgCl 2 1,5 mm * Πρόσθιος εκκινητής 0,5 μm Ανάστροφος εκκινητής 0,5 μm Πολυμεράση 0,05-0,1 U/μl * Αν δεν περιέχεται στο ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 45

Πίνακας 9: Πρόγραμμα αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος Κύκλοι Αρχική αποδιάταξη 94 C 3-5 min 1 Αποδιάταξη 94 C 30 sec Σύνδεση T m -2 C 30 sec 30 Επιμήκυνση 72 C 1 min/kb Τελική επιμήκυνση 72 C 10 min 1 Ψύξη 4 C Πίνακας 10: Σύσταση διαλύματος TE * Συστατικό Συγκέντρωση Tris-HCl ph=8 10 mm EDTA ph=8 1 mm * Αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο Πίνακας 11: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος πολυμεράσης Συστατικό Συγκέντρωση KCl 500 mm Tris-HCl ph=8,3 100 mm * MgCl 2 15 mm * Προαιρετικά 2.9. PCR σε Ολόκληρους Νηματώδεις (Worm PCR) Οι σκώληκες μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας ως μήτρα σε μία αντίδραση PCR χωρίς να απαιτείται προηγουμένως η απομόνωση και ο καθαρισμός DNA. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: μερικά άτομα (συνήθως 1-15) συλλέγονται σε μικρή ποσότητα TE (3-12 μl) και ψύχονται στους -80 C για τουλάχιστον 1 ώρα, προκειμένου να διευκολυνθεί η θραύση των ιστών. Ακολουθεί η προσθήκη ίσου όγκου διαλύματος λύσης (πίνακας 2.12) και πρωτεϊνάσης Κ σε τελική συγκέντρωση 200 μg/ml και επώαση για 1 ώρα και 30 λεπτά στους 65 C και 30 λεπτά στους 98 C προς απενεργοποίηση της πρωτεϊνάσης. Το προκύπτον διάλυμα χρησιμοποιείται ως μήτρα DNA για αντίδραση PCR. Πίνακας 12: Σύσταση διαλύματος λύσης DNA Συστατικό Συγκέντρωση KCl 50 mm Tris-HCl ph=8,3 10 mm MgCl 2 2,5 mm Triton X-100 0,45% Twin 20 0,45% 46

2.10. Ηλεκτροφόρηση DNA σε Πήκτωμα Αγαρόζης Τα τμήματα DNA ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα 1% αγαρόζης (ή 2% για μικρότερα τμήματα) σε 1X ΤΒΕ, παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου (C 21 H 20 BrN 3 ) σε τελική συγκέντρωση συνήθως 0,5 μg/ml, έπειτα από την προσθήκη 6X διαλύματος φόρτωσης DNA. Τα πηκτώματα φωτογραφήθηκαν αμέσως μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία μήκους κύματος 254 nm με χρήση του λογισμικού Dolphin-1D της εταιρίας Wealtec. Πίνακας 13: Σύσταση διαλύματος TBE Συστατικό Συγκέντρωση (g/l) Tris-Base 108 Βορικό Οξύ (H 3 BO 3 ) 55 EDTA 9,3 * * ή 40 ml 0,5M EDTA ph=8 Πίνακας 14: Σύσταση διαλύματος φόρτωσης DNA (6Χ) Συστατικό Συγκέντρωση (% w/v) Bromophenol Blue 0,25 Xylene Cynol FF 0,25 Γλυκερόλη 30-50 2.11. Δοκιμασία Προσδιορισμού Διάρκειας Ζωής Ικανή ποσότητα ατόμων (τουλάχιστον 100) προνυμφικού σταδίου L4 διαμοιράζονται σε τρυβλία NGM, στα οποία έχει αναπτυχθεί η επιθυμητή βακτηριακή καλλιέργεια (OP-50 ή HT115 μετασχηματισμένα με το επιθυμητό πλασμίδιο για αποσιώπηση μέσω RNAi). Σε κάθε τρυβλίο τοποθετούνται κατά κανόνα 35-40 άτομα και επωάζονται στην επιθυμητή θερμοκρασία. Τα άτομα που επιλέγονται για τη μελέτη πρέπει να έχουν αναπτυχθεί σε ιδανικές συνθήκες, καθώς καταστάσεις όπως η πείνα ή ο υπερπληθυσμός μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά το αποτέλεσμα. Η ημέρα τοποθέτησης των ατόμων στα τρυβλία σημειώνεται ως ημέρα 0 και ο πληθυσμός ελέγχεται καθημερινά για την καταγραφή των θανάτων. Ως νεκρά καταγράφονται τα άτομα που δεν ανταποκρίνονται στο άγγιγμα. Άτομα που απομακρύνονται από τη μελέτη για διαφορετικούς λόγους (π.χ. χαμένα ή ξεραμένα άτομα) καταγράφονται σε διαφορετική κατηγορία (censored) και συνυπολογίζονται στα αποτελέσματα. Οι σκώληκες μεταφέρονται σε φρέσκα τρυβλία NGM όταν κρίνεται απαραίτητο (π.χ. για να αποφευχθούν καταστάσεις πείνας, υπερπληθυσμού, στρες κτλ). Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων (Log-rank test) και η απεικόνισή τους (καμπύλες επιβίωσης) έγινε με χρήση του λογισμικού GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, California USA). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. 2.12. Δοκιμασίες Ανθεκτικότητας στο Στρες Όλα τα άτομα που χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμασίες ανθεκτικότητας στο στρες αναπτύχτηκαν σε ιδανικές συνθήκες. Η απεικόνιση και η στατιστική επεξεργασία (ασύζευκτη ανάλυση t-test) των αποτελεσμάτων σε όλες τις δοκιμασίες έγινε με χρήση του λογισμικού GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, California USA). Ως νεκρά καταγράφηκαν τα άτομα που δεν ανταποκρίνονταν στο άγγιγμα. Άτομα που απομακρύνθηκαν από τη μελέτη για διαφορετικούς λόγους (π.χ. χαμένα άτομα) δεν υπολογίστηκαν στο αποτέλεσμα. 47

2.12.1. Ανθεκτικότητα στο θερμικό σοκ Ικανός αριθμός ατόμων (τουλάχιστον 100) προνυμφικού σταδίου L4 διαμοιράζεται σε τρυβλία NGM, τα οποία επωάζονται στην επιθυμητή θερμοκρασία έως ότου τα άτομα καταστούν αναπαραγωγικώς ενεργά ενήλικα μίας ημέρας. Μετά το πέρας του απαιτούμενου χρόνου τα τρυβλία τοποθετούνται στους 35 C για 6 ώρες και επιστρέφονται στην αρχική θερμοκρασία επώασής τους προκειμένου να ανακάμψει ο πληθυσμός. Η καταγραφή των θανάτων και η εξαγωγή ποσοστών επιβίωσης γίνεται μετά από ανάκαμψη 24 ωρών. 2.13. Δοκιμασία Γονιμότητας 3-5 άτομα προνυμφικού σταδίου L4 του υπό μελέτη στελέχους τα οποία αναπτύχθηκαν υπό ιδανικές συνθήκες απομονώνονται σε ξεχωριστά τρυβλία και επωάζονται στην επιθυμητή θερμοκρασία. Τα άτομα μεταφέρονται καθημερινά σε νέο τρυβλίο μέχρι την παύση της ωοτοκίας προκειμένου να αποφευχθεί η ανάμιξη των πληθυσμών και γίνεται καταμέτρηση των απογόνων που εκκολάφθηκαν τις προηγούμενες ημέρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος του αριθμού των απογόνων ανά στέλεχος. Η απεικόνιση και η στατιστική επεξεργασία (ασύζευκτη ανάλυση t-test) πραγματοποιήθηκαν με χρήση του λογισμικού GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, California USA). 2.14. Δοκιμασία Ανάπτυξης Μεγάλος αριθμός (60-80) αναπαραγωγικά ενεργών ατόμων μεταφέρεται σε τρυβλίο NGM και επωάζεται στην επιθυμητή θερμοκρασία για χρονικό διάστημα 1-2 ωρών προκειμένου να επιτευχθεί συγχρονισμένη εναπόθεση απογόνων. Ακολούθως τα ενήλικα άτομα απομακρύνονται από το τρυβλίο. Οι απόγονοι ελέγχονται κάθε 24 ώρες και καταγράφεται το αναπτυξιακό τους στάδιο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των ατόμων συγκεκριμένων αναπτυξιακών σταδίων σε δεδομένη χρονική στιγμή. Η επεξεργασία και η απεικόνιση των αποτελεσμάτων έγινε με χρήση του λογισμικού GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, California USA). 48

