ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ (ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ)

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΚΡHTHΣ Τμήμα Διατροφής & Διαιτολογίας ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ (ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ) 1

ΜΕΡΟΣ 1 ο ΑΣΦΑΛΕΙΑ & ΥΓΙΕΙΝΗ ΣΤΟΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΧΩΡΟ 2

Η ασφάλεια και η υγιεινή στο χώρο της εργασίας έχει αναχθεί τα τελευταία χρόνια σε ένα πολύ σημαντικό ζήτημα Τα εργατικά ατυχήματα αυξάνονται λόγω εντατικοποίησης της εργασίας Σε όλες τις επιχειρήσεις ανεξαρτήτως αριθμού εργαζομένων, ο εργοδότης έχει την υποχρέωση να χρησιμοποιεί τις υπηρεσίες του τεχνικού ασφαλείας Οι επιχειρήσεις που απασχολούν πάνω από 50 άτομα προσωπικό πρέπει να έχουν ιατρό εργασίας 3

Σε επιχειρήσεις με προσωπικό λιγότερο από 50 άτομα ο εργοδότης είναι υποχρεωμένος να έχει ιατρό εργασίας όταν χρησιμοποιούν μόλυβδο, αμίαντο, καρκινογόνες ουσίες και βιολογικούς παράγοντες και από την εκτίμηση επικινδυνότητας προκύπτει κίνδυνος για την υγεία των εργαζομένων Υπάρχει νομοθετικό πλαίσιο για τους εργαζόμενους που έρχονται σε επαφή σε φυσικούς, χημικούς και βιολογικούς παράγοντες 4

Βιολογικοί παράγοντες: οι μικροοργανισμοί, μεταξύ των οποίων και οι γενετικά τροποποιημένοι, οι κύτταρο-καλλιέργειες και τα ενδοπαράσιτα του ανθρώπου, που είναι δυνατόν να προκαλέσουν οποιαδήποτε μόλυνση, αλλεργία ή τοξικότητα. Όλοι οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις πρέπει να θεωρούνται ως πιθανά παθογόνοι (δηλ. ικανοί να προκαλέσουν ασθένεια) Πρέπει λοιπόν οι εργαζόμενοι στο χώρο (φοιτητές προσωπικό) να εκπαιδευτούν και να εξοικειωθούν με την εφαρμογή των τεχνικών αποστείρωσης και να προετοιμαστούν για το ασφαλή χειρισμό των μικροβίων. 5

Σύμφωνα με το ΠΔ 186/1995: Οι βιολογικοί παράγοντες κατατάσσονται σε τέσσερις ομάδες κινδύνου, ανάλογα με το βαθμό του κινδύνου μόλυνσης: Βιολογικός παράγοντας της ομάδας 1: Είναι ο βιολογικός παράγοντας που είναι απίθανο να προκαλέσει ασθένεια στον άνθρωπο Βιολογικός παράγοντας της ομάδας 2: Είναι ο παράγοντας που μπορεί να προκαλέσει ασθένεια στον άνθρωπο και θα μπορούσε να προκαλέσει κίνδυνο για τους εργαζόμενους, ενώ δεν υπάρχει μεγάλη πιθανότητα να εξαπλωθεί στο κοινωνικό σύνολο. Γενικώς υπάρχει αποτελεσματική προληπτική ή θεραπευτική αγωγή 6

Βιολογικός παράγοντας της ομάδας 3: Είναι ο παράγοντας που μπορεί να προκαλέσει ασθένεια στον άνθρωπο και συνιστά σοβαρό κίνδυνο για τους εργαζόμενους. Ενδέχεται να υπάρχει κίνδυνος να διαδοθεί στο κοινωνικό σύνολο, αλλά, γενικώς υπάρχει αποτελεσματική προληπτική ή θεραπευτική αγωγή Βιολογικός παράγοντας της ομάδας 4: Είναι ο παράγοντας που προκαλεί σοβαρή ασθένεια στον άνθρωπο και συνιστά σοβαρό κίνδυνο για τους εργαζόμενους, ενδέχεται να παρουσιάζει υψηλό κίνδυνο διάδοσης στο κοινωνικό σύνολο και για τον οποίο συνήθως δεν υπάρχει αποτελεσματική προληπτική ή θεραπευτική αγωγή 7

Υγιεινή και ατομική προστασία Κατά την άσκηση δραστηριοτήτων οι οποίες συνεπάγονται κίνδυνο για την υγεία ή την ασφάλεια των εργαζομένων λόγω της εργασίας με βιολογικούς παράγοντες, οι εργοδότες είναι υποχρεωμένοι να λαμβάνουν τα κατάλληλα μέτρα για να εξασφαλίζουν ότι: 1. Οι εργαζόμενοι δεν τρώνε και δεν πίνουν στους χώρους εργασίας στους οποίους υπάρχει κίνδυνος μόλυνσης από βιολογικούς παράγοντες 2. Χορηγείται στους εργαζόμενους κατάλληλος προστατευτικός ιματισμός ή άλλος κατάλληλος ειδικός ιματισμός. 8

Υγιεινή και ατομική προστασία 3. Τίθενται στη διάθεση των εργαζομένων επαρκείς και κατάλληλες εγκαταστάσεις λουτρών και αποχωρητηρίων, καθώς και ενδεχομένως συστήματα για την πλύση των ματιών ή/και αντισηπτικά του δέρματος 4. Ο αναγκαίος προστατευτικός εξοπλισμός διατηρείται κατάλληλα σε καθορισμένο χώρο, ελέγχεται και καθαρίζεται, αν είναι δυνατόν, πριν, και οπωσδήποτε, μετά από κάθε χρήση, επιδιορθώνεται, αν είναι ελαττωματικός, ή αντικαθίσταται πριν από νέα χρήση 5. Έχουν καθοριστεί διαδικασίες για τη λήψη, το χειρισμό και την επεξεργασία δειγμάτων ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης 9

Εκπαίδευση των εργαζομένων Ο εργοδότης λαμβάνει τα κατάλληλα μέτρα ώστε οι εργαζόμενοι ή/και οι εκπρόσωποί τους στην επιχείρηση ή την εγκατάσταση να λαμβάνουν κατάλληλη και επαρκή εκπαίδευση, βάσει όλων των διαθέσιμων πληροφοριών, ιδίως με τη μορφή ενημέρωσης και οδηγιών, σχετικά με: Τους ενδεχόμενους κινδύνους για την υγεία Τις προφυλάξεις που πρέπει να λαμβάνονται για την πρόληψη της έκθεσης Τις απαιτήσεις υγιεινής Τη χρήση του προστατευτικού εξοπλισμού και ιματισμού Τα μέτρα που πρέπει να λαμβάνουν οι εργαζόμενοι σε περίπτωση ατυχήματος και για την πρόληψη ατυχημάτων 10

Ενημέρωση των εργαζόμενων 1. Στα πλαίσια της ενημέρωσης των εργαζομένων σύμφωνα με τις κείμενες διατάξεις, οι εργοδότες οφείλουν να παρέχουν γραπτές οδηγίες στο χώρο εργασίας και, εφόσον απαιτείται, να αναρτούν αφίσες στις οποίες ορίζεται τουλάχιστον η διαδικασία που πρέπει να ακολουθείται στην περίπτωση: α) Σοβαρού ατυχήματος ή περιστατικού που σχετίζεται με τον χειρισμό βιολογικού παράγοντα. β) Χειρισμού βιολογικού παράγοντα της ομάδας 4. 2. Οι εργαζόμενοι οφείλουν να αναφέρουν αμέσως κάθε ατύχημα ή περιστατικό που σχετίζεται με τον χειρισμό βιολογικού παράγοντα στον εργοδότη, στον τεχνικό ασφάλειας και στο γιατρό εργασίας. 11

Ενημέρωση των εργαζόμενων 3. Οι εργοδότες οφείλουν να ενημερώνουν αμέσως τους εργαζόμενους ή/και τους εκπροσώπους τους για κάθε ατύχημα ή περιστατικό το οποίο ενδέχεται να έχει προκαλέσει απελευθέρωση βιολογικού παράγοντα και το οποίο θα μπορούσε να προκαλέσει σοβαρή ανθρώπινη μόλυνση ή/και ασθένεια. Επιπλέον οι εργοδότες οφείλουν να ενημερώνουν τους εργαζόμενους ή/και τους εκπροσώπους τους στην επιχείρηση ή την εγκατάσταση το ταχύτερο δυνατόν για τα σοβαρά ατυχήματα ή περιστατικά, για τις αιτίες τους και για τα μέτρα που λαμβάνονται ή που θα ληφθούν για να επανορθωθεί η κατάσταση. 4. Κάθε εργαζόμενος έχει πρόσβαση στις πληροφορίες του καταλόγου και οι οποίες τον αφορούν προσωπικά 12

Κατάλογοι εκτιθέμενων εργαζομένων Οι εργοδότες τηρούν κατάλογο των εργαζομένων που εκτίθενται σε βιολογικούς παράγοντες της ομάδας 3 και 4 Ο κατάλογος αυτός αναφέρει το είδος της εκτελούμενης εργασίας, και εφόσον είναι δυνατόν, το βιολογικό παράγοντα στον οποίο έχουν εκτεθεί οι εργαζόμενοι, καθώς και τα στοιχεία τα σχετικά με την έκθεση, τα ατυχήματα και τα περιστατικά, ανάλογα με την περίπτωση. 13

Ο κατάλογος που αναφέρεται διατηρείται επί 40 έτη μετά από την τελευταία γνωστή έκθεση στις παρακάτω περιπτώσεις έκθεσης οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε μόλυνση: α) Από βιολογικούς παράγοντες που είναι γνωστό ότι μπορούν να προκαλέσουν μόνιμες ή λανθάνουσες μολύνσεις. β) Που δεν μπορεί να διαγνωσθεί, με βάση τις σημερινές γνώσεις, παρά μόνο όταν εκδηλωθεί η ασθένεια, μετά την παρέλευση πολλών ετών. 14

