DETERMINATION OF PHARMACEUTICAL RESIDUES IN SURFACE WATERS OF LOUROS RIVER

ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΑ Υ ΑΤΑ ΤΟΥ ΠΟΤΑΜΟΥ ΛΟΥΡΟΥ Χ. Ι. Νάννου, Χ. Ι. Κοσµά, Ι. Β. Ζιώρης, Τ. Α. Αλµπάνης Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων, 45110 Ιωάννινα, Ελλάδα E- mail: chnannou@cc.uoi.gr Η παρουσία φαρµακευτικών ουσιών στο περιβάλλον, αποτελεί έναν από τους κυριότερους παράγοντες ρύπανσης του. Οι ουσίες αυτές µπορεί να προέρχονται τόσο από σκευάσµατα που προορίζονται για χρήση από τον άνθρωπο, όσο και από κτηνιατρικά φάρµακα. Οι βασικοί τρόποι κατάληξής τους στο περιβάλλον, είναι οι απεκκρίσεις και οι εκροές των µονάδων επεξεργασίας υγρών αποβλήτων. Στην παρούσα έρευνα, µελετήθηκε η παρουσία υπολειµµάτων φαρµακευτικών ουσιών σε επιφανειακά ύδατα του ποταµού Λούρου και της Λίµνης Ζηρού, του Νοµού Πρέβαζας, στην Ήπειρο. Οι φαρµακευτικές ουσίες που µελετήθηκαν ήταν τα αναλγητικά/ αντιφλεγµονώδη paracetamol και diclofenac, τα αντιυπερλιπιδαιµικά fenofibrate και bezafibrate, το αντιεπιληπτικό carbamazepine, η caffeine ως ψυχοκινητικός διεγέρτης, το phenazone ως αντιπυρετικό, το αντιδιαβητικό metformin, το αντιβιοτικό sulfamethoazole, και το omeprazole ως ουσία κατά της δυσπεψίας και του πεπτικού έλκους. Η αναλυτική µέθοδος που ακολουθήθηκε περιλαµβάνει τη διαδικασία της προσυγκέντρωσης των υδατικών δειγµάτων µε τη χρήση προσροφητικών εκχύλισης δια της στερεάς φάσης (SPE) και στη συνέχεια ανάλυση µε υγρό χρωµατογράφο-συζευγµένο µε ανιχνευτή µάζας (LC-MS/MS). DETERMINATION OF PHARMACEUTICAL RESIDUES IN SURFACE WATERS OF LOUROS RIVER Ch.I. Nannou, Ch. I. Kosma, I.V. Zioris, T.A. Albanis Chemistry Department, University of Ioannina, 45110 Ioannina, Greece E- mail: chnannou@cc.uoi.gr The presence of pharmaceutical substances in the environment is one of the main factors of pollution. These substances could be derived from both formulations intended for use by humans and for veterinary medicines. They are transferred in aqueous systems by excreta or wastewaters. In this research, the presence of pharmaceuticals in surface waters of Louros River and Ziros Lake (Epirus, Greece) is studied. The pharmaceuticals studied, were the analgesics/anti-inflammatory drugs paracetamol and diclofenac, the antihyperlipidemics fenofibrate and bezafibrate, the antiepileptic carbamazepine, the sychomotor stimulant caffeine, phenazone as an antipyretic, the antidiabetic metformin, the antibiotic sulfamethoxazole, and also omeprazole as a substance against dyspepsia and peptic ulcer. The analytical methodology followed includes the process of pre- concentration of water samples using solid phase extraction (SPE) and then analyzed by liquid chromatography-coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS). 1

