ανασυνδυασμένης τρανσγλουταμινάσης ανθρώπινου ιστού ως πηγή αντιγόνου εξετάζεται στις αναφορές 11 και 12.

QUANTA Lite Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός R h-ttg IgA ELISA 704605 Ενδεικνυόμενη Χρήση Αυτή η ανάλυση έχει σχεδιαστεί για in-vitro μέτρηση συγκεκριμένων αυτοαντισωμάτων IgA έναντι ιστού τρανσγλουταμινάσης (ttg) παρόντος στον ανθρώπινο ορό, ως βοήθημα στη διάγνωση της νόσου κοιλιοκάκης. Παρέχονται επαρκή υλικά για να επιτραπεί η δοκιμασία έως 41 δειγμάτων εις διπλούν ή 89 μεμονωμένων, με μια καμπύλη βαθμονόμησης και 2 ελέγχους. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας Η νόσος κοιλιοκάκης χαρακτηρίζεται από δυσανεξία στη γλουτένη που οδηγεί σε μια χρόνια δυσαπορροφητική διαταραχή λόγω φλεγμονής του εντερικού βλεννογόνου και λείανσης του επιθήλιου 1. Τα αναθεωρημένα κριτήρια για τη διάγνωση της νόσου κοιλιοκάκης, σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Εταιρεία Παιδιατρικής Γαστρεντερολογίας και Διατροφής (ESPGAN) 1990, απαιτούν τον προσδιορισμό μίας και μοναδικής θετικής βιοψίας εντέρου σε συνδυασμό με την επίδειξη δύο τουλάχιστον από τα ακόλουθα τρία αυτοαντισώματα IgA 2 που περιγράφονται παρακάτω. Τα αντισώματα που σχετίζονται με τη νόσο κοιλιοκάκης περιλαμβάνουν: αντι-ενδομυϊκά IgA 3 αντισώματα, αντισώματα αντι-γλιαδίνης IgG και IgA 4 και αντισώματα αντι-ρετικουλίνης. Αρκετές μελέτες έχουν επιδείξει ότι οι δοκιμασίες με αντι-ενδομυϊκά IgA έχουν ειδικότητα μεγαλύτερη από 99% για την νόσο κοιλιοκάκης με μεγαλύτερη ευαισθησία από τις αναλύσεις με αντι-γλιαδίνη και αντι-ρετικουλίνη 5,6. Το αντιγόνο-στόχος ενδομυΐου έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως το εξαρτώμενο από το ασβέστιο, διασταυρούμενης σύνδεσης πρωτεΐνης ένζυμο, γνωστό ως τρανσγλουταμινάση ιστού 7,8. Η ανάλυση ELISA για IgA αντι-ttg παρέχει μια κατάλληλη μέθοδο εναλλακτική ως προς τις αναλύσεις ανοσοφθορισμού (IFA) και είναι ιδανική για ανίχνευση μικρής και μεγάλης κλίμακας 9,10. Η χρήση της ανασυνδυασμένης τρανσγλουταμινάσης ανθρώπινου ιστού ως πηγή αντιγόνου εξετάζεται στις αναφορές 11 και 12. Αρχές της Διαδικασίας Οι μικροκοιλότητες έχουν προηγουμένως επαλειφθεί με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ttg αντιγόνο, το αντιγόνο έχει καλλιεργηθεί σε Baculovirus κύτταρα και το κατασκεύασμα καλλιέργειας χρησιμοποίησε μια cdna κωδικοποίηση για τη μακρά συνενωμένη ισομορφή του ανθρώπινου ttg. Οι βαθμονομητές, οι έλεγχοι και τα αραιωμένα δείγματα ασθενών προστίθενται στις κοιλότητες και τα αυτοαντισώματα που αναγνωρίζουν το αντιγόνο ttg δεσμεύονται κατά την πρώτη επώαση. Έπειτα από την πλύση των κοιλοτήτων ώστε να απομακρυνθούν όλες οι αδέσμευτες πρωτεΐνες, προστίθεται κεκαθαρμένη υπεροξειδάση προσδιοριζόμενη ως αντι-ανθρώπινο IgA σύζευγμα αίγας. Το σύζευγμα δεσμεύεται με το ακινητοποιημένο ανθρώπινο αυτοαντίσωμα και το περίσσιο αδέσμευτο σύζευγμα απομακρύνεται με ένα επιπλέον βήμα πλύσης. Το δεσμευμένο σύζευγμα οπτικοποιείται με ένα υπόστρωμα 3,3,5,5 τετραμεθυλοβενζιδινής (TMB) το οποίο δίνει ένα προϊόν αντίδρασης χρώματος μπλε, η ένταση του οποίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αυτοαντισώματος στο δείγμα. Προστίθεται θειικό οξύ σε κάθε πλάκα για να σταματήσει η αντίδραση. Αυτό παράγει ένα τελικό κίτρινο χρώμα, το οποίο διαβάζεται στα 450nm. Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με ανασυνδυασμένο αντιγόνο ttg (12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Αρνητικός Έλεγχος, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς ανθρώπινα αντισώματα IgA έναντι του ttg, προαραιωμένο 1,2ml 3. R h-ttg IgA ELISA Βαθμονομητής A, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 4. R h-ttg IgA ELISA Βαθμονομητής B, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 5. R h-ttg IgA ELISA Βαθμονομητής C, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 6. R h-ttg IgA ELISA Βαθμονομητής D, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 7. R h-ttg IgA ELISA Βαθμονομητής Ε, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 8. R h-ttg IgA Θετικός Έλεγχος, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού IgA έναντι του ttg, προαραιωμένο, 1,2ml 9. HRP Δείγμα Αραιωτικό δείγματος, 2 φιαλίδια χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 10. HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στην ενότητα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 11. HRP R h-ttg IgA Σύζευγμα, αντι-ανθρώπινη IgA, 1 φιαλίδιο κίτρινου χρώματος, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 12. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 13. HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προειδοποιήσεις 1. Προειδοποίηση: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 1

2. Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην προετοιμασία των πρότυπων ορών για αυτό το προϊόν έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικά για αντισώματα HIV, HBsAg και HCV από εγκεκριμένες μεθόδους FDA. Ωστόσο, καμία μέθοδος ελέγχου δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση για την απουσία των HIV, HBV, HCV ή άλλων μολυσματικών παραγόντων. Κατά συνέπεια, το R h-ttg IgA Θετικός Έλεγχος, το R h-ttg IgA ELISA Βαθμονομητής A μέσω E και ο ELISA Αρνητικός Έλεγχος θα πρέπει να 14 χειρίζονται με τον ίδιο τρόπο όπως τα δυνητικά μολυσματικά υλικά. 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και δύναται να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης ή απορρόφησης μέσω του δέρματος ή των ματιών. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Ξεπλύνετε τις λεκάνες απόπλυσης εάν χρησιμοποιούνται για την απόρριψη του αντιδραστηρίου, με άφθονο νερό ώστε να αποφευχθεί η συγκέντρωση των αζιδίων. 4. Το σύζευγμα HRP περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για την πρόληψη πιθανών εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μια ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν εισπνευσθεί, καταποθεί ή απορροφηθεί από το δέρμα. Για την πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το HRP διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) αποτελείται από ένα αραιωμένο διάλυμα θειικού οξέως. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα, ή άλλα μείγματα που δύναται να αντιδράσουν με οξέα. Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και επομένως μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για την πρόληψη εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια που παρέχονται. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Προφυλάξεις 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Αυτό το προϊόν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνον από κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό. 3. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. Οποιαδήποτε παρέκκλιση μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της ανάλυσης και τα αποτελέσματα που αποκομίζονται. Πρέπει να δίνεται προσοχή στις συγκεκριμένες "Σημειώσεις" και προειδοποιήσεις σε κάθε σημείο αυτών των Οδηγιών Χρήσεως. 4. Οι αριθμοί της παρτίδας του βαθμονομητή, του συζεύγματος και της πλάκας δεν είναι εναλλάξιμοι. Η αντικατάσταση αυτών των στοιχείων με αριθμούς παρτίδας που διαφέρουν από αυτούς που παρέχονται στο κιτ μπορεί να οδηγήσει σε ασυνεπή και ανακριβή αποτελέσματα. Όλες οι ταινίες πρέπει να προέρχονται από την ίδια αλουμινένια συσκευασία. 5. Για να αποφύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων, χρησιμοποιείτε μόνο καινούρια ή καθαρά πλαστικά/γυάλινα υλικά. Ποτέ μην επιστρέφετε αντιδραστήρια στα φιαλίδια. 6. Να μην αφήνετε τα φιαλίδια των αντιδραστηρίων με ανοιχτά καπάκια. Τυχόν επακόλουθη εξάτμιση ή μόλυνση θα οδηγήσει σε ασυνεπή αποτελέσματα. 7. Το υπόστρωμα TMB δεν πρέπει να εκτίθεται στο φως ή στο νερό. 8. Μικροβιακά μολυσμένος, αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός και δείγματα που περιέχουν σωματιδιακό υλικό δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. 9. Η ανακριβής αραίωση του δείγματος δεν μπορεί να ελεγχθεί, καθώς οι έλεγχοι του κιτ είναι έτοιμοι για χρήση. Συνιστάται η χρήση βαθμονομημένων πιπετών και κατάλληλων δειγμάτων QC. 10. Η χρήση αυτόματων συστημάτων ανάλυσης, αραιωτών δειγμάτων και άλλου αυτόματου εξοπλισμού μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές στα αποτελέσματα σε σύγκριση με την δια χειρός διαδικασία. Είναι ευθύνη κάθε εργαστηρίου να επικυρώσει πλήρως το σύστημα, και να διασφαλίσει ότι τα αποτελέσματα είναι εντός των ορίων όπως προσδιορίζονται σε αυτό το ένθετο και το σχετικό πιστοποιητικό QC. 11. Όλος ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται πρέπει να βαθμονομείται και να διατηρείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συνθήκες αποθήκευσης 1. Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C και δεν πρέπει να καταψύχεται. Ακατάλληλες θερμοκρασίες αποθήκευσης θα επηρεάσουν τα αποτελέσματα. 2. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για 1 βδομάδα στους 2-8 C. 3. Η ημερομηνία λήξης του κιτ εμφανίζεται στην εξωτερική ετικέτα. Συλλογή δείγματος 1. Τα δείγματα αίματος πρέπει να συλλέγονται με φλεβοκέντηση να τους επιτρέπεται να πήζουν φυσικά και να διαχωρίζεται ο ορός. 2. Ο ορός μπορεί να αποθηκεύεται στους 2-8 C για έως και 7 ημέρες πριν από την ανάλυση 13, ενώ για παρατεταμένη αποθήκευση, πρέπει να διαιρείται και να αποθηκεύεται στους 20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. 3. Η επανειλημμένη τήξη και ψύξη πρέπει να αποφεύγεται. 4. Τα δείγματα ορού δεν πρέπει να αδρανοποιούνται με θέρμανση, καθώς αυτό μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται Φυλλάδιο οδηγιών: Παρέχει πλήρεις λεπτομέρειες της ανάλυσης. Πιστοποιητικό QC: Υποδεικνύει την αναμενόμενη απόδοση της παρτίδας. Κοιλότητες Επικαλυμμένες με Ανθρώπινη Τρανσγλουταμινάση: 12 διασπάσιμα 8 λωρίδες κοιλοτήτων επικαλυμμένες με ανασυνδυασμένο ttg. Κάθε πλάκα είναι συσκευασμένη σε μια επανασφραγιζόμενη αλουμινένια συσκευασία που περιέχει δύο αφυγραντικές σακούλες. 2