γ) Που εμφανίζει ιδιαίτερα μεγάλες περιόδους επώασης πριν από την εκδήλωση της ασθένειας δ) Που οδηγεί σε ασθένεια η οποία εμφανίζει κατά καιρούς υποτροπές επί μεγάλο χρονικό διάστημα παρά την θεραπευτική αγωγή. ε) Που μπορεί να έχει σοβαρές μακροπρόθεσμες συνέπειες Ο τεχνικός ασφάλειας και ο γιατρός εργασίας ή/και ο γιατρός του ασφαλιστικού οργανισμού στον οποίο ανήκει ο εργαζόμενος, καθώς και ο τεχνικός και υγειονομικός επιθεωρητής εργασίας έχουν πρόσβαση στον κατάλογο. 15

ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΣΤΟ ΧΩΡΟ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Οι εργαζόμενοι σε ένα εργαστήριο είναι εκτεθειμένοι σε πολλούς κινδύνους και κυρίως σε βιολογικούς Στο μικροβιολογικό εργαστήριο υπάρχουν: χημικά που είναι τοξικά, εύφλεκτα, εκρηκτικά, διαβρωτικά και καρκινογενετικά υλικά Βιολογικοί κίνδυνοι που προέρχονται από το παθολογικό υλικό που χειρίζεται εντός του εργαστηρίου (παθογόνοι μικροοργανισμοί και τοξίνες τους) Ενδεχομένως μπορεί να υπάρχει κίνδυνος από τη χρήση υψηλής τάσης, υπέρυθρης και άλλης ακτινοβολίας 16

Η πρόσβαση στους εργαστηριακούς χώρους πρέπει να είναι ελεγχόμενη και να απαγορεύεται στους μη έχοντες εργασία Χρειάζεται μεγάλη προσοχή στον χειρισμό καλλιεργειών, αντικειμενοφόρων πλακών και όλων των υλικών με τα οποία έχει έρθει σε επαφή το παθολογικό υλικό Προσοχή στην καλή υγιεινή του προσωπικού. Συνεχές πλύσιμο των χεριών Προσοχή στην επιμόλυνση προσωπικών αντικειμένων, ιματισμού και υποδημάτων από επιμόλυνση από τους πάγκους εργασίας ή από υλικά εργασίας 17

Οι κύριες πύλες εισόδου μικροοργανισμών στο σώμα είναι από: Εισπνοή Απορρόφηση Μέσω τραυμάτων και αμυχών Μέσω των ματιών Διαμέσου της επαφής με το δέρμα 18

Μέτρα ατομικής προστασίας Ρούχα, βιβλία και προσωπικά είδη, τοποθετούνται σε καθορισμένο χώρο στο εργαστήριο και ποτέ πάνω στους πάγκους εργασίας. Οι πόρτες και τα παράθυρα παραμένουν κλειστά κατά τη διάρκεια της άσκησης. Στην αρχή και στο τέλος της άσκησης οι πάγκοι καθαρίζονται και εξυγιαίνονται με απολυμαντικό υγρό. Τα μολυσμένα όργανα και σκεύη δεν εγκαταλείπονται στην επιφάνεια των πάγκων εργασίας. Αποστειρώνονται και φυλάσσονται σε καθορισμένο χώρο. Ο γρήγορος και ασφαλής χειρισμός των καλλιεργειών μυκήτων είναι αναγκαίος για να αποτραπεί η διάδοση των αναπαραγωγικών σπορίων τους στο εργαστηριακό περιβάλλον. 19

Πλύσιμο πάντοτε των χεριών με απορρυπαντικό υγρό πριν την πραγματοποίηση των ασκήσεων Εργαστηριακές ποδιές, καθαρές και αποστειρωμένες Γάντια στα χέρια κατά τον χειρισμό χημικών ή βιολογικών παραγόντων Αποφυγή επαφής χεριών με το πρόσωπο κατά τη διάρκεια της εργασίας Απαγορεύεται η πόση και η βρώση εντός του εργαστηριακού χώρου και φορώντας τη στολή εργασίας Προστασία ματιών με γυαλιά όποτε χρειάζεται Περιποίηση τραυμάτων και εκδορών αμέσως και αποφυγή επαφής με μολυσμένα υλικά (ύπαρξη οργανωμένου φαρμακείου) 20

21

22

23

24

25

26

27

ΜΕΡΟΣ 2 ο ΛΗΨΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ & ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΤΡΟΦΙΜΟΥ ΓΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 28

Η δειγματοληψία ενός τροφίμου πρέπει να γίνεται κανονικά τη στιγμή που διατίθεται αυτό το προϊόν για κατανάλωση, για την εκτίμηση της υγιεινής κατάστασης και του βαθμού μόλυνσης στα στάδια επεξεργασίας, διακίνησης και αποθήκευσης του. Στις περιπτώσεις που το προϊόν βρεθεί «μη κανονικό», συνίσταται να γίνει δειγματοληψία και στον χώρο παραγωγής του, στα διάφορα στάδια επεξεργασίας του, για να προσδιορισθεί το σημείο επιμόλυνσης και να εξαχθούν συμπεράσματα και να ληφθούν τα απαραίτητα μέτρα. 29

Δείγματα τροφίμων: ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Συσκευασμένα τρόφιμα (Φαγητά έτοιμα, Νερό, Χυμοί, κ.α.) Τα μη-συσκευασμένα τρόφιμα πρέπει να παραληφθούν με τις καλύτερες δυνατές συνθήκες (αποστειρωμένα κουτάλια, λαβίδες, μαχαίρια κτλ.) και κοντά σε φλόγα. Στα μη-συσκευασμένα τρόφιμα ακολουθείται επιλεκτική (από διάφορα μέρη του «χύμα» τρόφιμου) δειγματοληψία. Τα συσκευασμένα τρόφιμα δειγματίζονται με την συσκευασία τους. Η ποσότητα του δείγματος εξαρτάται πάντα από το πλήθος των αναλύσεων που θα γίνουν. 30

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Τα δείγματα μπαίνουν σε ασηπτικούς περιέκτες (αποστειρωμένες σακούλες που κλείνουν ερμητικά) και σημαίνονται εξωτερικά, όπου απαιτείται σήμανση («χύμα» τρόφιμα). Αν το δείγμα είναι τρόφιμο που διατηρείται στη συντήρηση πρέπει να μεταφερθεί στο εργαστήριο κάτω από συνθήκες συντηρήσεως (Ισοθερμικά ψυγεία) Αν το δείγμα είναι τρόφιμο καταψύξεως πρέπει να μεταφερθεί κάτω από τις ανάλογες συνθήκες (χρησιμοποιούνται παγοκύστες, ισοθερμικά δοχεία και μεταφερόμενα ψυγεία) Αν το δείγμα είναι τρόφιμο που διατηρείται στην ξηρή αποθήκευση πρέπει να μεταφερθεί στο εργαστήριο κάτω από συνθήκες ήπιας θερμοκρασίας (18 23 0 C) 31

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Μόλις φθάσουν τα δείγματα πρέπει να τους δοθεί αριθμός πρωτοκόλλου και να περιγραφεί, την ημερομηνία εισόδου στο εργαστήριο, τι περιέχουν (τι τρόφιμο είναι), ποιες είναι οι ζητούμενες εργαστηριακές εξετάσεις, ποια είναι η κατάσταση του δείγματος (ψυγμένο, κατεψυγμένο, ξηρής αποθήκευσης) και από πού προέρχεται (επωνυμία εταιρίας) Αφού γίνει η ταυτοποίηση του δείγματος και δοθεί αριθμός δείγματος στη συνέχεια τοποθετείται στον ανάλογο αποθηκευτικό χώρο Αν είναι προϊόν ξηράς αποθήκευσης όπως κονσέρβες τοποθετείται σε χώρο δροσερό και σκιερό Αν είναι προϊόν συντηρήσεως τοποθετείται σε ψυγείο Αν είναι προϊόν καταψύξεως τοποθετείται στον καταψύκτη 32

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Αν το δείγμα είναι ξηράς αποθήκευσης ή συντήρησης μπορεί να δουλευτεί οποιαδήποτε στιγμή Αν πρόκειται για δείγμα κατάψυξης ή βαθιάς κατάψυξης πρέπει από το προηγούμενο 24ωρο να τοποθετηθεί στη συντήρηση ώστε να αποψυχθεί σωστά και να μπορέσει να αναλυθεί Τα παγωτά τα χειριζόμαστε κατεψυγμένα 33

ΜΕΡΟΣ 3 ο Προετοιμασία δειγμάτων Δεκαδικές αραιώσεις 34

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Πρώτο στάδιο : από το υλικό που έχουμε σαν δείγμα αν πρόκειται για στερεό τρόφιμο παίρνουμε μια τυχαία ποσότητα του και την βάζουμε σε ένα αποστειρωμένο σακουλάκι του stomacher (ομογενοποιητής ιστών και τροφίμων) Κατά την κοπή του τροφίμου-δείγματος παρατηρούμε για την ύπαρξη πιθανών ξένων σωμάτων, παρασίτων, έντονης οσμής, ανώμαλου χρωματισμού (τυχών αλλοιώσεις οδηγούν σε απόρριψη του δείγματος) Για να πάρουμε την ποσότητα εκείνη του δείγματος που θα χρησιμοποιήσουμε χειριζόμαστε αποστειρωμένα εργαλεία κοντά σε φλόγα 35

