EFFECTS OF BISPHENOL-A (BPA) ON SEX DIFFERENTIATION AND ON GROWTH OF F1 GENERATION NAYPLII OF THE AMPHIGONIC POPULATION Artemia franciscana EKONOMOU G. 1*, CASTRITSI-CATHARIOS J. 1, TSIROPOULOS Ν.G. 2, NEOFITOU C. 1, EXADACTYLOS A. 1 1 Department of Ichthyology and Aquatic Environment, School of Agricultural Sciences, University of Thessaly, Fytokou str., 38446, Nea Ionia, Volos, Greece 2 Department of Agriculture Crop Production and Rural Environment, School of Agricultural Sciences, University of Thessaly, Fytokou str., 38446, Nea Ionia, Volos, Greece Abstract Every year large quantities of bisphenol-a are channeled to the environment. Σhis compound acts as an endocrine disrupter and modifies the action of endogenous estrogen in organisms exposed to it. Since Artemia franciscana is a well established test animal for acute toxicity tests, the aim of this study was to examine the effect of BPA on sex differentiation of the strain A. franciscana and on the growth of the F1 generation. The results showed variation in sex, as the ratio Male / Female in controls was 0.92:1, while in all treatments with BPA more males were found than females, with the ratio Male / Female to reach the value 2:1 at the concentration of 35 ppm. In addition, the measurement of the length of the F1 generation nauplii showed inhibition of growth when the parental generation was exposed to BPA concentrations higher than 10 ppm. Key words: Artemia franciscana, bisphelon-a,sex differentiation, growth *Corresponding author: Ekonomou George (geoikono@hotmail.com) ΔΠΗΓΡΑΖ ΣΖ ΓΗΦΑΗΝΟΛΖ-Α (ΒΡΑ) ΣΖ ΦΤΛΔΣΗΚΖ ΓΗΑΦΟΡΟΠΟΗΖΖ ΚΑΗ ΣΖΝ ΑΝΑΠΣΤΞΖ ΣΧΝ ΝΑΤΠΛΗΧΝ ΣΟΤ ΑΜΦΗΓΟΝΗΚΟΤ ΠΛΖΘΤΜΟΤ Artemia franciscana F1 ΓΔΝΗΑ ΟΗΚΟΝΟΜΟΤ Γ. 1*, ΚΑΣΡΗΣΖ-ΚΑΘΑΡΗΟΤ Η. 1, ΣΗΡΟΠΟΤΛΟ Ν. 2, ΝΔΟΦΤΣΟΤ Υ. 1, ΔΞΑΓΑΚΣΤΛΟ Α. 1 1 Σιήια Γεςπμκίαξ Ηπεομθμβίαξ ηαζ Τδάηζκμο Πενζαάθθμκημξ, πμθή Γεςπμκζηχκ Δπζζηδιχκ, Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ, Οδυξ Φοηυημο, 38446, Ν. Ηςκία Μαβκδζίαξ, Δθθάδα 2 Σιήια Γεςπμκίαξ Φοηζηήξ Παναβςβήξ ηαζ Αβνμηζημφ Πενζαάθθμκημξ, πμθή Γεςπμκζηχκ Δπζζηδιχκ, Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ, Οδυξ Φοηυημο, 38446, Ν. Ηςκία Μαβκδζίαξ, Δθθάδα Πεξίιεςε Κάεε πνυκμ δζμπεηεφμκηαζ ζημ πενζαάθθμκ ιεβάθεξ πμζυηδηεξ δζζθαζκυθδξ-α. Έπεζ δζαπζζηςεεί υηζ δ έκςζδ αοηή δνα ςξ εκδμηνζκζηυξ δζαηανάηηδξ ηαζ ηνμπμπμζεί ηδ δνάζδ ηςκ εκδμβεκχκ μζζηνμβυκςκ ζημοξ μνβακζζιμφξ πμο έπμοκ εηηεεεί ζε αοηήκ. Γεδμιέκμο υηζ δ Artemia franciscana είκαζ ζδακζηυ γχμ βζα πεζνάιαηα μλείαξ ημλζηυηδηαξ, ζημπυξ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ ήηακ κα ιεθεηδεεί δ επίδναζδ ηδξ ΒΡΑ ζηδ θοθεηζηή δζαθμνμπμίδζδ ημο ζηεθέπμοξ A. franciscana ηαζ ζηδκ ακάπηολδ ηδξ F1 197