HRP Αραιωτικό Δείγματος: 2 φιαλίδια που περιέχουν 50mL ρυθμιστικού διαλύματος για την αραίωση του δείγματος. Χρώματος ροζ, έτοιμο για χρήση. HRP Συμπύκνωμα Πλύσης: 1 φιαλίδιο που περιέχει 25mL ενός 40-άκις συμπυκνωμένου ρυθμιστικού διαλύματος για την πλύση των κοιλοτήτων. R h-ttg IgA Βαθμονομητές: 5 φιαλίδια, το καθένα περιέχει 1,2mL αραιωμένο ανθρώπινο ορό, με τις ακόλουθες συγκεντρώσεις αυτοαντισωμάτων αντι-ttg IgA: 100, 33,3, 11,1, 3,7, 1,23 U/mL. Έτοιμο για χρήση. R h-ttg IgA Θετικός Έλεγχος: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση. ELISA Αρνητικός Έλεγχος: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση. Σύζευγμα HRP R h-ttg IgA: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL κεκαθαρμένης υπεροξειδάσης με προσδιοριζόμενη με ετικέτα αντίσωμα σε ανθρώπινο IgA. Κίτρινου χρώματος. Έτοιμο για χρήση. Χρωμογόνο TMB : 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL υποστρώματος TMB. Έτοιμο για χρήση. HRP Διάλυμα Διακοπής: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL Θειικού οξέος 0.344M. Έτοιμο για χρήση. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Αυτόματη συσκευή πλύσης πλάκας μικροπλακών: Αυτή η συσκευή συνιστάται, ωστόσο, η πλύση των πλακών μπορεί να γίνει δια χειρός. Συσκευή ανάγνωσης της πλάκας: Ικανή να μετρήσει οπτικές πυκνότητες στα 450nm αναφερόμενα στον αήρ. Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό: Αυτό θα πρέπει να είναι της καλύτερης διαθέσιμης ποιότητας Βαθμονομημένες μικροπιπέτες: Για την προσθήκη 1000, 100 & 10µL Πιπέτα πολλαπλών καναλιών: Συνιστάται για την προσθήκη όγκου 100µL συζεύγματος, υποστρώματος και διαλύματος διακοπής. Γυάλινα/πλαστικά σωληνάρια: Για την αραίωση του δείγματος Μέθοδος Πριν ξεκινήσετε 1. Επάγετε το κιτ σε θερμοκρασία δωματίου Το κιτ έχει σχεδιαστεί για χρήση σε θερμοκρασία δωματίου (20-24 C). Αφαιρέστε το κιτ από την αποθήκευση και διατηρήστε σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 60 λεπτά. Οι κοιλότητες δεν πρέπει να αφαιρεθούν από την αλουμινένια συσκευασία πριν φτάσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Σημείωση: Τα κιτ μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία δωματίου για έως και 1 εβδομάδα. 2. Στοιχεία του κιτ Αναδεύστε απαλά κάθε στοιχείο του κιτ πριν από τη χρήση. 3. Αραίωση ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης Προσθέστε 25mL συμπυκνωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης σε 975mL αποσταγμένου νερού (αραίωση 1 προς 40) σε ένα καθαρό δοχείο και αναδεύστε. Σημείωση: Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για 1 εβδομάδα στους 2-8 C, οπότε αραιώστε μόνο την κατάλληλη ποσότητα. Εάν το ρυθμιστικό διάλυμα παρουσιάσει οποιοδήποτε σημάδι μικροβιακής μόλυνσης ή γίνει θολό, απορρίψτε το και ετοιμάστε ένα νέο διάλυμα. 