«Διερεύνηση της ρύθμισης των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου Cdt1 και Geminin σε κύτταρα με βλάβες στο DNA και σε αποπτωτικά κύτταρα»

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΏΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Διερεύνηση της ρύθμισης των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου Cdt1 και Geminin σε κύτταρα με βλάβες στο DNA και σε αποπτωτικά κύτταρα» ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΡΟΥΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2008

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΏΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Διερεύνηση της ρύθμισης των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου Cdt1 και Geminin σε κύτταρα με βλάβες στο DNA και σε αποπτωτικά κύτταρα» ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΡΟΥΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Λυγερού Ζωή Επίκουρος Καθηγήτρια Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας Τμήμα Ιατρικής ΠΑΤΡΑ 2008 2

Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή κα Λυγερού Ζωή κος Τσαμπάος Διονύσιος κος Γεωργάτος Σπυρίδων Επίκουρος Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Ιωαννίνων Επταμελής συμβουλευτική επιτροπή κα Λυγερού Ζωή κος Τσαμπάος Διονύσιος κος Γεωργάτος Σπυρίδων κος Ζούμπος Νικόλαος κος Βαράκης Ιωάννης κος Μοσχονάς Νικόλαος κος Καλόφωνος Χαράλαμπος Επίκουρος Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Ιωαννίνων Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών 3

Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Γενικής Βιολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του προγράμματος των Μεταπτυχιακών Σπουδών στις «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Με την ολοκλήρωσή της θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου, κ. Λυγερού Ζωή, Επίκουρο Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής, για την αμέριστη ηθική και υλική συμπαράσταση, την ουσιαστική καθοδήγηση, αλλά πάνω απ όλα για τις ερευνητικές αρχές που μου δίδαξε οι οποίες και αποτελούν πολύτιμα εφόδια στη μελλοντική μου σταδιοδρομία. Αποτελεί για μένα πρότυπο ακαδημαϊκού, ερευνητή και πηγή έμπνευσης όλα αυτά τα χρόνια και στη συνέχεια. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της συντονιστικής επιτροπής κ. Καθηγητές Δ. Τσαμπάο και Σ. Γεωργάτο, για.τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις τους και όλα τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής για την τιμή που μου έκαναν να συμμετέχουν σε αυτή. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον κ. Σταύρο Ταραβήρα, Επίκουρο Καθηγητή του Εργαστηρίου Φαρμακολογίας του Τμήματος Ιατρικής για τις ανεκτίμητες συμβουλές και την εμπιστοσύνη του. Για το ευχάριστο, φιλικό και κυρίως ανθρώπινο κλίμα εργασίας που μου προσέφεραν, θα ήθελα να απευθύνω τις ευχαριστίες μου προς όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας, στα μέλη ΔΕΠ κ. Αθανασιάδου, κ. Μοσχονά, κ. Σπάθα, κ. Ζαρκάδη και κ. Παπαχατζοπούλου. Ένα μεγάλο ευχαριστώ επίσης οφείλω στους μεταπτυχιακούς φοιτητές Μ. Ηλιού, Μ. Δημάκη, Π. Κοταντάκη, Μ. Κιτριλάκη, Ζ. Ξουρή, Π. Κωτσαντή, Δ. Πεφάνη, Χ. Σιρινιάν, Ε. Συμεωνίδου, Μ. Σπέλλα, Ν. Σταθοπούλου, Δ. Καραμήτρο και Ν. Καρατζέλη, για το ξεχωριστικό κλίμα συνεργασίας και τις ουσιαστικές συζητήσεις. Μοιραστήκαμε μαζί πολλά, χαρές, λύπες, σκέψεις και αγωνία για το μέλλον. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Prof. Philippe Bastiaens, για την επίβλεψή του κατά τη διάρκεια της εργασίας μου στο Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας (EMBL) και τους O. Rocks, A. Kinkhabwala, J. Colombelli, P. Lommerse, S. Santos, F. Haj και P. Verveer για τις συμβουλές τους και κυρίως τη φιλική τους διάθεση, που έκανε την παραμονή μου πολύ ευχάριστη. Θα ήθελα τέλος να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, τη Γεωργία, το Βαγγέλη, την Κλαίρη, τη Βίκυ και τον Ντίνο, που βρίσκονται πάντα κοντά μου και με στηρίζουν η αγάπη τους είναι για μένα η μεγαλύτερη επιβράβευση και η δύναμη για τη συνέχεια. 4

Περιεχόμενα 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9 1.1 Γενικά 10 1.2 Κυτταρικός κύκλος - η αδειοδότηση της αντιγραφής 10 1.3 Η ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου 11 1.4 Ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 μέσω αποικοδόμησης 14 1.5 H πρωτεΐνη Geminin και ο διττός ρόλος της στην αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής και τη διαφοροποίηση 16 1.6 Μηχανισμοί επαναντιγραφής του DNA και επιπτώσεις 21 1.7 Επαναντιγραφή του DNA και ογκογένεση 23 2 Απόκριση του κυττάρου σε βλάβες στο DNA 25 2.1 Πληθώρα βλαβών στο DNA 25 2.2 Ενεργοποίηση σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ως απόκριση στη δημιουργία βλαβών στο DNA 27 2.2.1 Η ενεργοποίηση σημείων ελέγχου του κυττάρου στη φάση G1 28 2.2.1.1 Ταχεία και ανεξάρτητη από την πρωτεΐνη p53 ενεργοποίηση σημείου ελέγχου του κυττάρου στη φάση G1 29 2.2.1.2 Η ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από την πρωτεΐνη p53 31 2.2.1.3 Η πρωτεΐνη Cdt1 στοχεύεται για αποικοδόμηση σε κύτταρα με βλάβες στο DNA 33 2.2.2 Η ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου 35 2.2.3 Η ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου G2/M 38 2.3 Συστήματα επιδιόρθωσης των βλαβών 39 3 Απόπτωση 43 3.1 Γενικά 43 3.2 Κασπάσες, οι πρωτεάσες της αποπτωτικής διαδικασίας 43 3.2.1 Μέλη της οικογένειας των κασπασών και δομικά χαρακτηριστικά τους 44 3.2.2 Μονοπάτια ενεργοποίησης των κασπασών 47 3.2.3 Υποστρώματα των κασπασών κατά την απόπτωση 49 2. ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 52 3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ 54 1 Κυτταροκαλλιέργεια 55 1.1 Παροδική διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με λιποδιαμόλυνση (lipofection) 55 1.2 Επαγωγή αποπτωτικής διαδικασίας 56 2 Μέθοδοι ανάλυσης πρωτεϊνών 56 2.1 Απομόνωση πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων 56 2.2 Ανοσοαποτύπωση western (ανάλυση Western Blotting) 57 2.3 Ανοσοκαθίζηση 58 2.4 Επωάσεις ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών in vitro 59 5

2.4.1 Ιn vitro επώαση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Geminin με ανασυνδυασμένη caspase-3 59 2.4.2 Ιn vitro φωσφορυλίωση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Geminin από ανασυνδυασμένη Casein kinase II (CKII) και ακόλουθος έλεγχος κατάτμησης από ανασυνδυασμένη κασπάση-3 60 3 Μέθοδοι ανασυνδυασμένου DNA-Κλωνοποιήσεις 61 3.1 Γενικά 61 3.1.1 Απομόνωση μεσαίας κλίμακας πλασμιδικού DNA 61 3.1.2 Κατάτμηση του πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού 61 3.1.3 Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 61 3.1.4 Καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης 64 3.1.5 Αντίδραση συνδετάσης 64 3.1.6 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας 64 3.2 Στρατηγική κλωνοποίησης μεταλλαγμένων μορφών 64 3.2.1 Στρατηγική κλωνοποίησης των μεταλλαγμένων μορφών της Geminin 64 3.2.2 Στρατηγική κλωνοποίησης υβριδικών μορίων και μεταλλαγμένων μορφών τους με φθορίζοντα μόρια 65 4 Μέθοδοι Κυτταρικής Βιολογίας 66 4.1 Ανοσοφθορισμός 66 4.1.1 Επικάλυψη καλυπτρίδων με poly-d-λυσίνη 66 4.1.2 Πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού 66 4.2 Αποσιώπηση γονιδιακής έκφρασης με τη χρήση sirna 68 5 Μικροσκοπικές Μέθοδοι σε ζωντανά κύτταρα 70 5.1 Δημιουργία εντοπισμένων βλαβών με τη χρήση παλμικού laser 70 5.2 Μικροσκοπία timelapse 70 5.3 Απεικονίσεις ανοσοφθορισμών - ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων 71 5.4 Πειράματα Επαναφοράς Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching) 71 6 Γενικά Αντιδραστήρια - Διαλύματα 74 6.1 Διάλυμα λύσης για τα πειράματα ανοσοκαθίζησης 75 6.2 Διάλυμα για την in vitro επώαση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Geminin και ανασυνδυασμένης caspase-3 75 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 77 1 Ρύθμιση της πρωτεΐνης Geminin σε αποπτωτικά κύτταρα 78 1.1 Η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται σε αποπτωτικά κύτταρα 78 1.2 Η Geminin στοχεύεται και κατατμείται από την κασπάση-3 81 1.3 Προσδιορισμός των θέσεων κατάτμησης της πρωτεΐνης Geminin από την κασπάση-3 84 1.4 Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση 88 1.5 Ρόλος της κατάτμησης της πρωτεΐνης Geminin από την κασπάση-3 91 1.5.1 Η κατάτμηση της Geminin στη θέση Κ1 (D204) προκαλεί τη δημιουργία θραύσματος της Geminin που δρα προ-αποπτωτικά 92 1.5.2 Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin στη θέση Κ2 έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της ικανότητας αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη hbrm 93 6