βεκζάξ πμο πνμέηορε απυ ηα άημια πμο είπακ εηηεεεί ζηδ ΒΡΑ. Απυ ηα πεζνάιαηα παναηδνήεδηε δζαθμνμπμίδζδ ζημ θφθμ ηαεχξ δ ακαθμβία Ανζεκζηά/Θδθοηά ζημοξ ιάνηονεξ ήηακ 0,92:1, εκχ ζε υθεξ ηζξ επελενβαζίεξ ιε ΒΡΑ ηα ανζεκζηά ήηακ πενζζζυηενα απυ ηα εδθοηά, ιε ηδκ ακαθμβία Ανζεκζηά/Θδθοηά κα θηάκεζ κα ζζμφηαζ ιε 2:1 ιεηά απυ έηεεζδ ζε ζοβηέκηνςζδ 35 ppm. Δπίζδξ, απυ ηδ ιεθέηδ ημο ιήημοξ ηςκ καοπθίςκ ηδξ F1 βεκζάξ, πνμέηορε ακαζημθή ηδξ ακάπηολήξ ημοξ υηακ δ παηνζηή βεκζά είπε εηηεεεί ζε ζοβηεκηνχζεζξ ΒΡΑ πάκς απυ 10 ppm Λέμεηο θιεηδηά: Artemia franciscana, δηζθαηλόιε-α, θπιεηηθή δηαθνξνπνίεζε, ηαρύηεηα αλάπηπμεο *οββναθέαξ επζημζκςκίαξ: Οζημκυιμο Γεχνβζμξ (geoikono@hotmail.com) Δηζαγσγή H δζζθαζκυθδ Α (ΒΡΑ) είκαζ εκδμηνζκζηυξ δζαηανάηηδξ πμο ακήηεζ ζηα λεκμμζζηνμβυκα ηαζ πνμηαθεί δζαηαναπέξ ηονίςξ ζηδκ ακάπηολδ ημο ακαπαναβςβζημφ ζοζηήιαημξ, ηαεχξ ηνμπμπμζεί ηδ δνάζδ ηςκ εκδμβεκχκ μζζηνμβυκςκ (Crain et al. 2007). Ζ ΒΡΑ είκαζ ιία μνβακζηή πδιζηή έκςζδ πμο πανάβεηαζ ζε ιεβάθεξ πμζυηδηεξ ηάεε πνυκμ, πνδζζιμπμζείηαζ ηονίςξ ζηδκ ηαηαζηεοή πθαζηζηχκ (Staples et al. 1998) ηαζ απυ ηδκ επελενβαζία ημοξ εθεοεενχκμκηαζ ζηδκ αηιυζθαζνα πάκς απυ 100 ηυκμζ εηδζίςξ (Tsai 2006). Δπεζδή ηα οπμθείιιαηα BPA απυ ηδκ παναβςβή, ηδ ιεηαπμίδζδ ηαζ ηα ενβμζηάζζα επελενβαζίαξ θοιάηςκ δζμπεηεφμκηαζ ζημ οδάηζκμ πενζαάθθμκ, ηα ηεθεοηαία πνυκζα μζ πενζζζυηενεξ ένεοκεξ έπμοκ επζηεκηνςεεί ζηδ ιεθέηδ ηδξ ημλζηήξ ηδξ δνάζδξ ιε έιθαζδ ζημοξ οδνυαζμοξ μνβακζζιμφξ (Staples et al. 2002, Cousins et al. 2002). Ζ ανηέιζα, ακ ηαζ απμηεθεί έκακ non target organism, είκαζ ζφιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία ζδακζηυ πεζναιαηυγςμ βζα πεζνάιαηα μλείαξ ημλζηυηδηαξ (MacRae et al 1988, Warner et al. 1989). Πνυζθαηα δδιμζζεοιέκδ ένεοκα βζα ηδκ ημλζηυηδηα ηδξ ΒΡΑ ζηδκ ανηέιζα (Castritsi-Catharios et al. 2013), δζαπίζηςζε υηζ υζμ αολάκεηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ΒΡΑ ιεζχκεηαζ ημ ιήημξ ηςκ πεζναιαηυγςςκ ηαζ δ εακαηδθυνμξ ζοβηέκηνςζδ LC50 ανέεδηε 44,8 ppm βζα 24 h έηεεζδξ ηαζ 34,7 ppm βζα 48 h