4. Αραίωση δείγματος Αραιώστε 10µL από κάθε δείγμα με 1000µL αραιωτικό δείγματος (1:101) και αναδεύστε καλά. Σημείωση: Τα αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 8 ωρών. 5. Χειρισμός ταινιών και πλαισίου Τοποθετείστε τον απαιτούμενο αριθμό κοιλοτήτων στη συσκευή συγκράτησης των ταινιών. Τοποθετείστε από την κοιλότητα A1, γεμίζοντας τις στήλες από αριστερά προς τα δεξιά διαμέσου της πλάκας. Κατά τον χειρισμό της πλάκας συμπιέστε τις μακρές άκρες του πλαισίου ώστε να εμποδίσετε τις κοιλότητες από το να πέσουν. Σημείωση: Επιστρέψετε τις αχρησιμοποίητες κοιλότητες στην αλουμινένια συσκευασία αμέσως με τις δύο αφυγραντικές σακούλες και επανασφραγίστε σφικτά ώστε να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση στην υγρασία. Μεριμνήστε έτσι ώστε να μην τρυπήσετε ή σκίσετε την αλουμινένια συσκευασία, δείτε παρακάτω, Προειδοποίηση: Η έκθεση των κοιλοτήτων στην υγρασία ή η μόλυνση από σκόνη ή άλλο σωματιδιακό υλικό θα έχει ως επακόλουθο τον εκφυλισμό του αντιγόνου, που θα οδηγήσει σε φτωχή ακρίβεια της ανάλυσης και δυνητικά ψευδή αποτελέσματα. Διαδικασία ανάλυσης Διατηρήστε την ίδια ακολουθία προσθήκης σε ολόκληρη την ανάλυση. 1. Προσθήκη Δείγματος Προσθέστε 100µL από κάθε βαθμονομητή, έλεγχο και αραιωμένου (1:101) δείγματος στις κατάλληλες κοιλότητες της πλάκας που παρέχεται. Σημείωση: Τα δείγματα θα πρέπει να προστίθενται όσο το δυνατόν ταχύτερα στην πλάκα ώστε να ελαχιστοποιείται η απόκλιση της ανάλυσης και ο χρονομετρητής να ξεκινά μετά την προσθήκη του τελευταίου δείγματος. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 2. Πλύση Η διαδικασία πλύσης είναι κρίσιμη και απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή. Μία ακατάλληλα ξεπλυμένη πλάκα θα δώσει ανακριβή αποτελέσματα, με ανεπαρκή ακρίβεια και πολλές παρεμβολές. Μετά την επώαση απομακρύνετε την πλάκα και πλύνετε τις κοιλότητες 3 φορές με 200-300µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης ανά κοιλότητα. Πλύνετε την πλάκα είτε χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο μηχάνημα πλύσης των πλακών είτε δια χειρός όπως υποδεικνύεται παρακάτω. Μετά από την τελική αυτόματη πλύση, αναποδογυρίστε την πλάκα και χτυπήστε απαλά τις κοιλότητες ώστε να στεγνώσουν σε απορροφητικό χαρτί. 3

Οι πλάκες μπορούν να πλυθούν δια χειρός κατά τα ακόλουθα: α. Αδειάστε το περιεχόμενο της πλάκας στην λεκάνη απόπλυσης. β. Χτυπήστε απαλά τις κοιλότητες ώστε να στεγνώσουν σε απορροφητικό χαρτί. γ. Γεμίστε κάθε κοιλότητα με 200-300µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης χρησιμοποιώντας μια πιπέτα πολλαπλών καναλιών. Δ..Αναδεύστε απαλά την πλάκα σε μια επίπεδη επιφάνεια. ε. Επαναλάβετε το α - Δ δύο φορές. φ. Επαναλάβετε το α και β. 3. Προσθήκη υποστρώματος Προσθέστε 100µL υποστρώματος σε κάθε κοιλότητα, σκουπίστε το πάνω μέρος των κοιλοτήτων με ένα χαρτομάντιλο για να απομακρύνετε τυχόν πιτσιλιές. Σημείωση: Για να αποφύγετε τυχόν μόλυνση, ποτέ μην επιστρέφετε το περίσσιο υπόστρωμα στο μπουκάλι του αντιδραστηρίου. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 4. Πλύση Επαναλάβετε το βήμα 2. 5. Προσθήκη Υποστρώματος (TMB) Προσθέστε 100µL υποστρώματος TMB σε κάθε κοιλότητα, σκουπίστε το πάνω μέρος των κοιλοτήτων με χαρτομάντιλο για να απομακρύνετε τυχόν πιτσιλιές. Σημείωση: Για να αποφύγετε τυχόν μόλυνση, μην επιστρέφετε το περίσσιο TMB στο μπουκάλι του αντιδραστηρίου. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 30 λεπτά. 6. Διακοπή Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής σε κάθε κοιλότητα. Αυτό προκαλεί μια αλλαγή χρώματος από μπλε σε κίτρινο. 