ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ Ιωάννης Ρούσσης Καθηγητής Χημείας και Βιοχημείας Τροφίμων και Οίνου Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Ιωάννινα 2015

Παρατίθενται αναλύσεις οίνου. Φυσικά δεν αναφέρονται αναλύσεις που πραγματοποιούνται στο υποχρεωτικό εργαστήριο της χημείας τροφίμων. Για το ακαδημαϊκό έτος 2014-15 οι εργαστηριακές ασκήσεις θα διαμορφωθούν όπως παρακάτω. 1. Χρώμα Φαινολικά συστατικά Αποτίμηση του χρώματος με μέτρηση των απορροφήσεων στα 420 nm, 520 nm, 620 nm. Προσδιορισμός δείκτη ολικών φαινολικών και προσδιορισμός ολικών φαινολικών με τη μέθοδο Folin. Προσδιορισμός ταννινών. Προσδιορισμός ανθοκυανών με τη αποχρωματισμό με όξινα θειώδη ιόντα. 2. Ζυμομύκητες Οξείδωση οίνου Ενεργοποίηση αφυδατωμένου ζυμομύκητα. Παρατήρηση ζυμομύκητα στο μικροσκόπιο. Καλλιέργεια ζυμομύκητα, και αποτίμηση ανασταλτικής δράσης θειώδη ανυδρίτη και σορβικού οξέος. Αποτίμηση της ικανότητας θειώδη ανυδρίτη και ασκορβικού οξέος για αναστολή της οξείδωσης οίνων για οξείδωση. 3. Ενώσεις αρώματος διοξείδιο του άνθρακα πρωτεΐνες Προσδιορισμός συνολικών εστέρων, και αποτίμηση συνολικών ανώτερων αλκοολών. Προσδιορισμός διοξειδίου του άνθρακα. Προσδιορισμός πρωτεϊνών.

ΧΡΩΜΑ ΟΙΝΟΥ Το χρώμα του οίνου είναι σημαντικός παράγοντας ποιότητας των οίνων. Οφείλεται, κυρίως, στις ανθοκυάνες, στις ταννίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις. Ακριβής αποτίμηση του χρώματος του οίνου μπορεί να γίνει με χρωματόμετρο. Επίσης, εκτίμηση του χρώματος του οίνου μπορεί να γίνει με φωτόμετρο. Το φάσμα των ερυθρών οίνων παρουσιάζει ένα μέγιστο στα 520 nm, που οφείλεται στο κόκκινο χρώμα των ανθοκυανών. Με την παλαίωση των ερυθρών οίνων οι ανθοκυάνες καθιζάνουν είτε σχηματίζουν με ταννίνες σύμπλοκα έγχρωμα (όπως κεραμιδί) είτε άχρωμα. Έτσι, το μέγιστο στα 520 nm μειώνεται, ενώ συμμετέχει και η απορρόφηση στα 620 nm που αποτιμά το μωβ χρώμα. Η απορρόφηση στα 420 nm οφείλεται κυρίως σε διάφορες ταννίνες.

Η εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων γίνεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 420 nm, που αποτιμάται το κίτρινο χρώμα. Η απορρόφηση ενός λευκού οίνου στα 420 nm (γενικά στην περιοχή 400-440 nm) είναι ανάλογη του βαθμού οξείδωσής του. Για την εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων, μετράται η απορρόφηση διαυγούς οίνου στα 420 nm. Για τους ερυθρούς οίνους, συνήθως μετράται η απορρόφηση διαυγούς οίνου στα 420 και 520 nm. Η ένταση του χρώματος του χρώματος = Α420 nm + Α 520 nm, και η απόχρωση = Α420 nm /Α520 nm. Επίσης, μετράται η απορρόφηση στα 420, 520 και 620 nm. Στην περίπτωση αυτή ένταση = Α420 nm + Α520 nm + Α620 nm.

Χρώμα και φαινολικά συστατικά Το χρώμα είναι σημαντικός παράγοντας ποιότητας των οίνων. Οφείλεται στις ανθοκυάνες, τις τανίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις. Επίσης, φαίνεται ότι υπάρχει σχέση μεταξύ χρώματος και αρώματος και γεύσης των οίνων. Χρώμα άτονο δηλώνει την ύπαρξη μέτριου αρώματος, ενώ έντονο χρώμα έντονο άρωμα. Ζωηρές χροιές δηλώνουν γευστική φρεσκάδα, ενώ άτονες χροιές πλαδαρότητα γεύσης. Στους ερυθρούς οίνους έντονες κόκκινες χροιές δηλώνουν νεότητα, η συνύπαρξη καστανών και κεραμίδι χροιών δείχνει γήρανση, και οι μπλε χροιές πολύ νέο κρασί. Στους λευκούς οίνους, η ένταση του κίτρινου χρώματος δείχνει ωριμότητα του οίνου, ενώ είναι και μέτρο της οξείδωσης του οίνου. Η παρατήρηση του χρώματος και της χροιάς του οίνου γίνεται σε ποτήρι με κλίση μπροστά σε λευκό φόντο, και με ένα καθαρό και δυνατό φωτισμό.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Για τους ερυθρούς και ροζέ οίνους, συνήθως μετράται η απορρόφηση στα 420 και 520 nm. Η ένταση του χρώματος = Α420 nm + A 520 nm, και η απόχρωση = Α420 nm / Α520 nm. Επίσης, μετράται η απορρόφηση στα 420, 520 και 620 nm. Στην περίπτωση αυτή Ένταση = Α420 nm + Α520 nm + Α620 nm. Ο διαυγής ερυθρός οίνος, εάν χρειάζεται, αραιώνεται με νερό με ph ίδιο με τον οίνο (η ρύθμιση του ph γίνεται με ασθενές κιτρικό οξύ και ρυθμιστικό φωσφορικών). Χρησιμοποιούνται κυψελίδες του 1 cm, ενώ το φωτόμετρο μηδενίζεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Το εύρος των τιμών απορρόφησης που είναι αποδεκτό είναι 0,3-0,7. Εάν οι απορροφήσεις είναι μεγαλύτερες, όπως στους ερυθρούς οίνους, χρησιμοποιούνται κυψελίδες του 1 mm, και το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται χ 10. Η ένταση και η απόχρωση του οίνου υπολογίζονται από τους παραπάνω τύπους και εκφράζονται σαν καθαροί αριθμοί με τρία δεκαδικά ψηφία. Για την εκτίμηση του χρώματος των λευκών οίνων, μετράται η απορρόφηση του διαυγούς οίνου στα 420 nm. Χρησιμοποιούνται κυψελίδες του 1 cm, ενώ το φωτόμετρο μηδενίζεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό.

ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ Οι φαινολικές ενώσεις των οίνων διακρίνονται σε φλαβονοειδή και μη φλαβονοειδή. Στα φλαβονοειδή, που έχουν σκελετό C6-C3-C6, ανήκουν οι ανθοκυάνες, οι φλαβανόλες (κατεχίνες) και οι φλαβονόλες. Τα μη φλαβονοειδή είναι κυρίως τα βενζοικά οξέα, με σκελετό C6-C1, και τα υδροξυκινναμωμικά οξέα, με σκελετό C6-C3. Οι ανθοκυάνες είναι οι κόκκινες χρωστικές, ενώ οι φλαβανόλες υπάρχουν και ως ολιγομερή και πολυμερή που καλούνται συμπυκνωμένες ταννίνες ή προανθοκυανιδίνες (λευκοανθοκυάνες η προκυανιδίνες).

Οι ανθοκυάνες είναι οι ερυθρές χρωστικές των σταφυλιών, και είναι ετεροζαχαρίτες. Στα κρασιά οι ανθοκυάνες αντιδρούν με το θειώδη ανυδρίτη με αποτέλεσμα το μερικό αποχρωματισμό. Επίσης, ενώνονται με ταννίνες παρουσία οξυγόνου. Κατά την παλαίωση με την ένωση ανθοκυανών-ταννινών σχηματίζονται έγχρωμες, άχρωμες η πορτοκαλόχρωμες. Στο κρασί η ισορροπία των μορφών των ανθοκυανών είναι συνάρτηση του ph. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών στους νέους οίνους είναι της τάξης των 400 mg/l, ενώ στους παλαιωμένους της τάξης των 90 mg/l.

Οι ανθοκυάνες με δύο υδροξύλια σε ο-θέση αντιδρούν με τρισθενή σίδηρο προς σύμπλοκα κυανού χρώματος, αντίδραση που ευνοείται σε λιγότερο όξινο περιβάλλον. Η μεταβολή του χρώματος των ερυθρών οίνων μετά την οινοποίηση πιθανόν σχετίζεται με την οξείδωση του Fe II σε Fe III και τον σχηματισμό του συμπλόκου. Επίσης, το θόλωμα σιδήρου των ερυθρών οίνων με σχηματισμό συμπλόκων του Fe III με ανθοκυάνες και ταννίνες πιθανόν σχετίζεται με τον παραπάνω σχηματισμό του συμπλόκου. Οι ανθοκυάνες με αντίδραση με τα όξινα θειώδη ιόντα μετατρέπονται σε άχρωμες ενώσεις. Η αντίδραση είναι αμφίδρομη. Με προσθήκη θειώδη ανυδρίτη λαμβάνει χώρα αποχρωματισμός του οίνου, και το χρώμα του οίνου επανέρχεται προοδευτικά. Οι ανθοκυάνες μπορούν να αποχρωματιστούν με αναγωγή, αντίδραση που ευνοείται σε ισχυρά όξινο ph και είναι αμφίδρομη. Ο ασθενής χρωματισμός του οίνου μετά την αλκοολική ζύμωση, που είναι αναγωγικό φαινόμενο, πιθανόν να σχετίζεται με την αναγωγή των ανθοκυανών. Κατά την παλαίωση η συγκέντρωση των ανθοκυανών μειώνεται.

Οι ταννίνες, ανάλογα με τη δομή τους, διακρίνονται στις συμπυκνωμένες και στις υδρολυόμενες ταννίνες. Οι συμπυκνωμένες ταννίνες είναι οι φυσικές ταννίνες των σταφυλικών και των οίνων. Σχηματίζονται με πολυμερισμό της φλαβανόλης-3 (κατεχίνη) και κυρίως της φλαβανοδιόλης-3,4 (λευκοανθοκυανιδίνη). Οι συνήθεις ταννίνες του σταφυλιού είναι ολιγομερή με 2 μέχρι 10-12 μονομερή. Οι ταννίνες των σταφυλιών βρίσκονται στα στερεά, αλλά στον οίνο μεταφέρεται μόνο μικρό τους μέρος. Η συγκέντρωσή τους στους ερυθρούς οίνους είναι 1,5-4 g/l και στους λευκούς 40-200 mg/l. Οι υδρολυόμενες ταννίνες αποτελούνται από ένα ζάχαρο, όπως γλυκόζη, με το οποίο ενώνονται φαινολικές ενώσεις. Αυτές είναι κυρίως το γαλλικό οξύ και το ελλαγικό οξύ (διμερές του γαλλικού οξέος). Οι υδρολυόμενες ταννίνες δεν βρίσκονται στο σταφύλι, αλλά προέρχοντα από τις κύριες εμπορικές ταννίνες που χρησιμοποιούνταις τις κατεργασίες των οίνων και από το ξύλο του βαρελιού. Οι ανθοκυάνες και οι ταννίνες καθορίζουν το χρώμα των οίνων. Το χρώμα των νέων ερυθρών οίνων οφείλεται στις ανθοκυάνες. Δεν συμβαίνει το ίδιο για το χρώμα των παλαιωμένων οίνων, που οι ταννίνες παίζουν σημαντικό ρόλο. Πάντως, παράμετροι όπως το ph, το οξυγόνο και ο σίδηρος παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του χρώματος.