έηεεζδξ. ημπυξ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ είκαζ δ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηδξ BPA ζηδ θοθεηζηή δζαθμνμπμίδζδ ηςκ αηυιςκ ημο ζηεθέπμοξ Artemia franciscana ηαζ δ πζεακή επίδναζή ηδξ ζηδκ ακάπηολδ ηδξ 2 δξ βεκζάξ πμο εα πνμηφρεζ απυ ηα άημια πμο είπακ εηηεεεί ζηδ ΒΡΑ. Τιηθά θαη Μέζνδνη Ζ παναζηεοή δζαθοιάηςκ δζζθαζκυθδξ-α (ΒΡΑ) έβζκε ζφιθςκα ιε ημ πνςηυημθθμ ηςκ Fun et al. (2007). Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ δζαθοιάηςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ήηακ 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25 ηαζ 35 ppm. Κφζηεζξ ημο ηανηζκμεζδμφξ Α. franciscana ημπμεεηήεδηακ βζα εηηυθαρδ ζε ζοκεεηζηυ εαθαζζζκυ κενυ 35. Μεηά ηδκ εηηυθαρδ ζε ηάεε ζοβηέκηνςζδ ΒΡΑ εηηέεδηακ 50 καφπθζμζ βζα 24 h ηαζ ζηδ ζοκέπεζα μζ καφπθζμζ ιεηαθένεδηακ ζε ηαεανυ ζοκεεηζηυ εαθαζζζκυ κενυ 35. Ζ ηαθθζένβεζα πναβιαημπμζήεδηε ζε ηςκζηέξ θζάθεξ ημο 1 L πμο πενζείπακ 500 ml ζοκεεηζημφ εαθαζζζκμφ κενμφ, ηάης απυ ζηαεενέξ ζοκεήηεξ (εενιμηναζία 24-26 μ C, 35 S, ζοκεπήξ πανμπή μλοβυκμο ηαζ ζοκεπήξ θςηζζιυξ 3000-4000 lux). Σα πεζναιαηυγςα ηνεθυηακ ιε ιαβζά ηαζ ηάεε ιένα ηα κεηνά άημια απμιαηνφκμκηακ. Μεηά ηδκ εκδθζηίςζδ ιεηνήεδηε δ ακαθμβία ανζεκζηχκ ηαζ εδθοηχκ ηαζ ημπμεεηήεδηακ ζε γεοβάνζα λεπςνζζηά ιέπνζ κα δχζμοκ απμβυκμοξ. Γζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηδξ ΒΡΑ ζηδκ ακάπηολδ ηδξ F1 βεκζάξ, απυ ηάεε ζοβηέκηνςζδ θήθεδηακ μζ απυβμκμζ ηνζχκ γεοβανζχκ ηαζ ιεηνήεδηε ημ μθζηυ ιήημξ ημοξ ζηζξ 24, 48 ηαζ 72 h ζε ζηενεμζηυπζμ ζοκδεδειέκμ ιε ηάιενα, ιε ηδ πνήζδ ημο θμβζζιζημφ analysis getit 5.1. Γζα ηζξ ιεηνήζεζξ ιήημοξ πνδζζιμπμζήεδηε ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ANOVA βζα κα ελαηνζαςεεί εάκ οπήνπακ ζηαηζζηζηχξ ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ιεηαλφ ημοξ. Έβζκακ ηνεζξ επακαθήρεζξ ημο πεζνάιαημξ βζα κα δζαπζζηςεεί εάκ είπαιε επακαθδρζιυηδηα ζηα απμηεθέζιαηα. Πνμηεζιέκμο κα βίκεζ δζενεφκδζδ ηδξ ζηαεενυηδηαξ ηςκ δζαθοιάηςκ ΒΡΑ ιε ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο, θήθεδηε δείβια κενμφ απυ ηάεε ηαθθζένβεζα ηαηά ηδκ ημπμεέηδζδ ηςκ καφπθζςκ ζηα δζαθφιαηα BPA ηαζ ηαηά ηδκ απμιάηνοκζή ημοξ απυ αοηά. Σα δείβιαηα ιεηνήεδηακ ζε ζφζηδια οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ορδθήξ απυδμζδξ (HPLC) ηφπμο Agilent 1100 ιε ακίπκεοζδ ζηα 230 nm. 198
