Εργαλεία Μοριακής Γενετικής
Αρχές Μοριακής κλωνοποίησης Τα περιοριστικά ένζυμα: αναγνωρίζουν αλληλουχίες (θέσεις περιορισμού). 2 τύποι ενζύμων: -Τύπος I = Κόβουν κοντά στη θέση περιορισμού -σπάνια χρησιμοποιούνται. -Τύπος ΙΙ = Κόβουν ακριβώς στη θέση περιορισμού -οι θέσεις είναι παλίνδρομες -ίδια αλληλουχία όταν διαβάζονται 5 to 3 Τα τύπου II ένζυμα δίνουν κολλώδη άκρα (sticky ends) = μονόκλωνα συμπληρωματικά άκρα Υπάρχουν και εκείνα που δεν δίνουν κολλώδη άκρα (blunt ends) DNA λιγάση μπορεί να ενώσει τα δύο τμήματα δημιουργώντας ένα σταθερό μόριο DNA. 2
Πήγμα αγαρόζης Η τεχνική χρησιμοποιείται για να διαχωρίσει τμήματα DNA με βάση το μέγεθος. Το πήκτωμα υπόκειται σε ηλεκρικό πεδίο. Το DNA που είναι αρνητικά φορτισμένο μεταναστεύει στο θετικό πόλο. -Οσο μεγαλύτερο το θραύσμα DNA τόσο πιο αργά κινείται στο πήκτωμα. Το DNA γίνεται ορατό με φθωρίζουσες χρώσεις (Ethidium Bromide) 3
4
5
Μετασχηματισμός Μετασχηματισμός είναι η εισαγωγή του DNA από μια εξωτερική πηγή μέσα σε ένα βακτηριακό κύτταρο. Είναι φυσιολογική διαδικασία. Αλλά στη μοριακή βιολογία χρησιμοποιείται σαν τεχνική ρουτίνας. Μοριακή κλωνοποίηση Ο κλώνος αναφέρεται σε ένα γενετικά πιστό αντίγραφο. Η μοριακή κλωνοποιήση αφορά την απομόνωση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας (συνήθως κωδικεύει μια πρωτείνη) = γονιδιακή κλωνοποίηση ή κλωνοπ/ση ανασυνδυασμένου DNA. Κοινός ξενιστής: E. coli Για την αναπαραγωγή ενός ενθέματος χρειάζεται ένας φορέας. 6
Φορείς Πλασμίδια: μικρά, κυκλικά, δίκλωνα μόρια DNA που αναπαράγονται εκτός του χρωμοσώματος του E.coli -Χρησιμοποιούνται για κλωνοποίηση μικρών τμημάτων DNA -Εχουν 3 κύριες ιδιότητες: 1. Θέση έναρξης αντιγραφής 2. Επιλέξιμο δείκτη 3. Περιοριστικές θέσεις ενζύμων για κλωνοποίηση 7
Φορείς Περ.ένζυμα με ή χωρίς κολλώδη άκρα. Ποια η σημασία τους για την εισαγωγή του ένθετου DNA; 8
Φορείς Φάγοι: τροποποιημένοι βακτηριακοί ιοί -Κυρίως βασίζονται στο φάγο ( ) του E. coli -Χρησιμοποιούνται για ένθετα >40 Kbp -Εχουν 2 χαρακτηριστικά που δεν απαντώνται στα πλασμίδια: -Σκοτώνουν το κύτταρο ξενιστή -Εχουν γραμμικό γένωμα (μέρος του αντικαθίσταται από το ένθεμα DNA) 9
Φάγοι 10
Φάγοι Τεχνητά χρωμοσώματα (για τη κλωνοποίηση μεγάλων θραυσμάτων DNA) -Βακτηριδιακά τεχνητά χρωμοσώματα (BACs). -Τεχνητά χρωμοσώματα σακχαρομύκητα. (YACs). 11
Βιβλιοθήκες DNA Συλλογή θραυσμάτων DNA από μια συγκεκριμένη πηγή που έχει εισαχθεί στα κύτταρα του ξενιστή. Η γενωμική βιβλιοθήκη αφορά όλο το γένωμα Η βιβλιοθήκη συμπληρωματικού DNA (cdna) αφορά μόνο το τμήμα του DNA που εκφράζεται. Σύνθεση από απομονωμένα mrna μόρια με τη βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης. 12