Οι ταννίνες προέρχονται από πολυμερισμό των κατεχινών και των προκυανιδινών, και από το βαρέλι. Οι ταννίνες έχουν πικρή γεύση και δίνουν στα κρασιά στυφίλα. Η στυφίλα προκαλείται με ένωση των ταννινών με τις πρωτείνες του σάλιου. Έτσι, το σάλιο δεν δρά ως λιπαντικό (ύγρανση του στόματος). Επίσης, οι ταννίνες επιδρούν στους βλεννογόνους που εκκρίνουν σάλιο, που τελικά φράσσονται. Το στόμα ξηραίνεται, στεγνώνει και σκληραίνει. Στο κρασί όλες οι στυφές ουσίες είναι ταννίνες. Όλες οι ταννίνες του κρασιού δεν έχουν την ίδια χημική σύνθεση ούτε τον ίδιο βαθμό πολυμερισμού. Από το βαθμό πολυμερισμού, πάντως, εξαρτάται η δράση τους. Οι μαλακές ταννίνες προσδίνουν όγκο και σώμα στο κόκκινο κρασί, ενώ οι επιθετικές προσδίνουν στυφότητα. Οι επιθετικές ταννίνες είναι μοριακού βάρους 500-3000. Κατά την παλαίωση σε ξύλινο βαρέλι σχηματίζονται, με την επίδραση του οξυγόνου, μεγάλα πολυμερή.

Μέθοδοι προσδιορισμού φαινολικών συστατικών Ολικά φαινολικά: συχνά χρησιμοποιείται η μέθοδος Folin. Η μέθοδος Folin-Ciocalteu χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό ολικών φαινολικών σε οίνους. Γενικά η Folin είναι μέθοδος αποτίμησης αντιοξειδωτικής δράσης. Την ίδια αντίδραση δίνουν κυρίως αντιοξειδωτικά όπως φαινολικά, και άλλα συστατικά όπως ανάγοντα σάκχαρα και νουκλεινικά οξέα. Ο θειώδης ανυδρίτης και το ασκορβικό οξύ που προστίθενται στους οίνους αντιδρούν σε κάποιο βαθμό. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην οξείδωση των αντιοξειδωτικών σε αλκαλικό περιβάλλον με μίγμα φωσφοβολφραμικού και φωσφομολυβδαινικού οξέος. Τα οξέα ανάγονται σε μίγμα κυανών οξειδίων του βολφραμίου (W 8 Ο 23 ) και του μολυβδαινίου (Мо 8 О 23 ). Η ένταση του κυανού χρώματος, με μέγιστο στα 700-760 nm, είναι ανάλογη των φαινολικών συστατικών. Μέτρο των ολικών φαινολικών αποτελεί η απορρόφηση στα 280 nm. Η απορρόφηση στα 320 nm αποτελεί μέτρο των υδροξυκινναμωμικών, η απορρόφηση στα 360 nm των φλαβονολών και στα 520 nm των ανθοκυανών. Οι φλαβανόλες-3 (κατεχίνες) προσδιορίζονται με αντίδραση με π- διμεθυλαμινοκινναμαλδεύδη και μέτρηση της απορρόφησης στα 640 nm. Οι ανθοκυάνες προσδιορίζονται με αποχρωματισμό με όξινο θειώδες και μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Τα διάφορα φαινολικά συστατικά συχνά προσδιορίζονται με υγρή χρωματογραφία και ανιχνευτή ορατού-υπεριώδους.

Συχνά, για τον ποσοτικό προσδιορισμό του συνόλου των ανθοκυανών χρησιμοποιούνται οι ιδιότητές τους α) να παρουσιάζουν αλλαγή χρώματος με μεταβολή του ph, και β) να σχηματίζουν άχρωμες ενώσεις με όξινα θειώδη ιόντα. Και στις δύο μεθόδους ακολουθεί μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Επίσης, η άμεση μέτρηση της απορρόφηση του οίνου στα 520 nm είναι μέτρο του συνόλου των ανθοκυανών. Ο φωτομετρικός προσδιορισμός των ταννινών βασίζεται στην ιδιότητά τους να μετατρέπονται μερικώς σε ανθοκυάνες με θέρμανση σε όξινο περιβάλλον. Οι παραγόμενες ανθοκυάνες προσδιορίζονται με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Δείκτης φαινολικών Η αποτίμηση των φαινολικών ενώσεων με βάση την απορρόφηση στα 280 nm, βασίζεται στο ότι οι βενζολικοί δακτύλιοι των φαινολικών ενώσεων απορροφούν στο υπεριώδες με μέγιστο περίπου στα 280 nm. Για τη μέτρηση χρησιμοποιείται διαυγής οίνος (ή γλεύκος), που αραιώνεται κατάλληλα με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Μετράται η απορρόφηση στα 280 nm με κυψελίδες χαλαζία του 1 cm. Ο μηδενισμός του φασματοφωτομέτρου γίνεται με απεσταγμένο/απιονισμένο νερό. Ο Δείκτης Φαινολικών (ΔΦ) = Απορρόφηση χ Αραίωση του οίνου.

