QUANTA Lite dsdna ELISA 708510 διπλού έλικα DNA ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite dsdna αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων αντι dsdna αντισωμάτων στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλα ορολογικά τεστ και κλινικά ευρήματα με σκοπό τη διάγνωση του συστηματικού ερυθηματώδoυς λύκου (SLE). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA s) ευρίσκονται σε μεγάλο εύρος μολύνσεων του συνδετικού ιστού και έτσι χρησιμοποιούνται σαν ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης. 1 Ενώ και ο έλεγχος των ΑΝΑ είναι μία υπέροχη ευρεία μέθοδος ανίχνευσης για SLE (ένα αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει απουσία ενεργού SLE) 2 δεν είναι εξειδικευμένος έλεγχος. Τα αντισώματα έναντι dsdna εμφανίζονται σχεδόν αποκλειστικά σε ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (SLE) και θεωρούνται σαν δείκτης για τη νόσο αυτή. Η παρουσία αντισωμάτων dsdna δείχνει ισχυρώς SLE,όμως η απουσία αντισωμάτων dsdna δεν συνεπάγεται την απουσία SLE σε όλες τις περιπτώσεις. Τα αυτοαντισώματα dsdna έχουν συμπεριλειφθεί στα Αναθεωρημένα κριτίρια ταξινόμησης του 1982 για SLE από την υποεπιτροπή συνδέσμου Ρευματισμών και Αρθρίτιδος. 3 Ποικίλες μέθοδοι συμπεριλαμβανομένων Ανοσοφθορισμού 4,ραδιοανοσολογικού, 5 παθητικής συγκόλλησης, 6 και σύνδεση συμπληρώματος 7 χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά dsdna. Εχουν επίσης αναπτυχθεί κλινικώς χρήσιμες ανοσοενζυματικές μέθοδοι ανάλυσης (ELISA). 8,9,10,11 Η τεχνική ELISA αυτης της μεθόδου είναι ημιποσοτική και μπορεί εύκολα να ελέγχει μεγάλο αριθμό δείγμάτων ασθενών. Επιπροσθέτως με τη χρήση κεκαθαρμένου dsdna σαν υπόστρωματος,ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω της παρουσίας αντισωμάτων DNA απλής έλικας,ιστονών, ή doexynucleoprotein ελαχιστοποιούνται. Αρχη Μεθοδου Τα υψηλώς κεκκαθαρμένα dsdna αντιγόνα είναι συνδεδεμένα σε πηγαδάκια μικροπλάκας πολυστερίνης κάτω από συνθήκες που θα συγκρατήσουν το αντιγόνο στην φυσική του κατάσταση. Έτοιμοι πρότυπους ορούς (control ) και ορός ασθενούς τοποθετούνται σε ξεχωριστά πηγαδάκια επιτρέποντας έτσι το όποιο dsdna, αντίσωμα που υπάρχει να προσκολλήσει στο ακινητοποιημένο αντιγόνο κατά την πρώτη επώαση. Το υπόλοιπο ξεπλένεται και ένα ένζυμο από σεσημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (conjugate) αντίσωμα προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο να συνδεθεί με όποιο αντίσωμα του ασθενούς έχει προσκολληθεί στο υπόστρωμα του πηγαδιού. Με το δεύτερο ξέπλυμα των μη συνδεδεμένων συζυγών ενζύμων(conjugate), η υπόλοιπη ενζυματική δραστηριότητα μετράται με την πρόσθεση ενός χρωστικού διαλύματος (chromogen) μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται. Η επεξεργασία μπορεί να αξιολογιθεί φωτομετρικά με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια προτύπων ορών (control). Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο dsdna (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα dsdna) 3. dsdna Positive Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένων ανθρώπινων αντισωμάτων ds DNA έτοιμο για χρήση) 4. DNA Calibrator Ρυθμιστής (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένων ανθρώπινων αντισωμάτων ds DNA έτοιμο για χρήση) 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 12 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 1
4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2 8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 ds DNA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση. 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ds DNA Positive Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ds DNA Calibrator Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογία Πριν αρχίσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 1. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία επεξεργασίας 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, θετικός, ρυθμιστής, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 2