13
14
15
Βιβλιοθήκες DNA Η υβριδοποίηση είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση ειδικών θραυσμάτων DNAs σε μίγματα. -Ραδιοσήμανση μιας γνωστής αλληλουχίας DNA ή RNA. -Χρησιμοποιείται συμπληρωματικής αλληλουχίας στο δείγμα. Ετσι μπορεί να ανιχνευθεί ένας κλώνος σε μια βιβλιοθήκη ή ένα αλληλομορφο-ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο. 16
Ανίχνευση κλώνου σε βιβλιοθήκες DNA 17
Ανάλυση DNA Στύπωμα κατά Southern - είγμα DNA διασπάται από περιοριστικά ένζυμα και τα διάφορα θραύσματα διαχωρίζονται σε πήκτωμα αγαρόζης. -Το πήκτωμα μεταφέρεται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η σύνθεση του ρυθμιστικού διαλύματος που βρίσκεται το δείγμα αποδιατάσει το δίκλωνο DNA σε μονόκλωνο. -Το δείγμα υβριδοποιείται με ραδιοσημασμένο κλώνο DNA - Οι συμπληρωματικές αλληλουχίες αποκαλύπτονται σε φίλμ ακτίνων Χ. 18
19
20
21
Ανάλυση mrna, πρωτεϊνών Στύπωμα κατά Northern -mrna (αντί DNA) διαχωρίζεται σε πήκτωμα αγαρόζης και μετά μεταφέρεται σε μεμβράνη. Στύπωμα κατά Western -Πρωτεΐνες διαχωρίζονται και μετά μεταφέρονται σε μεμβράνη. -Ο εντοπισμός τους απαιτεί τη χρήση αντισωμάτων. 22
Ανάλυση DNA RFLP ανάλυση (Restriction fragment length polymorphism) Ανίχνευση πολυμορφισμών με βάση το πρότυπο ηλεκτροφόρησης θραυσμάτων μετά από πέψη. Ανιχνεύουν μεταλλαγές ή άλλες αλλοιώσεις (διπλασιασμό τμημάτων). Τα θραύσματα διαφέρουν συχνά ανάμεσα σε διαφορετικά άτομα. Μπορεί να γίνει ανίχνευση με στύπωμα κατά Southern 23
24
DNA sequencing -Ενζυμική μέθοδος που εξελίχθηκε από τον Frederick Sanger -Dideoxynucleotides: τερματίζουν τη αντίδραση. 25
Τα ανάλογα βάσεων είναι ραδιοσημασμένα Τα ανάλογα βάσεων προσδένονται σε φθωρίζουσες ουσίες 26
Ανάλυση DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) -Εξελίχθηκε απο τον Kary Mullis -Επιτρέπει την ενίσχυση ενός μικρού μορίου DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές που βρίσκονται στο 5 και 3 άκρο της περιοχής -Κάθε κύκλος περιλαμβάνει 3 βήματα: 1. Αποδιάταξη (υψηλή θερμοκρασία) 2. Προσθήκη εκκινητών (χαμηλή θερμοκρασία) 3. Σύνθεση DNA (ενδιάμεση θερμοκρασία) -Taq polymerase 27
Μετά από 20 κύκλους, ένα μόνο μόριο παράγει >1 εκατ. αντίγραφα! PCR 28
Γενετική μηχανική Φορείς έκφρασης: περιέχουν αλληλουχίες απαραίτητες για την έκφραση ένθετων τμημάτων DNA σε ένα ειδικό τύπο κυττάρων. ιαγονιδιακά ζώα: μεταφέρουν ένθετα γονίδια. Ζωικά μοντέλα γονιδιακής στόχευσης: ένα ή περισσότερα γονίδια έχουν στοχευθεί (gene knock out) 29
Ζωικά μοντέλα γονιδιακής στόχευσης: 30
31
32
Ιατρικές εφαρμογές 33
Ιατρικές εφαρμογές-εμβόλια 34