Εισαγωγή στη Βιοχημεία των Βιολογικών Υγρών Πέτρου Καρκαλούσου Καθηγητή εφαρμογών Κλινικής Χημείας, ΤΕΙ Αθήνας Εισαγωγή Αν και το βιοχημικό εργαστήριο είναι το κατ εξοχήν εργαστήριο όπου αναλύονται δείγματα ορού και ούρων στη πράξη είναι πολύ περισσότερα τα βιολογικά υγρά που αναλύονται σε αυτό. Έτσι ενώ τα δείγματα ορού και ούρων είναι αυτά που αναλύονται ως επί το πλείστον στα βιοχημικά εργαστήρια πρωτοβάθμιας υγείας, στα δημόσια και ιδιωτικά νοσοκομεία αναλύονται πολύ περισσότερα. Ανάλογα με τις κλινικές που υποστηρίζουν, μετρούν αναλύτες του ΕΝΥ, των ορωδών υγρών, του αρθρικού υγρού κ.α. Εξειδικευμένα νοσοκομεία ζητούν από τα εργαστήριά τους αναλύσεις σε αμνιακό υγρό και μητρικό γάλα (μαιευτήρια) και σπανιότερα σε ιδρώτα (παιδιατρικά νοσοκομεία). Ο προσδιορισμός αναλυτών από τόσα πολλά βιολογικά υγρά αποτελεί μια πρόκληση για το νοσοκομειακό βιοχημικό εργαστήριο. Οι λόγοι είναι: 1. Οι αναλύσεις είναι πολλές φορές επείγουσες (STAT) π.χ. οι αναλύσεις του ΕΝΥ, του αμνιακού υγρού κ.α. 2. Τα διαφορετικά αντιδραστήρια που απαιτούνται μερικές φορές π.χ. ο προσδιορισμός πρωτεΐνης στο ΕΝΥ ή και σε άλλα υγρά. 3. Ο ειδικός εξοπλισμός που επίσης απαιτείται για μερικά βιολογικά υγρά π.χ. ειδική συσκευή για την μέτρηση της χολερυθρίνης σε νεογνά, ειδικός αναλυτής (χωρίς αντιδραστήρια) για τον προσδιορισμό παραμέτρων του μητρικού γάλακτος από τις μαίες, ειδική συσκευή για την μέτρηση του χλωρίου στον ιδρώτα παιδιών με κυστική ίνωση. 4. Η ποσότητα του δείγματος είναι πολύ μικρή. Οι λόγοι είναι η αδυναμία λήψης μεγαλύτερης ποσότητας λόγω κινδύνου για τον ασθενή, αλλά και το γεγονός ότι το δείγμα διαμοιράζεται και σε άλλα εργαστήρια π.χ. στο μικροβιολογικό για καλλιέργεια και κυτταρολογικό έλεγχο. 5. Το δείγμα δεν είναι πάντα διαυγές και ρευστό π.χ. το αρθρικό υγρό, του οποίου το μεγάλο ιξώδες μπορεί να προκαλέσει προβλήματα στον αναλυτή. 6. Οι διάφοροι φυσικοί χαρακτήρες των δειγμάτων, π.χ. υπάρχουν δείγματα που είναι συνήθως τελείως διαυγή, αλλά και άλλα που πολλές φορές φέρουν αίμα, άλλα κύτταρα ή είναι υπερβολικά θολά π.χ. το πλευριτικό υγρό.