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τις τελευταίες δεκαετίες, η αλµατώδης τεχνολογική ανάπτυξη, έχει συµβάλλει στην υποβάθµιση του περιβάλλοντος. Η αλόγιστη χρήση χηµικών ουσιών από τον άνθρωπο, αποτελεί έναν από τους σηµαντικότερους λόγους αυτής της υποβάθµισης. Έχουν γίνει πολλές έρευνες µε σκοπό τον προσδιορισµό των πηγών, την επίδραση και την κατάληξη των ουσιών αυτών στο περιβάλλον. Οι δραστικές φαρµακευτικές ουσίες, τα απορρυπαντικά, τα προϊόντα προσωπικής φροντίδας και οι ενδοκρινικοί διαταράκτες, έχουν προκαλέσει το µεγαλύτερο ενδιαφέρον τη τελευταία δεκαετία. Οι έρευνες έχουν δείξει ότι πολλές από αυτές τις ουσίες δεν αποµακρύνονται ολοκληρωτικά από τις συµβατικές µονάδες επεξεργασίας αποβλήτων και γι αυτό η ύπαρξή τους είναι συχνή στις εκροές. Μέσω των εκροών, γίνεται η µεταφορά αυτών των ουσιών στο περιβάλλον και αυτό έχει ως αποτέλεσµα να προκαλούνται σηµαντικές µεταβολές τόσο στο υδάτινο όσο και στο χερσαίο οικοσύστηµα. Τα φάρµακα είναι χηµικές ουσίες οι οποίες χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία, την πρόληψη ή τη διάγνωση µιας ασθένειας. Επίσης, χρησιµοποιούνται για την αύξηση της σωµατικής και ψυχικής υγείας. Τα φάρµακα µπορεί να καταναλώνονται σε περιπτώσεις περιστασιακών ασθενειών ή σε χρόνιες διαταραχές του οργανισµού. Αποτελούν µια ευρεία οµάδα χηµικών ενώσεων, που συµπεριλαµβάνει πολύπλοκα µόρια µε ποικιλία διαφορετικών χαρακτηριστικών οµάδων, φυσικοχηµικών και βιολογικών. Αναπτύσσονται και χρησιµοποιούνται για συγκεκριµένες βιολογικές δραστηριότητες, χαρακτηρίζονται από την ιοντική τους φύση, ενώ τυπικά τα µοριακά τους βάρη κυµαίνονται µεταξύ 300 έως 1000. Μέχρι τις αρχές της δεκαετίας του 90, δεν είχε γίνει καµία έρευνα για την ύπαρξη φαρµακευτικών ουσιών στο περιβάλλον. Αρχικά προτάθηκε στην Ε.Ε, στις αρχές της δεκαετίας του 90, να γίνει διαχωρισµός µεταξύ των φαρµακευτικών ουσιών µε εξαιρετικά χαµηλή συγκέντρωση στο περιβάλλον που δε θα ήταν επιβλαβείς και των φαρµακευτικών ουσιών που υπήρχαν σε αρκετά µεγάλες συγκεντρώσεις και θα προκαλούσαν καταστροφή στο περιβάλλον. Η δεύτερη κατηγορία φαρµακευτικών ουσιών θα απασχολούσε την ERA.[1] Μία άλλη κατηγορία φαρµάκων, περιλαµβάνει τις φαρµακευτικές ουσίες και τα ενεργά συστατικά των προϊόντων προσωπικής φροντίδας (Pharmaceuticals and Personal Care Products, PPCPs), τα οποία χρησιµοποιούνται σε µεγάλες ποσότητες σε όλο τον κόσµο.[2-8] Οι φαρµακευτικές ουσίες υπάρχουν σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις στα επιφανειακά ύδατα. Η συνήθης αναλυτική διαδικασία προσδιορισµού τους συµπεριλαµβάνει εκχύλιση δια της στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction, SPE) και στη συνέχεια ανάλυση µε αέρια ή υγρή χρωµατογραφία και φασµατογράφο µάζας (Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC- MS, Liquid Chromatography- Mass Spectrometry, LC-MS). Στην παρούσα εργασία, πραγµατοποιήθηκε προσδιορισµός δέκα φαρµακευτικών ουσιών, διαφόρων χηµικών κατηγοριών (Paracetamol, Diclofenac, Caffeine, Carbamazepine, Fenofibrate, Bezafibrate, Phenazone, Metformin hydrochloride, Sulfamethoxazole και Omeprazole). Τα δείγµατα προσυγκεντρώθηκαν µε την εφαρµογή της εκχύλισης δια της στερεάς φάσης, χρησιµοποιώντας δίσκους εκχύλισης SDB-RPS, και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε υγρό χρωµατογράφο LC-MS/MS. Στόχος της εργασίας ήταν η εφαρµογή της προτεινόµενης τεχνικής για γρήγορο και ακριβή προσδιορισµό των υπολειµµάτων των φαρµακευτικών ουσιών καθώς επίσης και η εκτίµηση της ποιότητας των υδάτων όσον αφορά 2