4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια.. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά Ποιοτικός έλεγχος 1. Τα dsdna ELISA Calibrator, dsdna ELISA Positive, και ο αρνητικός μάρτυρας, πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε δοκιμασία για να διασφαλίζεται ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το dsdna ELISA Calibrator, το dsdna ELISA Positive και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 ο C. 4. Το dsdna Positive σε IU/mL ή μονάδες WHO πρέπει να βρίσκεται στα όρια που αναφέρονται στη συσκευασία. 5. Για να θεωρηθούν δε έγκυρα τα αποτελέσματα του ελέγχου, όλα τα κριτήρια που αναφέρονται παρακάτω πρέπει να ισχύουν. Αν κάποιο από αυτά δεν ισχύει, ο έλεγχος πρέπει να θεωρηθεί ανακριβής και η διαδικασία να επαναληφθεί. α. Η απορρόφηση του ds DNA Positive πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του ds DNA Calibrator η οποία πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού μάρτυρα ELISA Negative. β. To ds DNA Positive πρέπει να έχει απορρόφηση μεγαλύτερη από 1.0 ενώ ο αρνητικός μάρτυρας ELISA Negative δεν μπορεί να έχει απορρόφηση μεγαλύτερη από 0.2. γ. Η απορροφητικότητα του dsdna ELISA Calibrator πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA Negative Control ή πάνω από 0.25. δ. Το ELISA Negative Control και το dsdna ELISA Positive έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. To dsdna ELISA Positive δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document C24-A3 για επιπλέον οδηγίες στις κατάλληλες πρακτικές QC. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του ds DNA (Calibrator) ρυθμιστή, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του ds DNA (Calibrator) ρυθμιστή σε IU/mL ή μονάδες WHO. Η τιμή του ds DNA (Calibrator) ρυθμιστή φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος δείγμα Ο.A. (μονάδες) = X ds DNA (Calibrator) (μονάδες) ds DNA (Calibrator) O.A. Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί μετά να ταξινομηθεί σαν αρνητικό, ασθενώς, ενδιάμεσο ή ισχυρώς θετικό σύμφωνα με τον πίνακα παρακάτω. IU/ml WHO units/ml Αρνητικό 0-200 0-92.6 Ασθενώς θετικό 201-300 92.7-138.9 Ενδιάμεσο θετικό 301-800 139-370.4 Ισχυρώς θετικό >801 >370.5 Τα αμφίβολα δείγματα πρέπει να αναλύονται ξανά πριν την αναφορά των αποτελεσμάτων. 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα δείχνει την παρουσία των αντισωμάτων του dsdna και προτείνει την πιθανότητα του SLE. 2. Ένα δείγμα με αμφίβολα επίπεδα dsdna δεν μπορεί να αξιολογηθεί για κατάσταση αντισωμάτων. Εάν τα αποτελέσματα παραμένουν αμφίβολα μετά από την επανάληψη της δοκιμασίας, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως αμφίβολο ή/και να πραγματοποιηθεί επιπρόσθετη δειγματοληψία. 3. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει την απουσία των αντισωμάτων του dsdna ή επίπεδα χαμηλότερα από την αρνητική αποκοπή της ανάλυσης. 4. Προτείνεται να συμπεριλαμβάνεται στα αποτελέσματα που βγαίνουν από το εργαστήριο η παρακάτω δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα επιτεύχθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite dsdna ELISA. Οι τιμές dsdna που επιτεύχθηκαν με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με τίτλο.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Αντισώματα μονής έλικας DNA, σύμπλεγμα DNA-Ιστόνης ή άλλο σύμπλεγμα πυρινοπρωτείνης δεν θα πρέπει να αντιδρά με το αντιγόνο ds DNA αξιοποιώντας τη δοκιμασία σημαντικά. Τα αντισώματα αυτά μπορεί να ανιχνευθούν σε μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό από άλλες μεθόδους. Έτσι συγκρίσεις μεταξύ διαφορετικών μεθόδων μπορούν να αποφέρουν διαφορετικά αποτελέσματα. 3