Ολικά φαινολικά μέθοδος Folin Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 7,9 ml απεσταγμένο νερό και 0,1 ml οίνου (συνήθως οι λευκοί χωρίς αραίωση, ενώ οι ερυθροί με αραίωση 1:10) είτε άλλου προϊόντος. Επίσης, 0,5 ml αντιδραστηρίου Folin και 1,5 ml 20 % ανθρακικού νατρίου, και γίνεται ανάμιξη. Μετά από παραμονή 30 min και πριν τα 45 min μετράται η απορρόφηση στα 750 nm, με κυψελίδα 1 cm, με τυφλό απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών προκύπτει από πρότυπη καμπύλη γαλλικού οξέος, και εκφράζεται σε mg/l γαλλικού οξέος. Τυπική εξίσωση: C=833 χ Α, όπου С η συγκέντρωση και Α η απορρόφηση. Οι μετρήσεις της απορρόφησης πρέπει να γίνονται σε σταθερό χρόνο για όλα τα δείγματα καθόσον το παραγόμενο χρώμα εξελίσσεται με το χρόνο.

Αποτίμηση ολικών φαινολικών και ομάδων φαινολικών με την απορρόφηση στα 280, 320, 360 και 520 nm Σε 0,25 ml δείγματος προστίθενται 0,25 ml 0,1 % HCl σε αιθανόλη και 4,55 ml 2 % HCl. Μετά από ανάδευση το διάλυμα παραμένει για 15 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και στη συνέχεια μετράται η απορρόφηση στα 280 (ολικά φαινολικά), 320 (υδροξυκιναμμωμικά οξέα), 360 (φλαβονόλες) και 520 nm (ανθοκυάνες) με κυψελίδες 1 cm. Σε κάθε ένα από τα μήκη κύματος χρησιμοποιείται πρότυπη καμπύλη αναφοράς. Στα 280 nm με διάλυμα γαλλικού οξέος σε 10 % αιθανόλη (0, 25, 75, 125, 500 mg/l), C = 416,7 χ Α, στα 320 nm με διάλυμα καφεικού οξέος σε 10 % αιθανόλη (0, 25, 50, 75, 100 mg/l), C = 192,3 χ Α, στα 360 nm με διάλυμα κερκετίνης σε 100 % αιθανόλη (0, 25, 75, 125, 250 mg/l), C = 370,4 χ Α, στα 520 nm με διάλυμα μαλβιδίνης σε 10 % αιθανόλη (0, 50, 100, 200, 300, 400 mg/l), C = 909,1 χ Α.

Προσδιορισμός ταννινών φωτομετρικά Ο φωτομετρικός προσδιορισμός των ταννινών βασίζεται στην ιδιότητά τους να μετατρέπονται μερικώς σε ανθοκυάνες με θέρμανση σε όξινο περιβάλλον. Οι παραγόμενες ανθοκυάνες προσδιορίζονται με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται 4 ml οίνου (αραιωμένου 50 φορές), 2 ml απεσταγμένο νερό και 6 ml π. HCl (12 Ν). Γίνεται θέρμανση σε αμμόλουτρο στους 100 ο C για 30 min. Ακολουθεί ψύξη με τρεχούμενο νερό, αφού προηγουμένως ο σωλήνας περιτυλιχθεί με σκοτεινόχρωμο περίβλημα. Αυτό επειδή οι ανθοκυάνες είναι ασταθείς στο φώς. Προστίθενται 1 ml αιθανόλης, για να σταθεροποιήσει και να κάνει πιο έντονο το χρώμα. Μετράται η απορρόφηση στα 550 nm με κυψελίδα 1 cm, με τυφλό απεσταγμένο νερό. Για τυφλό της μεθόδου γίνεται η ίδια διαδικασία χωρίς τη θέρμανση. Η συγκέντρωση ταννινών σε g/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση : C = 19,33 χ ΔΑ, όπου C η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά απορροφήσεων του δείγματος και του τυφλού.

Προσδιορισμός ανθοκυανών με αποχρωματισμό με όξινο θειώδες Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των ανθοκυανών να δίνουν με το ιόν SO 3 H - άχρωμες ενώσεις. Στην περίπτωση αυτή πρέπει να θεωρηθεί ότι τα άλλα συστατικά του οίνου δεν συμμετέχουν και η αλλαγή του χρώματος, μετά την προσθήκη ικανής περίσσειας όξινου θειώδους άλατος, είναι ανάλογη προς την περιεκτικότητα των ανθοκυανών. Σε 1 ml οίνου προστίθεται 1 ml αιθανόλης που περιέχει 0,1 % π. HC1 και 20 ml 2% HC1. Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml από το παραπάνω μίγμα και 4 ml 15% όξινου θειώδους νατρίου που προκαλεί άμεσο αποχρωματισμό του οίνου. Σε ένα δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 10 ml από το μίγμα και 4 ml απεσταγμένο νερό. Μετά από παραμονή 20 λεπτών, μετράται η απορρόφηση στα 520 nm, με κυψελίδα 1 cm και τυφλό απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών σε mg/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση: C=875 χ ΔΑ, όπου С η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά των απορροφήσεων στις δύο περιπτώσεις.

Αποχρωματισμός με μεταβολή του ph Σε καθένα από δύο δοκιμαστικούς σωλήνες φέρονται 1 ml οίνου, 1 ml αιθανόλης με 0,1% π. HC1, και στον ένα α) 10 ml 2% HC1 (ph 0,6), ενώ στον άλλο β) 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος πη 3,5 0,2 Μ όξινο φωσφορικό νάτριο / 0,1 Μ κιτρικό οξύ). Μετράται η απορρόφηση στα 520 nm, με κυψελίδα 1 cm και τυφλό απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών σε mg/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Τυπική εξίσωση: C=385 χ ΔΑ, όπου С η συγκέντρωση και ΔΑ η διαφορά των απορροφήσεων στις δύο περιπτώσεις.

ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΟΙΝΟΥ Η οξείδωση οίνου είναι μία πορεία που λαμβάνει χώρα με δράση ελεύθερων ριζών. Έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια αρώματος την ανάπτυξη οξειδωμένου χρώματος, όπως και την ανάπτυξη οξειδωμένου αρώματος. Η πορεία αρχίζει με την αντίδραση Fenton

Οξείδωση οίνου Η οξείδωση στον οίνο δεν είναι ενζυμικό φαινόμενο. Σύμφωνα με την πρόσφατη γνώση η οξείδωση στον οίνο λαμβάνει χώρα με ρίζες υδροξυλίου. Στο ph του οίνου ο Fe(II) ανάγει το οξυγόνο προς υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο παρουσία Fe(II) μετασχηματίζεται σε ρίζες υδροξυλίου (αντίδραση Fenton) Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 +OH. + OH - Ακολούθως, με την οξείδωση των φαινολικών συστατικών από τις ρίζες υδροξυλίου ξεκινάει μια αλληλουχία αντιδράσεων. Οι κινόνες που σχηματίζονται είναι ασταθείς και αντιδρούν περαιτέρω με το σχηματισμό πολυμερών και δημιουργία καστανού χρώματος. Οι ρίζες υδροξυλίου είναι πολύ δραστικές και μη επιλεκτικές, και μπορούν να οξειδώσουν σχεδόν όλα τα συστατικά των οίνων.

Στη συνέχεια οι ρίζες υδροξυλίου, που είναι ισχυρό και μη επιλεκτικό οξειδωτικό, οξειδώνουν συστατικά των οίνων. Ακολουθεί σειρά διαφόρων αντιδράσεων. Φαινολικά συστατικά οξειδώνονται και προκύπτει χρώμα.

Τα αντιοξειδωτικά που προστίθενται στον οίνο μπορεί να αναστέλλουν το φαινόμενο της οξείδωσης-καστάνωσης των οίνων. Ο θειώδης ανυδρίτης δεσμεύει το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το ασκορβικό οξύ οξειδώνεται προς δευδροασκορβικό οξύ δεσμεύοντας οξυγόνο. Παράλληλα προκύπτει υπεροξείδιο του υδρογόνου. Έτσι, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιείται μαζί με θειώδη ανυδρίτη, ο οποίος δεσμεύει το υπεροξείδιο του υδρογόνου που προκύπτει.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Στο εργαστήριο θα γίνει μελέτη της αναστολής της οξείδωσης λευκών οίνων με θειώδη ανυδρίτη και ασκορβικό οξύ. Η ταχεία οξείδωση του οίνου πραγματοποιείται με προσθήκη υπεροξειδίου του υδρογόνου και θέρμανση. Σε 5 ml οίνου προστίθενται 25 μl διαλύματος 3 % υπεροξειδίου του υδρογόνου και ακολουθεί διατήρηση στους 60 ο C για μία ώρα. Μετά από μία ώρα μετράται η απορρόφηση στα 420 nm, που είναι δείκτης της οξείδωσης-καστάνωσης. Η επίδραση των αντιοξειδωτικών αποτιμάται θα αποτιμάται με προσθήκη τους στον οίνο, πριν την προσθήκη υπεροξείδιου του υδρογόνου και τη θέρμανση. Ο θειώδης ανυδρίτης χρησιμοποιείται σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως 50 και 100 mg/l. Επίσης ασκορβικό οξύ σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως 50 και 100 mg/l. Επιπλέον, θα χρησιμοποιηθούν μίγματα θειώδη ανυδρίτη και ασκορβικού οξέος. Γίνεται σύγκριση των διαφόρων δειγμάτων με και χωρίς την προσθήκη αντιοξειδωτικών. Επίσης, γίνεται σύγκριση γίνεται με μάρτυρα χωρίς προσθήκη και χωρίς θέρμανση.

ΑΖΩΤΟΥΧΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Ο οίνος περιέχει άζωτο με μορφή διαφόρων αζωτούχων ενώσεων σε συγκεντρώσεις 0,5 έως 4 g/l. Οι αζωτούχες ενώσεις διακρίνονται στις ανόργανες και τις οργανικές. Οι ανόργανες περιέχονται στον οίνο ως αμμωνιακά και αποτέλούν το 5 % του συνολικού αζώτου. Το υπόλοιπο 95 % αποτελούν οι οργανικές ενώσεις, κυρίως πρωτεΐνες, πολυπεπτίδια., αμινοξέα και αμίδια. Οι πρωτεΐνες (Μ-Β. > 10.000) μπορεί να φτάνουν το 10 % του συνολικού αζώτου, και είναι υπεύθυνες για το πρωτεϊνικό θόλωμα. Τα πολυπεπτίδια (Μ.Β.. < 10.000) συνιστούν το 60-80 % του συνολικού αζώτου. Τα αμινοξέα αποτελούν το 30-40 % του συνολικού αζώτου των οίνων. Στα κόκκινα κρασιά οι πρωτεΐνες ενώνονται με τις ταννίνες και καταβυθίζονται. Αντίθετα στα λευκά κρασιά παραμένουν και μπορούν να δώσουν θόλωμα πρωτεϊνών στο εμφιαλωμένο κρασί Το ανόργανο άζωτο (ΝΗ4 + ) χρησιμοποιείται από τους ζυμομύκητες, και έτσι μειώνεται κατά την ζύμωση. Αντίθετα, τα βακτήρια χρησιμοποιούν το άζωτο των αμινοξέων. Τα κόκκινα κρασιά περιέχουν, λόγω εκχύλισης των στερεών συστατικών, μεγαλύτερα ποσά αζωτούχων ενώσεων, 0,8-4 g/l, από τα λευκά κρασιά, 0,5-1,25 g/l. Μέθοδοι προσδιορισμού πρωτεινών και αμινοξέων Το ολικό άζωτο μπορεί να προσδιοριστεί με τη μέθοδο Kjeldahl. Επίσης, οι πρωτεΐνες προσδιορίζονται με τη μέθοδο, Bradford, και α-αμινοξέα με αντίδραση με νινυδρίνη.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός πρωτεϊνών Ο προσδιορισμός των πρωτεϊνών και των πολυπεπτιδίων μπορεί να γίνει με την μέθοδο Bradford. Η μέθοδος στηρίζεται στο ότι το μέγιστο απορρόφησης όξινου διαλύματος της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 μετατοπίζεται από τα 465 nm στα 595 nm με σύνδεσή της με διαλυμένες πρωτεΐνες. Η χρωστική συνδέεται κυρίως με βασικά και αρωματικά αμινοξέα ιδιαιτέρα την αργινίνη. Σε 2,5 ml αραιωμένου (1 όγκος εμπορικής χρωστικής με 4 όγκους απεσταγμένου νερού) προστίθεται κατάλληλος όγκος οίνου και γίνεται ανάδευση. Μετά από παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 5 minutes μετράται η απορρόφηση στα 595 nm. Η συγκέντρωση υπολογίζεται με τη χρήση πρότυπης καμπύλης με αλβουμίνη. Τυπική πρότυπη C (mg/l) = 103 χ ΔΑ.

Προσδιορισμός α-αμινοξέων Η προλίνη είναι το αμινοξύ που βρίσκεται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση στους περισσότερους οίνους και γλεύκη. Σε ορισμένους οίνους μάλιστα αντιπροσωπεύει το 90 % του ολικού αζώτου. Η αργινίνη είναι μετά την προλίνη το δεύτερο σε συγκέντρωση στα σταφύλια. Στην πορεία οινοποίησης μεταβολίζεται από - τους ζυμομύκητες και εξαφανίζεται. Το άζωτο των α-αμινοξέων μπορεί να προσδιοριστεί με την αντίδραση νινυδρίνης, κατά την οποία τα αμινοξέα αντιδρούν με νινυδρίνη με σχηματισμό έγχρωμου προϊόντος. Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 0,6 ml οίνου, 0,3 ml διαλύματος ασκορβικού οξέος 0,25 % και 3 ml διαλύματος νινυδρίνης 3 %. Το μίγμα θερμαίνεται σε ζέον υδατόλουτρο για 10 minutes. Μετά την ψύξη προστίθενται 3 ml απόλυτης αιθανόλης και μετράται η απορρόφηση στα 570 nm. Η συγκέντρωση υπολογίζεται με τη χρήση πρότυπης καμπύλης με λευκίνη.

ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΕΣ ΟΙΝΟΠΟΙΗΣΗΣ Χρήση ενεργών αφυδατωμένοι ζυμομυκήτων Οι ζυμομύκητες παρουσία οξυγόνου αναπνέουν και πολλαπλασιάζονται, ενώ απουσία οξυγόνου ζυμώνουν ζάχαρα με παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα και αλκοόλης και ο πολλαπλασιασμός τους είναι περιορισμένος. Παραδοσιακά η ζύμωση του γλεύκους γινόταν από την μικροχλωρίδα του περιβάλλοντος. Σήμερα χρησιμοποιούνται σε μεγάλο βαθμό ενεργοί αφυδατωμένοι ζυμομύκητες που επιλέγονται για ομαλή οινοποίηση και παραγωγή καλής ποιότητας οίνου.

Η αφυδάτωση των ζυμομυκήτων και η συσκευασία σε κενό διασφαλίζουν ζωτικότητα μέχρι τρία χρόνια. Οι αφυδατωμένοι ζυμομύκητες περιέχουν 2 έως 3 χ 10 10 κύτταρά ανά gr, τα οποία επανενεργοποιούνται άμεσα και διατηρούν πλήρως τα αρχικά τους χαρακτηριστικά. Μετά την ενυδάτωσή τους οι ζυμομύκητες μπορούν να ξεκινήσουν αμέσως την ζύμωση. Έτσι, αποφεύγεται ο κίνδυνος επιμόλυνσης και η πιθανότητα να σταματήσει η ζύμωση. Προσθήκη 20 g ανά 100 L προσφέρουν 4 έως 6 χ 10 10 κύτταρα ανά ml. Σημειώνεται ότι τα κύτταρα στη φάση της ζύμωσης είναι 60 έως 100 χ 10 10 ανά ml. Επίσης, ότι οι ζυμομύκητες της καλλιέργειας εκκίνησης πρέπει να είναι 10 φορές παραπάνω από τους ενδογενείς ζυμομύκητες. Η ενεργοποίηση των αφυδατωμένων ζυμομυκήτων, πριν την προσθήκη στο γλεύκος, γίνεται είτε σε αραιωμένο γλεύκος είτε σε ζαχαρούχο διάλυμα. Χρησιμοποιείται 5 % διάλυμα ζάχαρης, διότι σε αυτή τη συγκέντρωση οι ζυμομύκητες ενυδατώνονται και πολλαπλασιάζονται. Εναλλακτικά χρησιμοποιείται αραιωμένο γλεύκος (3 όγκοι γλεύκος και 7 όγκοι πόσιμο νερό). Στο μη αραιωμένο γλεύκος η συγκέντρωση των ζαχάρων είναι πολύ υψηλή και εμποδίζει τη σωστή ενυδάτωση. Αντίθετα, στο καθαρό νερό τα κύτταρα προσροφούν πολύ νερό και διαρηγνύονται.