τα επίπεδα συγκεντρώσεων των φαρµακευτικών ουσιών σε επιλεγµένα σηµεία κατά µήκος της ροής του ποταµού. 2. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 2.1 Αντιδραστήρια και υλικά Οι πρότυπες φαρµακευτικές ουσίες προµηθεύτηκαν από τον οίκο Promochem (Wesel, Germany). Οι διαλύτες methanol και acetone προµηθεύτηκαν από τον οίκο Pestiscan (Labscan, Ltd, Dublin, Ireland) και το άνυδρο θειικό νάτριο προµηθεύτηκε από τον οίκο Merck (Darmstadt, Germany). Οι δίσκοι εκχύλισης Empore SDB-RPS (διαµέτρου 47 mm και πάχους 0,5 mm) προµηθεύτηκαν από τον οίκο 3M (Saint Paul, MN, USA). Τα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά των φαρµακευτικών ουσιών που µελετήθηκαν δίνονται στον πίνακα 1. Πίνακας 1. Φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά, δοµές και κατηγορίες φαρµακευτικών ουσιών που µελετήθηκαν Φαρµακευτική ουσία Paracetamol οµή Κατηγορία µη στεροειδές/ αντιφλεγµονώδες Μοριακό Βάρος (g/mol) pk a logk ow 151.17 9.38 0.46 Diclofenac µη στεροειδές/αντιφλεγµονώδες 334.23 4.15 4.51 Fenofibrate αντιυπερλιπιδαι- µικό 360.83 4.46 5.19 Bezafibrate αντιυπερλιπιδαι- µικό 361.82 3.6 4.25 Caffeine ψυχοκινητικός διεγέρτης 194.2 10.4 at 40 C 0.07 Carbamazepine αντιεπιληπτικό 236.26 7 2.47 Phenazone αναλγητικό/ αντιπυρετικό 188.226 1.5 στους 25 C 0.38 3

Metformin hydrochloride αντιδιαβητικό 165.63 12.4-2.64 Sulfamethoxazole αντιβιοτικό 253.279 5.7 0.89 Omeprazole κατά της δυσπεψίας και του πεπτικού έλκους 345.417 4.0 2.23 2.2 Περιγραφή της περιοχής δειγµατοληψιών Ο ποταµός Λούρος βρίσκεται στη Βορειοδυτική Ελλάδα. Πηγάζει από το όρος Τόµαρος, κοντά στην περιοχή του Μαντείου της ωδώνης, του Νοµού Ιωαννίνων. έχεται τροφοδοτικούς παραπόταµους από την περιοχή του χωριού Βαρυάδες του Ν. Ιωαννίνων και εκβάλλει στον Αµβρακικό κόλπο. Έχει συνολικό µήκος 80 km, µέσο πλάτος 12 m, βάθος περίπου 4.5 m, λεκάνη απορροής 925 km 2 (από την οποία το 2.25% είναι καλλιεργήσιµη έκταση), αµελητέο τεκτονικό εύρος και σχετικά χαµηλή ροή. Η ροή του ποταµού ποικίλλει σηµαντικά κατά τη διάρκεια του έτους, κυρίως ανάλογα µε τις εποχιακές βροχοπτώσεις. Η εκτεταµένη άντληση µεγάλων ποσοτήτων νερού από τον ποταµό κυρίως για αρδευτικούς σκοπούς, έχει µειώσει τον µέσο όρο ροή περίπου σε 20 m 3 /sec.τα δέλτα καλύπτουν συνολικά έκταση περίπου 450 km 2. Η συνολική έκταση των λιµνοθαλασσών είναι περίπου 64 km 2. Η περιοχή χαρακτηρίζεται από ποικιλότητα οικοσυστηµάτων. Η δηµιουργία της λίµνης Ζηρού φαίνεται να οφείλεται στην τεκτονοκαρστική δραστηριότητα της περιοχής. Οι γεωλόγοι πιστεύουν ότι η λίµνη αποτελούσε λιµναίο σπήλαιο, αλλά η οροφή κατέρρευσε προ 10.000 ετών περίπου. Ο υδροφόρος ορίζων της λίµνης είναι ο ίδιος µε αυτόν του ποταµού Λούρου, συνεπώς τα δύο υδάτινα συστήµατα επικοινωνούνhttp://el.wikipedia.org/wiki/%ce%9b%ce%af%ce%bc%ce%bd%ce%b7_%ce%96%ce %B7%CF%81%CE%BF%CF%8D - cite_note-7. Οι διαστάσεις της λίµνης είναι περίπου 900µ x 600µ. Το µέγιστο βάθος της λίµνης, βρέθηκε 70 µέτρα ενώ στη βόρεια όχθη το άµεσο βάθος στα βράχια