7. Μέτρηση οπτικής πυκνότητας Μετρήστε την οπτική πυκνότητα (ΟΠ) κάθε κοιλότητας στα 450nm σε ένα μετρητή μικροκοιλοτήτων, εντός 30 λεπτών από την διακοπή της αντίδρασης Έλεγχος ποιότητας 1. Έλεγχος Ποιότητας Για να είναι έγκυρη μια ανάλυση, πρέπει να ικανοποιούνται όλα τα παρακάτω κριτήρια: Οι βαθμονομητές και οι θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι πρέπει να συμπεριλαμβάνονται σε κάθε σειρά μετρήσεων. Οι τιμές που αποκομίζονται για τους θετικούς και αρνητικούς ελέγχους πρέπει να είναι εντός του εύρους που προσδιορίζεται στο Πιστοποιητικό QC. Το σχήμα της καμπύλης πρέπει να είναι παρόμοιο με της καμπύλης βαθμονόμησης, που εμφανίζεται στο Πιστοποιητικό QC. Εάν τα παραπάνω κριτήρια δεν ικανοποιούνται, η ανάλυση είναι άκυρη και η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί. 2. Υπολογίστε τις μέσες οπτικές πυκνότητες (Για αναλύσεις που γίνονται εις διπλούν μόνο) Για κάθε βαθμονομητή, έλεγχο και δείγμα υπολογίστε την μέση ΟΠ των διπλότυπων ενδείξεων. Το ποσοστό του συντελεστή μεταβλητότητας (% ΣΜ) για κάθε διπλότυπη ΟΠ θα πρέπει να είναι λιγότερο 15%. 3. Σχεδιασμός καμπύλης βαθμονόμησης Η καμπύλη βαθμονόμησης μπορεί να σχεδιαστεί είτε αυτόματα είτε δια χειρός όπως προκύπτει σχεδιάζοντας την συγκέντρωση αυτοαντισωμάτων IgA αντι-ttg στην λογαριθμική κλίμακα έναντι της ΟΠ στην γραμμική κλίμακα για κάθε βαθμονομητή: Αυτόματα - χρησιμοποιήστε καταλλήλως επικυρωμένα λογισμικά, και την εφαρμογή καμπύλης που ταιριάζει καλύτερα στα δεδομένα. Διά χειρός - χρησιμοποιήστε λογαριθμικό/γραμμικό χαρτί γραφήματος, σχεδιάστε μια ομαλή καμπύλη δια μέσου των σημείων (όχι ευθεία γραμμή ή από σημείο σε σημείο). 4. Αντιμετώπιση ανώμαλων σημείων Εάν οποιοδήποτε σημείο δεν βρίσκεται εντός της καμπύλης μπορεί να απαλειφθεί. Εάν η απουσία του σημείου αυτού σημαίνει ότι η καμπύλη έχει ένα σχήμα ανόμοιο με εκείνο της καμπύλης βαθμονόμησης του δείγματος, ή παραπάνω από ένα σημείο φαίνεται να είναι ανώμαλο, τότε πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση. 5. Υπολογισμός των τιμών ελέγχου Μετρήστε το επίπεδο του αυτοαντισώματος IgA αντι-ttg από την καμπύλη βαθμονόμησης. Οι τιμές πρέπει να πέφτουν εντός του εύρους που δίνεται στο Πιστοποιητικό QC. 6. Υπολογισμός του επιπέδου αυτοαντισωμάτων σε αραιωμένα δείγματα Μετρήστε το επίπεδο του αυτοαντισώματος IgA αντι-ttg στα αραιωμένα δείγματα απευθείας από την καμπύλη βαθμονόμησης. Σημείωση: Οι τιμές του βαθμονομητή έχουν ρυθμιστεί με παράγοντα του 100 ώστε να ερμηνεύσουν μια αραίωση δείγματος 1:101, επομένως δεν απαιτείται καμία επιπλέον μετατροπή. 7. Βαθμονόμηση ανάλυσης Η ανάλυση έχει βαθμονομηθεί σε U/mL έναντι ενός αυθαίρετου βαθμονομητή αναφοράς, καθώς καμία διεθνώς αναγνωρισμένη προεργασία αναφοράς δεν είναι επί του παρόντος διαθέσιμη. Περιορισμοί της Διαδικασίας 1. Αυτό το κιτ χρησιμοποιείται μόνο για να βοηθήσει στην διάγνωση. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι ορισμένες ασθένειες πρέπει να επιβεβαιωθούν από κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές δοκιμασίες. 2. Τα αποτελέσματα που αποκομίζονται από αυτή την ανάλυση δεν είναι διαγνωστική απόδειξη της παρουσίας ή της απουσίας νόσου. 3. Η χρήση αυτής της ανάλυσης και το φυσιολογικό εύρος (ερμηνεία αποτελεσμάτων) δεν έχει διαπιστωθεί για παιδιατρικά δείγματα. 4. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα μπορεί να οφείλεται στην ανεπάρκεια IgA και δεν αποκλείει την κοιλιακή ασθένεια. 4