Οι ενυδατωμένοι ζυμομύκητες προστίθενται στο γλεύκος με διασφάλιση καλής διασπορά τους. Δόση 20 g/ 100 L θεωρείται άριστη. Κατά την προσθήκη των ζυμομυκήτων πρέπει να αποφεύγονται, αλλαγές θερμοκρασίας πάνω από 5/7 C. Έτσι, μετά την ενυδάτωση των ζυμομυκήτων γίνεται ανάμιξη με ποσότητα γλεύκος για μείωση της θερμοκρασίας πριν την προσθήκη στο προς ζύμωση γλεύκος. Από την αρχή της ζύμωσης γίνεται προσθήκη αζωτούχων (αμμωνιακών είτε οργανικού αζώτου) και επίσης αδρανών ζυμομυκήτων (εμπλουτισμός σε βιταμίνες, αμινοξέα, λιπαρά οξέα, στερόλες). Ακόμη, εφαρμόζεται ήπιος αερισμός 36 έως 48 ώρες από την εκκίνηση της ζύμωσης που ευνοεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ώστε να υπάρχει μεγάλος πληθυσμός κυττάρων στο τέλος της ζύμωσης χωρίς κίνδυνο οξείδωσης. Η πορεία της ζύμωσης ελέγχεται με μέτρηση της θερμοκρασίας και της μείωσης της πυκνότητας του γλεύκους.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Ενεργοποίηση ζυμομύκητα Σε 5 % διάλυμα ζάχαρης σε πόσιμο νερό 30-35 C προστίθενται 100 g/l αφυδατωμένων ζυμομυκήτων. Ακολουθεί ήπια ανάδευση για λήψη αιωρήματος του ζυμομύκητα. Το αιώρημα αφήνεται 20 minutes για ενυδάτωση των ζυμομυκήτων. Προκύπτει πλούσιος αφρός με γλυκιά οσμή, που δεικνύει την ενυδάτωση του ζυμομύκητα. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Ο ζυμομύκητας που ενεργοποιήθηκε φέρεται σε πλάκα μικροσκοπίου και γίνεται άμεση παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Γίνεται παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων, η εκβλάστηση και τα ασκοσπόρια. Με τη μικροσκοπική παρατήρηση γίνεται και διάκριση μεταξύ γενών ζυμομυκήτων. Οι ζυμομύκητες Sacharomyces cereviseae διακρίνονται εύκολα από αυτούς του γένους Kloeckera. Στο σχήμα παρατίθενται φωτογραφίες στελεχών ζυμομυκήτων που απομονώθηκαν από αυθόρμητες ζυμώσεις γλεύκους. Μπορεί, από τη μορφολογία των κυττάρων, να γίνει διάκριση στελεχών Sacharomyces cereviseae και στελεχών Kloeckera apiculata.

Καλλιέργεια ζυμομυκήτων Οι ζυμομύκητες έχουν λιγότερες θρεπτικές απαιτήσεις από τα βακτήρια. Το πιο διαδεδομένο θρεπτικό υλικό είναι το YPD (Yeast Peptone Dextrose) που περιέχει πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, γλυκόζη 20, 10 και 20 g/l αντίστοιχα. Γίνεται καλλιέργεια ζυμομύκητα Saccharomyces cerevesiae, αφυδατωμένος που ενεργοποιήθηκε. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται θρεπτικός ζωμός YPD. Εμβολιάζεται ο ζωμός με το αιώρημα του ζυμομύκητα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Επιπλέον, προστίθεται ο θειώδης ανυδρίτης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Σημειώνεται ότι το μεταμπισουλφίτ αποδίδει περίπου 50 % θειώδη ανυδρίτη. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη ζυμομύκητα είτε θειώδη ανυδρίτη. Επίσης, χρησιμοποιείται μίγμα θειώδη ανυδρίτη και σορβικού οξέος. Στους δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετείται σωληνάκι Durcham, και γίνεται επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham).

Επίδραση θειώδη ανυδρίτη στην ανάπτυξη ζυμομύκητα Ως καλλιέργεια χρησιμοποιείται ζυμομύκητας Saccharomyces cerevisae (μαγιά κρασιού). Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται θρεπτικός ζωμός (πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, γλυκόζη, 20, 10 και 20 g/l, αντίστοιχα). Παρασκευάζεται αιώρημα της μαγιάς, και εμβολιάζεται ο ζωμός χυμός με το αιώρημα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Προστίθενται θειώδης ανυδρίτης σε συγκεντρώσεις 20, 100, 200 mg/l. Επίσης, χρησιμοποιούνται μίγματα θειώδη ανυδρίτη και σορβικού οξέος. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη μαγιάς είτε συντηρητικού. Τοποθετείται στους δοκιμαστικούς σωλήνες σωληνάκι Durcham ανάστροφα, και γίνεται επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham).