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Στάδιο δεύτερο: Προσθέτουμε τόσο αραιωτικό υγρό(buffered peptone water) όσο ώστε να είναι η πρώτη αραίωση 1/10. (Δηλαδή προσθέτουμε όσο είναι το βάρος του τροφίμου επί 9 ώστε η αρχική ποσότητα να είναι το 1/10 της τελικής). Η προσθήκη του αραιωτικού υγρού γίνεται στην περίπτωση που έχουμε στερεό δείγμα τροφίμου, έτσι ώστε να «διώξουμε» τους Μ/Ο από το τρόφιμο και το δείγμα μας πλέον να γίνει το ομογενοποιημένο με το τρόφιμο, αραιωτικό υγρό. Αν πρόκειται για υγρό τρόφιμο τότε δεν χρειάζεται να προσθέσουμε αραιωτικό και να το βάλουμε στο stomacher. 36

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Στάδιο τρίτο : το βάζουμε στο stomacher και το ομογενοποιούμε έως να διαλυθούν τα στερεά συστατικά (έως 2 λεπτά) Πρέπει κατά την τοποθέτηση της σακούλας στο stomacher να αφαιρέσουμε τον περισσότερο αέρα ώστε να μην «σκάσει» κατά την ομογενοποίηση. Αν χρειάζεται περισσότερο χρόνο για να ομογενοποιηθεί τότε ενδιάμεσα σταματάμε τη λειτουργία του stomacher και την ξεκινάμε ξανά. Για τα υγρά τρόφιμα παίρνουμε μια ποσότητα π.χ. 1 ή 10 ml και τη μεταφέρουμε σε φιάλη αραιώσεως που περιέχει 9 ή 90 ml αραιωτικού και ανακινούμε μέχρι να ομογενοποιηθεί. 37

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Στάδιο τέταρτο : ακολουθούν οι διαδοχικές αραιώσεις του αρχικού δείγματος. Ακολουθούν οι αραιώσεις 1/100, 1/1000 κτλ με μεταφορά 1ml δείγματος σε 9 ml αραιωτικού ή 10 ml δείγματος σε 90 ml αραιωτικού υγρού. Κάθε μεταφορά από μια φιάλη στην επόμενη ή από έναν δοκιμαστικό σωλήνα στον επόμενο χρησιμοποιούνται αποστειρωμένα σιφώνια ή pipettes. Όλες οι αραιώσεις πρέπει να πραγματοποιηθούν μέσα σε χρόνο 15 λεπτών από την ομογενοποίηση του δείγματος. 38

ΜΕΡΟΣ 4 ο OMX 39

ΟΛΙΚΗ ΜΕΣΟΦΙΛΗ ΧΛΩΡΙΔΑ Η αρίθμηση των βακτηρίων που περιέχονται σ ένα δείγμα τροφίμου γίνεται στην καθημερινή πράξη με τη χρήση στερεών κυρίως υποστρωμάτων, στα οποία γίνεται παραδεκτό, ότι τα ζωντανά βακτήρια μπορούν να αναπτυχθούν και κάθε μικροβιακό κύτταρο να δώσει μια ορατή αποικία. Όμως αυτό είναι μερικώς μόνο αληθές, γιατί ούτε όλα τα βακτήρια που υπάρχουν σ' ένα δείγμα τροφίμου μπορούν ν' αναπτυχθούν με τη χρήση μιας ορισμένης τεχνικής ούτε οι αποικίες που θα αναπτυχθούν είναι βέβαιο ότι προέρχονται από ένα μόνο μικροβιακό κύτταρο. 40

Για τους λόγους αυτούς η εκτίμηση της μικροβιολογικής ποιότητας (δείκτης υγιεινής κατάστασης) ενός τροφίμου βασίζεται στον προσδιορισμό του πληθυσμού διαφόρων ομάδων βακτηρίων (πχ. αερόβια μεσόφιλα, ψυχότροφα, κολοβακτηροειδή κλπ.), για κάθε μια από τις οποίες μπορεί να χρησιμοποιηθεί, με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η ανεύρεση μεγάλου αριθμού, έστω και μη παθογόνων βακτηρίων, υποδηλώνει μη ικανοποιητικές συνθήκες επεξεργασίας και συντήρησης των τροφίμων. Ο πληθυσμός των αερόβιων μεσόφιλων βακτηρίων, τα οποία με τη χρήση ορισμένου υποστρώματος και σε ορισμένη θερμοκρασία και χρόνο επωάσεως, μπορούν ν' αναπτυχθούν και να δώσουν από μία ορατή αποικία, χαρακτηρίζεται ως "Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα (ΟΜΧ)" ή "Συνολικός Αριθμός Μεσόφιλων (ΣΑΜ)" 41

Ο Συνολικός αριθμός μικροβίων, γνωστός και σαν «μικροβιακό φορτίο» εκφράζεται ανα gr ή ml τροφίμου και διαφέρει ανάλογα τη: Χημική σύσταση Μηχανική σύσταση ή υφή Τη περιεκτικότητα σε ανασταλτικούς παράγοντες (συντηρητικά, αλάτι, μπαχαρικά, κ.α.) Περιεκτικότητα σε υγρασία (ενεργότητα νερού) Μόλυνση ή ρύπανση του τροφίμου Επεξεργασία αλλά και τον χειρισμό του κατά το διάστημα μεταξύ παραγωγής και κατανάλωσης του εκάστοτε τροφίμου. 42

Βασική μέθοδο προσδιορισμού του πληθυσμού των ζώντων μεσόφιλων αερόβιων βακτηρίων αποτελεί η "Πρότυπη μέθοδος αριθμήσεως σε τρυβλία" (Standard Plate Count) ή αλλιώς "μέθοδος ενσωματώσεως Εκτός όμως από τη μέθοδο αυτή, έχουν προταθεί και άλλες μέθοδοι για την αρίθμηση της ΟΜΧ, οι οποίες έχουν σχεδιαστεί για να εξυπηρετούν ειδικούς σκοπούς (πχ. είδος τροφίμου, ταχύτητα, οικονομία υλικών κλπ.) με τη χρήση των Petrifilms (έτοιμα με θρεπτικό υλικό Kit για την ανίχνευση διαφόρων βακτηρίων). 43

ΠΡΟΤΥΠΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΣΕ ΤΡΥΒΛΙΑ (STANDARD PLAΤΕ COUNT) Είναι η περισσότερο ακριβής μέθοδος. Έχει τυποποιηθεί από άποψη υλικών και τεχνικής από την American Publίc Health Association (ΑΡΗΑ) και αποτελεί την επίσημη (νομοθετημένη) μέθοδο προσδιορισμού της ΟΜΧ των τροφίμων και του νερού σε πολλές χώρες Απαιτούμενα υλικά: Αραιωτικό υγρό : Ανάλογα με το είδος του τροφίμου είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ένα από τα αραιωτικά Για το κρέας και τα κρεατοσκευάσματα συνιστάται το αραιωτικό πεπτονούχο νερό 0,1 % γιατί αποδείχθηκε ότι προφέρει περισσότερη προστασία στα βακτήρια 44

ΠΡΟΤΥΠΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΣΕ ΤΡΥΒΛΙΑ (STANDARD PLAΤΕ COUNT) Υπόστρωμα αριθμήσεως Plate Count Agar Τρυβλία Petri, γυάλινα η πλαστικά μίας χρήσεως, διαμέτρου 85 mm (ή μεγαλύτερης) και βάθους 12mm. Σιφώνια, γυάλινα ή πλαστικά μιας χρήσεως, βαθμολογημένα για μικροβιολογική χρήση και χωρητικότητας από 0,1 ml έως 11 ml. Φιάλες αραιώσεως με βιδωτό πώμα, βαθμολογημένες για όγκο 99 ml ή φιαλίδια, με βιδωτό πώμα, των 20-30 ml Ηλεκτρικός ομοιογενοποιητής (Waring Blendor ή τύπου Stomacher). Μετρητής αποικιών. Ζυγός με ευαισθησία 0,1 g. 45

ΠΡΟΤΥΠΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΣΕ ΤΡΥΒΛΙΑ (STANDARD PLAΤΕ COUNT) Το Plate Count Agar παρασκευάζεται προσθέτοντας 20,5 gr σκόνης σε 1 lt νερό Το βάζουμε σε μια κατσαρόλα και το θερμαίνουμε (~80 0 C) Ανακατεύουμε συνεχώς για ομοιόμορφη κατανομή και για να μην κολλήσει Το αφήνουμε να κρυώσει (όχι σε θερμοκρασία <45 0 C) χρησιμοποιώντας ένα Υδατόλουτρο Κατανομή σε γυάλινες φιάλες Ακολουθεί υγρή αποστείρωση (121 βαθμούς/1,2 Atm/15-20 min) ph= 7±0,2 46

ΠΡΟΤΥΠΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΣΕ ΤΡΥΒΛΙΑ (STANDARD PLAΤΕ COUNT) Ενοφθαλμισμός Ο ενοφθαλμισμός γίνεται με την τεχνική της ενσωμάτωσης σε τρυβλία. Από τις δεκαδικές αραιώσεις που παρασκευάστηκαν μεταφέρεται, από κάθε αραίωση, ποσότητα 1 ml ή 0,1 ml και αποθέτεται στο κέντρο του πυθμένα απλής ή διπλής σειράς τρυβλίων. Σε κάθε τρυβλίο προσθέτονται 12-15 ml ρευστού υποστρώματος Plate Count Agar, το οποίο θερμοστατήθηκε σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 45-46 C. Η θερμοκρασία του υποστρώματος πρέπει να ελέγχεται με θερμόμετρο που έχει τοποθετηθεί σε φιάλη ή σωλήνα με νερό που θερμάνθηκε όπως και το υπόστρωμα. 47

ΠΡΟΤΥΠΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΣΕ ΤΡΥΒΛΙΑ (STANDARD PLAΤΕ COUNT) Ενοφθαλμισμός Η ενσωμάτωση του δείγματος με το ρευστό υπόστρωμα γίνεται με απαλές κυκλικές κινήσεις αρχικά και οριζόντιες στη συνέχεια. Πρέπει να αποφεύγεται ο διασκορπισμός του υποστρώματος προς τα τοιχώματα ή το κάλυμμα των τρυβλίων. Σε κάθε ομάδα δειγμάτων τοποθετούνται και τρυβλία μάρτυρες για τον έλεγχο της στειρότητας των υλικών (αραιωτικού, τρυβλίων, υποστρώματος) Η όλη εργασία από τη στιγμή της παρασκευής των αραιώσεων μέχρι τον ενοφθαλμισμό πρέπει να τελειώνει μέσα σε 15-20 min. 48

ΠΡΟΤΥΠΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΣΕ ΤΡΥΒΛΙΑ (STANDARD PLAΤΕ COUNT) Επώαση Η επώαση των ενοφθαλμισμένων τρυβλίων στους 35-37 C για 48 +/-3 ώρες ή/στους 32 C για 72 ώρες. (AOAC 1970, FDA 1976, Hanigan και McCance 1976). Τα τρυβλία τοποθετούνται στον Επωαστικό κλίβανο ανεστραμμένα. Εξάλλου σημαντικές διαφορές υπάρχουν σε σχέση με το είδος του τροφίμου. Παράδειγμα, για τον προσδιορισμό της ΟΜΧ του θαλάσσιου νερού και των οστρακοειδών ο WHO (1977) ορίζει επώαση στους 20 C επί 5 ημέρες, 49

ΜΕΡΟΣ 4α ΑΡΙΘΜΗΣΗ ΟΜΧ 50

ΕΚΦΡΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Το αποτέλεσμα της μέτρησης δεν εκφράζει αριθμό μικροβίων, αλλά αριθμό αποικιών, που αναπτύχθηκαν σε ορισμένο χρόνο και θερμοκρασία από συγκεκριμένη ποσότητα τροφίμου (cfu/gr ή ml colony forming unit). Ο αριθμός των αποικιών που βρίσκουμε είναι μικρότερος από των αριθμό των μικροβίων (ζώντων) που υπάρχουν πραγματικά μέσα στο δείγμα (TVC total viable count), γιατί: Τα μικρόβια βρίσκονται μέσα στο «μείγμα» μεμονωμένα, με μορφή αθροισμάτων ή αλυσίδων. Πιθανόν, τα υποχρεωτικά αερόβια δεν αναπτύσσονται μέσα στη μάζα του θρεπτικού υλικού, από έλλειψη οξυγόνου. Μπορεί να καταστραφούν τα θερμοευαίσθητα μικρόβια, όταν προστεθεί το θρεπτικό υλικό και μέχρι την ψύξη του. Μερικά από αυτά μπορεί να μην αναπτύσσονται στη θερμοκρασία που επιλέχθηκε. 51

ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΟΜΧ (APHA) Επειδή ο τρόπος επιλογής των τρυβλίων και αρίθμησης των σοβαρά το τελικό αποτέλεσμα έχουν θεσπιστεί κανόνες αρίθμησης από την APHA Η αρίθμηση των αποικιών γίνεται με τη βοήθεια μετρητή αποικιών 52

ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΟΜΧ (APHA) Αριθμούνται όλες οι ορατές αποικίες Η τελική επιλογή των τρυβλίων και ο τρόπος υπολογισμού του αριθμού των αποικιών γίνεται με βάση τις παρακάτω αρχές της APHA : 1. Αριθμούνται και στη συνέχεια επιλέγονται μόνο τα τρυβλία που έχουν από 30 μέχρι 300 αποικίες 2. Εάν μόνο ένα τρυβλίο έχει 30-300 αποικίες τότε ο αριθμός των αποικιών πολλαπλασιάζεται με τον αντίστοιχο συντελεστή αραιώσεως (π.χ. για την αραίωση 1:100 με το 100) και το αποτέλεσμα εκφράζει το συνολικό αριθμό μεσόφιλων βακτηρίων (ΟΜΧ) ανά gr ή ml δείγματος (δείγμα 1, πίνακας 1) 53

ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΟΜΧ (APHA) 3. Εάν τα τρυβλία από δύο διαδοχικές αραιώσεις έχουν 30-300 αποικίες υπολογίζεται ο αριθμός των βακτηρίων που προκύπτει από κάθε αραίωση και εξάγεται ο μέσος όρος εκτός και εάν ο λόγος του αριθμού που προκύπτει από τη μεγαλύτερη αραίωση προς τον αριθμό που προκύπτει από τη μικρότερη είναι μεγαλύτερος του 2. Στην τελευταία αυτή περίπτωση λαμβάνεται υπόψη ο αριθμός μόνο που προκύπτει από τη μικρότερη αραίωση (δείγμα 3, πίνακας 1) 4. Εάν τα τρυβλία έχουν λιγότερες από 30 αποικίες τότε το αποτέλεσμα εκφράζεται με βάση τον αριθμό αποικιών του τρυβλίου της μικρότερης αραιώσεως (δείγμα 4, πίνακας 1) 54

ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΟΜΧ (APHA) 5. Εάν κανένα τρυβλίο δεν εμφανίζει αποικίες τότε το αποτέλεσμα εκφράζεται σαν μικρότερο από το συντελεστή της μικρότερης αραιώσεως (δείγμα 5, πίνακας 1) 6. Εάν όλα τα τρυβλία έχουν περισσότερες από 300 αποικίες τότε επιλέγεται το τρυβλίο της μεγαλύτερης αραίωσης και αριθμούνται οι αποικίες του με τη βοήθεια τετραγωνισμένης οθόνης του μετρητή ή με την παρεμβολή μεταξύ τρυβλίου και οθόνης τετραγωνισμένης διάφανης μήτρας. Οι περισσότερες περιπτώσεις που μπορεί να εμφανιστούν είναι: 55

ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΟΜΧ (APHA) a. Λιγότερες από 10 αποικίες ανά τετραγωνικό εκατοστό. Αριθμούνται σε διάταξη σταυρού 13 τετράγωνα (7 οριζοντίως και 6 καθέτως) και το άθροισμα των αποικιών πολλαπλασιάζεται επί 5 εφόσον χρησιμοποιούνται τρυβλία με εμβαδόν 65 τετραγωνικά εκατοστά. Διαφορετικά υπολογίζεται ο αντίστοιχος συντελεστής b. Από 10 έως 100 αποικίες ανά τετραγωνικό εκατοστό. Αριθμούνται 4 τετράγωνα, εξάγεται ο μέσος όρος και το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί 65 και επί το συντελεστή αραιώσεως 56

ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΡΙΘΜΗΣΕΩΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΟΜΧ (APHA) c. Περισσότερες από 100 αποικίες ανά τετραγωνικό εκατοστό. Ο αριθμός ΟΜΧ υπολογίζεται ως >6500 και το αποτέλεσμα σε 1 gr ως >6500 x το συντελεστή αραιώσεως 7. Εάν χρησιμοποιηθεί διπλή σειρά τρυβλίων τότε εξάγεται πρώτα ο μέσος όρος των τρυβλίων της ίδιας αραιώσεως και στη συνέχεια των δύο συνεχόμενων αραιώσεων αφού πρώτα τηρηθούν οι κανόνες των παραγράφων 1,2 και 3 (δέίγματα 8 και 9 πίνακα 1) 8. Το τελικό αποτέλεσμα στρογγυλοποιείται στα δύο πρώτα ψηφία. Εάν το τρίτο ψηφίο είναι ίσο ή μεγαλύτερο από το 5 τότε το δεύτερο αυξάνει στον αμέσως επόμενο αριθμό (δείγμα 9, πίνακας 1) 57

Αριθμός δείγματος ΠΙΝΑΚΑΣ 1 Αριθμός αποικιών ανά τρυβλίο Λόγος ΟΜΧ /gr ή ml 10-2 10-3 1 280 24-28.000 2 230 31 1:1,3 27.000 3 130 32 1:2,4 13.000 4 14 1-1.400 5 0 0 - <100 6 Πολυάριθμες/ Δεν αριθμούνται 7 Πολυάριθμες/ Δεν αριθμούνται 6870 - >6.500.000 4120-4.100.000 8 250 280 9 230 150 42 38 43 36 1:1,5 33.000 1:2,1 19.000 58

ΜΕΡΟΣ 5 ο Κολοβακτηροειδή Εντερικής προέλευσης κολοβακτηροειδή, E.Coli Μη Εντερικής προέλευσης κολοβακτηροειδή (Total coliforms) 59

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Ως εντεροβακτήρια ή εντεροβακτηροειδή εννοούνται όλα τα βακτήρια τα οποία ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae. Είναι αερόβια ή προαιρετικά αερόβια, Gram -, μη σπορογόνα βακτήρια. Τα εντεροβακτήρια διακρίνονται σε κολοβακτηροειδή (coliforms) και μηκολοβακτηροειδή (non-coliforms) Τα πρώτα ζυμώνουν τη λακτόζη και παράγουν οξύ και αέριο ενώ τα άλλα όχι Τα κολοβακτηροειδή διακρίνονται περαιτέρω σε 2 υποομάδες: Τα εντερικής προέλευσης (fecal coliforms) Τα μη εντερικής προέλευσης ή ολικά κολοβακτηροειδή (total coliforms) Τα Ολικά κολοβακτηροειδή ενδημούν στον εντερικό σωλήνα διαφόρων ειδών ζώων, αλλά και στο περιβάλλον Τα Εντερικής προέλευσης κολοβακτηροειδή ενδημούν στον εντερικό σωλήνα των θερμόαιμων ζώων. Π.χ. E.Coli Καταστρέφονται με την ήπια θερμική επεξεργασία, αφυδάτωση και κατάψυξη και η παρουσία τους στα τρόφιμα οφείλεται κυρίως σε επιμολύνσεις. Τα κολοβακτηροειδή αποτελούν δείκτη των συνθηκών υγιεινής που επικρατούν κατά την επεξεργασία των τροφίμων και της υγιεινής τους κατάστασης. 60