είναι 9 µέτρα. Η νότια όχθη «σβήνει» σταδιακά σε ρηχή αµµουδιά. Η θερµοκρασία του νερού κυµαίνεται τόσο το χειµώνα όσο και το καλοκαίρι από 9,6 ο C 21,2 ο C. 2.3 Σηµεία δειγµατοληψίας Οι σταθµοί δειγµατοληψίας στον ποταµό Λούρο ήταν οι Πηγές, οι Εκβολές, η Γέφυρα Καλογήρου 4Α και 4Β, το Τσοπέλι και το σηµείο που ο ποταµός εκβάλλει στη θάλασσα. Οι δειγµατοληψίες πραγµατοποιήθηκαν τους εξής µήνες: Απρίλιο, Μάιο, Ιούνιο, Ιούλιο και Σεπτέµβριο 2009. Η δειγµατοληψία των επιφανειακών υδάτων γινόταν µε τη συλλογή 2,5 L νερού σε γυάλινες σκουρόχρωµες φιάλες µε πώµα. Κάθε φιάλη ξεπλένονταν τρεις φορές µε το δείγµα πριν να πληρωθεί µε αυτό. Τα δείγµατα φυλάσσονταν στο ψυγείο στους 4 C µέχρι την εκχύλιση. 4

2.4 Εκχύλιση δια της στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction, SPE) Για την ανάλυση δειγµάτων νερού από τον ποταµό Λούρο, χρησιµοποιήθηκαν δίσκοι εκχύλισης SDB-RPS. Για την ανάλυση των επιφανειακών δειγµάτων εξετάσθηκαν 1000 ml δείγµατος για κάθε σηµείο και ηµεροµηνία δειγµατοληψίας. Οι δίσκοι τοποθετήθηκαν σε συσκευή εκχύλισης συνδεδεµένη µε αντλία κενού. Για την ενεργοποίηση του δίσκου SDB-RPS, προστέθηκαν προσεκτικά 10 ml ακετόνης και αφέθηκαν για 5 λεπτά. Μετά από τα 5 λεπτά εφαρµόστηκε κενό µέχρι να στεγνώσει ο δίσκος, και στη συνέχεια προστέθηκαν στάγδην 10 ml µεθανόλης. Στη συνέχεια, και πριν περάσει όλη η ποσότητα της µεθανόλης από το δίσκο, προστέθηκαν 10 ml απεσταγµένου ύδατος. Μετά την αποµάκρυνσή του νερού, υπό εφαρµογή κενού, προστέθηκε το υδατικό δείγµα, το οποίο εκχυλίστηκε µε ρυθµό ροής 10 ml/min. Μετά το τέλος της εκχύλισης, το κενό παρέµεινε προκειµένου να επιτευχθεί αποµάκρυνση του ύδατος από τον δίσκο, και προστέθηκαν επιπλέον 10 ml απεσταγµένου ύδατος προκειµένου να παραληφθεί η τυχόν ποσότητα δείγµατος που παρέµεινε στα τοιχώµατα. Η έκλουση των φαρµακευτικών ουσιών από το δίσκο εκχύλισης πραγµατοποιήθηκε µε 3 10 ml µεθανόλης, η οποία παρέµενε στο δίσκο για 5 λεπτά πριν από κάθε έκλουση. Το εκχύλισµα συλλέχθηκε σε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετηµένο κάτω από το δίσκο εκχύλισης. Στη συνέχεια ακολούθησε ξήρανση του δείγµατος µε Na 2 SO 4, έκπλυση τρεις φορές µε το διαλύτη έκλουσης και συµπύκνωση σε ήπιο ρεύµα αζώτου µέχρι τελικού όγκου 1 ml. Στη συνέχεια ακολούθησε χρωµατογραφική ανάλυση. 2.5 Χρωµατογραφικές συνθήκες To LC µε συζευγµένη φασµατογραφία µάζας (MS/MS) τεχνολογίας τριπλού τετραπόλου που χρησιµοποιήθηκε είναι της εταιρίας THERMO. Το σύστηµα THERMO LC-MS/MS περιλαµβάνει έναν δειγµατολήπτη THERMO ACCELA Autosampler, µια αντλία ACCELA THERMO Pump, το σύστηµα αποδιαλύτωσης (desolvation) που στην συγκεκριµένη περίπτωση είναι θερµαινόµενος διασυνδετής ESI (Electron Spray Ionization) και τέλος το σύστηµα µάζας τεχνολογίας τριπλού τετραπόλου TSQ QUANTUM ACCESS MAX. Οι στήλες που χρησιµοποιούνται είναι όλες C18 καθώς είναι κατάλληλες για την πλειοψηφία των φυτοφαρµάκων και διαθέτουν και την µεγαλύτερη αναλογία C: ετεροάτοµα (19:3). Η κινητή φάση του χρωµατογράφου αποτελείται από MeOH (LC-MS grade) µε 5mΜ Ammonium Formate και H 2 O(LC-MS grade) µε 5mΜ Ammonium Formate. Χρησιµοποιήθηκε σύστηµα βαθµωτής έκλουσης (gradietn elution) µε µίγµα διαλυτών (A) H 2 O και (B) MeOH και ταχύτητα ροής 450 µl/min. Οι αρχικές συνθήκες ήταν 90% (Α)-10% (Β) µέχρι τα 2 min. Στη συνέχεια, από τα 2-7 min η αναλογία γίνεται 40% (Α)-60% (Β) και τελικά καταλήγει από τα 7-14 min σε 10% (Α)-90% (Β) όπου και παραµένει για 6 min. Τέλος, η αναλογία επιστρέφει στις αρχικές συνθήκες όπου και παραµένει για 6 min. 5