2.15. Φορείς Κλωνοποίησης 2.15.1. pl4440 (ppd129.36) Ο φορέας κλωνοποίησης ppd129.36 (pl4440)(timmons and Fire, 1998) είναι κατάλληλος για την παραγωγή δίκλωνου RNA, καθώς περιχεί δύο υποκινητές της T7 RNA πολυμεράσης που περιβάλλουν μια αλληλουχία πολλαπλών θέσεων κλωνοποίησης (multicloning site, MCS). Όταν ένα γονίδιο του C. elegans κλωνοποιείται στο MCS, η T7 RNA πολυμεράση, με τη βοήθεια των δύο αντίθετης κατεύθυνσης υποκινητών, μπορεί να μεταγράψει και τις δύο αντιπαράλληλες αλυσίδες του γονιδίου, με αποτέλεσμα την παραγωγή δίκλωνου RNA εντός των βακτηριακών κυττάρων. Στα σκουλήκια που θα τραφούν με τα βακτήρια αυτά θα προκληθεί συστεμική αποσιώπηση του ενδογενούς γονιδίου μέσω του μηχανισμού RNAi. Περιέχει γονίδιο ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη και είναι κατάλληλος για μετασχηματισμό DH5α και HT115 κυττάρων. Εικόνα 10: Περιοριστικός χάρτης του φορέα κλωνοποίησης pl4440. 49

2.15.2. pbluescript II KS(+) Ο φορέας pbluescript II KS(+) χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση γονιδίων του νηματώδους και το μετασχηματισμό σκουληκιών με μικροένεση. Η αλληλουχία πολλαπλών θέσεων κλωνοποίησης του πλασμιδίου βρίσκεται εντός του γονιδίου της β-γαλακτοσιδάσης (lacz), παρέχοντας τη δυνατότητα διαλογής των βακτηριακών αποικιών που φέρουν το κλωνοποιημένο τμήμα DNA μέσω της επιλογής μπλε-λευκού (blue-white selection), μετά το μετασχηματισμό των βακτηριακών κυττάρων και επίστρωσή τους σε περιέχοντα X-gal τρυβλία. Περιέχει γονίδιο ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη και χρησιμοποιείται ευρέως για το μετασχηματισμό DH5α κυττάρων. Εικόνα 11: Περιοριστικός χάρτης του φορέα κλωνοποίησης pbluescript II KS(+). 2.15.3. prf4 Το πλασμίδιο prf4 χρησιμοποιείται ως συμπληρωματικός φορέας για το μετασχηματισμό σκουληκιών μαζί με το εκάστοτε επιθυμητό πλασμίδιο. Προέρχεται από τον φορέα pbluescript και περιέχει το γονίδιο rol-6 (su1006) του νηματώδους που κωδικοποιεί μια μεταλλαγμένη μορφή κολλαγόνου. Όταν εισαχθεί στο σκουλήκι, συμπεριφέρεται ως επικρατές και προκαλεί μια ανωμαλία στη σωματική δομή που με τη σειρά της οδηγεί σε περιστροφική κυκλική κίνηση του σκώληκα (φαινότυπος roller). 50

2.15.4. pl2534 (ppd96.52) Ο φορέας κλωνοποίησης pl2534 είναι κατάλληλος για έκφραση στα σωματικά μυϊκά κύτταρα του C. elegans, καθώς φέρει κλωνοποιημένο τον υποκινητή του γονιδίου myo-3 του νηματώδους αναρροϊκά της αλληλουχίας πολλαπλών θέσεων κλωνοποίησης. Περιέχει γονίδιο ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη και χρησιμοποιείται ευρέως για το μετασχηματισμό DH5α κυττάρων. Εικόνα 12: Περιοριστικός χάρτης του φορέα κλωνοποίησης pl2534. 51

2.15.5. ppd95.77 Ο φορέας ppd95.77 χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση γονιδίων του C. elegans και το μετασχηματισμό σκουληκιών με μικροένεση. Το πλασμίδιο περιέχει τη αλληλουχία του γονιδίου της GFP καταρροϊκά της αλληλουχίας πολλαπλών θέσης κλωνοποίησης με αποτέλεσμα τα διαγονιδιακά άτομα να εκφράζουν την GFP υπό τον έλεγχο οποιουδήποτε υποκινητή έχει κλωνοποιηθεί εκεί, ή την εκάστοτε επιθυμητή πρωτεΐνη σε σύντηξη με την GFP στο C-τελικό της άκρο. Περιέχει γονίδιο ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη και χρησιμοποιείται κατά κόρον για το μετασχηματισμό DH5α κυττάρων. Εικόνα 13: Περιοριστικός χάρτης του φορέα κλωνοποίησης ppd95.77. 52