2. Εφόσον τα αντισώματα IgG είναι σημαντικά 13,14,15 στη δοκιμασία αυτή χρησιμοποιείται ειδική σφαιρίνη IgG. Τα ds DNA αντισώματα ΙgM δεν ανιχνεύονται στη δοκιμασία αυτή. Εάν υπάρχει επηρεασμός από τα αντισώματα ΙgM επανεξετάσατε το δείγμα με μεγαλύτερη αραίωση. Απότομη αύξηση της τιμής του δείγματος δείχνει τη παρουσία αντισωμάτων ΙgM. Η νέα αυτή τιμή δείνει πιο ακριβή προσδιορισμό της ποσότητος των αντισωμάτων IgG στο δείγμα. 3. Η παρουσία ανοσολογικού συμπλέγματος ή άλλο συσσωμάτωμα ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα μπορεί να προκαλέσει αύξηση της μη ειδικής σύνδεσης και ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. 4. Τα αποτελέσματα της διαδικασίας πρέπει να συνδιάζονται με τά κλινικά ευρήματα και άλλους ορολογικούς ελέγχους. 5. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα dsdna δεν αποκλείει την παρουσία SLE. 6. Ένα θετικό αποτέλεσμα δοκιμασίας υποδεικνύει μόνο την παρουσία αντισώματος σε dsdna και δεν υποδηλώνει απαραίτητα διάγνωση SLE. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα του QUANTA Lite dsdna ELISA να ανιχνεύει τα ds DNA αντισώματα κρίθηκε σε σύγκριση με ένα εμπορικό τεστ ανοσοφθορισμού IFA από την INOVA Diagnostics, Inc. Φυσιολογικές Τιμές Τα φυσιολογικά όρια της δοκιμασίας προσδιορίστηκαν αναλύοντας δείγματα 175 τυχαίων δοτών αίματος. Από αυτούς 2 (1.1%) είχα αντι ds DNA τιμές κάτω των 200 IU/ml (92.6 WHO units/ml). Ευαισθησία και Ειδικότητα Η επίδραση της δοκιμασίας υπολογίστηκε από τις δοκιμασίες 50 ασθενών με διάφορα αυτοάνοσα νοσήματα οι οποίοι είχαν κάποιο τύπο αντιπυρινικού αντισώματος ΑΝΑ αλλά όχι σημαντικά αντισώματα ds DNA με μέθοδο αναφοράς. Από αυτούς 1 (2.0%) είχε τιμές αντι ds DNA κάτω των 200 IU/ml (68.6 WHO Units/ml). Mία προς μία σύγκριση με άλλη εμπορική δοκιμασία κατά ds DNA ELISA έγινα σε 67 ασθενείς από πληθυσμό με θετικά και αρνητικά δείγματα. Τα αποτελέσματα φαίνονται κατωτέρω. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ P B N P 16** 0 0 P=Positive Θετικό INOVA B 0 1* 1 B=Bordline Ενδιάμεσο N 0 7* 39 N=Negative Αρνητικό *Αρνητικά με ανοσοφθορισμό IFA κατά ds DNA. ** 12 από 16 θετικά επίσης με ανοσοφθορισμό IFA κατά ds DNA. 4
Βιβλιογραφία 1. Tan E: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167, 1982. 2. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379, 1964. 3. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271, 1982. 4. Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: 811, 1977. 5. Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassy for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: 534, 1981. 6. Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. Journal Immunol Methods 3: 287, 1973. 7. Arana RK, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. Journal Clinical Investitgation 46: 1867, 1967. 8. Kavai M, et al.: Enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to native DNA in sera of patients with SLE. Journal Immunol Methods 48: 169, 1982. 9. Rubin RL, et al.: An improved ELISA for anti-native DNA by elimination of interference by anti-histone antibodies. Journal Immunol Methods 63: 359, 1983. 10. Pisetsky DS, Peters DV: A simple enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to native DNA. Journal Immunol Methods 41: 187, 1981. 11. Klotz JL: Enzyme-linked Immunosorbent Assay for antibodies to native and denatured DNA. Methods in Enzymology 84: 194, 1982. 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, Fifth Edition, 2007 13. Sontheimer RD, Gilliam JN: DNA antibody class, subclass, and complement fixation in systemic lupus erythematosus with and without nephritis. Clinical Immunolgy and Immunopatholgy 10: 459, 1978. 14. Talal N, et al.: Biological significance of IgM and IgG antibodies to DNA and RNA in autoimmune disease. American Journal of Clinical Pathology 68: 643, 1977. 15. Gonzalez EN, Rothfield NF. Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 274: 133, 1966. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950 info@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628510GRC May 2010 Revision 22 5