2 Ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 σε κύτταρα με βλάβες στο DNA 97 2.1 Πρόκληση εντοπισμένων βλαβών στο DNA ζωντανών κυττάρων με τη χρήση παλμικού laser 97 2.1.1 Προσδιορισμός βέλτιστων συνθηκών έκθεσης κυττάρων στο παλμικό laser 98 2.1.2 Εντοπισμός της επαγόμενης από το laser βλάβης στον άξονα Ζ 100 2.1.3 Το παλμικό laser δεν προκαλεί αλλαγές στην υποκυτταρική δομή και δεν οδηγεί σε νέκρωση ή απόπτωση των κυττάρων 101 2.1.4 Η χρήση του παλμικού laser οδηγεί σε ενεργοποίηση μονοπατιών αναγνώρισης και επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA 103 2.1.5 Η επαγόμενη από το παλμικό laser βλάβη προκαλεί την ενεργοποίηση σημείων ελέγχου του κυττάρου 105 2.2 Η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης και η συσσώρευση αυτή προηγείται της αποικοδόμησής της 107 2.2.1 Η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης 107 2.2.2 Η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους 109 2.2.3 Η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή εντοπισμένης βλάβης που προκαλείται από υπεριώδη ακτινοβολία 110 2.2.4 Η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης προηγείται της αποικοδόμησής της 111 2.3 Διελεύκανση των μοριακών μονοπατιών στόχευσης της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης 114 2.3.1 Το μοτίβο PIP box της πρωτεΐνης Cdt1 απαιτείται για τη συσσώρευσή του στην περιοχή της βλάβης 114 2.3.2 Η πρωτεΐνη PCNA συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης παράλληλα με την πρωτεΐνη Cdt1 117 2.3.3 Η πρωτεΐνη PCNA απαιτείται για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης 118 2.4 Διερεύνηση των μοριακών αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών Cdt1, PCNA και Cdt2 στην περιοχή της βλάβης 121 2.4.1 Οι πρωτεΐνες Cdt2, Cul4A και DDB1, συσσωρεύονται στην περιοχή της βλάβης 121 2.4.2 Η πρωτεΐνη Cdt1 δεν απαιτείται για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης PCNA στην περιοχή της βλάβης 124 2.4.3 Η πρωτεΐνη Cdt1 δεν απαιτείται για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt2 στην περιοχή της βλάβης 126 2.4.4 Η πρωτεΐνη Cdt2 δεν απαιτείται για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης 128 2.4.5 Ανάλυση της κινητικής συσσώρευσης των πρωτεϊνών Cdt1, Cdt2 και PCNA στην περιοχή της βλάβης 130 2.4.6 Διερεύνηση της δυναμικής των πρωτεϊνών Cdt1, Cdt2 και PCNA στην περιοχή της βλάβης 132 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 136 1 Ρύθμιση της πρωτεΐνης Geminin κατά την απόπτωση 137 1.1 Η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται κατά την απόπτωση από την κασπάση-3 137 7

1.2 Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin από την κασπάση-3 ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης από την Casein Kinase II 138 1.3 Ρόλος της κατάτμησης της πρωτεΐνης Geminin 140 2 Ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 σε κύτταρα με βλάβες στο DNA 143 2.1 Πρόκληση εντοπισμένων βλαβών στο DNA ζωντανών κυττάρων με τη χρήση παλμικού laser 143 2.2 Η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης και η συσσώρευση αυτή προηγείται της αποικοδόμησής της 145 2.3 Διαλεύκανση των μοριακών μονοπατιών στόχευσης της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης 145 2.4 Μοριακές αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών Cdt1, PCNA και Cdt2 στην περιοχή της βλάβης 148 2.5 Πιθανός ρόλος της συσσώρευσης της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης 151 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 156 7. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 173 8. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 178 8

1. Εισαγωγή 1.Εισαγωγή 9

1. Εισαγωγή 1.1 Γενικά Τα 10 14 κύτταρα που αποτελούν το σώμα ενός ενήλικα ανθρώπου προέρχονται από ένα μόνο κύτταρο, το γονιμοποιημένο ωάριο, μέσα από μια σειρά κυτταρικών διαιρέσεων. Κατά την πορεία αυτή αλλά και στο ενήλικο άτομο, για τη διατήρηση της ομοιόστασης, απαιτείται η ακριβής ρύθμιση και ο συντονισμός του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Η μελέτη των μηχανισμών που συντονίζουν τις διαδικασίες αυτές σε συνάρτηση με ενδοκυτταρικά και εξωκυτταρικά ερεθίσματα, είναι θεμελιώδης για την κατανόηση της φυσιολογικής λειτουργίας του οργανισμού, αλλά και της διαταραγμένης βιολογικής συμπεριφοράς που παρουσιάζεται σε ασθένειες, όπως ο καρκίνος. 1.2 Κυτταρικός κύκλος - η αδειοδότηση της αντιγραφής Ο διπλασιασμός των χρωμοσωμάτων αποτελεί μια κεντρική διαδικασία του κύκλου ζωής των κυττάρων (κυτταρικός κύκλος). Τα 6 δισεκατομμύρια ζεύγη νουκλεοτιδίων του ανθρωπίνου γονιδιώματος πρέπει να αντιγραφούν με ακρίβεια και μόνο μία φορά πριν από κάθε κυτταρική διαίρεση. Η υψηλή πιστότητα στη διαδικασία του διπλασιασμού και η χωρίς λάθη μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας στις επόμενες γενεές είναι κρίσιμη για την επιβίωση τόσο σε κυτταρικό επίπεδο όσο και στο επίπεδο του οργανισμού. Η αντιγραφή του DNA στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ξεκινά από πολυάριθμες αφετηρίες αντιγραφής, οι οποίες αναγνωρίζονται από ένα εξαμερές σύμπλοκο πρωτεϊνών, το σύμπλοκο αναγνώρισης αφετηριών ORC (Origin Recognition Complex 1-6) (Bell and Dutta, 2002). Το σύμπλοκο ORC το οποίο φέρει ενεργότητα AΤΡάσης, προσελκύει κατά το τέλος της μίτωσης-αρχή της φάσης G1 μια δεύτερη πρωτεΐνη με δράση ΑΤPάσης, την πρωτεΐνη Cdc6 (Bell and Dutta, 2002; Lei and Tye, 2001). Στη συνέχεια, ο παράγοντας αδειοδότησης Cdt1 στρατολογεί στις αφετηρίες της αντιγραφής το εξαμερές σύμπλοκο των πρωτεϊνών MCM2-7. Η δέσμευση του συμπλόκου των MCM πρωτεϊνών στην αφετηρία εξαρτάται από υδρόλυση ATP από την πρωτεΐνη Cdc6 και τις υπομονάδες ORC (Randell et al., 2006) και σηματοδοτεί το σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου και την αδειοδότηση της αφετηρίας για αντιγραφή (licensing). Οι πρωτεΐνες MCM διαθέτουν δράση ελικάσης του DNA. Επακόλουθη έναρξη της αντιγραφής εξαρτάται από την ενεργοποίηση των MCM πρωτεϊνών και 10