Πίνακας 2. Χρόνοι κατακράτησης, ιόντα και ενέργειες διάσπασης των ιόντων που µελετήθηκαν Pharmaceutical Polarity Parent mass Tube Less (V) 1 st MS transition (m/z) CE (ev) 2 nd MS transition (m/z) CE (ev) t r (min) Metformin ESI+ 130.2 84 71.3 22 85.2 15 0.94 Phenazone ESI+ 189.1 81 77.2 35 131.1 20 5.72 Fenofibrate ESI+ 363 112 276.9 17 - - 7.56 Diclofenac ESI- 296.1 84 250 34 214 20 8.38 Omeprazole ESI+ 346.0 87 198.1 12 136.1 35 8.07 Sulfamethoxaz ESI+ 254.2 100 156 16 92.2 29 2.00 ole Carbamazepine ESI+ 237.1 93 194.1 19 192.1 26 7.96 Paracetamol ESI+ 152 102 93.2 23 110.1 16 1.70 Caffeine ESI+ 195.1 96 138.1 19 110.2 24 4.91 Bezafibrate ESI- 362.1 130 316.1 14 139.1 26 7.59 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πραγµατοποιήθηκε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισµός δώδεκα φαρµακευτικών ουσιών µε τη µέθοδο SPE/LC-MS/MS. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της έρευνας στα επιφανειακά νερά, η caffeine και το paracetamol ανιχνεύθηκαν στο 100 % των δειγµάτων. Η υψηλότερη συγκέντρωση που ανιχνεύθηκε ήταν 32 ng/l για την caffeine στο σταθµό «Τσοπέλι» τον Οκτώβριο, ενώ σχεδόν σε όλα τα υπόλοιπα φάρµακα οι συγκεντρώσεις κυµάνθηκαν σε τιµές µικρότερες από το όριο ποσοτικοποίησης. Από τις µέσες τιµές των συγκεντρώσεων παρατηρείται ότι η caffeine κυµάνθηκε στα υψηλότερα επίπεδα (14,5 ng/l), ενώ το phenazone στα χαµηλότερα (0,14 ng/l). Η καφεΐνη είναι συστατικό που χρησιµοποιείται σε πολλά ροφήµατα (καφές, τσάι, ελαφρά ροφήµατα που περιέχουν καφεΐνη) και σε πολλά προϊόντα φαγητού (σοκολάτες, γλυκά και γαλακτοκοµικά) [9]. Η ύπαρξη της καφεΐνης στα αστικά απόβλητα προέρχεται κυρίως από την απευθείας διάθεση ροφηµάτων που περιέχουν αυτή την ουσία. Η καφεΐνη έχει αναφερθεί ότι είναι χηµικά σταθερή και δεν αποµακρύνεται εύκολα από τις ΜΕΥΑ. Λόγω της αυξηµένης κατανάλωσής της, η καφεΐνη ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγµατα σε υψηλές συγκεντρώσεις. 6

Η παρακεταµόλη, την οποία συναντάµε στα αναλγητικά φάρµακα υφίσταται άµεση βιοαποδόµηση στις ΜΕΥΑ και γι αυτό η ύπαρξή της στα φυσικά νερά δεν αναφέρεται συχνά [10]. Λόγω του ότι η παρακεταµόλη καταναλώνεται χωρίς συνταγή γιατρού, έχουν βρεθεί αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις στην εισροή ΜΕΥΑ σε πολλές Ευρωπαϊκές χώρες. Το Phenazone ανιχνεύθηκε στο 2,9 % των δειγµάτων µέση συγκέντρωση 0,14 ng/l. Το θεραπευτικό έλκους Omeprazole, δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν. Πιθανώς λόγο της χαµηλής σταθερότητάς του στις περιβαλλοντικές συνθήκες. Το omeprazole αποδοµείται εύκολα στο περιβάλλον [11]. Σχήµα 2. Χρωµατογράφηµα LC-MS/MS πρότυπου διαλύµατος των επιλεγµένων