Τεχνικές επιλεκτικής απομόνωσης μικροοργανισμών από περιβαλλοντικά δείγματα Γ. Κανινή Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τομέας Βοτανικής Πανεπιστήμιο Αθηνών
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Sampling : the policy of inferring the behavior of a whole batch by studying a fraction of it We can t count/ identify all of the organisms in most ecological systems so we sample a portion of the system and extrapolate our findings to estimate the density/composition of the entire system
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Α. Χρονική περίοδος / συχνότητα Β. Θέση δειγματοληψίας Γ. Αριθμός και διάταξη θέσεων δειγματοληψίας Δ. Όγκος δείγματος Ε. Όργανα δειγματοληψίας
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Α. Χρονική περίοδος / συχνότητα επίδραση καιρικών συνθηκών στο δείγμα (θερμοκρασία, υγρασία, κυματισμός κ.τ.λ.) wet dry sand ανταγωνισμός Μεταβατικές συνθήκες clay μη ανταγωνισμός
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Α. Χρονική περίοδος / συχνότητα επίδραση καιρικών συνθηκών στη φυσιολογία (σχηματισμός ενδοσπορίων) - Στόχευση συγκεκριμένων γενών πχ Streptomyces - Δυσκολία ανάκτησης συχνότητα εξωγενών παρεμβάσεων (πχ περιοδικότητα εναπόθεσης αποβλήτου, λίπανσης, οργώματος) - Ενίσχυση ανταγωνισμού μεταξύ ειδών - Πιθανή προσρόφηση μικροοργανισμών σε συστατικά αποβλήτου
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Β. Θέση δειγματοληψίας Νερό / ίζημα - Βάθος (αυτότροφοι ετερότροφοι, ψυχρόφιλοι - θερμόφιλοι, χημειολιθότροφοι κτλ) - Εκβολή, πηγή, ανάμιξη νερών, είσοδος λυμμάτων
στα 100 m o ρυθμός αύξησης είναι to 11 % του μετρούμενου στην επιφάνεια Ορυθμόςαύξησηςείναι μέγιστος σε απόσταση έως 6 m
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Β. Θέση δειγματοληψίας Νερό / ίζημα - Βάθος (αυτότροφοι ετερότροφοι, ψυχρόφιλοι - θερμόφιλοι, χημειολιθότροφοι κτλ) - Εκβολή, πηγή, ανάμιξη νερών, είσοδος λυμμάτων συγκέντρωση θρεπτικών συστατικών συγκέντρωση οξυγόνου
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Β. Θέση δειγματοληψίας Έδαφος - Κλίση (επιφανειακή απορροή νερού) - Βάθος (αερόβιοι αναερόβιοι, πηγή άνθρακα)
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Γ. Αριθμός και διάταξη θέσεων δειγματοληψίας Χ Χ Χ Χ Χ
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Γ. Αριθμός και διάταξη θέσεων δειγματοληψίας χαρακτηριστικά πεδίου (θέσεις που επιτρέπεται η πρόσβαση) έκταση που πρόκειται να μελετηθεί Γενικά το συστηματικό μοντέλο εξασφαλίζει μεγαλύτερη επαναληψιμότητα και βεβαιότητα κάλυψης του πεδίου Το τελικό δείγμα προκύπτει μετά από προσεχτική ανάμιξη των επιμέρους δειγμάτων
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Δ. Όγκος δείγματος είδος ανάλυσης που θα ακολουθήσει και μεθοδολογία (πχ προσδιορισμός μεγέθους πληθυσμού) αναμενόμενα επίπεδα πληθυσμού επιθυμητή ακρίβεια Το όριο παρουσίας του βακτηρίου Salmonella στους ταμιευτήρες πόσιμου νερού είναι μηδενικό. Το δείγμα που λαμβάνεται για ανάλυση είναι περίπου 80 l