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Μπορούν να προκαλέσουν αλλοιώσεις στα τρόφιμα διότι: Αναπτύσσονται σε μεγάλο αριθμό υποστρωμάτων Χρησιμοποιούν σαν πηγή ενέργειας μεγάλο αριθμό υδατανθράκων και άλλων οργανικών ενώσεων Αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες από 10 46 0 C Με αποτέλεσμα να παράγουν μεγάλες ποσότητες οξέων και αερίων που δίνουν ανεπιθύμητες οσμές και γεύσεις στα τρόφιμα Γενικά, εκτός από την E.Coli, η παρουσία των υπολοίπων κολοβακτηροειδών στα τρόφιμα ή στο νερό, δεν μπορεί να χρησιμεύσει σαν απόλυτη, αλλά μόνο σαν πιθανή ένδειξη εντερικής μόλυνσης γιατί δεν έχει μελετηθεί πλήρως η οικολογία τους και δεν είναι γνωστή η ικανότητα πολλαπλασιασμού τους μέσα στο πεπτικό σύστημα του ανθρώπου και των ζώων και δεν είναι οι αποκλειστικοί φιλοξενούμενοι αυτού του συστήματος. 61

ΜΕΡΟΣ 5α ο ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ (Total Coliforms) 62

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Απαιτούμενα υλικά: Αραιωτικό υγρό McConkey Broth Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% (BGLB Broth) MPN Method (Most Probable Number) Ακολουθείται η προετοιμασία του δείγματος με τον ίδιο τρόπο που πραγματοποιήθηκε για τον έλεγχο της Ο.Μ.Χ. Αφού πραγματοποιηθούν οι δεκαδικές αραιώσεις του δείγματος, μεταφέρουμε 1ml αραιωμένου δείγματος σε 3πλη ή 5πλη σειρά σωλήνων που περιέχουν ένα από τα διαθέσιμα θρεπτικά υποστρώματα (BGLB Broth ή McConkey Broth) και ανεστραμμένο σωλήνα Durham (για δημιουργία φυσαλίδας αέρα). Η προετοιμασία του υποστρώματος πραγματοποιείται σύμφωνα με τις προδιαγραφές της κατασκευάστριας εταιρίας. (Ετοιμάζεται από πριν). Ομογενοποιούμε το δείγμα (χρήση αναδευτήρα) και επωάζουμε στους 35 Ο C για 24 και 48 ώρες. 63

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Θολερότητα και παραγωγή αερίου στο σωλήνα Durham, υποδηλώνουν θετικότητα σε Coliforms. Όμως: Η φυσαλίδα αέρα μέσα στο σωλήνα δεν πρέπει να συγχέεται με την παραγωγή αερίου. Όταν ο όγκος του αερίου είναι μικρότερος από το 1/10 του όγκου του σωληνίσκου τότε η δοκιμή θεωρείται αμφίβολη Κατόπιν, σημειώνονται οι θετικοί σωλήνες από κάθε αραίωση και υπολογίζεται ο προκαταρκτικός πληθυσμός MPN κολοβακτηροειδών, με βάση τους πίνακες MacCrady. Για επιβεβαίωση της παραπάνω μεθόδου μπορούμε να πάρουμε δείγμα από τους θετικούς σωλήνες και να το επωάσουμε, σε νέους αποστειρωμένους σωλήνες, χρησιμοποιώντας BGLB υπόστρωμα (35 Ο C για 24 ώρες). Συστήνεται να χρησιμοποιούμε διαφορετικό από το αρχικό υπόστρωμα κατά την επιβεβαιωτική μέθοδο. Σημειώνονται οι θετικοί σωλήνες και συγκρίνονται με το αποτέλεσμα της προκαταρκτικής δοκιμής και με βάση τους πίνακες MacCrady υπολογίζεται ο αριθμός MPN κολοβακτηροειδών ανα gr ή ml τροφίμου. 64

Pos. tubes Table 1. For 3 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs per gram and 95 percent confidence intervals. Conf. lim. Pos. tubes Conf. lim. MPN/g MPN/g 0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High 0 0 0 <3.0 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 65

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΡΟΣ 6 ο ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ E.Coli 66

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Από κάθε θετικό σωλήνα της επιβεβαιωτικής ή της προκαταρκτικής δοκιμής ενοφθαλμίζονται σωλήνες που περιέχουν E.C. Broth ή Peptone Water και ανεστραμμένο σωλήνα Durham. Επωάζουμε κατά προτίμηση σε υδατόλουτρο για 24 h στους 44,5 0 C (νερό ή αλιεύματα ως δείγμα) ή στους 45,5 (για άλλα τρόφιμα) και ελέγχουμε για παραγωγή αερίου. Μετά την επώαση ελέγχονται οι σωλήνες και οι θετικοί (ανάπτυξη αερίου) σημειώνονται και χρησιμοποιούνται οι πίνακες McCrady για υπολογισμό του MPN της E.Coli Επιβεβαιωτική μέθοδος: Αν παρατηρηθεί θετικότητα (παραγωγή αερίου), μεταφέρουμε ποσότητα δείγματος (περίπου 1-2ml), σε νέο αποστειρωμένο σωλήνα που περιέχει peptone water (indole free) Οι σωλήνες εξετάζονται για την παράγωγη ινδόλης, η οποία προκύπτει από την αποικοδόμηση της τρυπτοφάνης, που περιέχεται στο πεπτονούχο διάλυμα. (με χρήση Kovacs Reagent) Οι θετικοί σωλήνες (αέριο παρουσία ινδόλης) που προκύπτουν θεωρούνται σίγουρα «θετικοί» στην παρουσία E.Coli. 67

ΜΕΡΟΣ 7 ο Ολική Αρίθμηση Ψυχρότροφων μικροβίων 68

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Τα ψυχρότροφα μικρόβια (κυρίως μικρόβια των γενών Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Alcalίgenes, καθώς και οι μύκητες, όπως Geotrichum, Botrytis, κ.ά.), έχουν ενδιαφέρονv, γιατί προκαλούν αλλοιώσεις στα τρόφιμα, που συντηρούνται με ψύξη. Έτσι, η ικανότητα συντήρησης πολλών τροφίμων (νωπού κρέατος, γάλακτος) εξαρτάται από τον αρχικό πληθυσμό των ψuχρότροφων μικροβίων που περιέχουν. Γι' αυτό το λόγο προκύπτει και η ανάγκη αρίθμησης τους σε ορισμένα τρόφιμα. Ψυχρότροφα (psychrotroph), σύμφωνα με την επικρατούσα άποψη, είναι τα μικρόβια που μπορούν να αναπτυχθούν σε θερμοκρασίες μεταξύ 0 C και 7 C και να σχηματίσουν αποικίες ή να δώσουν θολερότητα (αναλόγως του μέσου καλλιέργειας) εντός 7 έως 10 ημερών, ενώ ψυχρόφιλα (psychrophiles) είναι εκείνα που μπορούν να αναπτυχθούν μεταξύ θερμοκρασιών λίγο χαμηλότερων του μηδενός και μέχρι τους 20 C με άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης μεταξύ 10 C και 15 C. 69

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Στη βιομηχανία γάλακτος ο όρος «ψυχρότροφα» χρησιμοποιείται για τα μικρόβια που μπορούν να αναπτυχθούν μεταξύ 2 και 7 0 C, ανεξάρτητα από την θερμοκρασία ανάπτυξης τους. Γενικά τα ψυχρότροφα μικρόβια είναι θερμό-ευαίσθητα και καταστρέφονται με την παστερίωση. Η παρουσία τους λοιπόν σε τρόφιμα που έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία υποδηλώνει μόλυνση μετά την επεξεργασία τους. Σημείωση: Υπάρχουν όμως και θερμοάντοχα ψυχρότροφα μικρόβια, όπως είδη των γενών Bacillus & Clostridium. Γενικά τα ψυχρότροφα ή τα ψυχρόφιλα μικρόβια μπορούν να προκαλέσουν, κυρίως στα υπό ψύξη τρόφιμα (πχ κρέας γάλα) αλλοιώσεις που έχουν να κάνουν με την γεύση και οσμή. Επίσης και η παρουσία παθογόνων ψυχρότροφων πχ Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni και τα είδη του γένους Listeria (κυρίως η L. monocytogenes), επιβάλλουν την συνεχή παρακολούθηση των τροφίμων από τον Υπεύθυνο Ποιοτικού Ελέγχου κάθε εταιρίας τροφίμων. 70

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Μέθοδοι αρίθμησης Γίνεται με την χρήση στερεών υποστρωμάτων και με την τεχνική της ενσωμάτωσης ή της επιφανειακής εξάπλωσης Χρησιμοποιούνται κατά βάση μη εκλεκτικά υποστρώματα, εκτός εάν το επιβάλλουν ειδικοί λόγοι. Απαιτούμενα υλικά Αραιωτικό υγρό (peptone water) Plate Count Agar Tryptone Soya Agar * Κλίβανος επώασης (ψυχόμενος) Προετοιμασία δειγμάτων και αραιώσεων Όπως στην ΟΜΧ 71

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Μέθοδος ενσωμάτωσης Από τις δεκαδικές αραιώσεις που ετοιμάστηκαν ενοφθαλμίζεται 1 ml σε διπλή σειρά τρυβλίων. Προστίθεται 15 ml ρευστού PCA ή TSA και αφού γίνει προσεκτική ενσωμάτωση του δείγματος με το υπόστρωμα, τα τρυβλία επωάζονται για 10 μέρες στους 7 0 C. Η αρίθμηση είναι όμοια με την ΟΜΧ Μέθοδος επιφανειακής εξάπλωσης Ενοφθαλμίζονται επιφανειακά τα τρυβλία (περιέχουν στερεοποιημένο θρεπτικό υλικό) με τη βοήθεια κεκαμμένης ράβδου, με 0,1 ml το καθένα από τις αντίστοιχες αραιώσεις του δείγματος. Επωάζονται για 3 μέρες στους 7 0 C. Η αρίθμηση είναι όμοια με την ΟΜΧ, όμως το αποτέλεσμα εκφράζεται αφού λάβουμε υπόψη το βαθμό της αραίωσης και την ποσότητα του ενοφθαλμισμένου δείγματος (0,1 ml) Πχ σε τιμή 140 cfu στην 10-3 αραίωση, ο αριθμός των αποικιών ανα gr/ml είναι 140 χ 1000 χ 10 = 1400000 = 1,4Χ10 6 72