2.16. Πέψεις και Καθαρισμός DNA Για την πέψη των τμημάτων DNA χρησιμοποιήθηκαν ένζυμα των εταιριών New England Biolabs, Fermentas, Minotech και Takara. Όπου ήταν απαραίτητο, μετά την ολοκλήρωση της πέψης ακολούθησε καθαρισμός του DNA μέσω κατακρήμνισης με αιθανόλη ως εξής: στο διάλυμα DNA προστίθεται 1/10 του όγκου διάλυμα 3M CH 3 COONa ph=5,2 και 2,5 όγκοι καθαρής αιθανόλης. Ακολουθεί ανάδευση και ψύξη του διαλύματος στους -20 C για τουλάχιστον 1 ώρα. Μετά την ψύξη το διάλυμα φυγοκεντρείται στις 13.000 rpm για 15 λεπτά και στους 4 C. Το υπερκείμενο αφαιρείται και στο ίζημα προστίθεται 1 ml παγωμένης 70% αιθανόλης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση όπως και προηγουμένως, αφαίρεση του υπερκείμενου, ξήρανση και επαναδιάλυση του ιζήματος στην επιθυμητή ποσότητα ελεύθερου από νουκλεάσες, απιονισμένου και αποστειρωμένου H 2 O ή ΤΕ (συνήθως 30 μl). Στην περίπτωση που ένα προϊόν πέψης έπρεπε να απομονωθεί μεταξύ δύο ή περισσότερων προϊόντων, η πέψη ακολουθήθηκε από ηλεκτροφόρηση και απομόνωση της επιθυμητής ζώνης με χρήση του Wizard SV kit της εταιρίας Promega. 2.17. Αντίδραση λιγάσης Για τη σύνδεση γραμμικών τμημάτων DNA χρησιμοποιήθηκε λιγάση του φάγου T4 της εταιρίας Fermentas. Συνήθως, η μοριακή αναλογία μεταξύ φορέα κλωνοποίησης και αλληλουχίας εισδοχής είναι 1:3 έως 1:5. Οι ακριβείς ποσότητες των τμημάτων εξαρτώνται από το μέγεθός τους. Οι αντιδράσεις λιγάσης πραγματοποιήθηκαν στους 22 C για 20 λεπτά. 2.18. Παρασκευή δεκτικών βακτηριακών κυττάρων E. coli 5ml LB εμβολιάζονται με μοναδική αποικία του επιθυμητού στελέχους, ή με μικρή ποσότητα από στοκ γλυκερόλης, και επωάζονται στους 37 C για 16 ώρες, με παράλληλη ανάδευση. Την επόμενη μέρα, η καλλιέργεια αυτή χρησιμοποιείται για εμβολιασμό υγρού LB σε αραίωση 1/40-1/100 και επωάζεται στους 37 C υπό ανάδευση, έως ότου η οπτική πυκνότητα στα 600 nm φτάσει στο 0,4-0,6 (εκθετική φάση ανάπτυξης). Η καλλιέργεια τοποθετείται σε πάγο για 10-20 λεπτά και φυγοκεντρείται στις 3000 rpm για 10 λεπτά στους 4 C. Μετά από σχολαστική αφαίρεση του υπερκείμενου, το ίζημα επαναδιαλύεται σε 10 ml παγωμένου διαλύματος CaCl 2 (πίνακας 2.2) και επωάζεται στον πάγο για τουλάχιστον 30 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 5 λεπτά και επαναδιάλυση (σε επαφή με τον πάγο) του ιζήματος σε 2 ml παγωμένου διαλύματος CaCl 2. Το εναιώρημα διαμοιράζεται σε σωληνάκια ανά 100 μl και φυλάσσεται στους -80 C. Η αποδοτικότητα των κυττάρων μπορεί να ελεγχθεί μέσω του μετασχηματισμού 100 μl * αυτών με 10 pg υπερελικωμένου πλασμιδιακού Πίνακας 15: Διάλυμα CaCl 2 DNA, την επίστρωση σε τρυβλίο με το κατάλληλο Συστατικό Συγκέντρωση αντιβιοτικό και την καταμέτρηση των CaCl 2 50 mm ανεπτυγμένων αποικιών. Η αποδοτικότητα Γλυκερόλη 10% (v/v) εκφράζεται σε αριθμό αποικιών/μg DNA (cfu/μg). * Φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 C 53

2.19. Μετασχηματισμός Δεκτικών Βακτηριακών Κυττάρων E. coli Σε 100 μl δεκτικών βακτηριακών κυττάρων προστίθεται 0,1-0,5 μg DNA (ή 8-10 μl από την αντίδραση λιγάσης). Τα κύτταρα επωάζονται στον πάγο για τουλάχιστον 30 λεπτά. Ακολουθεί θερμικό σοκ στους 42 C για 45 δευτερόλεπτα, επώαση στον πάγο για 2 λεπτά, προσθήκη 1 ml διαλύματος SOC και επώαση στους 37 C για 45-60 λεπτά, με ή χωρίς ταυτόχρονη ανακίνηση. Μετά το πέρας της επώασης, 100 μl απλώνονται σε τρυβλίο LB άγαρ που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό. Η περίσσεια φυγοκεντρείται για 5 λεπτά στις 4.000 rpm, το ίζημα επαναδιαλύεται σε 100 μl υπερκείμενου και επιστρώνεται σε δεύτερο τρυβλίο. Τα τρυβλία επωάζονται στους 37 C για 16 ώρες και ελέγχονται για την παρουσία βακτηριακών αποικιών. 2.20. Απομόνωση Πλασμιδιακού DNA 2.20.1. Μέθοδος βρασμού (Boiling-preps) Διάλυμα LB, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, εμβολιάζεται με βακτηριακή αποικία και επωάζεται για 16 ώρες στους 37 C υπό ανάδευση. Μετά το πέρας της επώασης, τμήμα της καλλιέργειας ( ~ 1,5 ml) φυγοκεντρείται στις 13.000 rpm για 30-60 δευτερόλεπτα. Το υπερκείμενο αφαιρείται σχολαστικά και το ίζημα επαναδιαλύεται πλήρως σε 500 μl διαλύματος STET. Ακολουθεί προσθήκη 5 μl διαλύματος λυσοζύμης (20 mg/ml) και βρασμός για 1 λεπτό. Το εναιώρημα φυγοκεντρείται στις 13.000 rpm για 10 λεπτά, το υπερκείμενο απομονώνεται (ή αφαιρείται το ίζημα) και σε αυτό προστίθεται ίσος όγκος ( ~ 450 μl) ισοπροπανόλης. Το μείγμα αναδεύεται, ψύχεται στους -20 C για τουλάχιστον 30 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στις 13.000 rpm για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίπτεται, το ίζημα αφήνεται να στεγνώσει πλήρως και επαναδιαλύεται σε ελεύθερο από νουκλεάσες, απιονισμένο και αποστειρωμένο H 2 O (συνήθως σε 50 μl). Πίνακας 16: Σύσταση διαλύματος STET * Συστατικό Συγκέντρωση Σακχαρόζη 8% Triton X-100 5% EDTA ph=8 50 mm Tris-HCl ph=8 5 mm * Αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο. 2.20.2. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης καθαρότητας Στις περιπτώσεις που χρειάστηκε πολύ καθαρό πλασμιδιακό DNA και σε αρκετή ποσότητα (όπως για παράδειγμα, για μικροενέσεις), χρησιμοποιήθηκε το QIAprep Spin Miniprep Kit της QIAGEN που αποδίδει μέχρι 20 μg πλασμιδίου (high-copy) από 1-5 ml καλλιέργειας. 54

2.21. Δημιουργία Διαγονιδιακών Στελεχών με τη Μέθοδο των Μικροενέσεων Η τεχνική μετασχηματισμού που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία των διαγονιδιακών στελεχών της παρούσας εργασίας είναι η ένεση του επιθυμητού διαλύματος DNA στον απομακρυσμένο βραχίονα της γονάδας. Η περιοχή αυτή είναι ουσιαστικά ένα συγκύτιο που περιέχει πολλούς γεννητικούς πυρήνες, γεγονός που επιτρέπει τη διανομή του ενιόμενου DNA σε πολλά γεννητικά κύτταρα, μετά το πέρας της κυτοκίνησης. Η τεχνική αυτή επιτρέπει τη δημιουργία μεγάλων εξωχρωμοσωμικών συστοιχιών DNA που περιέχουν αντίγραφα του επιθυμητού διαγονιδίου και δεν ενσωματώνονται στο γονιδίωμα. Ως αποτέλεσμα, τα διαγονιδιακά ζώα παρουσιάζουν μωσαϊκή έκφραση των διαγονιδίων κατά τυχαίο τρόπο. Ενσωμάτωση στο γονιδίωμα μπορεί να επιτευχθεί μέσω έκθεσης σε υπεριώδη ακτινοβολία εντάσεως 300 J/cm 2. Ως συμπληρωματικός φορέας για το μετασχηματισμό χρησιμοποιήθηκε, μαζί με το επιθυμητό πλασμίδιο, το πλασμίδιο prf4 που φέρει το γονίδιο αναφοράς rol-6. Τα μετασχηματισμένα άτομα εμφανίζουν το φαινότυπο roller. Κατά το σχεδιασμό διαγονιδίων προς μετασχηματισμό, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όχι μόνο οι αλληλουχίες που κωδικοποιούν για πρωτεΐνη αλλά και οι μη-κωδικές περιοχές (π.χ. 5 και 3 αμετάφραστες περιοχές). Επιπροσθέτως, Πίνακας 17: Σύσταση μείγματος ενέσεων η παρουσία εσωνίων είναι πολύ σημαντική για την Συστατικό Συγκέντρωση έκφραση του διαγονιδίου(maniatis and Reed, 2002; prf4 100 ng/μl Nott et al., 2004). DNA ladder 80 ng/μl Για της μικροενέσεις χρησιμοποιήθηκαν οπτικό DNA 20 ng/μl μικροσκόπιο Zeiss Observer.D1 εφοδιασμένο με συσκευή μικροενέσεων Narishige IM-31. Τα άτομα Tris-HCl ph=8 10 mm για τις ενέσεις ακινητοποιήθηκαν μέσα σε σταγόνα Halocarbon oil 700, απλωμένη πάνω σε λεπτό στρώμα 3% αγαρόζης σε H 2 O πάνω σε καλυπτρίδα. Η σύσταση του διαλύματος που χρησιμοποιείται τυπικά για την ένεση παρουσιάζεται στον πίνακα 17. Εικόνα 14: Η ιδανική θέση για την είσοδο της βελόνας μικροενέσεων. Τα λευκά βέλη απεικονίζουν τη ροή του ενιόμενου διαλύματος. Ανατύπωση από www.wormbook.org 55