Αναμενόμενες Τιμές Το φυσιολογικό εύρος προσδιορίστηκε σε ορό από 200 φυσιολογικούς ενήλικες αιμοδότες. Ένα από αυτά τα δείγματα επιβεβαιώθηκε πως περιέχει αντισώματα ttg IgA. Το εύρος παρέχεται μόνο ως οδηγός. Οι αναλύσεις ELISA είναι πολύ ευαίσθητες και ικανές να ανιχνεύσουν μικρές διαφορές σε πληθυσμούς δειγμάτων. Συνιστάται ο ξεχωριστός προσδιορισμός του φυσιολογικού εύρους από κάθε εργαστήριο, βάση των τεχνικών πληθυσμού και εξοπλισμών που χρησιμοποιούνται. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Αρνητικό <4,0 U/mL Ασθενώς Θετικό 4-10 U/mL Θετικό >10 U/mL Χαρακτηριστικά απόδοσης ΑΚΡΙΒΕΙΑ Η ακρίβεια εντός της ανάλυσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έξι δείγματα που δοκιμάστηκαν εντός του εύρους της καμπύλης βαθμονόμησης. Ο % ΣΜ για κάθε δείγμα δίνεται παρακάτω: ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΕΝΤΟΣ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ αρ=20 Συγκέντρωση (U/mL) % ΣΜ Δείγμα 1 2,8 2,8 Δείγμα 2 5,1 3,9 Δείγμα 3 15,8 1,9 Δείγμα 4 21,6 3,2 Δείγμα 5 29,4 5,5 Δείγμα 6 55,8 3,3 Η ακρίβεια μεταξύ των αναλύσεων μετρήθηκε με 6 δείγματα που δοκιμάστηκαν εις διπλούν έξι φορές για τρεις ημέρες. Ο % ΣΜ για κάθε δείγμα δίνεται παρακάτω: ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ αρ=6 Συγκέντρωση (U/mL) % ΣΜ Δείγμα 1 3,2 4,5 Δείγμα 2 5,3 5,8 Δείγμα 3 17,2 6,8 Δείγμα 4 25,2 7,1 Δείγμα 5 30,5 6,9 Δείγμα 6 74,0 6,7 ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Η ευαισθησία της ανάλυσης των 1,23 U/mL επιβεβαιώθηκε με την ανάλυση δύο δειγμάτων σε πολλαπλά αντίγραφα με τιμές 1.5 και 2.5 φορές το χαμηλότερο σημείο βαθμονόμησης (1,23 U/mL). Η στατιστική ανάλυση με το Student s t test επιβεβαίωσε ότι τα δείγματα αυτά ήταν σημαντικά διαφορετικά μεταξύ τους (p<0.0001). ΕΥΡΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ Το εύρος μέτρησης της ανάλυσης είναι 1,23-100 U/mL. Φυσιολογικές Τιμές Τα επίπεδα IgA αντι-ttg αυτοαντισωμάτων μετρήθηκαν στον ορό 200 φυσιολογικών ενήλικων αιμοδοτών. Βάσει της κατευθυντήριας ερμηνείας των αποτελεσμάτων, το 0,5% (1/200) ήταν θετικό για IgA ttg αυτοαντισώματα. Αυτό το θετικό δείγμα ήταν επίσης θετικό για σε ένα εναλλακτικό κιτ ttg IgA EIA. Αριθμός δειγμάτων Επιπλέον, 39/40 δείγματα από ασθενείς με νόσο του Crohn (αρ=21) και ελκώδη κολίτιδα (αρ=19) βρέθηκαν αρνητικά στην ανάλυση IgA αντι-ttg. Το μεμονωμένο θετικό δείγμα της νόσου του Crohn επιβεβαιώθηκε ως θετικό από ενδομυϊκό IFA αντι-iga. 5

ΣΧΕΤΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ, ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ, ΣΥΜΦΩΝΙΑ Η σχετική ειδικότητα, ευαισθησία και συμφωνία προσδιορίστηκαν έναντι ενός κιτ αντι-iga και ενδομυϊκού IFA χρησιμοποιώντας 106 δείγματα δοκιμασίας από επιβεβαιωμένους μέσω βιοψίας πασχόντων ή μη πασχόντων από κοιλιοκάκη. BINDAZYME Αντι-τρανσγλουταμινάση IgA Αντι-IgA ενδομυϊκό IFA + - + 53 3 a b - 1 49 Σχετική ευαισθησία 98,2 % Σχετική ειδικότητα 94,2% Σχετική συμφωνία 96,2% α. 3/3 EIA θετικά / IFA αρνητικά δείγματα προέρχονταν από επιβεβαιωμένους μέσω βιοψίας πασχόντων από κοιλιοκάκη. β. Δείγμα ασθενώς θετικό με IFA ΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Μία σειρά παρεμβαλλόμενων ουσιών είχαν προστεθεί στα αρνητικά και θετικά δείγματα IgA αντι-ttg, τα οποία κατά συνέπεια αναλύθηκαν στη συνέχεια. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο των ουσιών αυτών βασίστηκε στο Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Ιαπωνία. Ουσία Χολερυθρίνη F (Ελεύθερη) Χολερυθρίνη C (Σύζευγμα) Αιμοσφαιρίνη σε κατάσταση Αιμόλυσης Εντερικός χυλός Ρευματοειδής παράγοντας Συγκέντρωση 19,3mg/dL 19,9mg/dL 485mg/dL 1550 Μονάδες 45 IU/mL Καμία παρεμβολή από αυτές τις ουσίες δεν παρατηρήθηκε σε κανένα από τα δείγματα που δοκιμάστηκαν. Γραμμικότητα ανάλυσης Τρία δείγματα δοκιμάστηκαν για γραμμικότητα στο εύρος βαθμονόμησης, ο συντελεστής παλινδρόμησης R 2 ήταν μεγαλύτερος από 0.997 κατά τη σύγκριση των πραγματικών με τις αναμενόμενες τιμές σε U/mL, με τη μέση τιμή ανάκτησης 99%. Μελέτες φαινομένου Prozone Τρία θετικά δείγματα αραιώθηκαν 1:6.25 σε αραιωτικό δείγματος (κανονική αραίωση 1:101) ώστε να αξιολογηθούν τα πιθανά αποτελέσματα του φαινομένου prozone. Όλα τα δείγματα αραιώθηκαν κατάλληλα, καμία ψευδώς αρνητική τιμή δεν παρατηρήθηκε στις χαμηλότερες αραιώσεις δείγματος, κατά συνέπεια δεν παρατηρήθηκε το φαινόμενο prozone. Πρότυπο Πλάκας A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B Γ Δ E Φ Γ Χ 6

Περίληψη της διαδικασίας 1. Προσθέστε 100µL από κάθε βαθμονομητή, έλεγχο και 1:101 αραιωμένο δείγμα στις κατάλληλες κοιλότητες. Επωάστε για 30 λεπτά. Ξεπλύνετε. 2. Προσθέστε 100µL συζεύγματος σε κάθε κοιλότητα. Επωάστε για 30 λεπτά. Ξεπλύνετε. 3. Προσθέστε 100µL υποστρώματος σε κάθε κοιλότητα. Επωάστε για 30 λεπτά. 4. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής σε κάθε κοιλότητα. Μετρήστε την απορρόφηση στα 450nm. 7

Βιβλιογραφία 1. Trier, JS. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24: 1709-1719. 2. Walker Smith J A et al. Revised criteria for the diagnosis of celiac disease: Report of working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood. 1990;65: 909-911. 3. Valdermarsson T et al. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies. 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science. 1996;41:83-87. 4. Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: 941-947 5. Volta U et al. IgA anti-endomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases and Science. 1991;36:752-756. 6. Grodzinsky E. Hed J, Skogh T. IgA anti-endomysial antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy. 1994:49:593-597. 7. Dieterich W et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of Celiac Disease. Nature Medicine. 1997; 3:797-801. 8. Dieterich W et al. Autoantibodies to Tissue Transglutaminase as Predictors of Celiac Disease. Gastroenterology. 1998; 115:1317-1321. 9. Sulkane S et al. Tissue Transglutaminase Autoantibody Enzyme linked Immunosorbent Assay in detecting Celiac Disease. Gastroenterology. 1998; 115:1322-1328. 10. Sollid LM and Scott H. New tool to predict Celiac Disease on its Way to the Clinics. Gastroenterology. 1998; 115:1584-1594. 11. Sardy M et al. Recombinant Human Tissue Transglutaminase ELISA for the Diagnosis of Glutin-sensitive Enteropathy. Clin Chem. 1999; 45:12, 2142-2149. 12. Sblattero D et al. Human recombinant Tissue Transglutaminase ELISA: An Inovative Diagnostic Assay for Celiac Disease. Ammeriacan Journal of Gastroenterology. 2000; 95:5, 1253-1257 13. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624605GRC August 2012 Revision 3 8