1. Εισαγωγή απαιτεί τη δράση δύο ομάδων κινασών: τις κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες CDKs και την κινάση DDK (Dbf4-dependent kinase), (εικόνα 1.1) (Bell and Dutta, 2002). Εικόνα 1.1: Η διαδικασία της αδειοδότησης της αντιγραφής 1.3 Η ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Η έναρξη της αντιγραφής του DNA ρυθμίζεται ώστε να λαμβάνει χώρα μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια του κυταρικού κύκλου και μόνο εφόσον έχει προηγηθεί η μιτωτική διαδικασία. Για την εξασφάλιση της παραπάνω ρύθμισης, το κύτταρο διαθέτει μηχανισμούς που παρεμποδίζουν το σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου μετά την έναρξη της φάσης S, ώστε να αποτρέπεται η επαναδειοδότηση της αντιγραφής. Μετά το πέρας της μιτωτικής διαδικασίας άρεται η αρνητική ρύθμιση στο σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου και οι περιοχές έναρξης της αντιγραφής επαναδειοδοτούνται για αντιγραφή κατά την επόμενη φάση S. Παράλληλοι ρυθμιστικοί μηχανισμοί παρεμποδίζουν την επανασυγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων κατά τη φάση S και G2. Η ακριβής ρύθμιση στηρίζεται σε αλληλοσυμπληρούμενα μονοπάτια που μπορεί να στοχεύουν όλες τις πρωτεΐνες - συστατικά των προαντιγραφικών συμπλόκων: τις πρωτεΐνες Cdt1 και Cdc6, τις πρωτεΐνες ORCs και το σύμπλοκο των MCM2-7 πρωτεϊνών (Blow and Dutta, 2005; Feng and Kipreos, 2003; Machida et al., 2005). Κατά τη διαδικασία αυτή, εξέχοντα ρόλο κατέχουν οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες CDKs και μηχανισμοί πρωτεόλυσης, που εξαρτώνται ή όχι από τις κινάσες αυτές. Η χαμηλή ενεργότητα των κινασών CDKs κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου επιτρέπει την αδειοδότηση της αντιγραφής, ενώ η αύξηση της ενεργότητάς τους κατά την είσοδο στη φάση S επιτρέπει την πυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής, αλλά ταυτόχρονα 11

1. Εισαγωγή παρεμποδίζει την επαναδειοδότηση των ήδη πυροδοτημένων αφετηριών (Porter, 2008; Stern and Nurse, 1996). Η παρεμπόδιση του επανασχηματισμού του προαντιγραφικού συμπλόκου μετά την είσοδο στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, είναι μια συντηρημένη λειτουργία στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Παρ όλα αυτά οι επιμέρους τρόποι στόχευσης των μελών του προαντιγραφικού συμπλόκου διαφέρουν μεταξύ των ευκαρυωτικών οργανισμών και μπορεί να περιλαμβάνουν τη στόχευση για πρωτεόλυση, την αλλαγή του ενδοκυτταρικού εντοπισμού ή την παρουσία αναστολέων που παρεμποδίζουν τον επανασχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου (Kearsey and Cotterill, 2003). Οι παράγοντες αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6 ρυθμίζονται αρνητικά κατά την έναρξη της φάσης S, ώστε να εξασφαλίζεται η μη επαναπρόσδεση των πρωτεϊνών MCM σε αφετηρίες της αντιγραφής που έχουν ήδη πυροδοτηθεί. Στο ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae, η πρωτεΐνη Cdt1 εξάγεται από τον πυρήνα κατά την φάση S του κυτταρικού κύκλου (Tanaka and Diffley, 2002) και στον σχιζοσακχαρομύκητα Schizosaccharomyces pombe και τα μετάζωα η πρωτεΐνη Cdt1 αποικοδομείται με την έναρξη της S φάσης (Blow and Dutta, 2005; Feng and Kipreos, 2003; Machida et al., 2005), (εικόνα 1.2). H πρωτεΐνη Cdc6, στους ζυμομύκητες S. pombe και S. cerevisiae ρυθμίζεται αρνητικά μέσω αποικοδόμησης, ενώ στα μετάζωα η πρωτεΐνη Cdc6 εξάγεται από τον πυρήνα και αποικοδομείται (Blow and Dutta, 2005; Feng and Kipreos, 2003; Kearsey and Cotterill, 2003; Kim et al., 2007; Machida et al., 2005) (εικόνα 1.2). Αν και η πλειονότητα των μηχανισμών που ρυθμίζουν την παρεμπόδιση του επανασχηματισμού του προαντιγραφικού συμπλόκου μετά την πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής ελέγχονται μέσω της ενεργότητας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών CDKs, υπάρχουν και μηχανισμοί αναστολής που δεν εξαρτώνται από τη δράση των κινασών. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη Cdt1 μπορεί να στοχεύεται μετά την έναρξη της φάσης S στα θηλαστικά από δύο παράλληλα μονοπάτια για αποικοδόμηση, από τα οποία το ένα εξαρτάται από την ενεργότητα των CDKs κινασών ενώ το άλλο όχι (βλ. επόμενο κεφάλαιο). Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1, προκαλεί επαναντιγραφή του DNA σε κύτταρα θηλαστικών στα οποία η έκφραση της πρωτεΐνης p53 έχει αποσιωποιηθεί (Vaziri et al., 2003) ή όταν το σημείο ελέγχου στη φάση S του κυττάρου, το οποίο εξαρτάται από την κινάση ATR (Αtaxia Τelangiectasia and Rad3-related), είναι προβληματικό (Liu et al., 2007). Επιπλέον, στα μετάζωα, η δράση της πρωτεΐνης Cdt1 ρυθμίζεται και από την παρουσία του αρνητικού ρυθμιστή της, της πρωτεΐνης Geminin, η οποία προσδένεται 12

1. Εισαγωγή στην πρωτεΐνη αναστέλλοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής (Lygerou and Nurse, 2000; Wohlschlegel et al., 2000), (εικόνα 1.2 και κεφάλαιο 1.5). Απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin στη Drosophila και σε μερικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προκαλεί την επαναντιγραφή του DNA (Kulartz and Knippers, 2004; Melixetian et al., 2004; Mihaylov et al., 2002; Nishitani et al., 2004; Quinn et al., 2001; Zhu et al., 2004). Η επαναδειοδότηση της αντιγραφής παρεμποδίζεται επίσης από την παρουσία της πρωτεΐνης Emi1, η οποία, αναστέλλοντας τη δράση του συμπλόκου προαγωγής της ανάφασης (Anaphase Promoting Complex, APC) κατά τις φάσεις S και G2 του κυτταρικού κύκλου, επιτρέπει στις μιτωτικές κυκλίνες και την πρωτεΐνη Geminin να συσσωρεύονται. Για το λόγο αυτό, αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Emi1 έχει ως αποτέλεσμα την επαναντιγραφή του DNA σε κύτταρα HeLa και στη μη κακοήθη κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων μαστού MCF10A (Machida and Dutta, 2007) (εικόνα 1.2). Εικόνα 1.2: Μηχανισμοί που παρεμποδίζουν την επαναντιγραφή του DNA σε κύτταρα θηλαστικών. Στο κέντρο της εικόνας περιγράφεται το προαντιγραφικό σύμπλοκο ο σχηματισμός του οποίου αποτελεί προϋπόθεση για την έναξη της αντιγραφής. Στην εικόνα παρουσιάζονται τα γνωστά 13