2.22. Απομόνωση Γενωμικού DNA Για την απομόνωση γενωμικού DNA, οι νηματώδεις συλλέγονται από τρυβλία NGM με διάλυμα M9 και μεταφέρονται σε σωληνάριο τύπου eppendorf, όπου αφήνονται να καθιζάνουν. Η περίσσεια M9 αφαιρείται και το ίζημα των σκουληκιών επαναιωρείται σε καθαρό διάλυμα M9. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται όσες φορές χρειάζεται έως ότου η παρουσία βακτηρίων στο διάλυμα πάψει να είναι αντιληπτή. Μετά από το τελευταίο πλύσιμο, οι νηματώδεις επαναιωρούνται σε μικρή ποσότητα διαλύματος M9 ( ~ 0,5 ml) στην οποία προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος λύσης (πίνακας 2.12) και πρωτεϊνάση Κ σε τελική συγκέντρωση 200 μg/ml. Το μείγμα επωάζεται στους 65 C μέχρι την πλήρη διάλυση των νηματωδών (μερικές ώρες). Ακολουθεί προσθήκη ίσου όγκου διαλύματος φαινόλης:χλωροφόρμιου:ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1), ισχυρή ανάδευση και φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 5 λεπτά. Η πάνω φάση μεταφέρεται προσεχτικά σε νέο σωληνάριο και σε αυτή προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος χλωροφόρμιου:ισοαμυλικής αλκοόλης (24:1). Το μείγμα αναδεύεται καλά και φυγοκεντρείται στις 13.000 rpm για 5 λεπτά. Η πάνω φάση μεταφέρεται προσεχτικά σε νέο σωληνάριο. Ακολουθεί κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 1/10 του όγκου 3M CH 3 COONa και 2,5 όγκων απόλυτης αιθανόλης, ήπια ανάδευση και φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίπτεται, τα ίζημα αφήνεται να στεγνώσει πλήρως, επαναδιαλύεται σε 20-40 μl ελεύθερου από νουκλεάσες, απιονισμένου και αποστειρωμένου H 2 O και αποθηκεύεται στους -20 C. 2.23. ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΑ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ Ο παρακάτω πίνακας περιέχει τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν. Πίνακας 18: Ανασυνδυασμένα πλασμίδια. Όνομα ppd95.77::gfp(new)::lgg-1 ppd95.77::pmyo3::gfp(new)::lgg- 1 Περιγραφή Το γονίδιο lgg-1 (718bp) ενισχύθηκε από το πλασμίδιο Pmec7::gfp::lgg-1 με τους εκκινητές Lgg-1 BglII Frw και Lgg-1 EcoRI Rev για την κλωνοποίησή του με τα ένζυμα BglII - EcoRI στο φορέα ppd95.77::gfp(new), στο 3 άκρο του γονιδίου gfp. Ο υποκινητής Pmyo3 (2400bp) από το πλασμίδιο L2534 κόπηκε με τα ένζυμα ΗindIII - XbaI για να κλωνοποιηθεί με τα ίδια ένζυμα στο πλασμίδιο ppd95.77::gfp(new)::lgg-1, στο 5 άκρο του γονιδίου gfp. 56

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 57

Στόχος της μελέτης: Δεδομένου του ρόλου της πρωτεϊνοσύνθεσης στη ρύθμιση της γήρανσης και μάλιστα ότι χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης συμβάλλουν στην επιμήκυνση της διάρκειας ζωής θελήσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο του μεταβολισμού των mrnas στη γήρανση και στην απόκριση στο στρες του C.elegans. Πιο συγκεκριμένα, μελετήσαμε το ρόλο των γονιδίων dcap-1 και dcap-2, που αποτελούν το ολοένζυμο αφαίρεσης της καλύπτρας στο 5 άκρο του mrna. Το ολοένζυμο αυτό ανταγωνίζεται για πρόσδεση στο 5 άκρο τον παράγοντα έναρξης της μετάφρασης eif4e, αποτελώντας έτσι ένα μηχανισμό ρύθμισης της πρωτεϊνοσύνθεσης. Παράλληλα με την παραπάνω μελέτη διεξαγάγαμε δοκιμή φαρμάκων κατά των αρρυθμιών και της υπέρτασης στο νηματώδη με σκοπό την εύρεση μηχανισμών της δράσης τους. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι μεταλλαγμένα στελέχη dcap-1 και dcap-2 εμφανίζουν μικρότερη διάρκεια ζωής, μειωμένη γονιμότητα, καθυστέρηση στην ανάπτυξη καθώς και μειωμένη απόκριση στο στρες σε σχέση με το Ν2 στέλεχος αγρίου τύπου. Προχωρήσαμε παραπέρα μελετώντας τον αντίκτυπο του μεταβολισμού των mrnas σε μακρόβια στελέχη C.elegans, που χαρακτηρίζονται από μειωμένα επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης. 3.1 Μελέτη της επίδρασης του μεταβολισμού των mrnas στη φυσιολογία και στην απόκριση στο στρες σε μακρόβια στελέχη C. elegans. 3.1.1. Μελέτη της επίδρασης του μεταβολισμού των mrnas στο γενετικό υπόβαθρο του μακρόβιου daf-2 μεταλλαγμένου στελέχους Ένας από τους τρόπους ρύθμισης της πρωτεϊνοσύνθεσης αποτελεί και ο μεταβολισμός του mrna. Γνωρίζοντας ότι τα daf-2 μακρόβια στελέχη χαρακτηρίζονται από χαμηλούς μεταβολικούς ρυθμούς και χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης(houthoofd et al., 2005), θελήσαμε στο γενετικό υπόβαθρό τους να μελετήσουμε το ρόλο των συστατικών του ολοένζυμου αφαίρεσης της καλύπτρας, που κωδικοποιούνται από τα γονίδια dcap-1 και dcap-2 στη φυσιολογία του νηματώδη σκώληκα. Να διερευνήσουμε δηλαδή πώς επηρεάζεται η διάρκεια ζωής του, η γονιμότητά του, η ανάπτυξή του κι η απόκρισή στο θερμικό σοκ. Τα αποτελέσματα αναφέρονται παρακάτω. 3.2.1. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη διάρκεια ζωής του daf- 2 μακρόβιου στελέχους. Από προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου μας έχει βρεθεί ότι τα dcap-1 και dcap-2 μεταλλαγμένα στελέχη παρουσιάζουν μείωση στη διάρκεια ζωής τους στους 25 ο C της τάξης του 33% και 50% αντίστοιχα σε σχέση με το Ν2 στέλεχος αγρίου τύπου. Πιο αναλυτικά, ενώ το Ν2 άγριο στέλεχος ζει στους 25 ο C 12 ημέρες κατά μέσο όρο, τα dcap-1 και dcap-2 ζουν 8 ημέρες και 6 ημέρες αντίστοιχα. 58