Απνηειέζκαηα φιθςκα ιε ηα απμηεθέζιαηα ηςκ ακαθφζεςκ ηςκ κενχκ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ιε ημ ζφζηδια HPLC, ανέεδηε υηζ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ BPA ζημ κενυ δε ιεηααθήεδηε ζε υθα ηα επίπεδα ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ πμο δμηζιάζηδηακ (3-35 mg/l). Πίλαθαο 1. Απνηειέζκαηα αλαινγίαο θχινπ θαη ζλεζηκφηεηαο κεηά απφ έθζεζε ηνπ ζηειέρνπο A. franciscana ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ΒΡΑ. A Θ Α/Θ Θκδζζιυηδηα Θκδζζιυηδηα % Μάνηονεξ 23 25 0,92:1 2 4 3 ppm 26 23 1,13:1 1 2 5 ppm 26 24 1,08:1 0 0 8 ppm 24 21 1,14:1 5 10 10 ppm 30 16 1,88:1 4 8 15 ppm 24 17 1,41:1 9 18 20 ppm 21 15 1,40:1 14 28 25 ppm 20 13 1,54:1 13 26 35 ppm 20 10 2,00:1 20 40 Α= Αξζεληθά, Θ= Θειπθά, Α/Θ= Αλαινγία αξζεληθψλ πξφο ζειπθά Ζ ακαθμβία θφθμο ηαζ δ εκδζζιυηδηα ηδξ παηνζηήξ βεκζάξ ημο ζηεθέπμοξ A. franciscana πανμοζζάγμκηαζ ζημκ Πίκαηα 1. Σα απμηεθέζιαηα απυ ηδ ιέηνδζδ ημο ιήημοξ ηςκ καοπθίςκ 2 δξ βεκζάξ ηαζ απυ ηδ ζηαηζζηζηή ημοξ επελενβαζία δίκμκηαζ ζημ πήια 1 ηαζ ζημκ Πίκαηα 2, ακηίζημζπα. 199
ρήκα 1. Μήθνο ησλ λαχπιησλ ηεο F1 γεληάο πνπ πξνήιζαλ απφ γνλείο πνπ είραλ εθηεζεί ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ΒΡΑ Πίλαθαο 2. Απνηειέζκαηα κήθνπο ησλ λαππιίσλ (F1) πνπ πξνέθπςαλ απφ γνλείο πνπ είραλ εθηεζεί ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξψζεηο ΒΡΑ. Οη ηηκέο ηνπ κήθνπο ησλ λαππιίσλ πνπ είραλ ζηαηηζηηθά ζεκαληηθή δηαθνξά ζε ζρέζε κε ηνπο κάξηπξεο παξνπζηάδνληαη κε θίηξηλν ρξψκα 24 h 48 h 72 h AVG (ιm) SD (ιm) AVG (ιm) SD (ιm) AVG (ιm) SD (ιm) Μάνηονεξ 765,95 43,15 801,34 32,23 927,43 62,11 3 ppm 760,59 51,46 797,75 25,91 903,31 57,66 5 ppm 741,06 34,76 782,00 49,08 886,94 52,64 8 ppm 720,82 33,49 752,16 35,66 859,78 55,32 10 ppm 713,55* 44,75 734,97* 22,12 827,65* 43,07 15 ppm 701,77** 51,22 718,53* 47,62 812,74** 54,16 20 ppm 695,30** 39,83 708,44** 51,43 800,40** 47,88 25 ppm 682,11** 52,31 693,99** 41,79 786,13** 65,79 35 ppm 675,45** 46,87 690,89** 57,01 764,52** 60,55 ηαηζζηζηά ζδιακηζηή δζαθμνά ζε επίπεδμ *P<0,05 ή **P<0,005. AVG (Average) = Μέζδ ηζιή μθζημφ ιήημοξ, SD (Standard Deviation) = Σοπζηή Απυηθζζδ. 200