1. Εισαγωγή μονοπάτια που αναστέλλουν το σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου και την επαναντιγραφή του DNA (μαύρες γραμμές) και τα μονοπάτια τα οποία αναστέλλουν το σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπλόκου χωρίς όμως να είναι γνωστό εάν παρεμποδίζουν την επαναντιγραφή του DNA (διακεκομμένες γραμμές). Εικόνα από (Hook et al., 2007) τροποποιημένη. 1.4 Ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 μέσω αποικοδόμησης Η ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 θεωρείται ο κύριος μηχανισμός αποφυγής της επαναδειοδότησης της αντιγραφής κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου στους ανώτερους ευκαρυώτες, ο κύριος δε τρόπος ρύθμισης της πρωτεΐνης Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι μεταμεταφραστικός, μέσω πρωτεόλυσης. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποικοδομείται από το σύστημα λιγάσης ουβικουϊτίνης πρωτεασώματος. Στο μονοπάτι αυτό οι λιγάσες της ουβικουϊτίνης (E3s), δεσμευόμενες σε ειδικά υποστρώματα, καθορίζουν την ειδικότητα της αποικοδόμησης, διευκολύνοντας τη μεταφορά μορίων ουβικουϊτίνης από το ένζυμο σύζευξης της ουβικουϊτίνης (Ε2s) στο υπόστρωμα (Pickart, 2004). Η ομοιοπολική σύνδεση πολλαπλών μορίων ουβικουϊτίνης στο υπόστρωμα επάγει την αποικοδόμηση του υποστρώματος από το 26S πρωτεάσωμα (Pickart and Fushman, 2004). Η πρωτεΐνη Cdt1 στοχεύεται για πρωτεόλυση μετά την έναρξη της S φάσης του κυτταρικού κύκλου από δύο διαφορετικές Ε3 λιγάσες της ουβικουϊτίνης οι οποίες αναγνωρίζουν διαφορετικά μέρη στην αλληλουχία της πρωτεΐνης Cdt1 που περιέχονται στα 100 αμινοξέα του αμινοτελικού της άκρου. Η μία από αυτές είναι το σύμπλοκο SCF που περιέχει την F-box πρωτεΐνη Skp2 (SCF skp2 ) και η δεύτερη είναι η Cul4ADdb1 Cdt2 λιγάση της ουβικουϊτίνης (εικόνες 1.2 και 1.3). Η πρωτεΐνη Cdt1 αναγνωρίζεται από το σύμπλοκο SCF skp2 μετά από φωσφορυλίωση από το σύμπλοκο κυκλίνης Ε/Α-CDK στη θρεονίνη T29 (Liu et al., 2004; Sugimoto et al., 2004) και το Cy μοτίβο στην περιοχή 68RRL της πρωτεΐνης Cdt1 φαίνεται να αποτελεί την περιοχή πρόσδεσης της κυκλίνης-α. Η ουβικουϊτίνωση και η στόχευση για πρωτεόλυση της πρωτεΐνης Cdt1 μέσω του συμπλόκου SCF skp2 λαμβάνει χώρα κατά τις S και G2 φάσεις του κυτταρικού κύκλου (Nishitani et al., 2006). Το δεύτερο σύμπλοκο που ενέχεται στη στόχευση της πρωτεΐνης Cdt1 μετά την έναρξη της S φάσης περιλαμβάνει το σύμπλοκο με δράση λιγάσης της ουβικουϊτίνης Cul4ADdb1 Cdt2 (Higa et al., 2006; Hu and Xiong, 2006; Jin et al., 2006; Nishitani et al., 2006; Senga et al., 2006). Σε πειράματα που χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα από 14

1. Εισαγωγή ωοκύτταρα του αμφιβίου Xenopus laevis, το σύμπλοκο Cul4ADdb1 Cdt2 καταλύει τη ουβικουϊτίνωση της πρωτεΐνης Cdt1 πάνω στη χρωματίνη και απαιτεί αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1 μέσω ενός μοτίβου PIP box (PCNA-Interacting Protein) με την πρωτεΐνη PCNA, στοχεύοντας την πρωτεΐνη Cdt1 για πρωτεόλυση κατά τη διάρκεια της αντιγραφής (εικόνες 1.2 και 1.3) (Arias and Walter, 2006; Jin et al., 2006). Το μοτίβο PIP box (QXRVTDF) εδράζεται στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης Cdt1 και απαιτείται για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1 με την πρωτεΐνη PCNA και στον άνθρωπο (Hu and Xiong, 2006; Jin et al., 2006; Nishitani et al., 2006; Senga et al., 2006). Η ίδια αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών Cdt1 και PCNA απαιτείται και για τη στόχευση της πρωτεΐνης Cdt1 από το ίδιο σύμπλοκο ουβικουϊτίνης σε κύτταρα που φέρουν βλάβες στο DNA, χωρίς όμως να είναι γνωστός ο ακριβής τρόπος με τον οποίο οι πρωτεΐνες αυτές συνεργούν στη στόχευση της πρωτεΐνης Cdt1 (Hu and Xiong, 2006; Jin et al., 2006; Nishitani et al., 2006; Senga et al., 2006). Εικόνα 1.3: Η πρωτεΐνη Cdt1 στοχεύεται για αποικοδόμηση από δύο παράλληλα μονοπάτια που εμπλέκουν τις λιγάσες ουβικουϊτίνης Skp2 (SCF skp2 ) και Cul4ADdb1 Cdt2 αντίστοιχα. Εικόνα από (Kim and Kipreos, 2007) 1.5 H πρωτεΐνη Geminin και ο διττός ρόλος της στην αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής και τη διαφοροποίηση Εκτός από την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Cdt1, οι ανώτεροι ευκαρυωτικοί οργανισμοί διαθέτουν έναν ακόμη τρόπο να ρυθμίζουν αρνητικά την πρωτεΐνη Cdt1, 15

1. Εισαγωγή την παρουσία της πρωτεΐνης Geminin. Η πρωτεΐνη Geminin είναι μια μικρή πρωτεΐνη 25 Kda (209 αμινοξέα στον άνθρωπο), η οποία αναγνωρίστηκε κατά τη διάρκεια σάρωσης για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αποικοδομούνται κατά τη μίτωση στο αμφίβιο Xenopus (McGarry and Kirschner, 1998). Ανοσοχρώση της πρωτεΐνης Geminin σε κύτταρα XL177 του αμφιβίου ανέδειξε πως η πρωτεΐνη αυτή είναι πυρηνική, είναι απούσα από κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G1, όταν σχηματίζεται το προαντιγραφικό σύμπλοκο, συσσωρεύεται στις φάσεις S και G2 του κυτταρικού κύκλου και αποικοδομείται ξανά πριν την επόμενη φάση G1. Η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Geminin λαμβάνει χώρα κατά τη μετάβαση από τη μετάφαση σην ανάφαση της μίτωσης, διαμεσολαβείται από το σύμπλοκο προαγωγής της ανάφασης (APC, Anaphase Promoting Complex) και απαιτεί ένα ειδικό μοτίβο (destruction box) που εδράζεται στο αμινοτελικό άκρο της αλληλουχίας της. Η πρωτεΐνη Geminin δρα αναστέλλοντας τη διαδικασία έναρξης της αντιγραφής κι όχι τη φάση επιμήκυνσης της σύνθεσης του DNA, αναστέλλοντας την πρόσδεση των πρωτεϊνών MCMs στη χρωματίνη. Σε συνδυασμό με αποτελέσματα πειραμάτων που ανέφεραν φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ Geminin και Cdt1 (Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000) προτάθηκε ότι η Geminin αναστέλλει την έναρξη της αντιγραφής αλληλεπιδρώντας αρνητικά με τον Cdt1 (Lygerou and Nurse, 2000). Πράγματι, μελέτες κρυσταλλογραφικής ανάλυσης της δομής του συμπλόκου της πρωτεΐνης Geminin με την πρωτεΐνη Cdt1, ανέδειξαν σημαντικές πληροφορίες για τη φυσική τους σύνδεση και τον πιθανό τρόπο με τον οποίο αναστέλλεται η πρόσδεση των MCMs πρωτεϊνών στη χρωματίνη (Lee et al., 2004). Στα θηλαστικά η Geminin ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου: συσσωρεύεται με την έναρξη της φάσης S και παραμένει μέχρι τη μετάβαση από τη μετάφαση στην ανάφαση, οπότε και γίνεται πρωτεολυτικός στόχος του APC. Η απουσία της Geminin σε συνδυασμό με χαμηλή CDK ενεργότητα στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου ευνοεί τη συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου και επομένως την αδειοδότηση της αντιγραφής. Ορθόλογα γονίδια της Geminin έχουν μελετηθεί στον άνθρωπο (McGarry and Kirschner, 1998), στον ποντικό (McGarry and Kirschner, 1998), στο κοτόπουλο (Luo et al., 2007), στο ψάρι Medaka (Oryzias latipas) (Del Bene et al., 2004), στη Drosophila (Quinn et al., 2001) και στο νηματώδη σκώληκα C. elegans (Yanagi et al., 2005). Η μελέτη της πρωτεΐνης Geminin προσέλκυσε πρόσφατα ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς ανακαλύφθηκαν αρκετές άμεσες αλληλεπιδράσεις της με 16