Με γενετικές διασταυρώσεις (τα άτομα τοποθετούνται σε αναλογία αρσενικώνερμαφρόδιτων 4:1-5:1. Τα ερμαφρόδιτα τοποθετούνται ως προνύμφες σταδίου L3-L4 Ακολούθως απομονώνονται ερμαφρόδιτα άτομα της F1 γενιάς και οι απόγονοι αυτών (F2). Ο έλεγχος για την ύπαρξη των επιθυμητών μεταλλάξεων γίνεται είτε απευθείας στα F2 άτομα, είτε στους απογόνους τους (γενιά F3) μέσω Worm PCR, Κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι) δημιουργήσαμε τα διπλά μεταλλαγμένα στελέχη daf-2;dcap-1 και daf-2;dcap-2 για να διερευνήσουμε τον αντίκτυπο που θα έχει η έλλειψή τους στη μακροβιότητα των daf-2 μεταλλαγμένων στελεχών. Σε αυτά τα πειράματα το daf-2 στέλεχος αποτελεί την ομάδα-μάρτυρα με την οποία συγκρίνουμε τα διπλά μεταλλαγμένα στελέχη. Τα πειράματα διεξήχθησαν στους 25 ο C. Γραφική Παράσταση 1: Επίδραση στη διάρκεια ζωής στους 25 ο C. Τα άτομα μεγάλωσαν σε τρυβλία στους 20 ο C και μπήκαν στο στάδιο L4 στους 25 ο C. Όπως φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί το daf-2;dcap-1 παρουσιάζει μείωση στη διάρκεια ζωής του έως και 18,60% σε σχέση με το daf-2 στέλεχος. Επιπλέον, το daf-2;dcap-2 παρουσιάζει μείωση στη διάρκεια ζωής του σε σχέση με το daf-2 στέλεχος έως και 47,73%. Πίνακας 19: Πειράματα μακροβιότητας στα στελέχη daf-2, daf-2;dcap-1, daf-2;dcap-2 στους 25 ο C. A/A Στέλεχος Μέση διάρκεια ζωής ± ΤΣ Μέγιστη διάρκεια ζωής ± ΤΣ Αριθμός Ατόμων % μείωση μέσης διάρκειας ζωής % μείωση μέγιστης διάρκειας ζωής P value Σημαντικότητα 1 daf-2 44 ± 0,58 58 ± 1,16 96/32 daf-2;dcap-1 38 ± 0,33 46 ± 1,33 104/1 13,64 20,69 0,0002 *** daf-2;dcap-2 23 ± 2,46 40 ± 2,52 104/5 47,73 31,03 <0,0001 *** 2 daf-2 43 ± 0,67 51 ± 0,67 99/19 daf-2;dcap-1 35 ± 1,73 47 ± 1,33 100/8 18,60 7,8 <0,0001 *** daf-2;dcap-2 27 ± 2,00 37 ± 0,5 59/2 37,20 27,45 <0,0001 *** 3 daf-2 42 ± 0,00 51 ± 0,33 99/24 daf-2;dcap-1 35 ± 0,83 46 ± 1,45 100/3 16,67 9,80 <0,0001 *** 59

4 daf-2 41 ± 2,08 50 ± 0,67 93/18 daf-2;dcap-2 25 ± 1,33 38 ± 0,33 85/0 39,02 24 <0,0001 *** Μέση διάρκεια ζωής: Η μέρα ενήλικης ζωής όπου το υποσύνολο των ζωντανών ατόμων φτάνει στο 50% του αρχικού πληθυσμού (± Τυπικό Σφάλμα). Μέγιστη διάρκεια ζωής: Ο μέσος όρος των ημερών θανάτου του τελευταίου 10% του αρχικού πληθυσμού. Αριθμός ατόμων: Συνολικός αριθμός ατόμων/αριθμός ατόμων που απομακρύνθηκαν. Τα πειράματα 1,2,3 και 4 πραγματοποιηθήκαν στους 25 C. Η μείωση της μέσης και της μέγιστης διάρκειας ζωής και η σημαντικότητα υπολογίστηκαν σε σύγκριση με τον εσωτερικό μάρτυρα κάθε πειράματος. Η μείωση της μέσης και της μέγιστης διάρκειας ζωής και η σημαντικότητα υπολογίστηκαν σε σύγκριση με το στέλεχος daf-2. Σημαντικότητα: (ns) μη σημαντικό, (*) p value 0,05, (**) p value 0,01, (***) p value 0,001. 3.2.2. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη γονιμότητα του daf-2 μακρόβιου στελέχους. Από προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου μας έχει βρεθεί ότι στους 25 ο C τα dcap-1 και dcap-2 μεταλλαγμένα στελέχη εμφανίζουν μείωση στη γονιμότητα της τάξης του 46% και 83% αντίστοιχα σε σχέση με το Ν2 στέλεχος αγρίου τύπου. Ο μέσος όρος απογόνων του Ν2 στελέχους στους 25 ο C είναι 271, ενώ στα dcap-1 και dcap-2 μεταλλαγμένα στελέχη είναι 147 και 45 αντίστοιχα κατά μέσο όρο. Στα συγκεκριμένα πειράματα η έλλειψη λειτουργικών αλληλόμορφων των γονιδίων dcap- 1 και dcap-2 έχει ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση της γονιμότητας του daf-2 στελέχους. Συγκεκριμένα, το daf-2;dcap-1 δεν εμφανίζει σημαντική μείωση της γονιμότητάς του στους 15 ο C και 20 ο C σε σχέση με το daf-2 στέλεχος. Ωστόσο, στους 25 ο C εμφανίζει μείωση της τάξης του 86% σε σχέση με το daf-2 στέλεχος. Αντίθετα, το daf-2;dcap-2 στέλεχος εμφανίζει μείωση στατιστικά σημαντική σε όλες τις θερμοκρασίες σε σχέση με το daf-2 στέλεχος. Πιο αναλυτικά, στους 15 ο C και στους 20 ο C η μείωση στη γονιμότητά του είναι της τάξης του 74%, ενώ στους 25 ο C φτάνει το 99,66%, όπου είναι και πρακτικά στείρο. Η μείωση του αριθμού των απογόνων παρατηρήσαμε ότι δε φαίνεται να οφείλεται σε εμβρυική θνησιμότητα, καθώς τα έμβρυα που εναποτίθενται εκκολάπτονται, αλλά στην παραγωγή και εναπόθεση μικρότερου αριθμού εμβρύων. Πίνακας 20: Επίδραση στη γονιμότητα στους 15 ο C. Μεγάλωσαν στους 15 ο C κι άφησαν απογόνους στους 15 ο C P value Σημαντικότητα Στέλεχος Μέσος όρος αριθμού απογόνων daf-2 220 daf-2;dcap-1 204 0,27 ns daf-2;dcap-2 58 <0,0001 *** Γράφημα 1: Επίδραση στη γονιμότητα στους 15 ο C. Μεγάλωσαν στους 15 ο C. 60