7. Τα δείγματα είναι μοναδικά και εξαιρετικά πολύτιμα. Τέτοια είναι όλα τα δείγματα παρακεντήσεων π.χ. ΕΝΥ, περικαρδιακό υγρό, πλευριτικό υγρό, περιτοναϊκό υγρό, αρθρικό υγρό και αμνιακό υγρό. 8. Ο έλεγχος ποιότητας των αναλύσεων στα βιολογικά υγρά δεν καλύπτεται πλήρως από δείγματα εσωτερικού ελέγχου ποιότητας και σχήματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Λίγες εταιρείες έχουν δείγματα ελέγχου άλλων βιολογικών υγρών πέρα από τον ορό και τα ούρα. 9. Δεν υπάρχουν τιμές αναφοράς για τις περισσότερες από τις παραμέτρους που προσδιορίζονται. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων γίνεται σε σχέση με τις αντίστοιχες εξετάσεις που γίνονται την ίδια ημέρα στο αίμα. 10. Η διαπίστευση αναλύσεων στα βιολογικά υγρά είναι ιδιαίτερα απαιτητική δεδομένου των απαιτήσεων για ορθή λήψη, του εξαιρετικά μικρού χρόνου απόδοσης αποτελέσματος (π.χ. ΕΝΥ, αμνιακό υγρό) και της δυσκολιών του εσωτερικού και εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. 11. Ο χειρισμός τους απαιτεί πολλή προσοχή από το προσωπικό του βιοχημικού εργαστηρίου δεδομένου ότι πολλά από αυτά είναι εξαιρετικά επικίνδυνα π.χ. ΕΝΥ για μηνιγγίτιδα, πλευριτικό υγρό για φυματίωση. 12. Σε περίπτωση που λαμβάνονται διαδοχικά δείγματα κατά την παρακέντηση για να διανεμηθούν σε ισάριθμα εργαστήρια, στο βιοχημικό εργαστήριο καταλήγει το πρώτο και συνήθως το χειρότερης ποιότητας. Τα επόμενα δείγματα που είναι «καθαρότερα» και πιο διαυγή οδηγούνται στο μικροβιολογικό εργαστήριο γιατί είναι καταλληλότερα για καλλιέργεια, μικροβιολογική και κυτταρολογική εξέταση. Τα βιολογικά υγρά που εξετάζουμε εδώ είναι κατά κύριο λόγο υγρά παρακεντήσεων Εξαιρούνται το σάλιο, ο ιδρώτας και το μητρικό γάλα. Από τα δείγματα αυτά μία ιδιαίτερη κατηγορία είναι τα λεγόμενα ορώδη. Ως ορώδη υγρά χαρακτηρίζονται αυτά που μοιάζουν ως προς το χρώμα ή/και την σύνθεση με τον ορό. Τέτοια είναι τα υγρά κλειστών κοιλοτήτων όπως είναι το περιτοναϊκό υγρό, το πλευριτικό υγρό, το περικαρδιακό υγρό και το αρθρικό υγρό. Κυρίως για τα υγρά αυτά, αλλά και πολλές φορές και για άλλα, χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της ποιότητας του οι όροι εξιδρώματα και διϊδρώματα. Ως διϊδρώματα χαρακτηρίζονται τα υγρά που αποδίδονται σε καλοήθη συστημική νόσο και ως εξιδρώματα εκείνα που οφείλονται σε εντοπισμένη φλεγμονώδη ή κακοήθη νόσο. Οι εξετάσεις των βιολογικών υγρών Σχεδόν σε όλα τα βιολογικά υγρά κάνουμε ένα παρόμοιο κύκλο αναλύσεων και μετρήσεων.