1. Εισαγωγή πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη διαφοροποίηση, προτείνοντάς τη ως πιθανό κρίκο που συνδέει τις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης (Seo and Kroll, 2006). Στις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούνμε την πρωτεΐνη Geminin συμπεριλαβάνονται, εκτός της πρωτεΐνης Cdt1, οι μεταγραφικοί παράγοντες Hox και Six3 (Del Bene et al., 2004; Luo et al., 2004) και τα μέλη του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης SWI/SNF, Brg1 και Brm (Seo et al., 2005b). Η δομή της πρωτεΐνης Geminin περιέχει μία κεντρική περιοχή coiled-coil (110-141 αμινοξέα στον άνθρωπο) η οποία είναι απαραίτητη για το διμερισμό της, την πρόσδεση στην πρωτεΐνη Cdt1 και την αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής (Saxena et al., 2004), (εικόνα 1.4). Στο αμινοτελικό της βρίσκεται μια αλληλουχία 9 αμινοξέων, RRTLKMIQP (αμινοξέα 23-31 στην ανθρώπινη Geminin), η οποία αποτελεί το ειδικό μοτίβο «αποικοδόμησης» (destruction box) που αναγνωρίζεται από το σύμπλοκο προαγωγής της ανάφασης (APC). Αντίθετα, η περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης Geminin με τις πρωτεΐνες Brg1 και Brm, βρίσκεται στο καρβοξυτελικό της τμήμα (εικόνα 1.4). Τέλος, περιέχει μια περιοχή 50 περίπου αμινοξέων, προς το αμινοτελικό της άκρο, με ρόλο στη δημιουργία του νευρικού δίσκου κατά τα πρώτα στάδια της εμβρυογένεσης στο αμφίβιο Xenopus (δεν παρουσιάζεται στο σχήμα) (Kroll et al., 1998). Εικόνα 1.4: Δομικές και λειτουργικές περιοχές στην πρωτεΐνη Geminin Η πρωτεΐνη Geminin παρουσιάζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Υπερέκφραση της πρωτεΐνης Geminin σε κύτταρα 17

1. Εισαγωγή θηλαστικών προκαλεί την παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 ή τα σηματοδοτεί για απόπτωση (Shreeram et al., 2002; Wohlschlegel et al., 2000; Wohlschlegel et al., 2002), ενώ αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin στη Drosophila προκαλεί μερική επαναντιγραφή του γονιδιώματος και τη δημιουργία γιγάντιων πυρήνων (Mihaylov et al., 2002; Quinn et al., 2001). Ομοίως, αποσιώπηση της έκφρασής της σε φυσιολογικά και καρκινικά ανθρώπινα κύτταρα προκαλεί επαναντιγραφή του DNA στον ίδιο κυτταρικό κύκλο, ενεργοποίηση των κινασών Chk1 και Chk2, και παύση του κυτταρικού κύκλου αποτρέποντας την είσοδο των κυττάρων στη μίτωση (Melixetian et al., 2004; Zhu et al., 2004). Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν πως η πρωτεΐνη Geminin παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας αποτρέποντας την επαναντιγραφή του DNA. Επίσης, η έκφραση της πρωτεΐνης Geminin χαρακτηρίζει τα διαιρούμενα κύτταρα και εμφανίζεται υπερεκφρασμένη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και όγκους, (Karakaidos et al., 2004; Nishitani et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000; Xouri et al., 2004). Εκτός της δράσης της πρωτεΐνης Geminin ως αναστολέα της έναρξης της αντιγραφής, έχει αναφερθεί δράση της Geminin στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος (νευρογένεση). Η πρωτεΐνη Geminin ταυτοποιήθηκε σε μελέτες που σκοπό είχαν την εύρεση γονιδίων τα οποία υπερεκφραζόμενα εκτοπικά σε έμβρυα οδηγούν στην γένεση νευρικού ιστού (Kroll et al., 1998; Quinn et al., 2001). Πρόσφατες μελέτες στο ψάρι Oryzias latipes υπέδειξαν την αλληλεπίδραση της Geminin με τον μεταγραφικό παράγοντα Six3, ο οποίος ενέχεται στη διαφοροποίηση του αμφιβληστροειδούς του ματιού στα σπονδυλωτά (Del Bene et al., 2004). Ο Six3 ανταγωνίζεται την πρωτεΐνη Cdt1 για δέσμευση στην πρωτεΐνη Geminin και οι αλληλεπιδράσεις αυτές πιθανολογείται ότι ρυθμίζουν την ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης κατά την ανάπτυξη του ματιού των σπονδυλωτών (εικόνα 1.5). Παράλληλα πειράματα ανέδειξαν αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Geminin με μέλη της οικογένειας των Hox μεταγραφικών παραγόντων (Luo et al., 2004). Η πρόσδεση αυτή παρεμποδίζει τη δέσμευση των Hox πρωτεϊνών στη χρωματίνη, αναστέλλει την εξαρτώμενη από τη Hox μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων στόχων και εκτοπίζει τον Cdt1 από το σύμπλοκο με τη Geminin, προτείνοντας μια λειτουργία της Gemimin ως ρυθμιστή μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης (εικόνα 1.5). Πρόσφατα πειράματα σε έμβρυα του αμφιβίου Xenopus και P19 κύτταρα ποντικού προτείνουν μια επιπρόσθετη λειτουργία της 18

1. Εισαγωγή πρωτεΐνης Geminin ως αναστολέα της διαφοροποίησης (Seo et al., 2005b). Η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με τις δύο πρωτεΐνες-καταλυτικές υπομονάδες του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης Brg1 και Brm, μέσω του καρβοξυτελικού της τμήματος. Η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Geminin με την πρωτεΐνη Brg1, παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Brg1 με προνευρικές πρωτεΐνες όπως η Neurogenin και η NeuroD (πρωτεΐνες bhlh, basic-helix-loop- Helix), αναστέλλοντας την ενεργοποίηση προνευρικών γονιδίων και την επακόλουθη νευρογένεση (εικόνα 1.5) (Seo et al., 2005b). Η μελέτη αυτή πρότεινε πως η πρωτεΐνη Geminin ενώ προάγει τη νευρογένεση (Kroll et al., 1998), μπορεί να αναστέλλει την πρώιμη νευρική διαφοροποίηση (μέσω της αλληλεπίδρασή της με τις πρωτεΐνες Brg1 και Brm), ρυθμίζοντας έτσι τη μετάβαση από τα διαιρούμενα νευρικά προγονικά κύτταρα σε διαφοροποιημένους νευρώνες. Οι μέχρι τώρα μελέτες οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η χωρική και η χρονική ρύθμιση της ικανότητας της πρωτεΐνης Geminin να αλληλεπιδρά με πολλαπλές πρωτεΐνες είναι εξαιρετικής σημασίας για τη μελλοντική τύχη του κυττάρου. Εικόνα 1.5: Ρόλος της πρωτεΐνης Geminin στη διαφοροποίηση 19

1. Εισαγωγή Α. Σε διαιρούμενα προγονικά νευρικά κύτταρα, τα υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης Geminin μπορούν να αναστέλλουν τις δραστηριότητες των προνευρικών bhlh πρωτεϊνών και των γονιδιακών στόχων του συμπλόκου SWI/SNF, είτε με την απευθείας αναστολή της αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών bhlh και SWI/SNF (επάνω) είτε με την αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο SWI/SNF στις περιοχές στόχους των πρωτεϊνών bhlh και τη στρατολόγηση απο-ακετυλασών των ιστονών (HDACs) ή συγκαταστολέων αποσιωπώντας τη μεταγραφή (κάτω). Β. Μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης Geminin λαμβάνει χώρα κατά τη στιγμή της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο, καθιστώντας ικανό το μεταγραφικό σύμπλοκο των bhlh-swi/snf για την ενεργοποίηση νευροποιητικών γονιδίων στόχων. Γ. Η πρωτεΐνη Geminin μπορεί να προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1 ή τους μεταγραφικούς παράγοντες Six3 και Hox με ανταγωνιστικό τρόπο, είτε παρεμποδίζοντας τη μεταγραφή των γονιδίων που εξαρτάται από τις πρωτεΐνες Hox/Six3 είτε παρεμποδίζοντας την πρόσδεση της πρωτεΐνης Cdt1 στα προαντιγραφικά σύμπλοκα κατά τη G1 φάση. Δ. Η πρωτεΐνη Geminin μπορεί επίσης να ρυθμίζει αρνητικά τη γονιδιακή έκφραση των Hox γονιδίων μέσω της αλληλεπίδρασης με τις Polycomb πρωτεΐνες στους ενισχυτές των Hox γονιδίων. Εικόνα από (Seo and Kroll, 2006) τροποποιημένη. 1.6 Μηχανισμοί επαναντιγραφής του DNA και επιπτώσεις Ο ακριβής τρόπος με τον οποίο λαμβάνει χώρα η επαναντιγραφή του DNA ως αποτέλεσμα της επαναδειοδότησης της αντιγραφής δεν έχει μελετηθεί εις βάθος. Πιστεύεται πως η επαναντιγραφή του DNA συμβαίνει λόγω πυροδότησης των αφετηριών που προηγουμένως είχαν ήδη αντιγραφεί και όχι ως αποτέλεσμα επιπλέον πλήρων κύκλων αντιγραφής του DNA (Blow and Hodgson, 2002). Η επί τόπου επαναντιγραφή του DNA συμβαίνει είτε λόγω υπερέκφρασης των παραγόντων αδειοδότησης, όπως οι πρωτεΐνες Cdt1 και Cdc6, είτε λόγω αποσιώπησης της έκφρασης αναστολέων της διαδικασίας της αδειοδότησης, όπως η πρωτεΐνη Geminin και η πρωτεΐνη Emi1. Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών Cdt1 και Cdc6 προκαλεί επαναντιγραφή των περιοχών που πυροδοτούνται νωρίς στη φάση S, μέσα σε 2-4 ώρες μετά την πρώτη πυροδότηση στην αρχή της S φάσης (Vaziri et al., 2003). Μία από τις πιο σημαντικές επιπτώσεις της επαναντιγραφής του DNA είναι η ενεργοποίηση σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που ενέχονται στην απόκριση σε βλάβες στο DNA (Blow and Dutta, 2005). Η επαναντιγραφή του DNA ενεργοποιεί τις κινάσες σερίνης/θρεονίνης ATM (ataxia-telangiectasia mutated) και ATR (ATM and Rad3-related). Οι κινάσες αυτές φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τις κινάσες Chk1 και Chk2 οι οποίες προκαλούν παύση του κυτταρικού κύκλου κατά τη μετάβαση G2/M. Οι κινάσες Chk1 και Chk2 φωσφορυλιώνουν και απενεργοποιούν την πρωτεΐνη Cdc25C, την πιο σημαντική ενεργοποιητική φωσφατάση του 20