ΕΝΩΣΕΙΣ ΑΡΩΜΑΤΟΣ Το άρωμα των οίνων διακρίνεται σε πρωτογενές, δευτερογενές και τριτογενές. Επίσης, υπάρχει διάκριση μεταξύ του αρώματος και του μπουκέτου του οίνου. Το άρωμα είναι σχετικά απλή σύνθεση, ενώ το μπουκέτο είναι μίξη πολλών αρωμάτων. Το πρωτογενές η ποικιλιακό άρωμα οφείλεται σε ενώσεις αρώματος των σταφυλιών. Τέτοιες είναι τερπενικές αλκοόλες, εστέρες, ανώτερες αλκοόλες και πτητικά παράγωγα φαινολών. Επίσης, στα οσμηρά συστατικά του σταφυλιού είναι η εξανόλη και η εξενόλη, που προσδίνουν χορτώδη οσμή. Το δευτερογενές η ζύμωσης οφείλεται σε ενώσεις που παράγονται κατά τη ζύμωση του γλεύκους. Τέτοιες είναι εστέρες, όπως ο οξικός αιθυλεστέρας, ο ισοαμυλικός αιθυλεστέρας, ο καπρονικός αιθυλεστέρας, ο καπρυλικός αιθυλεστέρας, ανώτερες αλκοόλες, όπως η προπανόλη, η ισοβουτανόλη, η ισοαμυλική αλκοόλη, λιπαρά οξέα και άλλες. Επίσης, κατά τη μηλογαλακτική ζύμωση παράγονται ενώσεις αρώματος, όπως ο γαλακτικός αιθυλεστέρας. Το τριτογενές η παλαίωσης οφείλεται σε ενώσεις που δημιουργούνται κατά την ωρίμανση και παλαίωση του οίνου. Σε αναγωγικές συνθήκες δημιουργούνται οι ενώσεις του λεγόμενου μπουκέτου των οίνων. Επίσης, δημιουργούνται εστέρες των οξέων του οίνου με την αιθανόλη, όπως ηλεκτρικός και μηλικός αιθυλεστέρας.

Πολλές ενώσεις με το χαρακτηριστικό τους άρωμα συμβάλλουν στο άρωμα του οίνου. Οι εστέρες συμβάλλουν στο φρουτώδες άρωμα. Ο καπρονικός αιθυλεστέρας έχει άρωμα βιολέτας και ο ισοαμυλικός αιθυλεστέρας μπανάνας. Από άλλες ενώσεις η φαχνυλο-2-αιθανόλη έχει άρωμα τριαντάφυλλου, η εξανόλη χόρτου, το διακετύλιο βουτύρου. Από την άλλη πλευρά, διάφορες ενώσεις έχουν αρνητική επίδραση στο άρωμα του οίνου. Παράδειγμα, με οξείδωση μετά την μείωση του φρουτώδους αρώματος παράγεται άρωμα οξείδωσης. Με οξείδωση της αιθανόλης παράγεται ακαταλδεύδη, με έντονο χαρακτηριστικό άρωμα. Οι εστέρες και οι ανώτερες αλκοόλες συμβάλλουν σημαντικά στο άρωμα των οίνων. Οι αιθυλεστέρες υπάρχουν σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες και μικρότερες από το κατώφλι αντίληψής τους. Μεταξύ των εστέρων είναι ο οξικός αιθυλεστέρας που έχει χαρακτηριστική οσμή. Σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις συμβάλλει στο σύνθετο του αρώματος των οίνων, ενώ σε υψηλές (παράδειγμα > 180 mg/l) έχει αρνητική επίδραση. Επίσης, οι ανώτερες αλκοόλες σε μικρές συγκεντρώσεις συμβάλλουν στο σύνθετο του αρώματος των οίνων, ενώ σε μεγαλύτερες (παράδειγμα > 300 η 500-600 mg/l) έχουν ανεπιθύμητη επίδραση, προσδίνουν πικάντικο και χορτώδη χαρακτήρα.

Προσδιορισμός ενώσεων αρώματος Οι ενώσεις αρώματος των οίνων προσδιορίζονται κυρίως με αέριο χρωματογραφία και ανιχνευτή ανάλογα με τις ενώσεις που προσδιορίζονται. Συχνά χρησιμοποιείται ανιχνευτής ιονισμού φλόγας (GC-FID). Πολύ επιτυχής είναι ο συνδυασμός αέριας χρωματογραφίας με φασματοσκοπία μάζας (GC-MS). Για πτητικές ενώσεις σε σχετικά μεγάλες συγκεντρώσεις μπορεί να γίνει απευθείας έγχυση του δείγματος οίνου, ενώ πιο συχνά προηγείται εκχύλιση. Εφαρμόζεται εκχύλιση υγρού-υγρού, εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) και μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME). Προσδιορισμός των συνολικών πτητικών εστέρων και των συνολικών ανώτερων αλκοολών μπορεί να γίνει φωτομετρικά, μετά από απόσταξη του οίνου και αντίδραση με ειδικά αντιδραστήρια.

Συνολικοί πτητικοί εστέρες και συνολικές ανώτερες αλκοόλες Οι πτητικοί εστέρες αντιδρούν με υδροξυλαμίνη και δημιουργούν προϊόν που αντιδρά με τρισθενή σίδηρο και δημιουργεί έγρωμο σύμπλοκο.

Οι ανώτερες αλκοόλες, με εξαίρεση την 1-προπανόλη, παρουσία πυκνού θειικού οξέος αντιδρούν με π-διμεθυλάμινο βενζαλδεύδη (είτε άλλη αρωματική αλδεύδη όπως η βανιλίνη), και σχηματίζουν έγχρωμο παράγωγο που απορροφά στα 525 nm. Το θεϊκό οξύ αφυδατώνει τις αλκοόλες προς ακόρεστους υδρογονάνθρακες που αντιδρούν με αρωματικές αλδεύδες. Οι αντιδράσεις δεν είναι στοιχειομετρικές. Σημειώνεται ότι και άλλες ενώσεις (αλδεύδες, κετόνες, ακετάλες, τερπένια) με το θειικό οξύ αφυδατώνονται προς ακόρεστους υδρογονάνθρακες. Έτσι, για αποφυγή παρεμποδίσεων εφαρμόζεται προκατεργασία του αποστάγματος με άλας αργύρου.