Φυσικούς ή μακροσκοπικούς χαρακτήρες. Δίνουν μια πρώτη εικόνα για τη γενική κατάσταση του βιολογικού υγρού. Αν και υπάρχουν μικρές διαφορές μεταξύ των διαφόρων βιολογικών υγρών ως προς ποιοι φυσικοί χαρακτήρες είναι σημαντικοί και θα πρέπει να αναφέρονται στην έκθεση αποτελεσμάτων, η όψη, η χροιά (χρώμα) και η παρουσία πήγματος είναι κοινά σε όλα σχεδόν τα βιολογικά υγρά παρακεντήσεων. Αν και οι φυσικοί χαρακτήρες συμπληρώνονται στο μικροβιολογικό εργαστήριο η εικόνα του βιολογικού υγρού έχει σημασία και για το βιοχημικό εργαστήριο, μια που δείχνει την κατάσταση του, την επικινδυνότητα του αλλά και τους πιθανούς κινδύνους για τον αναλυτικό εξοπλισμό π.χ. η παρουσία πήγματος μπορεί να μπλοκάρει τον βιοχημικό αναλυτή. Σε μερικά βιολογικά υγρά όμως απαιτείται η καταγραφή και άλλων φυσικών χαρακτήρων. Ενδεικτικά αναφέρεται ο προσδιορισμός του ιξώδους του αρθρικού υγρού. Φυσιολογικά το αρθρικό υγρό έχει μεγάλο ιξώδες, μειώνεται όμως όταν φλεγμαίνει π.χ. στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Στο ΕΝΥ έχει σημασία ο προσδιορισμός του ειδικού βάρους και του ph (όπως στο πλευριτικό υγρό). Στο γαστρικό υγρό ο προσδιορισμός του ph και η ηλεκτρεγερτική του δύναμη είναι κεφαλαιώδους σημασίας. Κυτταρολογική εξέταση. Γίνεται στο μικροβιολογικό εργαστήριο και αφορά την ταυτοποίηση και την μέτρηση κυττάρων σε αυτό. Συγκεκριμένα αναγνωρίζονται με μετρώνται ερυθρά και λευκά αιμοσφαίρια. Έχει σημασία η αναγνώριση της παλαιότητας των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Η παρουσία φυσιολογικών σε μορφή ερυθρών αιμοσφαιρίων σημαίνει ότι αυτά είναι νέα σε ηλικία και κατά συνέπεια μπορούν να θεωρηθούν ως προϊόν της παρακέντησης. Αντίθετα τα παραμορφωμένα, άρα και παλιά ερυθροκύτταρα είναι αποτέλεσμα ενδογενούς αιμορραγίας π.χ. τραυματισμός στο κεφάλι αν βρεθούν στο ΕΝΥ. Η μέτρηση των κυττάρων γίνεται σε κυτταρομετρική πλάκα, όπως είναι η Improved Neubauer (η πιο συνηθισμένη στα Ελληνικά εργαστήρια), η Fuchs Rosenthal (στην Ελλάδα χρησιμοποιείται κυρίως για το ΕΝΥ). Κατά την κυτταρολογική εξέταση μπορούν να παρατηρηθούν επιθηλιακά κύτταρα και μικροοργανισμοί, η ενασχόληση όμως αυτά είναι αντικείμενο της μικροβιολογικής εξέτασης. Μικροβιολογική εξέταση. Και αυτή γίνεται στο μικροβιολογικό εργαστήριο και αφορά την παρατήρηση μικροβίων, επιθηλιακών κυττάρων ακόμα και ανόργανων κρυστάλλων όπως γίνεται στο αρθρικό υγρό όταν υπάρχουν ενδείξεις ουρικής αρθρίτιδας. Η παρατήρηση γίνεται με χρώση Gram μετά από την μονιμοποίηση του παρασκευάσματος. Χημικές αναλύσεις. Αφορούν εξ ολοκλήρου το βιοχημικό εργαστήριο του νοσοκομείου αν κάποιες από αυτές μπορούν να γίνουν ακόμα και από το νοσηλευτικό προσωπικό π.χ. ο προσδιορισμός των παραμέτρων του μητρικού γάλακτος από τις μαίες στην αίθουσα θηλασμού και ο ταχύτατος προσδιορισμός της χολερυθρίνης σε ειδική συσκευή από τους νοσηλευτές της μονάδας νεογνών. Αν και
υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία, τρεις είναι οι σημαντικότερες. Θα πρέπει να τονιστεί ότι οι τιμές των χημικών αναλύσεων στα βιολογικά υγρά συνεκτιμώνται πάντα σε σχέση με αυτές του αίματος (ορού) και αφορούν τον λόγο: Συγκέντρωση στο Βιολογικό υγρό/συγκέντρωση στον Ορό. Οι δύο λήψεις γίνονται την ίδια ημέρα και οι τιμές στον ορό είναι πάντοτε μεγαλύτερες. Η πρωτεΐνη. Ο προσδιορισμός της ολικής πρωτεΐνης συνοδεύει σχεδόν όλα τα βιολογικά υγρά παρακεντήσεων. Παθολογική ένδειξη είναι η αύξησή της η οποία μπορεί να οφείλεται είτε σε αύξηση της ροής της από το εξωτερικό περιβάλλον προς την κοιλότητα του οργάνου είτε σε ενδογενή παραγωγή της π.χ. από τους μικροοργανισμούς κάποιας φλεγμονής όπως είναι ο μηνιγγιτιδόκοκκος στο ΕΝΥ στη βακτηριακή μηνιγγίτιδα. Η πρωτεΐνη που εισέρχεται στη κλειστή κοιλότητα είναι συνήθως μικρού μοριακού βάρους π.χ. ελαφριές αλυσίδες ανοσοσφαιρινών στο ΕΝΥ ή και μεγαλύτερου π.χ. αλβουμίνη. Ειδικά η αλβουμίνη χρησιμοποιείται πολύ για την διάγνωση του ασκίτη αφού η διαφορά SAAG (Serum to Ascites Albumin Gradient): Αλβουμίνη Ορού Αλβουμίνη Ασκητικού Υγρού χρησιμοποιείται πολύ για την διάκριση μεταξύ διαφόρων αιτιών ασκίτη. Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH). Μεταξύ των διαφόρων ενζύμων που προσδιορίζονται στα βιολογικά υγρά το πιο κοινό για όλα τα βιολογικά υγρά παρακεντήσεων είναι η LDH. H αύξηση της αποτελεί παθολογική ένδειξη. Η ηλεκτροφόρηση του LDH σε μερικές περιπτώσεις αποτελεί σημαντικό διαφοροδιαγνωστικό στοιχείο π.χ. κατά την ηλεκτροφόρηση του LDH στο ΕΝΥ η αύξηση των ισοενζύμων LDH1 και LDH2 παρατηρείται στην άσηπτη (ιογενή) μηνιγγίτδα, ενώ η αύξηση των ισοενζύμων LDH4 και LDH5 στην σηπτική (βακτηριακή) μηνιγγίτιδα. Τόσο το ολικό λεύκωμα, όσο και η γαλακτική αφυδρογονάση υπάρχουν και στα ερυθρά αιμοσφαίρια. Για το λόγο αυτό, αν το βιολογικό υγρό είναι αιματηρό, συστήνεται η διόρθωση της τιμής τους λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των ερυθρών στο βιολογικό υγρό. Γλυκόζη. Η μείωση της γλυκόζης (γλυκόλυση) αποτελεί ένδειξη φλεγμονής από βακτήρια. Για τον λόγο αυτό αποτελεί και επείγουσα εξέταση, ειδικά για το ΕΝΥ, που δηλώνει την παρουσία βακτηριακής μηνιγγίτιδας, πολύ επικίνδυνης για την ζωή. Άλλες βιοχημικές εξετάσεις. Υπάρχουν και πολλές άλλες βιοχημικές εξετάσεις που μπορεί να ζητηθούν, κάποιες από αυτές είναι απολύτως βασικές για τα συγκεκριμένα βιολογικά υγρά, κάποιες άλλες είναι προαιρετικές και γίνονται όταν το λεύκωμα, η LDH και η γλυκόζη δεν μπορούν να οδηγήσουν σε ασφαλή συμπεράσματα.