1. Εισαγωγή συμπλόκου Cdk1/κυκλίνης B, προκαλώντας παύση του κυτταρικού κύκλου. Εάν επαχθεί επαναντιγραφή του DNA με ταυτόχρονη απουσία των παραπάνω μελών των σημείων ελέγχου του κυττάρου, προκαλείται αδυναμία παύσης του κυτταρικού κύκλου πριν την είσοδο στη μίτωση, με αποτέλεσμα εκτοπική μίτωση και θάνατο των κυττάρων. Η προκαλούμενη επαναντιγραφή του DNA λόγω αποσιώπησης της έκφραση της πρωτεΐνης Geminin ή υπερέκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1, σε συνδυασμό με την αποσιώπηση πιθανών διαμεσολαβητών των G2/M σημείων ελέγχου, ανέδειξε τις πρωτεΐνες Fanconi Anemia (FA), BRCA1, p53, MRE11/RAD50/NBS1, RPA και Rb ως σημαντικές για την ενεργοποίηση των ρυθμιστικών μηχανισμών απόκρισης στην επαναντιγραφή του DNA (εικόνα 1.6) (Lee et al., 2007; Liu et al., 2007; Tatsumi et al., 2006). Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες ανέδειξαν πως η περίσσεια της πρωτεΐνης Cdt1 σε κυτταρικά εκχυλίσματα ωοκυττάρων του αμφιβίου Xenopus προκαλεί την επαναντιγραφή του DNA, την ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου και την παρουσία μικρών θραυσμάτων δίκλωνου DNA (Davidson et al., 2006). Η εμφάνιση των θραυσμάτων αυτών και η ισχυρή ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου εξαρτώνται από τη μη ελεγχόμενη επαναντιγραφή του DNA και δε λαμβάνουν χώρα μετά από συντονισμένη και πλήρη επαναντιγραφή του DNA. Τα θραύσματα αυτά του δίκλωνου DNA αποτελούνται αποκλειστικά από DNA που έχει επαναντιγραφεί και παρουσιάζουν χαρακτηριστικά που προτείνουν πως προήλθαν από σύγκρουση «κεφαλής με ουρά» διχάλων αντιγραφής που προχωρούν κατά μήκος της ίδιας μήτρας DNA (εικόνα 1.6) (Davidson et al., 2006). Επομένως, η ενεργοποίηση σημείων ελέγχου του κυττάρου και η παύση του κυτταρικού κύκλου στη μετάβαση από τη φάση G2 στην M, παρεμποδίζουν τα κύτταρα στα οποία έχει συμβεί επαναντιγραφή του DNA από την είσοδο σε μια «καταστροφική» μιτωτική διαδικασία. 21

1. Εισαγωγή Εικόνα 1.6: Ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου σε απόκριση στην επαναντιγραφή του DNA Πολλαπλοί κύκλοι αντιγραφής του DNA προκαλούν τη δημιουργία περιοχών με πολλαπλές αντιγραφικές φυσαλίδες (bubbles within bubbles), οι οποίες ενεργοποιούν σηματοδοτικά μονοπάτια εξαρτώμενα από την κινάση ATR. Η σύγκρουση των διχάλων αντιγραφής δημιουργεί διπλές κατατμήσεις στο DNA και προκαλεί την ενεργοποίηση μονοπατιών εξαρτώμενων από την κινάση ATM. Οι πορτοκαλί αστερίσκοι σημαίνουν πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου σε απόκριση στην επαναντιγραφή του DNA. Η ροζ διακεκομμένη γραμμή σημαίνει ένα υποθετικό μονοπάτι. Το 9-1-1 και το MRN σύμπλοκο αποτελούνται από τις Rad9-Rad1-Hus1 και τις Mre11-Rad50-Nbs1 πρωτεΐνες, αντίστοιχα. Εικόνα από (Hook et al., 2007) τροποποιημένη. 22

1. Εισαγωγή 1.7 Επαναντιγραφή του DNA και ογκογένεση Σε πολλούς τύπους κυττάρων θηλαστικών, η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 μπορεί να προκαλέσει επαναντιγραφή του DNA, η οποία μπορεί να αυξηθεί με τη συνεργιστική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdc6. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες Cdt1 ή/και Cdc6 βρίσκονται υπερεκφρασμένες σε όγκους και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (Arentson et al., 2002; Gonzalez et al., 2006; Karakaidos et al., 2004; Tatsumi et al., 2006; Xouri et al., 2004), ενώ NIH3T3 κύτταρα στα οποία υπερεκφράζεται η πρωτεΐνη Cdt1 δημιουργούν όγκους όταν ενίονται σε ανοσοκατασταλμένους μύες (Arentson et al., 2002). Επίσης, διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη Cdt1 σε p53 -/- T λεμφοκύτταρα, αναπτύσσουν λεμφοβλαστικά λεμφώματα του θύμου (Seo et al., 2005a). Παρ όλο που η υπερέκφραση των πρωτεϊνών Cdt1 και Cdc6 στους ανθρώπινους όγκους θα μπορούσε να είναι μια παρενέργεια της αυξημένης ικανότητας για πολλαπλασιασμό, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των πρωτεϊνών Cdt1 και Cdc6 με το δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67 (Gonzalez et al., 2006; Karakaidos et al., 2004). Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν πως η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 μπορεί να προκαλεί τη δημιουργία όγκων λόγω της επαγωγής γονιδιωματικής αστάθειας. Πάνω από το 50% των ανθρώπινων καρκίνων παρουσιάζουν μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53. Η αποσιώπηση της πρωτεΐνης p53 συνεργεί με την υπερέκφραση των πρωτεϊνών Cdt1 και Cdc6 ώστε να δημιουργήσουν γονιδιωματική αστάθεια στον μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Karakaidos et al., 2004). Επιπλέον, κύτταρα θύμου από διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη Cdt1 και δεν εκφράζουν p53 παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα ανευπλοειδίας (Seo et al., 2005a). Η γονιδιωματική αστάθεια που προκαλείται από την υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 δεν εξαρτάται απόλυτα από την απουσία της πρωτεΐνης p53, καθώς φυσιολογικοί ανθρώπινοι ινοβλάστες στους οποίους η πρωτεΐνη p53 είναι άθικτη, η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 προκαλεί υψηλό ποσοστό κυττάρων με ανευπλοειδία (Tatsumi et al., 2006). Ομοίως, πρωτεΐνες που φυσιολογικά ρυθμίζουν αρνητικά την πρωτεΐνη Cdt1, προκαλούν γονιδιωματική αστάθεια όταν αποσιωπούνται, όπως έχει αναφερθεί για τις πρωτεΐνες DDB1 (Lovejoy et al., 2006) και Cdt2 (Jin et al., 2006; Sansam et al., 2006) ή για την πρωτεΐνη Geminin (Kulartz and Knippers, 2004; Melixetian et al., 2004; Mihaylov et al., 2002; Nishitani et al., 2004; Quinn et al., 2001; Zhu et al., 2004). Πρόσφατες μελέτες επίσης ανέδειξαν πως οι πρωτεΐνες Cdt1 και Cdc6 βρίσκονται υπερεκφρασμένες πολύ νωρίς σε περιπτώσεις προκαρκινικών 23