Πίνακας 21: Επίδραση στη γονιμότητα στους Μεγάλωσαν στους 15 ο C κι άφησαν απογόνους στους 20 ο C P value Σημαντικότητα Στέλεχος Μέσος όρος αριθμού απογόνων daf-2 226 daf-2;dcap-1 208 0,39 ns daf-2;dcap-2 58 <0,0001 *** Γράφημα 2: Επίδραση στη γονιμότητα στους 20 ο C. Μεγάλωσαν στους 15 ο C, μπήκαν ως L4 στους 20 ο C. Πίνακας 22: Επίδραση στη γονιμότητα στους 25 ο C. Μεγάλωσαν στους 15 ο C κι άφησαν απογόνους στους 25 ο C Στέλεχος Μέσος όρος αριθμού απογόνων daf-2 29 P value Σημαντικότητα daf-2;dcap-1 4 <0,0001 *** daf-2;dcap-2 0,1 <0,0001 *** Γράφημα 3: Επίδραση στη γονιμότητα στους 25 ο C. Μεγάλωσαν στους 15 ο C, μπήκαν ως L4 στους 25 ο C. 3.2.3. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στην ανάπτυξη του daf-2 μακρόβιου στελέχους. Όλοι οι πολυκύτταροι οργανισμοί αναπτύσσονται με εντυπωσιακή ακρίβεια, παρά τη μεγάλη πολυπλοκότητα της διαδικασίας, η οποία ρυθμίζεται σε επίπεδο κυττάρου, ιστού και οργανισμού. Η φυσιολογική ανάπτυξη ενός ατόμου εξαρτάται από την ακριβή χρονική ρύθμιση των κυτταρικών διαιρέσεων, του καθορισμού της κυτταρικής μοίρας και της διαφοροποίησης. Κεντρικό ρόλο στις διαδικασίες αυτές διαδραματίζει η ορμονική σηματοδότηση(thummel, 1995). Στο νηματώδη έχουν αναγνωριστεί πολλά γονίδια που συμμετέχουν στη ρύθμιση αναπτυξιακών γεγονότων κατά τη διάρκεια της προνυμφικής ανάπτυξης, συμπεριλαμβανομένων και γονιδίων που κωδικοποιούν για μεταγραφικούς και μεταφραστικούς ρυθμιστές(ambros and Horvitz, 1984; Ambros and Moss, 1994). 61

Έπειτα από δοκιμασίες ανάπτυξης στο εργαστήριό μας των στελεχών Ν2, dcap-1 και dcap- 2 βρέθηκε ότι ενώ στις 72 ώρες μετά το συγχρονισμό η πλειοψηφία του πληθυσμού (90%) στο Ν2 στέλεχος είναι στο στάδιο των νεαρών ενήλικων, στο dcap-1 μεταλλαγμένο στέλεχος το 60% είναι στο στάδιο των νεαρών ενήλικων και το 40% είναι στο L4 στάδιο ανάπτυξης. Τέλος, στο dcap-2 μεταλλαγμένο στέλεχος το 40% είναι στο στάδιο L2 και άλλο ένα 40% είναι στο στάδιο L3. Παρατηρήθηκε, λοιπόν, ότι στο daf-2;dcap-1 μεταλλαγμένο στέλεχος στις 5 ημέρες (120 ώρες) μετά το συγχρονισμό εμφανίζεται η πλειοψηφία του πληθυσμού των απογόνων να είναι στο στάδιο L4, ενώ στο daf-2 στέλεχος είναι ενήλικα. Επίσης, στον πληθυσμό των απογόνων του daf-2;dcap-2 στελέχους εμφανίζονται όλα τα αναπτυξιακά στάδια, αλλά ιδιαίτερα από το στάδιο L4 και κάτω. Παρατηρείται, επομένως, καθυστέρηση στην ανάπτυξη στο daf-2;dcap-1, όταν το αλληλόμορφο του γονιδίου dcap-1 δεν είναι λειτουργικό. Επιπρόσθετα, όταν το γονίδιο dcap-2 δεν είναι λειτουργικό παρατηρείται εντελώς ασύγχρονη (απορρύθμιση) ανάπτυξη του πληθυσμού. Γράφημα 4: Επίδραση στην ανάπτυξη στους 15 ο C. Το πείραμα διεξήχθη στους 15 ο C. 3.2.4. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στο σχηματισμό dauers στο γενετικό υπόβαθρο του daf-2 μακρόβιου στελέχους. Όπως αναφέρθηκε και στο κεφάλαιο της Εισαγωγής σημαντικός είναι ο ρόλος εξελικτικά συντηρημένων μονοπατιών όπως της γουανυλικής κυκλάσης, του TGF-β μονοπατιού, του ινσουλινόμορφου μονοπατιού και ορμονικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος στη ρύθμιση της εισόδου στη dauer μορφή. Τα daf-2 στελέχη εμφανίζουν ένα ποσοστό dauers στους 20 ο C (στα δικά μας πειράματα της τάξης του 24%). Παρατηρήθηκε, λοιπόν, ότι μη λειτουργικό αλληλόμορφο για το γονίδιο dcap-1 οδηγεί σε αύξηση του αριθμού των dauers απογόνων στους 20 ο C με το ποσοστό τους να είναι 32% περίπου του ολικού πληθυσμού. Αυτό, όμως, που αποτελεί ενδιαφέρον είναι το ποσοστού των dauers στο daf-2;dcap-2 στέλεχος που φτάνει το 91%. Δηλαδή, η συντριπτική πλειοψηφία στον πληθυσμό του daf- 2;dcap-2 στελέχους είναι dauers στους 20 ο C, ενώ κι η τροφή είναι επαρκής αλλά κι η 62

θερμοκρασία δεν είναι υψηλή. Αντίθετα, το Ν2 στέλεχος δεν εμφανίζει στους 20 ο C dauers (μόλις στο 0,1% ανέρχονται), όταν η τροφή είναι επαρκής και δεν επικρατούν συνθήκες υπερπληθυσμού στο πιάτο. Επιπλέον, η έλλειψη λειτουργικών αλληλόμορφων για τα dcap- 1 και dcap-2 γονίδια δεν επάγει το σχηματισμό dauers σε Ν2 γενετικό υπόβαθρο, αλλά μόνο στο daf-2 μακρόβιο υπόβαθρο στους 20 ο C. Πίνακας 23: Επίδραση στην είσοδο στο στάδιο dauer. Πείραμα στους 20 ο C Στέλεχος Μέσος όρος ποσοστού P value Σημαντικότητα dauers (%) daf-2 15,12 daf-2;dcap-1 25,67 0,1660 ns daf-2;dcap-2 94,94 <0,0001 *** %Ποσοστό: Ορίζεται ως ο αριθμός των dauers προς τον ολικό πληθυσμό στο κάθε πιάτο επί 100. Γράφημα 5: Επίδραση στην είσοδο στο στάδιο dauer. Το πείραμα διεξήχθη στους 20 ο C. 3.2.5. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στην απόκριση στο θερμικό σοκ στο daf-2 μακρόβιο στέλεχος. Ο νηματώδης C.elegans αντιμετωπίζει στο φυσικό του περιβάλλον μια συνεχή εναλλαγή συνθηκών, όπως η θερμοκρασία, το ph, η διαθεσιμότητα του οξυγόνου κ.α. Προκειμένου να ανταπεξέλθουν στις απρόβλεπτες και συχνά απότομες αλλαγές του περιβάλλοντος όλοι οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει μια ποικιλία μηχανισμών απόκρισης στο στρες, τροποποιώντας είτε τη συμπεριφορά τους είτε τη φυσιολογία τους. Σε κυτταρικό επίπεδο, κεντρικό ρόλο στην απόκριση στο στρες διαδραματίζουν οι πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος (HSPs), τα επίπεδα έκφρασής τους όμως ελέγχονται σε επίπεδο οργανισμού μέσω της δράσης νευρο-ενδοκρινικών μονοπατιών και κατ επέκταση της νευρικής 63