Χλώριο. Η συγκέντρωση του χλωρίου είναι η μοναδική εξέταση που γίνεται στον ιδρώτα. Αύξηση του παρατηρείται στη κυστική ίνωση, η οποία αν και ανιχνεύεται με μοριακές εξετάσεις (ο έλεγχος της αποτελεί σήμερα μέρος του προγεννητικού ελέγχου και των δύο γονέων,) η διάγνωση της ίδιας της νόσου καθορίζεται από την συγκέντρωση του χλωρίου στον ιδρώτα. Γίνεται μόνο στα παιδιατρικά νοσοκομεία. Ιόντα υδρογόνου, ph. O προσδιορισμός των ιόντων υδρογόνου αποτελεί βασική εξέταση για το γαστρικό υγρό, αφού η χαμηλή τιμή του (ph: 1 2) αποτελεί προϋπόθεση για την σωστή πέψη των τροφών. Η παθολογική τιμή του καλό είναι να συνοδεύεται και από τον προσδιορισμό της ηλεκτρεγερτικής δύναμης του γαστρικού υγρού με άδειο (προσδιορισμός του Basic Acid Output ή BAO) ή γεμάτο στομάχι (προσδιορισμός του Maximum Acid Output ή MAO). Χολερυθρίνη. Ο προσδιορισμός της έχει μεγάλη σημασία για την αντιμετώπιση του νεογνικού ίκτερου. Μετριέται στον ορό των νεογνών, αλλά μπορεί να μετρηθεί και στο αμνιακό υγρό, αν χρειάστηκε και έγινε αμνιοπαρακέντηση. Μετριέται επίσης και στο ΕΝΥ για την διάγνωση της αιμόλυσης. Άλλα ένζυμα. Πολλά άλλα ένζυμα χρησιμοποιούνται στη διάγνωση παθήσεων που σχετίζονται με διάφορα βιολογικά υγρά. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η αμυλάση,, της οποίας η συγκέντρωση προσδιορίζεται στον ορό και στα ούρα για τη διάγνωση της παγκρεατίτιδας. Για τον ίδιο λόγο μπορεί να μετρηθεί και στο περιτοναϊκό υγρό, όταν γίνει λήψη του. Η δραστικότητα της γαστρίνης αποτελεί βασική παράμετρο της ποιότητας του γαστρικού υγρού. Άλλα κοινά ένζυμα είναι η GOT, CK, ALP, ACP κ.α. Οργανικές ενώσεις, πεπτίδια. Ενδεικτικά αναφέρονται το γαλακτικό οξύ και η μυελική βασική πρωτεΐνη (Myelin Basic Protein) που μετρώνται αμφότερα στο ΕΝΥ. To γαλακτικό οξύ αυξάνει στη βακτηριακή κυρίως μηνιγγίτιδα, σε αντίθεση με την ιογενή, και η MBP στην σκλήρυνση κατά πλάκας. Το CRP μετριέται στο ΕΝΥ και σε άλλα βιολογικά υγρά ως δείκτης βακτηριακής λοίμωξης, έναντι της ιογενούς και τα τριγλυκερίδια/χοληστερόλη στο περιτοναϊκό υγρό ως δείκτης επιπλοκής στην περιτοναϊκή κάθαρση. Η συγκέντρωση του υαλουρονικού οξέος αποτελεί το μέτρο του ιξώδους του αρθρικού υγρού και η αυξημένη προσταγλανδίνη Ε μέτρο φλεγμονής ρευματοειδούς αιτιολογίας. Στο αμνιακό υγρό εκτός από την χολερυθρίνη προσδιορίζονται δείκτες ωρίμανσης του εμβρύου σε ότι αφορά τους μύες (κρεατινίνη), τον πνεύμονα (λεκιθίνη/σφιγγομυελίνη) και το νευρικό σύστημα (afp). Επίσης μετρώνται φάρμακα (σάλιο), καρκινικοί δείκτες (ορώδη υγρά), ορμόνες (π.χ. σάλιο) κ.α. Στον Πίνακα 1 μπορεί να προστεθεί το μητρικό γάλα του οποίου η σύσταση μετριέται σε μαιευτήρια ειδικά σε εκείνα που έχουν ειδικό τμήμα θηλασμού ή ακόμα και τράπεζα μητρικού γάλακτος (Έλενα Βενιζέλου). Στο μητρικό γάλα