1. Εισαγωγή αλλοιώσεων επιθηλιακών κυττάρων ξεκινώντας από τη φάση της δυσπλασίας μέχρι την πλήρη κακοήθεια (Liontos et al., 2007). Συχνή αιτία για την υπερέκφραση των πρωτεϊνών αυτών ήταν η γονιδιακή ενίσχυση, προτείνοντας πως οι παράγοντες αυτοί μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση per se. Επιπλέον, η προκαλούμενη από την ενίσχυση των παραγόντων αυτών επαναντιγραφή του DNA προκαλεί την ενεργοποίηση της απόκρισης σε βλάβες στο DNA, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τους αντικαρκινικούς φραγμούς της απόπτωσης και της γήρανσης (Liontos et al., 2007). Επομένως, φαίνεται πως η ισορροπία μεταξύ των επιπέδων των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6 και των αρνητικών ρυθμιστών τους είναι κρίσιμη για το εάν θα συμβεί επαναντιγραφή του DNA ή όχι. Υψηλά επίπεδα Cdt1 και Cdc6 ή αποσιώπηση του αρνητικού ρυθμιστή της πρωτεΐνης Cdt1, Geminin, προάγουν επαναντιγραφή του DNA, η οποία συσχετίζεται με προκαλούμενη γονιδιωματική αστάθεια. 24

1. Εισαγωγή 2. Απόκριση του κυττάρου σε βλάβες στο DNA 2.1 Πληθώρα βλαβών στο DNA Η επιβίωση των οργανισμών στηρίζεται στην ακριβή μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας από κάθε κύτταρο στα θυγατρικά του. Κάθε πιστή μεταβίβαση απαιτεί όχι μόνο τη ακρίβεια στην αντιγραφή του DNA και την κατανομή των χρωμοσωμάτων, αλλά επίσης και την ικανότητα της επιδιόρθωσης μετά από αυθόρμητες και επαγόμενες βλάβες του DNA. Όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα αντιμετωπίζουν την πρόκληση της διατήρησης της ακεραιότητας του γονιδιώματός τους παρά τη συνεχή έκθεση σε περιβαλλοντικούς και μεταβολικoύς παράγοντες που προκαλούν βλάβες στο DNA. Η πληθώρα βλαβών που προκύπτουν στο DNA ξεκινούν από τρεις κύριες αιτίες. Πρώτον, περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως για παράδειγμα η υπεριώδης ακτινοβολία (UV), η ιονίζουσα ακτινοβολία και μεγάλος αριθμός γενοτοξικών χημικών προκαλούν μεταβολές στη δομή του DNA, οι οποίες εάν παραμείνουν χωρίς επιδιόρθωση, μπορεί να οδηγήσουν σε μεταλλάξεις που αυξάνουν την πιθανότητα για καρκίνο. Δεύτερον, φυσιολογικά προϊόντα του κυτταρικού μεταβολισμού αποτελούν έναν μόνιμο κίνδυνο ως προς την ακεραιότητα του DNA «από τα έσω». Σε αυτά περιλαμβάνονται τα ενεργά παράγωγα οξυγόνου προερχόμενα από την οξειδωτική αναπνοή και από προϊόντα της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, τα οποία και προκαλούν πάνω από 100 αναγνωρισμένες διαφορετικές τροποποιήσεις στο DNA (Cadet et al., 1997). Τρίτον, κάποιοι χημικοί δεσμοί του DNA αυθορμήτως τείνουν προς διάσπαση κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Η υδρόλυση νουκλεοτιδικών καταλοίπων αφήνουν αβασικές θέσεις, η αυθόρμητη ή η επαγόμενη απαμίνωση της κυτοσίνης, της αδενίνης, της γουανίνης ή της 5-μεθυλο-κυτοσίνης προκαλεί τη μετατροπή των βάσεων αυτών σε λανθασμένα κωδικοποιούμενες ουρακίλη, υποξανθίνη, ξανθίνη και θυμίνη, αντίστοιχα (Lindahl, 1993). Η εικόνα 1.7Α συνοψίζει μερικές από τις πιο κοινές βλάβες που προκαλούνται στο DNA και τις πηγές αυτών. 25

1. Εισαγωγή Εικόνα 1.7: Βλάβες στο DNA, μηχανισμοί επιδιόρθωσης και επιπτώσεις A. Παρουσιάζονται οι συνήθεις παράγοντες που δημιουργούν βλάβες στο DNA (επάνω), παραδείγματα βλαβών στο DNA που δημιουργούνται από τους παραπάνω παράγοντες (μέσον) και οι σχετικοί τρόποι επιδιόρθωσης για την εξάλειψη των βλαβών αυτών (κάτω). Β. Η άμεση αντίδραση στη δημιουργία βλαβών στο DNA είναι η παροδική παύση του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G1, S, G2 και M (επάνω) και αλλαγές στις διαδικασίες μεταβολισμού του DNA (μέσον). Μακροπρόθεσμες επιπτώσεις των βλαβών στο DNA (κάτω) περιλαμβάνουν μόνιμες αλλαγές στην αλληλουχία του DNA (σημειακές μεταλλάξεις σε γονίδια ή χρωμοσωμικές ανωμαλίες ) οι οποίες μπορεί να προκαλούν ασθένειες. Οι συντμήσεις: cis-pt and MMC, cisplatin και mitomycin C, αντίστοιχα (DNA-crosslinking παράγοντες), (6 4)PP and CPD, 6 4 φωτοπροΐόντα και διμερή πυριμιδινών κυκλοβουτανίου, αντίστοιχα (και οι δύο βλάβες επάγονται από UV ακτινοβολία), BER και NER, σύστημα επιδιόρθωσης εκτομής βάσεων και σύστημα επιδιόρθωσης εκτομής νουκλεοτιδίων αντίστοιχα, HR, ομόλογος ανασυνδυασμός, EJ, σύνδεση άκρων. Εικόνα από (Hoeijmakers, 2001) τροποποιημένη. Μετά την πρόκληση βλαβών στο DNA, επάγεται η παύση του κυτταρικού κύκλου με σκοπό να δοθεί επαρκής χρόνος για την επιδιόρθωση των βλαβών. Αν αυτό δεν είναι εφικτό, το κύτταρο ενδέχεται να προχωρήσει παρά τη βλάβη ή να οδηγηθεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο ή σε κυτταρική γήρανση (εικόνα 1.7Β). Πολλές βλάβες επίσης εμποδίζουν τη μεταγραφή, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την απενεργοποίηση κάθε γονιδίου που περιέχει βλάβη στη μεταγραφόμενη αλυσίδα. Η διαδικασία αυτή οφείλεται στην ανάπτυξη ενός «αφοσιωμένου» συστήματος 26