φαρµακευτικών ουσιών σε συγκέντρωση 500 ppb 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ανάλυση φαρµακευτικών ουσιών µε την εφαρµογή της εκχύλισης δια της στερεάς φάσης και τη χρήση υγρής χρωµατογραφίας LC-MS/MS αποτελεί µια αποτελεσµατική και ταχεία µέθοδο. Η ύπαρξη των φαρµακευτικών ουσιών ήταν σε χαµηλές συγκεντρώσεις σε όλους τους σταθµούς δειγµατοληψίας. Η τύχη και η κατάληξη των φαρµακευτικών ουσιών στο περιβάλλον φαίνεται να αποτελεί σηµαντική απειλή για την υποβάθµιση της ποιότητας των επιφανειακών και υπογείων υδάτων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Κοσµά Χ., 2007. Συστηµατικός έλεγχος υπολειµµάτων φαρµακευτικών ουσιών σε επιφανειακά υδατικά και νοσοκοµειακά απόβλητα, ιζήµατα και ιλύες, Μεταπτυχιακό ίπλωµα Ειδίκευσης, Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων 2. Karl Fent, Anna A. Weston, Daniel Caminada (2006), Ecotoxicology of human pharmaceuticals, Aquatic Toxicology, 76: 122-159. 3. M.D. Hernando, M. Mezcua, A.R. Fernandez-Alba, D. Barcelo (2006), Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wastewater effluents, surface waters and sediments, Talanta, 69: 334-342. 4. Sergei S. Verenitch, Christopher J. Lowe, Asit Mazumder (2006), Determination of acidic drugs and caffeine in municipal wastewaters and receiving waters by gas 7

chromatography ion trap tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1116: 193-203. 5. P. Selimi, N. Bechrakis, D. Lambropoulou and T. Albanis (2006), Occurrence of Pharmaceutical Compounds in Kalamas River Basin (N.W. Greece), 3rd SWIFT- WFD Workshop in collaboration with AQUATERRA, Towards operational monitoring programmes and protocols for implementation of Water Framework Directive. Chemical analysis and data interpretation of priority and emerging pollutants at the river basin 2006, May 15-16 2006 Barcelona, Spain. 6. Niina Lindqvist, Tuula Tuhkanen, Leif Kronberg (2005), Occurrence of acidic pharmaceuticals in raw and treated sewages and in receiving waters, Water Research, 39: 2219-2228. 7. S. Marchese, D. Perret, A. Gentili, R. Curini, F. (2003), Pastori. Determination of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs in Surface Water and Wastewater by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, Chromatographia, 58: 263-269. 8. Tina Kosjek, Ester Heathb, Ales Krbavcic (2005), Determination of non-steroidal anti-inflammatory drug NSAIDs) residues in water samples, Environment International. 9. Martin J. Hilton, Kevin V. Thomas (2003), Determination of selected human pharmaceutical compounds in effluent and surface water samples by high-performance liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1015: 129-141. 10. Gomez M. Jose, Petrovic Mira, Fernandez-Alba R. Amadeo, Barcelo Damia, 2007. Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent wastewaters, Journal of Chromatography A. 11. Calamari Davide, Zuccato Ettore, Castiglioni Sara, Bagnati Renzo, Fanneli Roberto, 2003. Strategic Survey of Therapeutic Drugs in the Rivers Po and Lambro in Northern Italy, Environ. Sci. Technol., Vol. 37, pp 1241-1248. 8