ΜΕΡΟΣ 8 ο ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΥΔΑΤΟΣ (Η 2 Ο) 73

ΓΕΝΙΚΑ ΟΡΙΣΜΟΣ (98/83/ΕΚ) ΝΕΡΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ ΤΟ ΝΕΡΟ ΕΙΤΕ ΣΤΗ ΦΥΣΙΚΗ ΤΟΥ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΕΙΤΕ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ, ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΠΟΣΗ, ΜΑΓΕΙΡΕΜΑ, ΠΡΟΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΡΟΦΗΣ Ή ΑΛΛΕΣ ΟΙΚΙΑΚΕΣ ΧΡΗΣΕΙΣ, ΑΝΕΞΑΡΤΗΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΤΟΥ ΚΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΕΑΝ ΠΡΟΕΡΧΕΤΑΙ ΑΠΟ ΔΙΑΝΟΜΗΣ, ΑΠΟ ΒΥΤΙΟ, Ή ΣΕ ΦΙΑΛΕΣ Ή ΣΕ ΔΟΧΕΙΑ ΤΟ ΝΕΡΟ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΣΤΙΣ ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΕΙΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ, ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ, ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ Ή ΕΜΠΟΡΙΑ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ Ή ΟΥΣΙΩΝ, ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΟΝΤΑΙ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ, ΕΚΤΟΣ ΕΑΝ ΟΙ ΑΡΜΟΔΙΕΣ ΕΘΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΡΙΝΟΥΝ ΟΤΙ Η ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΔΕΝ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΠΗΡΕΑΣΕΙ ΤΗΝ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΣΤΗΝ ΤΕΛΙΚΗ ΤΟΥΣ ΜΟΡΦΗ 74

ΠΡΟΔΙΑΓΡΑΦΕΣ ΤΟ ΝΕΡΟ ΘΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ ΑΠΑΛΛΑΓΜΕΝΟ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΩΝ ΚΑΙ ΟΠΟΙΟΝΔΗΠΟΤΕ ΟΥΣΙΩΝ, ΣΕ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΡΙΘΜΟΥΣ, ΠΟΥ ΑΠΟΤΕΛΟΥΝ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΟ ΚΙΝΔΥΝΟ ΓΙΑ ΤΗ ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ. ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΠΛΗΡΗ ΤΙΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΠΙΝΑΚΩΝ (Α) ΚΑΙ (Β) 75

ΠΙΝΑΚΑΣ Α Παράμετρος Παραμετρική τιμή αριθμός/100ml E.Coli 0 Εντερόκοκκοι 0 ΦΙΑΛΕΣ - ΔΟΧΕΙΑ Παράμετρος Παραμετρική τιμή αριθμός/100ml E.Coli 0/250 ml Εντερόκοκκοι 0/250 ml Pseudomonas aeruginosa 0/250 ml Αριθμός αποικιών στους 22 0 C 100/ml Αριθμός αποικιών στους 37 0 C 20/ml 76

Ακρυλαμίδιο Αντιμόνιο Αρσενικό Βενζο-α-πυρένιο Βενζόλιο Βόριο Βρωμικά άλατα Κάδμιο Χρώμιο Χαλκός Μόλυβδος Υδράργυρος Νικέλιο Νιτρικά άλατα Νιτρώδη άλατα Παρασιτοκτόνα Σελήνιο Βινυλοχλωρίδιο ΠΙΝΑΚΑΣ Β 0,10 μg/l 5,00 μg/l 10,00 μg/l 0,010 μg/l 1,00 μg/l 1,00 μg/l 10,00 μg/l 5,00 μg/l 50,00 μg/l 2,00 μg/l 10,00 μg/l 1,00 μg/l 20,00 μg/l 50,00 μg/l 0,50 μg/l 0,10 μg/l 10,00 μg/l 0,50 μg/l 77

ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΤΑ ΚΡΑΤΗ ΜΕΛΗ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ ΟΛΑ ΤΑ ΑΝΑΓΚΑΙΑ ΜΕΤΡΑ ΩΣΤΕ ΝΑ ΕΞΑΣΦΑΛΙΣΟΥΝ ΟΤΙ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΕΙΤΑΙ ΤΑΚΤΙΚΑ Η ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ, ΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟ ΝΑ ΕΛΕΓΧΕΤΑΙ ΟΤΙ ΠΛΗΡΕΙ ΤΗΣ ΚΕΙΜΕΝΕΣ ΠΡΟΥΠΟΘΕΣΕΙΣ. ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΕΤΑΙ ΜΕ ΑΥΤΟ ΤΟΝ ΤΡΟΠΟ Η ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΠΟΥ ΚΑΤΑΝΑΛΙΣΚΕΤΑΙ ΚΑΘ ΟΛΗ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΟΥ ΕΤΟΥΣ. ΚΑΤΑΡΤΙΖΟΝΤΑΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ. 78

ΕΠΑΝΟΡΘΩΤΙΚΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΧΡΗΣΕΩΣ ΣΤΗΝ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΜΗ ΤΗΡΗΣΗΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΓΙΝΕΤΑΙ ΑΜΕΣΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΑΙΤΙΩΝ, ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟ ΑΥΤΩΝ ΕΞΑΣΦΑΛΙΖΕΤΑΙ ΑΜΕΣΑ Η ΑΠΑΓΟΡΕΥΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΟΧΗΣ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΠΟΥ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΟ ΚΙΝΔΥΝΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΥΓΕΙΑ Ή ΠΕΡΙΟΡΙΖΕΤΑΙ Η ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ Ή ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΤΑ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΜΕΤΡΑ ΩΣΤΕ ΝΑ ΜΗΝ ΥΠΑΡΞΕΙ ΚΙΝΔΥΝΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΥΓΕΙΑ ΑΜΕΣΗ ΕΝΗΜΕΡΩΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΟΧΗ ΟΔΗΓΙΩΝ ΠΡΟΣ ΤΟΥΣ ΠΟΛΙΤΕΣ 79

ΓΕΝΙΚΑ ΕΜΦΙΑΛΩΜΕΝΟ ΝΕΡΟ ΟΙ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΕΣ, ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΤΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΦΕΚ379/Β/86 53/Β/86 (ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΕΚ892/Β /01) ΦΥΣΙΚΟ ΜΕΤΑΛΛΙΚΟ ΝΕΡΟ/ΝΕΡΟ ΠΗΓΗΣ ΟΙ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΤΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΕΚ 114/Β/98 80

ΠΡΟΔΙΑΓΡΑΦΕΣ 81

82

ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΤΩΝ ΕΜΦΙΑΛΩΜΕΝΩΝ ΝΕΡΩΝ ΤΑ ΕΜΦΙΑΛΩΜΕΝΑ ΝΕΡΑ ΘΕΩΡΟΥΝΤΑΙ ΑΣΦΑΛΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΓΕΙΑ ΕΑΝ ΔΕΝ ΕΧΟΥΝ ΕΠΙΜΟΛΥΝΘΕΙ ΜΕ ΤΟΞΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΠΑΘΟΓΟΝΟΥΣ Μ/Ο Ή ΞΕΝΑ ΣΩΜΑΤΑ, ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΑ ΠΟΥ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΒΛΑΨΟΥΝ ΤΗΝ ΥΓΕΙΑ ΤΟΥ ΚΑΤΑΝΑΛΩΤΗ. ΘΕΩΡΟΥΝΤΑΙ ΑΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΕΠΙΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΜΑΚΡΟΠΡΟΘΕΣΜΕΣ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΣΤΗΝ ΥΓΕΙΑ. 83

ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ ΤΟΣΟ ΤΑ ΥΛΙΚΑ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ ΟΣΟ ΚΑΙ Η ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΜΗΝ ΜΟΛΥΝΟΥΝ ΤΟ ΠΡΟΣ ΕΜΦΙΑΛΩΣΗ ΝΕΡΟ. ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΥΛΙΚΑ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΚΑΙ ΕΓΚΕΚΡΙΜΕΝΑ ΓΙΑ ΤΟ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟ ΠΡΟΙΟΝ, ΓΙΑ ΤΙΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗΣ ΤΟΥ ΚΑΙ ΝΑ ΜΗ ΜΕΤΑΦΕΡΟΥΝ ΕΠΙΚΙΝΔΥΝΕΣ ΚΑΙ ΤΟΞΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΣΕ ΑΥΤΟ. ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΘΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ ΕΛΕΥΘΕΡΑ ΑΠΟ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥΣ Μ/Ο Ή ΑΛΛΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΜΟΛΥΝΟΥΝ Ή ΝΑ ΑΛΛΟΙΩΣΟΥΝ ΤΑ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΑ ΤΟΥ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΝΑ ΤΟ ΚΑΤΑΣΤΗΣΟΥΝ ΑΚΑΤΑΛΛΗΛΟ ΓΙΑ ΠΟΣΗ. 84

ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ ΤΑ ΥΛΙΚΑ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΟΙ ΕΤΟΙΜΟΙ ΠΕΡΙΕΚΤΕΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΟΝΤΑΙ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟ ΧΩΡΟ, ΜΑΚΡΙΑ ΑΠΟ ΤΟ ΧΩΡΟ ΠΛΗΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣ. ΟΙ ΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΕΣ ΘΕΩΡΟΥΝΤΑΙ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΜΕΝΕΣ ΛΟΓΩ ΤΗΣ ΥΨΗΛΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΦΑΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΤΟΥΣ. ΟΙ ΓΥΑΛΙΝΕΣ ΦΙΑΛΕΣ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΚΑΘΑΡΟ, ΟΥΔΕΤΕΡΟ ΓΥΑΛΙ, ΚΑΙ ΠΡΙΝ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΠΛΕΝΟΝΤΑΙ ΜΕ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΑ ΜΕΣΑ. ΤΟ ΝΕΡΟ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΓΙΑ ΤΟ ΠΛΥΣΙΜΟ ΤΩΝ ΦΙΑΛΩΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ ΠΟΣΙΜΟ ΚΑΙ ΤΟ ΤΕΛΙΚΟ ΞΕΠΛΥΜΑ ΝΑ ΓΙΝΕΤΑΙ ΜΕ ΣΤΕΙΡΟ ΝΕΡΟ Ή ΙΔΙΑΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΑΥΤΟ ΠΟΥ ΘΑ ΕΜΦΙΑΛΩΘΕΙ. 85

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ 86

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ 87

ΓΕΝΙΚΑ ΠΟΙΟΙ ΕΙΝΑΙ ΟΙ Μ/Ο ΠΟΥ ΣΥΝΑΝΤΑΜΕ ΣΤΟ ΝΕΡΟ Μ/Ο ΠΟΥ ΔΙΑΒΙΩΝΟΥΝ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΤΟ ΝΕΡΟ (π.χ. ΘΕΙΟΒΑΚΤΗΡΙΑ, ΣΙΔΗΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑ κ.α.) ΣΥΝΗΘΩΣ ΑΚΙΝΔΥΝΟΙ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Μ/Ο ΠΟΥ ΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΠΕΡΙΤΤΩΜΑΤΑ ΖΩΩΝ & ΑΝΘΡΩΠΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ Μ/Ο (vibrio cholerae, salmonella typhi, salmonella, singela, campylobacter jejunim κ.α.) ΔΙΑΦΟΡΟΙ ΙΟΙ (ΠΟΛΙΟΜΥΕΛΙΤΙΔΑ, ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ κ.α.) 88

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΝΕΡΟΥ ΟΙ ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ Μ/Ο ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ ΣΥΝΗΘΩΣ ΣΕ ΜΙΚΡΟ ΑΡΙΘΜΟ ΚΑΙ ΔΥΣΚΟΛΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΖΟΝΤΑΙ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕ ΔΕΙΚΤΕΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ Μ/Ο ΠΟΥ ΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΠΕΡΙΤΤΩΜΑΤΑ ΖΩΩΝ ΚΑΙ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΑ (π.χ. E.Coli) και ΟΜΧ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥΣ ΕΙΝΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΣΩΛΗΝΩΝ Membrane Filtration (MF) (ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ) 89

MF (Membrane Filtration) OMX & Colliforms Δειγματισμός νερού προς ανάλυση. (Θα αναλυθεί στο εργαστήριο) 1 lit (τουλάχιστον) νερού διοχετεύεται μέσα από ειδικά αποστειρωμένα φίλτρα (μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, οπής 0,45μm). Τοποθετούμε την μεμβράνη εφαπτόμενη στο θρεπτικό υπόστρωμα (περιέχει θρεπτικό μέσο επιλεγόμενο για ΟΜΧ) του τρυβλίου ή σε σωλήνα που περιέχει θρεπτικό υλικό κατάλληλο για ανάπτυξη Coliforms (LST Broth) και σωλήνα Durham. Επώαση στους 37 0 C για 48 ώρες ή 22 0 C για 72 ώρες (OMX) και 37 0 C για 48 ώρες (Coliforms). Αν υπάρχει θετικότητα στα Coliforms ακολουθούμε επιβεβαιωτική μέθοδο χρησιμοποιώντας BGLB υπόστρωμα). Καταμέτρηση των χαρακτηριστικών αποικιών της ΟΜΧ που σχηματίζονται. Η τιμή που παίρνουμε μας δείχνει απευθείας των συνολικό αριθμό των αποικιών της ΟΜΧ που υπάρχουν στο δείγμα του νερού. 90

ΜΕΡΟΣ 9 ο ΜΕΘΟΔΟΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ STAPHYLOCOCCUS AUREUS 91

Ο Staphylococcus aureus ανήκει στο γένος Staphylococcus, της οικογένειας Micrococcaceae. Εκεί ανήκουν τα γένη Staphylococcus, Micrococcus & Planococcus. Χαρακτηριστικό Micrococcus Staphylococcus Planococcus Κόκκοι Gram+ + + + Παραγωγή καταλάσης Ζύμωση της γλυκόζης + + + - + - Κινητικότητα - - + 92

Ευρέως διαδεδομένοι στο περιβάλλον. Κυρίως από βλεννογόνο ρινοφάρυγγα, αποστήματα και γενικά το δέρμα του ανθρώπου και των ζώων. Αποτελεί μια από τις κυριότερες πηγές τροφικών δηλητηριάσεων παγκοσμίως. Η σταφυλοκοκκική τοξίνωση οφείλεται στην κατανάλωση τροφίμων που μέσα τους έχουν παραχθεί, από στελέχη σταφυλόκοκκων, εξωτοξίνες (εντεροτοξίνες). Δεν καταστρέφονται τελείως με το βρασμό, για 30 λεπτά, ενώ καταστρέφονται στους 120 0 C για 20 30 λεπτά. Είναι ιδιαιτέρως τοξικές. Για να παραχθεί η τοξίνη σε αρκετή ποσότητα ώστε να προκαλέσει συμπτώματα πρέπει ο πληθυσμός τους ανά gr τροφίμου να είναι πάνω από 500.000. 93

Μέθοδοι προσδιορισμού (Χρήση στερεού Θρεπτικού Υποστρώματος) Ακολουθείται η προετοιμασία του δείγματος με τον ίδιο τρόπο που πραγματοποιήθηκε για τον έλεγχο της Ο.Μ.Χ. Σε τρυβλία τα οποία περιέχουν το κατάλληλο υπόστρωμα (Baird- Parker Egg Yolk Agar) τοποθετούμε, με τη μέθοδο της επιφανειακής εξάπλωσης, 0,1 ml δείγματος από την αραίωση που επιλέγουμε. Επωάζουμε στους 35 Ο C/24 48 ώρες και σε όποια παρατηρηθεί θετικότητα εμφανίζονται μαύρες-γκρι γυαλιστερές αποικίες διαμέτρου 1-5mm που περιβάλλονται από διαυγή ζώνη 2-5mm. 94

Μέθοδοι προσδιορισμού (Χρήση υγρού Θρεπτικού Υποστρώματος με τη μέθοδο MPN) Χρησιμοποιείται κυρίως σε τρόφιμα που φέρουν μικρό αριθμό βακτηρίων (<100/γρ) Ακολουθείται η προετοιμασία του δείγματος με τον ίδιο τρόπο που πραγματοποιήθηκε για τον έλεγχο της Ο.Μ.Χ. Από κάθε αραίωση του δείγματος εμβολιάζονται 3 δοκιμαστικοί σωλήνες με ποσότητα 1ml δείγματος. Συνήθως εξετάζουμε τις αραιώσεις 10-1 10-2 10-3. Το θρεπτικό υπόστρωμα που χρησιμοποιείται είναι το Tryptic Soya Broth + 9,5% NaCl. Επωάζουμε στους 37 Ο C/48 ώρες. Σε όποια παρατηρηθεί θετικότητα (θόλωμα) μεταφέρεται με κρίκο εμβολιασμού, μικρή ποσότητα και εμβολιάζονται τα τρυβλία που φέρουν στερεοποιημένο Baird-Parker Agar. Ο πιθανός αριθμός (MPN) του S.aureus ανά γρ. δείγματος από τους πίνακες McCrady. 95

ΜΕΡΟΣ 10 ο ΜΕΘΟΔΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ 96

Είναι βακτήρια Gram+ Έχουν μορφή κόκκου και ανήκουν στην οικογένεια Enterococcaceae Είτε σχηματίζουν ζεύγη είτε βρίσκονται με τη μορφή αλυσίδας. Αναπτύσσονται σε συγκέντρωση NaCl 6,5% ή και μεγαλύτερη, για αυτό και συναντώνται συχνά σε «παστά» τρόφιμα Αποτελούν δείκτη εντερικής μόλυνσης, δείκτη κακής επεξεργασίας των τροφίμων και αίτιο τροφικών δηλητηριάσεων. Οι στρεπτόκοκκοι ανήκουν στην ορολογική ομάδα D Lancefield με υποομάδες ως εξής: 1. Str. Faecalis και οι παραλλαγές του 2. Str. Faecium 3. Str. Bovis & Str. equinus Η υπερίσχυση των 2 & 3 σε δείγμα τροφίμου, υποδηλώνει μόλυνση του από εντερική μικροχλωρίδα ζώων. Απομονώνονται λοιπόν συχνά από χώρους επεξεργασίας κρέατος, από απόβλητα εργοστασίων γάλακτος. 97

Μέθοδος προσδιορισμού Εφαρμόζεται η διαδικασία των διαδοχικών αραιώσεων όπως στα προηγούμενα πειράματα. Ρευστοποιείται το επιλεγμένο θρεπτικό υπόστρωμα (Enterococcus Selective Agar) και διατηρείται σε υδατόλουτρο στους 45 46 0 C. Από τις διαδοχικές αραιώσεις που έχουν ετοιμασθεί γίνεται ενοφθαλμισμός 2πλης σειράς τρυβλίων με 1ml δείγματος. Προσθέτουμε 13-15 ml του υποστρώματος που έχει θερμοστατηθεί στο υδατόλουτρο και ενσωματώνεται κατάλληλα με το δείγμα. Μετά την στερεοποίηση προσθέτουμε 4-5ml υγρού υποστρώματος ανάλογης θερμοκρασίας για το σχηματισμό στοιβάδας, διότι οι αναμενόμενοι εντερόκοκκοι είναι μικροαερόφιλοι. Επώαση στους 35 0 C/48h Αριθμούνται οι σχηματιζόμενες κόκκινες αποικίες και επιλέγονται για αρίθμηση τα τρυβλία που έχουν πάνω από 10 και κάτω από 80 αποικίες. 98