In a perfect world, it is optimal to do preliminary sampling to get a sense of the spatial and temporal variance and calculate the number of samples necessary to get the desired power. It is better to take too many samples than not enough (the freezer is a wonderful invention)
1. Λήψη περιβαλλοντικού δείγματος Ε. Όργανα δειγματοληψίας
Διαγραμματική απεικόνιση σταδίων δειγματοληψίας εδάφους
Παραδείγματα : Μόλυνση κατά τη συλλογή του δείγματος λάθος εκτίμηση της σύστασης του πληθυσμού οι εξωγενείς μικροοργανισμοί πιθανώς να αναπτύσσονται εις βάρος των ενδογενών Bottle Effect : κατά τη μεταφορά ή αποθήκευση του δείγματος οι συνθήκες ευνοούν την αύξηση του αρχικού πληθυσμού λάθος εκτίμηση του μεγέθους του πληθυσμού οι μικροοργανισμοί που δεν ευνοούνται από τις συνθήκες δύσκολα ανακτώνται
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης A. Ο πληθυσμός «στόχος» βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα Εμπλουτισμός (in situ) προσθήκη ανόργανων αλάτων α) διάλυμα ρυθμιζόμενης ροής β) στερεό Εμπλουτισμός (ex situ) μεταφορά δείγματος σε διάλυμα αλάτων ή αλάτων + επιλεγμένη πηγή άνθρακα / επώαση σε κατάλληλες συνθήκες / εκ νέου μεταφορά στο διάλυμα εμπλουτισμού κ.ο.κ Διήθηση / συμπύκνωση δείγματος συνήθως για δείγματα νερού / λάσπης ηθμός με πόρους κατάλληλων διαστάσεων
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης A. Ο πληθυσμός «στόχος» βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα Εμπλουτισμός (in situ) προσθήκη ανόργανων αλάτων α) διάλυμα ρυθμιζόμενης ροής β) στερεό Εμπλουτισμός (ex situ) μεταφορά δείγματος σε διάλυμα αλάτων ή αλάτων + επιλεγμένη πηγή άνθρακα / επώαση σε κατάλληλες συνθήκες / εκ νέου μεταφορά στο διάλυμα εμπλουτισμού κ.ο.κ Διήθηση / συμπύκνωση δείγματος συνήθως για δείγματα νερού / λάσπης ηθμός με πόρους κατάλληλων διαστάσεων
Purple Non-Sulfur Photosynthetic Bacteria Εμπλουτισμός δείγματος γλυκού νερού σε Mineral Salts-Succinate Broth μετά από επώαση 7 ημερών στο φως και σε θερμοκρασία 30 C Καλλιέργεια από το εμπλουτισμένο δείγμα Ηθμός 0.45 μ στον οποίο διηθήθηκε ποσότητα 50 ml δείγματος χωρίς εμπλουτισμό Ο ηθμός τοποθετήθηκε σε κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα και επωάστηκε στο φως υπό αναερόβιες συνθήκες και σε θερμοκρασία 30 C
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης A. Ο πληθυσμός «στόχος» βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα Εμπλουτισμός (in situ) προσθήκη ανόργανων αλάτων α) διάλυμα ρυθμιζόμενης ροής β) στερεό Εμπλουτισμός (ex situ) μεταφορά δείγματος σε διάλυμα αλάτων ή αλάτων + επιλεγμένη πηγή άνθρακα / επώαση σε κατάλληλες συνθήκες / εκ νέου μεταφορά στο διάλυμα εμπλουτισμού κ.ο.κ Διήθηση / συμπύκνωση δείγματος συνήθως για δείγματα νερού / λάσπης ηθμός με πόρους κατάλληλων διαστάσεων
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Β. Ο πληθυσμός «στόχος» προϋποθέτει την παρουσία και άλλων πληθυσμών για την αύξησή του 1. Ηθμοί εδάφους 2. Αντικειμενοφόροι 3.Τυποποιημένα θρεπτικά υποστρώματα σε αυτοκόλητη επιφάνεια 4. Στήλη Winogradsky