σηματοδότησης(garcia et al., 2007; Prahlad et al., 2008). Η απόκριση στο στρες έχει μελετηθεί σε μεγάλο βαθμό στο νηματώδη και μέσω αυτών των μελετών έχουν αναγνωριστεί πολλά μονοπάτια και γονίδια που συμμετέχουν στην απόκριση σε διάφορες μορφές στρες, ενώ συχνά η αυξημένη αντοχή στο στρες συνοδεύεται και από μακροβιότητα. Στην απόκριση στο στρες σε κυτταρικό επίπεδο εμπλέκονται και τα Σωμάτια Π, καθώς έκθεση του νηματώδους σε στρεσογόνες συνθήκες οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους και του αριθμού τους, ενώ στελέχη που φέρουν μεταλλαγμένα αλληλόμορφα γονιδίων που κωδικοποιούν για βασικά συστατικά τους εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία [Rousakis et al., in preparation]. Από προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου μας έχει δειχθεί ότι ενώ το Ν2 άγριο στέλεχος παρουσιάζει επιβίωση 66% έπειτα από θερμικό σοκ στους 35 ο C για 6 ώρες. Τα dcap-1 και dcap-2 μεταλλαγμένα στελέχη παρουσιάζουν επιβίωση 45% και 22% αντίστοιχα έπειτα από θερμικό σοκ στους 35 ο C για 6 ώρες. Στόχος μας ήταν να μελετηθεί η επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στο daf-2 στέλεχος, το οποίο θεωρείται πιο ανθεκτικό στο θερμικό σοκ απ ότι το στέλεχος αγρίου τύπου (Houthoofd K. et al, 2005, McColl G et al, 2010,Chiang WC et al., 2012). Παρατηρήθηκε ότι ενώ το daf-2 στέλεχος παρουσιάζει περίπου 56% επιβίωση έπειτα από θερμικό σοκ στους 35 ο C για 8 ώρες, το daf-2;dcap-1 παρουσιάζει 42% επιβίωση και το daf- 2;dcap-2 37% επιβίωση. Γράφημα 6: Επίδραση στην απόκριση στο στρες. Πίνακας 24: Επίδραση στην απόκριση στο στρες. Πείραμα στους 35 ο C για 8 ώρες Στέλεχος Μέσος όρος ποσοστού P value Σημαντικότητα επιβίωσης (%) daf-2 55,83 daf-2;dcap-1 42,15 <0,0001 *** daf-2;dcap-2 36,55 <0,0001 *** %Ποσοστό επιβίωσης: Ζωντανά σκουλήκια προς το συνολικό πληθυσμό επί 100. 64

3.3 Μελέτη της επίδρασης του μεταβολισμού του mrna στο γενετικό υπόβαθρο του μακρόβιου eat-2 μεταλλαγμένου στελέχους Το eat-2 μεταλλαγμένο στέλεχος στο C. elegans αποτελεί μοντέλο για τη μελέτη του Χρόνιου Θερμιδικού Περιορισμού(Lakowski and Hekimi, 1998). Το eat-2 μεταλλαγμένο στέλεχος χαρακτηρίζεται από ελαττωματική λειτουργία του φάρυγγα με αποτέλεσμα μειωμένη πρόσληψη τροφής κι αυξημένη διάρκεια ζωής (Lakowski B. and Hekimil S.,1998). Η αύξηση στη διάρκεια ζωής του eat-2 στελέχους μεσολαβείται από μειωμένη σηματοδότηση από το TOR μονοπάτι (Vellai T et al, 2003) κι απαιτεί τη μεταγραφή γονιδίων στόχων από το μεταγραφικό παράγοντα PHA-4/FOXA (Panowski SH et al., 2007). Μεταξύ άλλων ο μεταγραφικός αυτός παράγοντας απαιτείται και για τη μεταγραφή γονιδίων που συμμετέχουν στην αυτοφαγία. Έτσι, λοιπόν το eat-2 μεταλλαγμένο στέλεχος χαρακτηρίζεται από αυξημένη αυτοφαγία και χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης(hansen et al., 2008). Δεδομένου των χαμηλών επιπέδων πρωτεϊνοσύνθεσης του eat-2 στελέχους κι ότι οι πρωτεΐνες DCAP-1 και DCAP-2 ανταγωνίζονται με τον εναρκτήριο παράγοντα της μετάφρασης eif4 για πρόσδεση στο μεθυλιωμένο 5 άκρο του mrna θελήσαμε να διερευνήσουμε την έλλειψη των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη διάρκεια ζωής, στη γονιμότητα και στην ανάπτυξη στο γενετικό υπόβαθρο του eat-2 μεταλλαγμένου στελέχους. 3.3.1. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη διάρκεια ζωής του eat- 2 μακρόβιου στελέχους. Γραφική παράσταση 2: Γραφική απεικόνιση της μεταβολής του ποσοστού της επιβίωσης λόγω της επίδρασης της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στο eat-2 στέλεχος. Μεγάλωσαν στους 20 ο C, μπήκαν στους 25 ο C στο στάδιο L4. Πίνακας 25: Επίδραση στη μακροβιότητα A/A Στέλεχος Μέση διάρκεια ζωής ± ΤΣ Μέγιστη διάρκεια ζωής ± ΤΣ Αριθμός Ατόμων % μείωση μέσης διάρκειας ζωής % μείωση μέγιστης διάρκειας ζωής P value Σημαντικότητα 1 eat-2 19± 0,70 24 ± 0,50 174/14 eat-2;dcap-1 13 ± 0,29 19± 0,71 106/29 31,56 20,83 <0,0001 *** 2 eat-2 21 ± 0,88 25 ± 0,58 106/4 65