ΜΕΡΟΣ 11 ο Οξυγαλακτικά βακτήρια 99

Τα Οξυγαλακτικά βακτήρια (Lactic Acid Bacteria) είναι Gram +, μη σπορογόνοι κόκκοι, βάκιλλοι ή κοκκοβάκιλλοι. Ανήκουν στα γένη Micrococcus, Streptococcus, Leuconostoc & Lactobacillus κυρίως. Ευρέως διαδεδομένη στη φύση. Υπάρχουν στην στοματική κοιλότητα, στο ανθρώπινο έντερο καθώς και σε γαλακτοκομικά προϊόντα, στο κρέας, τους χυμούς, το κρασί κλπ Προκαλούν τις λεγόμενες οξυγαλακτικές ζυμώσεις πολλές από τις οποίες είναι ωφέλιμες ενώ άλλες είναι ανεπιθύμητες και οδηγούν σε ανωμαλίες στην γεύση, οσμή και άλλα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Ανάμεσα στα Οξυγαλακτικά βακτήρια δεν υπάρχουν παθογόνα στελέχη, εκτός από τον Lb. Catenaforme που βρίσκεται φυσιολογικά στο στόμα και στο έντερο και έχει βρεθεί ότι προκαλεί μολύνσεις τραυμάτων, μόλυνσης δοντιών κ.α. Λόγω της υψηλής αντοχής που παρουσιάζουν σε όξινο περιβάλλον ονομάζονται οξεόφιλα. 100

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Μέθοδοι αρίθμησης Δεν υπάρχει θρεπτικό υπόστρωμα ούτε μέθοδος που να επιτρέπουν την ανάπτυξη όλων των οξυγαλακτικών βακτηρίων που βρίσκονται στα τρόφιμα. Για την αρίθμηση τους χρησιμοποιούνται οι μέθοδοι της: Ενσωμάτωσης και Επιφανειακής εξάπλωσης Απαιτούμενα υλικά Αραιωτικό υγρό APHA MRS Agar (κυρίως για γαλακτοκομικά προϊόντα) Rogosa Agar * Tomato Juice Agar APT Agar (κυρίως για κρεατοσκευάσματα) 101

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΝΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Μέθοδος ενσωμάτωσης Από τις δεκαδικές αραιώσεις γίνεται εμβολιασμός σε 2πλη σειρά τρυβλίων. Προσθέτουμε 15 ml θρεπτικού υλικού θερμοκρασίας 45 0 C και μετά την στερεοποίηση του υλικού προσθέτουμε 5 ml του ιδίου υλικού για την δημιουργία στοιβάδας επικάλυψης και για την αποφυγή δημιουργίας επιφανειακών αποικιών (spreaders). Επώαση στους 37 0 C για 72 ώρες ή 30 0 C για 5 ημέρες. Η αρίθμηση τους γίνεται βάση κανόνων APHA Μέθοδος επιφανειακής εξάπλωσης Ετοιμάζονται τα τρυβλία με το υπόστρωμα που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί Μετά την πήξη του προστίθενται 0,1 0,2 ml ενοφθαλμίσματος από τις δεκαδικές αραιώσεις. Με τη βοήθεια της κεκαμμένης ράβδου γίνεται εξάπλωσης του στην επιφάνεια του τρυβλίου. Προσθέτουμε 5 ml του ιδίου υλικού για την δημιουργία στοιβάδας επικάλυψης Επώαση στους 37 0 C για 72 ώρες ή 30 0 C για 5 ημέρες. Μετά την επώαση ο αριθμός των αποικιών πολλαπλασιάζεται επι 5 ή 10 ανάλογα με τον όγκο του ενοφθαλμίσματος και επι το συντελεστή της αραίωσης. 102

ΜΕΡΟΣ 12 ο Listeria monocytogenes 103

Ανήκει στο γένος Listeria της οικογένειας Listeriaceae. Είναι βακτήριο Gram+ με σχήμα κοκκοειδές ή κοντής ράβδου, ακίνητο σε θερμοκρασίες άνω των 37 0 C και κινητό σε τιμές 20-25 0 C. Αναπτύσσεται σε τιμές από 1-44 0 C με άριστες τιμές από 30-37 0 C. Η πλειοψηφία των στελεχών της είναι παθογόνα και προκαλούν σοβαρές τροφικές δηλητηριάσεις που μπορεί να οδηγήσουν ακόμα και στο θάνατο. Βάσει του κανονισμού 2073/2005 τα ποσοτικά όρια ανοχής εξαρτώνται από το είδος του τροφίμου. Όσον αφορά τις παιδικές τροφές ισχύουν όρια «μηδενικής ανοχής» Ο ελάχιστος βαθμός βακτηρίων που απαιτείται για πρόκληση Λιστερίωσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την κατάσταση της υγείας του δέκτη. Σε υγιείς ανθρώπους είναι 10 2 10 3 cfu/gr, ενώ σε ασθενείς 1-10 3 cfu/gr. Ευρέως διαδεδομένη στη φύση και συνήθως συναντάται στα έτοιμα προς κατανάλωση (ψυγμένα χωρίς να έχουν υποστεί υψηλή θερμική επεξεργασία τρόφιμα) καθώς και στα νωπά προϊόντα (π.χ. γάλα). Επίσης σε μαλακά τυριά, προϊόντα κρέατος, αλιεύματα, μαλάκια και συχνά σε νωπά λαχανικά. 104

25 γρ ή ml δείγματος ομογενοποιούνται με 225 ml LEB Broth Base. Επώαση στους 30 0 C / 48h Προσθήκη εκλεκτικού παράγοντα για εμπλουτισμό (Listeria Selective Enrichment Supplement) Παραμονή στους 30 0 C / 24 & 48 h Μετά από 24h Μεταφορά σε: Oxford Agar PALCAM Agar Μετά από 48h Μεταφορά σε: Oxford Agar PALCAM Agar 105

Επώαση στους 35 0 C για 24-48h 5 πιθανές αποικίες μεταφέρονται σε TSA Yeast Extract Agar Επώαση στους 30 0 C για 24-48h Βιοχημικές δοκιμές 106

ΜΕΡΟΣ 13 ο Μικροβιολογική εξέταση επιφανειών και εξοπλισμού στη βιομηχανία των τροφίμων 107

Απόλυτη καθαρότητα απαιτείται για τα μέσα και τα υλικά που χρησιμοποιούνται στις βιομηχανίες και βιοτεχνίες τροφίμων. Η υγιεινή κατάσταση και η μικροβιολογική ποιότητα των επιφανειών και του εξοπλισμού πρέπει να ελέγχονται ανα τακτά χρονικά διαστήματα γιατί επηρεάζουν την υγιεινή και την ποιότητα των παραγόμενων τροφίμων. Υλικά: Ταινίες συγκολλητικές, πλαστικές, τύπου cellotape Κύλινδροι (θήκες) τύπου Rilsan από πλαστικό υλικό διαμέτρου 5 10cm Βύσματα βαμβακιού, πάχους 0,5 cm και μήκους 2 cm που τοποθετούνται σε στυλεό από ξύλο μήκους 12 15 cm Τρυβλία Rodac Ειδικοί σπόγγοι 108

Τεχνική συγκολλητικής ταινίας Εφαρμογή της ταινίας σε εξεταζόμενη επιφάνεια και εξάσκηση πίεσης σε αυτή. Αποκόλληση και εναπόθεση της σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό που η επιφάνεια του έχει στεγνώσει καλά. Απομάκρυνση ταινίας Η επιλογή του υποστρώματος εξαρτάται από το είδος του μ/ο προς ανάλυση Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό των: Σαλμονελλών Σταφυλοκκόκων Κολοβακτηροειδών Εντεροβακτηριοειδών Δίδει πολύ καλά αποτελέσματα για την εκτίμηση της καθαρότητας των χεριών του προσωπικού Δεν συνίσταται για τον έλεγχο μέσων και υλικών που μπορεί να φέρουν λιπαρές ουσίες καθώς δεν κολλάει σε αυτές η ταινία 109

Τεχνική βύσματος βαμβακιού (swab test) Χρησιμοποιούνται βύσματα υδρόφιλου βαμβακιού που τοποθετούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες με αραιωτικό υγρό και αποστειρώνονται. Πριν τη χρήση στραγγίζονται πολύ καλά και έπειτα σαρώνεται η προς εξέταση επιφάνεια. Λαμβάνουμε υλικό από 10 διαφορετικά σημεία της επιφάνειας. Η τεχνική αυτή είναι πολύ εύχρηστη και κατάλληλη για την εξέταση όλων των επιφανειών και του εξοπλισμού. Είναι σύμφωνη η χρήση του με τις απαιτήσεις του ΕΦΕΤ. Παρασκευή αραιώσεων: Το βύσμα του βαμβακιού μετά το «σκούπισμα» της υπό εξέτασης επιφάνειας, τοποθετείται σε σωλήνα που περιέχει 10 ml αραιωτικού υγρού (1 η αραίωση). Κατά την έξοδο του στραγγίζεται πολύ καλά (πρέπει να γίνει επαρκής μεταφορά του υπό εξέταση δείγματος στο σωλήνα με το αραιωτικό μέσο) Ετοιμάζονται οι υπόλοιπες δεκαδικές αραιώσεις Ακολουθούνται ενοφθαλμισμοί σε τρυβλία με κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα (επιλέγουμε υπόστρωμα ανάλογα με το είδος των βακτηρίων που θέλουμε να ελέγξουμε) 110