1. Εισαγωγή επιδιόρθωσης το οποίο ονομάζεται «επιδιόρθωση συζευγμένη με τη μεταγραφή» (transcription-coupled repair, TCR), το οποίο εκτοπίζει ή απομακρύνει την ακινητοποιημένη RNA πολυμεράση και εγγυάται υψηλής προτεραιότητας επιδιόρθωση. Οι βλάβες του DNA παρεμβαίνουν επίσης και στην αντιγραφή του. Προσφάτως, ανακαλύφθηκε μια νέα ομάδα DNA πολυμερασών (DNA πολυμεράσες ζ-κ), οι οποίες είναι ειδικά αφοσιωμένες στο να ξεπερνούν το αντιγραφικό στρες που επάγεται από βλάβες στο DNA (Goodman and Tippin, 2000; Kunkel and Bebenek, 2000). Οι ειδικές δηλαδή αυτές πολυμεράσες αναλαμβάνουν προσωρινά την ευθύνη της αντιγραφής του DNA από τις άλλες μπλοκαρισμένες στην περιοχή της βλάβης πολυμεράσες-δ/ε (polδ/ε) και πιθανότατα κι από την πολυμεράση-α (polα), και κατέχοντας πιο ελαστικές ιδιότητες ταιριάσματος βάσεων επιτρέπουν τη σύνθεση του DNA διαμέσου της βλάβης. Ο αριθμός των συγκεκριμένων πολυμερασών υπερβαίνει τον αριθμό των πολυμερασών που κάτω από φυσιολογικές συνθήκες συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA, γεγονός που υποδεικνύει και τη σημαντικότητα της διαδικασίας. Πάντως, η διαδικασία αυτή είναι υπεύθυνη για το μεγαλύτερο ποσοστό των επαγόμενων από βλάβες στο DNA σημειακών μεταλλάξεων (Lawrence, 1994). Παρ όλα αυτά, η λειτουργία αυτών των πολυμερασών προφυλάσσει το γονιδίωμα. Με κάποιο τρόπο, η πρόκληση βλαβών γίνεται αισθητή από τον μηχανισμό του κυτταρικού κύκλου, ο οποίος και σταματά σε συγκεκριμένα σημεία ελέγχου στις G1, S, G2 και Μ φάσεις, επιτρέποντας την επιδιόρθωση των βλαβών, πριν τη μετατροπή τους σε μόνιμες μεταλλάξεις (Zhou and Elledge, 2000). Η ανίχνευση των βλαβών μπορεί να λαμβάνει χώρα από τη διακοπή της μεταγραφής, της αντιγραφής ή από ειδικούς αισθητήρες. Όταν η βλάβη είναι εκτεταμένη, το κύτταρο μπορεί να επιλέξει την απόλυτη λύση της διάσωσης για τον οργανισμό αποπίπτωντας, με τη δαπάνη ενός κυττάρου. 2.2. Ενεργοποίηση σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ως απόκριση στη δημιουργία βλαβών στο DNA Τα σημεία ελέγχου του κυττάρου είναι βιοχημικά σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία ανιχνεύουν τις ποικίλες βλάβες και τις δομικές αλλοιώσεις του DNA και επάγουν μια πολύπλευρη απόκριση, η οποία καθυστερεί την πρόοδο του κυτταρικού 27

1. Εισαγωγή κύκλου και ενεργοποιεί τα συστήματα επιδιόρθωσης (Hartwell and Kastan, 1994; Zhou and Elledge, 2000). Αντανακλώντας τις συγκεκριμένες θέσεις που κατέχουν και τη λειτουργία τους στα συγκεκριμένα μονοπάτια απόκρισης στη βλάβη, οι πρωτεΐνεςμέλη των σημείων ελέγχου των κυττάρων έχουν ταξινομηθεί σε αισθητήρες της βλάβης, σε μεταγωγείς του σήματος και σε τελεστές (Zhou and Elledge, 2000). Τα σημεία ελέγχου του κυττάρου, για να εξασφαλίσουν την πιστή μετάδοση της πληροφορίας του γονιδιώματος και να προάγουν την επιβίωση, πρέπει να εκπληρώνουν κάποια καθήκοντα: πρέπει σε απόκριση στη δημιουργία βλαβών ταχύτατα να επάγουν την παύση του κυτταρικού κύκλου, να βοηθούν στην ενεργοποίηση της επιδιόρθωσης του DNA, να διατηρούν την παύση του κυτταρικού κύκλου μέχρι να ολοκληρωθεί η επιδιόρθωση του DNA και αφού αυτή ολοκληρωθεί να επανακινούν τον κυτταρικό κύκλο. Η βιολογική και η φυσιολογική σημασία της παρουσίας των σημείων ελέγχου του κυττάρου καταδεικνύεται από τη φυλογενετική συντήρησή τους (Zhou and Elledge, 2000), αλλά κι από τις επιπτώσεις όταν τα σημεία ελέγχου αδυνατούν να εκπληρώσουν τα καθήκοντά τους. Μη σωστή λειτουργία των σημείων ελέγχου των κυττάρων οδηγεί στη συσσώρευση μεταλλάξεων και χρωμοσωμικών ανωμαλιών, οι οποίες με τη σειρά τους αυξάνουν την πιθανότητα για αναπτυξιακές δυσμορφίες ή γενετικά σύνδρομα και ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου (Hartwell and Kastan, 1994). Τα σημεία ελέγχου του κυττάρου, ανάλογα με τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία προκαλείται η παύση, μπορούν να διακριθούν σε τρεις κατηγορίες: στο σημείο ελέγχου της φάσης G1, το σημείο ελέγχου της φάσης S, και στο σημείο ελέγχου G2/M. Στη συνέχεια θα αναφερθούμε στα μονοπάτια των σημείων ελέγχου, εστιάζοντας την προσοχή μας στις βασικότερες σηματοδοτικές πρωτεΐνες του κάθε μονοπατιού. 2.2.1 Η ενεργοποίηση σημείων ελέγχου του κυττάρου στη φάση G1 Για μια δεκαετία περίπου η παύση του κυτταρικού που επάγεται από βλάβες στο DNA στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου καταλογίζονταν στον μεταγραφικό παράγοντα και ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 (Bartek and Lukas, 2001b; Hartwell and Kastan, 1994; Vogelstein et al., 2000). Μετά από ποικιλία βλαβών, η πρωτεΐνη p53 τροποποιείται μεταμεταφραστικά, σταθεροποιείται και είναι ικανή να επάγει τη έκφραση γονιδίων που απαιτούνται για την παύση του κυτταρικού κύκλου ή την 28

1. Εισαγωγή εκκίνηση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (Ryan et al., 2001; Vogelstein et al., 2000). Μεταξύ των γονιδίων που επάγονται από την πρωτεΐνη p53 είναι ο αναστολέας της CDK κινάσης p21 Waf1/Cip1, ο οποίος είναι ικανός να αναστέλλει την ενεργοποίηση των κινασών CDKs που απαιτούνται για την είσοδο στη φάση S (Ekholm and Reed, 2000; Sherr and Roberts, 1999). Ωστόσο, ο εξαρτώμενος από τη μεταγραφή και την πρωτεϊνική σύνθεση ρόλος της πρωτεΐνης p53 στο σημείο ελέγχου στη φάση G1, είναι πολύ αργός ώστε να εξηγηθεί η ταχεία αναστολή της κινάσης CDK2, η οποία λαμβάνει χώρα μετά από τη δημιουργία βλαβών στο DNA (Bartek and Lukas, 2001b). Επιπλέον, η αναστολή της ενεργότητας του συμπλόκου κυκλίνης Ε-CDK2 στο τέλος της G1 φάσης συμβαίνει και σε κύτταρα απουσία των πρωτεϊνών p53 και p21 (Costanzo et al., 2000; Falck et al., 2001; Mailand et al., 2000). Τα παραπάνω προτείνουν την παρουσία δύο διαφορετικών αποκρίσεων των σημείων ελέγχου στη G1 φάση. Η αρχική απόκριση ενεργοποιείται ταχύτατα, παροδικά, ανεξάρτητα από την παρουσία της πρωτεΐνης p53, ενώ η δεύτερη πιο καθυστερημένη χρονικά αλλά πιο παρατεταμένη παύση στη G1 φάση περιλαμβάνει τον άξονα δράσης των πρωτεϊνών p53-p21. Σημαντική πειραματική υποστήριξη του παραπάνω μοντέλου προέρχεται από την πρόσφατη ανακάλυψη ενός νέου μονοπατιού που υποστηρίζει την ταχεία αναστολή της κινάσης CDK2 μετά από ποικιλία τυπών βλάβης, όπως θα περιγραφεί πιο κάτω. 2.2.1.1 Ταχεία και ανεξάρτητη από την πρωτεΐνη p53 ενεργοποίηση σημείου ελέγχου του κυττάρου στη φάση G1 Με σκοπό η επαγωγή της παύσης του κυτταρικού στη G1 φάση να είναι αποδοτική και να ενεργοποιείται μέσα σε λίγα μόνο λεπτά από τη δημιουργία βλαβών στο DNA, θα πρέπει να χρησιμοποιεί κάποιο μηχανισμό ο οποίος να δρά ανεξάρτητα από τη διαδικασία της μεταγραφής και της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Πρόσφατες μελέτες προτείνουν πως τέτοια μονοπάτια σημείων ελέγχου των κυττάρων που βρίσκονται στη G1 φάση λειτουργούν στοχεύοντας τη φωσφατάση Cdc25A (Falck et al., 2001; Mailand et al., 2000). Η δράση της φωσφατάσης αυτής ακυρώνει την ανασταλτική φωσφορυλίωση στην κινάση CDK2 και είναι απαραίτητη για τη μετάβαση από τη G1 φάση στην S (Bartek and Lukas, 2001b). Ανεξάρτητα από την κατάσταση της πρωτεΐνης p53, τα επίπεδα και η ενεργότητα της πρωτεΐνης Cdc25A γρήγορα μειώνονται καθώς τα κύτταρα των θηλαστικών εκτίθενται σε υπεριώδη 29