eat-2;dcap-1 14 ± 0,33 19 ± 0,58 106/21 33,33 24 <0,0001 *** 3 eat-2 eat-2;dcap-1 19 ± 0,33 11 ± 0,00 24 ± 0,00 18± 1,33 114/15 105/32 42,11 25 <0,0001 *** 4 eat-2 eat-2;dcap-1 19 ± 0,33 13 ± 1,00 25 ± 0,33 20 ± 0,00 116/16 64/15 31,58 20 <0,0001 *** 5 eat-2 18 ± 1,00 25 ± 1,00 64/4 eat-2;dcap-2 8 ± 0,48 13 ± 0,48 86/19 Μέση διάρκεια ζωής: Η μέρα ενήλικης ζωής όπου το υποσύνολο των ζωντανών ατόμων φτάνει στο 50% του αρχικού πληθυσμού (± Τυπικό Σφάλμα). Μέγιστη διάρκεια ζωής: Ο μέσος όρος των ημερών θανάτου του τελευταίου 10% του αρχικού πληθυσμού. Αριθμός ατόμων: Συνολικός αριθμός ατόμων/αριθμός ατόμων που απομακρύνθηκαν. Τα πειράματα 1,2,3 και 4 πραγματοποιηθήκαν στους 25 C. Η μείωση της μέσης και της μέγιστης διάρκειας ζωής και η σημαντικότητα υπολογίστηκαν σε σύγκριση με τον εσωτερικό μάρτυρα κάθε πειράματος. Η μείωση της μέσης και της μέγιστης διάρκειας ζωής και η σημαντικότητα υπολογίστηκαν σε σύγκριση με το στέλεχος daf-2. Σημαντικότητα: (ns) μη σημαντικό, (*) p value 0,05, (**) p value 0,01, (***) p value 0,001. Η μείωση στη διάρκεια ζωής στα στελέχη όπου τα γονίδια dcap-1 και dcap-2 δεν είναι λειτουργικά έχει δειχθεί από προηγούμενα πειράματά μας ότι δεν αφορά μόνο σε προβλήματα στην ανάπτυξη, αλλά και σε επίδραση απευθείας στη διαδικασία της γήρανσης. Αυτό αποδείχθηκε μέσω της σίγησης των γονιδίων (RNAi) dcap-1 και dcap-2 μετα-αναπτυξιακά σε στελέχη Ν2 αγρίου τύπου, daf- 2 και eat-2, όπου η διάρκεια ζωής τους εμφανίστηκε μειωμένη. Ο πληθυσμός, δηλαδή, κάθε στελέχους μεταφέρθηκε σε πιάτα με βακτήρια που εκφράζουν δίκλωνο RNA από το στάδιο L4 και μετά. 3.3.2. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στη γονιμότητα του eat-2 μακρόβιου στελέχους. Από προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου μας έχει βρεθεί ότι στους 25 ο C τα dcap-1 και dcap-2 μεταλλαγμένα στελέχη εμφανίζουν μείωση στη γονιμότητα της τάξης του 46% και 83% αντίστοιχα σε σχέση με το Ν2 στέλεχος αγρίου τύπου. Ο μέσος όρος απογόνων του Ν2 στελέχους στους 25 ο C είναι 271, ενώ στα dcap-1 και dcap-2 μεταλλαγμένα στελέχη είναι 147 και 45 αντίστοιχα κατά μέσο όρο Έπειτα, προχωρήσαμε στο να διερευνήσουμε αν υπάρχει επίδραση στη γονιμότητα του στελέχους eat-2 λόγω της απουσίας λειτουργικών αλληλόμορφων γονιδίων dcap-1 και dcap-2. Στο eat-2;dcap-1 παρατηρούμε μείωση της γονιμότητας κατά 74% σε σχέση με το eat-2 στέλεχος, ενώ στο eat-2;dcap-2 η μείωση αυτή φτάνει στο 88%. Ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων από τα πειράματα απεικονίζεται στο παρακάτω γράφημα και στον πίνακα που ακολουθεί. Τα πειράματα γονιμότητας έλαβαν χώρα στους 25 ο C. Μεγάλωσαν στους 20 ο C κι άφησαν P value Σημαντικότητα 66

απογόνους στους 15 ο C Στέλεχος Μέσος όρος αριθμού απογόνων eat-2 101 eat-2;dcap-1 26 <0,0001 *** eat-2;dcap-2 12 <0,0001 *** Πίνακας 26: Επίδραση στη γονιμότητα στους 25 ο C έχοντας ως στέλεχος αναφοράς το eat-2. Γράφημα 7: Επίδραση στη γονιμότητα στους 25 ο C θέτοντας ως στέλεχος αναφοράς το eat-2 μεταλλαγμένο στέλεχος. Μεγάλωσαν στους 20 ο C, μπήκαν ως L4 στους 25 ο C. 3.3.3. Επίδραση της έλλειψης των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 στην ανάπτυξη του eat-2 μακρόβιου στελέχους. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο γράφημα και στον πίνακα που ακολουθεί. Παρατηρούμε, επίσης, σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη από την έλλειψη αυτών των δύο γονιδίων. Πιο συγκεκριμένα, στις 3 ημέρες (72 ώρες) μετά το συγχρονισμό στο eat-2 στέλεχος η πλειοψηφία των απογόνων είναι στο στάδιο L4, ενώ στο eat-2;dcap-1 είναι στο L3 στάδιο και στο eat-2;dcap-2 στο στάδιο L2. 67

Γράφημα 8: Επίδραση στην ανάπτυξη στους 20 ο C. Το πείραμα διεξήχθη στους 20 ο C. 3.4 Κλωνοποίηση της πρωτεΐνης LGG-1 συζευγμένη με την Πράσινη Φθορίζουσα πρωτεΐνη υπό τον έλεγχο του μυοειδικού υποκίνητη Pmyo3. Δεδομένου ότι η μακροβιότητα έχει συνδεθεί με χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης και μάλιστα στην περίπτωση του eat-2 στελέχους η αύξηση της αυτοφαγίας επάγεται κι είναι σημαντική για το μακρόβιο φαινότυπό του λόγω του θερμιδικού περιορισμού και μέσω της μειωμένης σηματοδότησης από το μονοπάτι TOR (Melendez A. et al., 2003, Hansen M. et al., 2008) προχωρήσαμε στην κλωνοποίηση του γονιδίου lgg-1 συζευγμένο με την Πράσινη Φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) στο 5 άκρο του υπό τον έλεγχο του μυοειδικού υποκινητή Pmyo3 για την παρατήρηση των επιπέδων της αυτοφαγίας σε μετέπειτα πειράματα του εργαστηρίου μας έπειτα από διασταύρωση με dcap-1 και dcap-2 μεταλλαγμένα στελέχη. Η πρωτεϊνη LGG-1 είναι η ορθόλογη στο C.elegans (Melendez A et al, 2003) για την κυστιδιακή πρωτεϊνη Atg8/MAP-LC3, που ενσωματώνεται στα προ-αυτοφαγοσώματα και στις αυτοφαγοσωμικές μεμβράνες. Στο C.elegans η GFP::LGG-1 εντοπίζεται σε σημεία ή εστίες κυττάρων όπου είναι γνωστό ότι έχουν αυξημένο αριθμό αυτοφαγικών σωματίων (Melendez A et al, 2003, Florez-McClure ML et al, 2007). Τα σημεία αυτά και οι εστίες έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως ένδειξη αυτοφαγίας στο C. elegans (Melendez A et al, 2003, Morck C and Pilon M, 2006, Florez-McClure ML et al, 2007, Jia K and Levine B, 2007, Kang C et al., 2007). Έπειτα, μετά την κλωνοποίηση του Pmyo3::gfp::lgg-1 κατασκευάσαμε το διαγονιδιακό στέλεχος Ν2 Ex [Pmyo3::gfp::lgg-1]. Στη συνέχεια, είχαμε μια ομάδα που μεγάλωσε σε καλλιέργεια μάρτυρα για RNAi και μια ομάδα που μεγάλωσε σε καλλιέργεια RNAi για το γονίδιο tor (107i) και παρατηρήσαμε με τη βοήθεια Συνεστιακής Μικροσκοπίας Laser το σχηματισμό αυτοφαγικών σωματίων. Όπως ήταν αναμενόμενο υπήρχε αύξησή τους στην ομάδα που είχε μεγαλώσει σε πιάτο με καλλιέργεια βακτηρίων που εκφράζουν dsrna για 68

το γονίδιο tor. Παρατηρήθηκαν οι απόγονοι στο στάδιο L3 και τα αποτελέσματα φαίνονται στις παρακάτω εικόνες. Εικόνα 15: N2 Ex[Pmyo3::gfp::lgg-1] σε control RNAi Εικόνες 16, 17: N2 Ex[Pmyo3::gfp::lgg-1] σε TOR RNAi 69