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Β. Ο πληθυσμός «στόχος» προϋποθέτει την παρουσία και άλλων πληθυσμών για την αύξησή του 1. Ηθμοί εδάφους 2. Αντικειμενοφόροι : pedoscopes (έδαφος), peloscopes (ίζημα) 3.Τυποποιημένα θρεπτικά υποστρώματα σε αυτοκόλητη επιφάνεια 4. Στήλη Winogradsky Πορώδες υλικό που μιμείται τους πόρους του εδάφους, δυνατότητα εμποτισμού με θρεπτικό υλικό
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Β. Ο πληθυσμός «στόχος» προϋποθέτει την παρουσία και άλλων πληθυσμών για την αύξησή του 1. Ηθμοί εδάφους 2. Αντικειμενοφόροι : pedoscopes (έδαφος), peloscopes (ίζημα) 3.Τυποποιημένα θρεπτικά υποστρώματα σε αυτοκόλητη επιφάνεια 4. Στήλη Winogradsky
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Β. Ο πληθυσμός «στόχος» προϋποθέτει την παρουσία και άλλων πληθυσμών για την αύξησή του 1. Ηθμοί εδάφους 2. Αντικειμενοφόροι : pedoscopes (έδαφος), peloscopes (ίζημα) 3.Τυποποιημένα θρεπτικά υποστρώματα σε αυτοκόλητη επιφάνεια 4. Στήλη Winogradsky
Sergei Winogradsky (1856-1953) Founder of soil microbiology winogradsky column: microbial communities develop along a gradient of oxygen tension; method still used today Bacteria: central in element transformations
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Γ. Δείγμα άγνωστης μικροβιακής σύστασης Γενικού τύπου θρεπτικά υποστρώματα Σχεδιασμένα ώστε να επιτρέπουν την αύξηση μεγάλου αριθμού διαφορετικών μικροβιακών γενών περίπου 1 10 % των βακτηρίων του εδάφους περίπου 5 15 % των μυκήτων του εδάφους οι μύκητες αναπτύσσονται σε υποστρώματα με υψηλό λόγο C : N, ενώ τα βακτήρια σε υποστρώματα με χαμηλό τα περισσότερα βακτήρια αναπτύσσονται σε ουδέτερο ρη, ενώ οι μύκητες σε όξινο η αύξηση μικροοργανισμών από περιβαλλοντικά δείγματα μπορεί να αναστέλλεται από πλούσια θρεπτικά υποστρώματα αντιβιοτικά
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Δ. Ο πληθυσμός «στόχος» είναι μέρος μιας πολύπλοκης και πολυπληθούς κοινωνίας Εκλεκτικά θρεπτικά υποστρώματα Σχεδιασμένα ώστε να αποκλείουν την αύξηση μεγάλου αριθμού διαφορετικών μικροβιακών γενών πηγή άνθρακα παράλειψη αλάτων και ιχνοστοιχείων που απαιτούνται από την πλειοψηφία των μικροοργανισμών (π.χ. μη προσθήκη νιτρικών και νιτρωδών αλάτων, κατευθύνει την αύξηση νιτροποιητικών βακτηρίων) αντιβιοτικά (π.χ. πενικιλλίνη για αποκλεισμό των Gram +, νυστατίνη για αποκλεισμό μυκήτων) μεταβολή φυσικοχημικών ιδιοτήτων (π.χ. ρη) επιλογή συνθηκών επώασης
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Δ. Ο πληθυσμός «στόχος» είναι μέρος μιας πολύπλοκης και πολυπληθούς κοινωνίας Διαγνωστικά θρεπτικά υποστρώματα Σχεδιασμένα ώστε να επιτρέπουν το μορφολογικό διαχωρισμό επιλεγμένων μικροβιακών ομάδων (π.χ. MacConkey Agar) Escherichia coli Salmonella typhimurium Selective: inhibits most Gram positives
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Δ. Ο πληθυσμός «στόχος» είναι μέρος μιας πολύπλοκης και πολυπληθούς κοινωνίας Ανοσομαγνητικός διαχωρισμός IMS Σχεδιασμένο ώστε να επιτρέπει το διαχωρισμό επιλεγμένων μικροβιακών ειδών ή και στελεχών (π.χ. Salmonella, E. coli O157) προσαρμογή αντισωμάτων κατά αντιγόνου επιφανείας επάνω σε μαγνητικά σφαιρίδια (magnetic beads) προσθήκη στο δείγμα συλλογή με μαγνήτη και επίστρωση σε εκλεκτικόθρεπτικόυπόστρωμα
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Δ. Ο πληθυσμός «στόχος» είναι μέρος μιας πολύπλοκης και πολυπληθούς κοινωνίας Επιλογή συνθηκών επώασης και κατεργασία δείγματος Αποκλεισμός μεγάλων μικροβιακών ομάδων Π.χ. - θερμοκρασία επώασης > 50 ο C αποκλείει τους μεσόφιλους, - ξήρανση του δείγματος αποκλείει μικροοργανισμούς χωρίς δυνατότητα σχηματισμού ενδοσπορίων, - αναερόβιες συνθήκες
Αύξηση σε αναερόβιες συνθήκες χρήση κατάλληλου υποστρώματος (Thioglycollate broth has a reducing agent in it - the chemical thioglycollate - which binds any free oxygen within the medium) δείκτης αναερόβιων συνθηκών (resazurin, in the medium will be a light pink in the area of higher oxygen)
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Ε. Οπληθυσμός«στόχος» αναπτύσσεται με πολύ αργό ρυθμό (slow growth) απαραίτητη χρήση αντιμυκητιακών ρύθμιση υγρασίας για μακρύ χρόνο επώασης αφαίρεση αποικιών που εμφανίζονται αρχικά
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης ΣΤ. Αναζητείται ο ρόλος ενός πληθυσμού «στόχου» στη μικροβιακή κοινωνία ή η επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων σε αυτόν Μικρόκοσμοι ανάπτυξη μοντέλων για την περιγραφή αλληλεπιδράσεων μεταξύ πληθυσμών (ανταγωνισμός, συναγωνισμός) διατήρηση σταθερών συνθηκών και προσομοίωση ενός επιθυμητού περιβάλλοντος δυνατότητα μεταβολής ενός παράγοντα κάθε φορά
2. Μέθοδοι επιλεκτικής απομόνωσης Ζ. Ο πληθυσμός «στόχος» βρίσκεται σε «λήθαργο» (Viable but non culturable VBNC) Μετά από συνθήκες stress κάποια βακτήρια παραμένουν σε μη ενεργή κατάσταση. Παρόλα αυτά διατηρούν το μεταβολισμό και τη δομή τους. Μιμούνται κατά κάποιο τρόπο τα βακτήρια με δυνατότητα σχηματισμού ενδοσπορίων VBNC βακτήρια υπό συνθήκες starvation παράγουν τοξικούς μεταβολίτες στο εσωτερικό όταν μεταφερθούν σε πλούσιο θρεπτικό υπόστρωμα VBNC βακτήρια από ανοξικές συνθήκες σχηματίζουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου στο εσωτερικό όταν μεταφερθούν απότομα σε αερόβιες συνθήκες
Συμπεράσματα Η αύξηση των μικροοργανισμών από τα μη ορατά με γυμνό μάτι κύτταρα σε αποικίες απαιτεί συντονισμό πλήθους γεγονότων : Έκφραση και λειτουργία απαραίτητων ενζύμων, αλληλεπιδράσεις με κύτταρα που εντοπίζονται στο ίδιο περιβάλλον, απόκριση στους φυσικοχημικούς παράγοντες του περιβάλλοντος Όσα περισσότερα γνωρίζουμε για τη φυσιολογία και οικολογία ενός οργανισμού, τόσο αυξάνονται οι πιθανότητες απομόνωσης σε εργαστηριακό περιβάλλον
Συμπεράσματα Παρά το γεγονός ότι οι κλασσικές μικροβιολογικές τεχνικές αναπτύσσονται συνεχώς και η συνεργασία των τομέων μικροβιολογίας, βιοχημείας και οικολογίας είναι πραγματικότητα, πολύ μικρό ποσοστό των μικροοργανισμών είναι δυνατό να απομονωθεί στο εργαστήριο Είναι απαραίτητη η συμβολή γενετικών και μοριακών τεχνικών προκειμένου να γίνει περισσότερο κατανοητή η λειτουργία του μικροβιακού κυττάρου και να προσεγγιστούν οι ιδιαίτερες απαιτήσεις κάθε είδους, ώστε να είναι τελικά δυνατή η απομόνωσή του