προσδιορίζονται με μικρό αυτόματο αναλυτή το συνολικό λίπος, η συνολική πρωτεΐνη, το συνολικό ποσό των υδατανθράκων και οι θερμίδες (Kcal/L). Επίσης λείπει και το γαστρικό υγρό στο οποίο μετρώνται εκτός από το ph και την ηλεκτρεγερτική του δύναμη ένζυμα όπως είναι η γαστρίνη. Υγρό Κοινές εξετάσεις Προαναλυτικά σφάλματα ΕΝΥ Γλυκόζη «Συντήρηση» γλυκόζης Πρωτεΐνη Περικαρδιακ ό υγρό Περιτοναϊκό/ ασκητικό υγρό Πλευριτικό υγρό Αμνιακό υγρό Χολερυθρίνη Πρωτεΐνη LDH Πρωτεΐνη, Αλβομίνη, LDH, Αμυλάση, Τριγλυκερίδια, Γενική αίματος, Καλλιέργεια Πρωτεΐνη, LDH Γλυκόζη ph Χολερυθρίνη Αρθρικό υγρό Ένζυμα Σάλιο Ελεύθερες ορμόνες, φάρμακα Προστασία της χολερυθρίνης από το φως Η καλλιέργεια πρέπει να προηγείται όλων των αναλύσεων. Το περιτοναϊκό υγρό θα πρέπει να συλλέγεται ταυτόχρονα με το αίμα. «Συντήρηση» γλυκόζης Μόλις το αίμα συλλεγεί τοποθετείται σε ειδικό φιαλίδια για την μέτρηση αερίων αίματος. Προστασία της χολερυθρίνης από το φως Το δείγμα πρέπει να αναλύεται μέσα σε δύο ώρες. Το δείγμα συλλέγεται σε περιέκτες του εμπορίου Ιδρώτας Χλώριο Τα νεογνά πρέπει να είναι τουλάχιστον δύο εβδομάδων και 3 κιλών βάρος. Ο ρυθμός αποβολής ιδρώτα πρέπει να είναι 1 g/m 2 /min Αναλυτικοί Μεταναλυτικοί παράγοντες Προσδιορίζεται η αλβουμίνη σε αίμα και υγρό για τον υπολογισμό του δείκτη SAAG Αναερόβιος προσδιορισμός ως αέριο αίματος Φυγοκέντρηση πριν την ανάλυση Το δείγμα ψύχεται για να μειωθεί το ιξώδες. Η συλλογή του ιδρώτα στο ειδικό φίλτρο θα πρέπει να διαρκεί τουλάχιστον 40 λεπτά. Αριθμός ερυθρών αιμοσφαιρίων Χρησιμοποιείται το διάγραμμα Liley ή Queenan για την ερμηνεία των τιμών Η αφυδάτωση ή η μόλυνση του στόματος μπορεί να οδηγήσει σε ψευδή αποτελέσματα. Ερμηνεία αποτελεσμάτων Κριτήρια Light Κριτήρια Light Προσδιορίζοντας στο αίμα βιοδείκτες ήπατος (π.χ. ολικού λευκώματος, αλβουμίνης), βιοδείκτες νεφρού και η αμυλάση. Κριτήρια Light, Ταυτόχρονη μέτρηση πρωτεΐνης και LDH ορού ή πλάσματος Απαιτείται η εβδομάδα κύησης Θα πρέπει να καθιερωθούν τιμές Cut-Offs για τις δυναμικές δοκιμασίες. Δεν πρέπει να μετράται και να ερμηνεύεται η συγκέντρωση του νατρίου χωρίς αυτή του χλωρίου. Πίνακας 1. Βιολογικά υγρά, κοινές εξετάσεις τους και οι σημαντικότεροι προαναλυτικοί, αναλυτικοί και μετααναλυτικοί παράγοντες που επηρεάζουν τους προσδιορισμούς τους (από την οδηγία The Biochemistry Biological Fluids ACBI [Ένωση Κλινικών Βιοχημικών Ιρλανδίας, 2009]).