πδήηεζε Απυ ηα απμηεθέζιαηα πνμέηορε υηζ δ εκδζζιυηδηα ήηακ ακάθμβδ πνμξ ηδ ζοβηέκηνςζδ ΒΡΑ ζηδκ μπμία είπακ εηηεεεί ηα πεζναιαηυγςα. Ζ ιέβζζηδ εκδζζιυηδηα (40%) πανμοζζάζηδηε ζηδ ιεβαθφηενδ ζοβηέκηνςζδ δζζθαζκυθδξ-α (35 ppm) πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηα ζοβηεηνζιέκα πεζνάιαηα (Πίκαηαξ 1). θεξ μζ ζοβηεκηνχζεζξ BPA ήηακ οπμεακάηζεξ (δ εκδζζιυηδηα ήηακ ιζηνυηενδ απυ 50%) ηαεχξ δ LC50 βζα 24 h έηεεζδξ ηδξ A. franciscana ζηδ ΒΡΑ είκαζ 44,8 ppm (Castritsi-Catharios et al. 2013). ηα άημια πμο εηηέεδηακ ζε ΒΡΑ παναηδνήεδηε δζαθμνμπμίδζδ ζημ θφθμ ζε ζπέζδ ιε ημοξ ιάνηονεξ. οβηεηνζιέκα, ζημοξ ιάνηονεξ ηα εδθοηά άημια ήηακ πενζζζυηενα ηαζ δ ακαθμβία Ανζεκζηά/Θδθοηά ήηακ 0,92:1. Ακηίεεηα, ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ιε ΒΡΑ ηα ανζεκζηά ήηακ πενζζζυηενα απυ ηα εδθοηά ιε ηδκ ακαθμβία Ανζεκζηά/Θδθοηά κα θηάκεζ κα ζζμφηαζ ιε 2:1 ζηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ 35 ppm. Αοηυ πζεακχξ κα μθείθεηαζ ζηζξ δζαηαναπέξ ζημ ακαπαναβςβζηυ ζφζηδια πμο πνμηαθεί δ ΒΡΑ (Crain et al. 2007) ηαζ ζοιθςκεί ιε ιζα ιεθέηδ ηςκ Monje et al. (2009) πμο έβζκε ζε ανμοναίμοξ ηαζ δζαπζζηχεδηε υηζ δ επίδναζδ ηδξ ΒΡΑ αθθμζχκεζ ιυκζια ηδκ δνάζδ ηςκ μζζηνμβυκςκ. Απυ ηδ ιέηνδζδ ημο ιήημοξ ηςκ καοπθίςκ ηδξ F1 βεκζάξ, ανέεδηε ακαζημθή ζηδκ ακάπηολή ημοξ ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα ηαζ ζηζξ ηνεζξ πνμκζηέξ ζηζβιέξ πμο ιεθεηήεδηακ. Σμ ιήημξ ηςκ καοπθίςκ ήηακ ιζηνυηενμ υζμ ιεβαθφηενδ ήηακ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ΒΡΑ πμο είπε εηηεεεί δ παηνζηή βεκζά. Απυ ηδ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ANOVA πνμέηορε υηζ ζημοξ απυβμκμοξ ηςκ αηυιςκ πμο είπακ εηηεεεί ζε ζοβηεκηνχζεζξ ΒΡΑ 10 ppm ηαζ πάκς, ημ ιήημξ δζέθενε ζηαηζζηζηά ζδιακηζηά (P<0,05) ζε ζπέζδ ιε ημ ιήημξ ηςκ ιανηφνςκ (Πίκαηαξ 2). Ζ παναηήνδζδ αοηή ζοιθςκεί ιε ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πνμδβμφιεκδξ ένεοκαξ πμο είπε βίκεζ απυ ημοξ Castritsi-Catharios et al. (2013) βζα ηδκ επίδναζδ ηδξ ΒΡΑ ζημ ζηέθεπμξ A. franciscana, υπμο απμδείπεδηε δ ακαζηαθηζηή ηδξ δνάζδ ζηδκ ηαπφηδηα ακάπηολδξ ηαζ ημ ιέβεεμξ καοπθίςκ ζηαδ. ΗΗ-ΗΗΗ πμο είπακ εηηεεεί. Δπίζδξ, δ ακαζημθή ηδξ ακάπηολδξ ημο ζηεθέπμοξ A. franciscana ιεηά απυ έηεεζή ημο ζε ημλζηά έπεζ ακαθενεεί ηαζ ζηδκ ενβαζία ηςκ Castritsi-Catharios et al. (2014), υηακ ιεθέηδζακ ηδκ επίδναζδ ηςκ οθαθμπνςιάηςκ ζηδκ ηαπφηδηα ακάπηολδξ ηςκ καοπθίςκ. Απυ αοηυ ζοιπεναίκμοιε υηζ μζ ημλζηέξ μοζίεξ δνμοκ ακαζηαθηζηά ζηδκ ακάπηολδ ημο ζοβηεηνζιέκμο μνβακζζιμφ ηαζ δ πνμηαθμφιεκδ ακαζημθή είκαζ ακάθμβδ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ημλζηήξ μοζίαξ αηυιδ ηαζ ζε οπμεακάηζεξ ζοβηεκηνχζεζξ. Δπεζδή δ ανηέιζα απμηεθεί μνβακζζιυ οπυδεζβια βζα ηα ηανηζκμεζδή εα ιπμνμφζε κα αζηζμθμβδεεί ζημ άιεζμ ιέθθμκ ημ θαζκυιεκμ ημο κακζζιμφ ηςκ ηανηζκμεζδχκ ζε νοπαζιέκμοξ οδάηζκμοξ μζηυημπμοξ. Βηβιηνγξαθία Castritsi-Catharios J., Alambritis G., Miliou H., Cotou E., Zouganelis D.G. (2014). Comparative Toxicity of Tin Free Self-Polishing Copolymer Antifouling Paints and Their Inhibitory Effects on Larval Development of a Not-Target Organism. Materials Sciences and Applications 5, 158-169. Castritsi-Catharios J., Syriou V., Miliou H., Zouganelis D.G. (2013). Toxicity effects of bisphenol A to the nauplii of the brine shrimp Artemia franciscana. Journal of Biological Research- Thessaloniki 19, 38-45. Cousins I.T., Staples C.A., Klecka G.M., Mackay D. (2002). A Multimedia Assessment of the Environmental Fate of Bisphenol A. Human and Ecological Risk Assessment 8(5), 1107-1135. Crain A.D., Eriksen M., Iguchi T., Jobling S., Laufer H., LeBlanc G.A., Guillette LJ.Jr. (2007). An ecological assessment of Bisphenol A: Evidence from comparative biology. Reproductive Toxicology 24, 225-239. Fan J., Guo H., Liu G., Peng P. (2006). Simple and sensitive fluorimetric method for determination of environmental hormone bisphenol A based on its inhibitory effect on the redox reaction between peroxyl radical and rhodamine 6G. Analytica Chimica Acta 585, 134-138. MacRae T.H., Bagshaw J.C., Warner A.H. (1988). Biochemical and cell biology of Artemia. CRC Press Inc, Boca Raton, FL. 201
Monje L., Varayoud J., Munoz-de-Toro M., Luque E.H. Ramos J.G. (2009). Neonatal exposure to bisphenol A alters estrogen dependent mechanisms governing sexual behavior in the adult female rat. Reproductive Toxicology 28(4), 435-442. Staples C.A., Dorn P.B., Klecka G.M., O Block S.T., Harris L.R. (1998). A review of the environmental fate, effects, and exposures of bisphenol A. Chemosphere 36(10), 2149-2173. Staples C.A., Woodburn K., Caspers N., Hall T., Kleka G. (2002). A Weight of Evidence Approach to the Aquatic Hazard Assessment of Bisphenol A. Human and Ecological Risk Assessment 8(5), 1083-1105. Tsai W.T. (2006). Human health risk on environmental exposure to bisphenol-a: a review. Journal of Environmental Science and Health C 24, 225-255. Warner A.H., MacRae T.H., Bagshaw J.C. (1989). Cell and molecular biology of Artemia development. Plenum Press, NY. 202