Ενόργανη Ανάλυση Εργαστήριο Φασματοσκοπία Υπερύθρου (Infra Red Spectroscopy, IR) Πέτρος Α. Ταραντίλης 1
Βασικές αρχές 2
H παρούσα άσκηση αποσκοπεί: Στην εισαγωγή στη φασματοσκοπία υπερύθρου (Infrared, IR) και ειδικότερα με την τεχνική μετασχηματισμού Fourier (FT-IR). Στην εξοικείωση με: την Οργανολογία του Φασματοφωτομέτρου IR τις Τεχνικές Λήψης Φάσματος την Επεξεργασία των φασμάτων FT-IR την Ερμηνεία των Φασμάτων, Ταυτοποίηση, Ποιοτικό Ανάλυση με FT-IR τον Ποσοτικό Προσδιορισμό 3
Τρόποι δόνησης Οι απορροφήσεις στο IR προέρχονται από δύο βασικές τάξεις δονήσεων: α) Δονήσεις τάσης (stretching vibrations). β) Δονήσεις κάμψης (bending vibrations). 4
Τρόποι δόνησης π.χ. 1,0 1239 C-O (O-C=O) C=O 1764 Οξικός αιθυλεστέρας Absorbance C-H 2991 C-H 1378 C-O (R-O-C=O) 1054 0,0 4000 Wavenumbers (cm -1 ) 400 5
Οργανολογία Φασματοφωτομέτρου IR Στην περιοχή από 4000-400 cm -1 που συνήθως χρησιμοποιείται στο IR η ευαισθησία του φασματοφωτομέτρου είναι περιορισμένη και οι εντάσεις των απορροφήσεων πολύ μικρές, με αποτέλεσμα ο "θόρυβος" να σκεπάζει τις ταινίες απορρόφησης. Η αδυναμία αυτή των κοινών φασματοφωτομέτρων υπερνικήθηκε με την φασματοσκοπία IR με Μετασχηματισμό κατά Fourier (Fourier Transform Infra Red spectroscopy, FT-IR). 6
Οργανολογία Φασματοφωτομέτρου IR 7
Οργανολογία Φασματοφωτομέτρου IR Πηγή ακτινοβολίας: Λυχνία νικελίου χρωμίου (Nicrome) Πηγή Laser: Διέγερση ατόμων ηλίου και νέου (HeNe) Συμβολόμετρο Michelson: Διαχωριστής δέσμης από KBr, Kινητό και Ακίνητο κάτοπτρο Ανιχνευτής: Δευτεριωμένη θειϊκή τριγλυκίνη (Deuterated TriGlycine Sulfate, DTGS) 8
Οργανολογία Φασματοφωτομέτρου IR Σ υ μ β ο λ ό μ ε τ ρ ο M i c h e l s o n Α κ ί ν η τ ο κ ά τ ο π τ ρ ο ( M r ) Π η γ ή l a s e r Υ π ο λ ο γ ι σ τ ή ς κ α ι λ ο γ ι σ μ ι κ ό O M N I C Π α ρ α β ο λ ι κ ό κ ά τ ο π τ ρ ο D T G S α ν ι χ ν ε υ τ ή ς Κ ι ν ο ύ μ ε ν ο κ ά τ ο π τ ρ ο ( M m ) Δ ια χ ω ρ ι σ τ ή ς B ) D S Κ ά τ ο π τ ρ ο ε σ τ ί α σ η ς Χ ώ ρ ο ς δ ε ί γ μ α τ ο ς Κ ά τ ο π τ ρ ο Σχηματικό διάγραμμα φασματοφωτομέτρου FT-IR Ο π ή Π η γ ή υ π ε ρ ύ θ ρ ο υ 9
Οργανολογία Φασματοφωτομέτρου IR Σχηματικό διάγραμμα συμβολομέτρου 10
Χαρακτηριστικές παράμετροι 1. Διαχωριστική ικανότητα (Resolution) 2. Λόγος σήματος προς θόρυβο (Signal-to-Noise Ratio, RSN). 11
1. Διαχωριστική ικανότητα (Resolution) Πλεονεκτήματα μειονεκτήματα μιας μεγάλης διαχωριστικής ικανότητας. Πλεονεκτήματα Μεγαλύτερη ανάλυση κορυφών Οξύτερες κορυφές Μειονεκτήματα Μεγαλύτερος θόρυβος Αυξάνει ο χρόνος λήψης του φάσματος Η διαχωριστική ικανότητα εξαρτάται από τη χρονική καθυστέρηση δηλαδή από το πόσο μεγάλες είναι οι αποστάσεις που διανύει το κινητό κάτοπτρο από τη θέση ZPD (Zero Path Difference). Όσο αυξάνει η χρονική καθυστέρηση τόσο περισσότερο διακριτές είναι οι συχνότητες στο συμβολόγραμμα. 12
2. Λόγος σήματος προς θόρυβο (Signal-to-Noise Ratio, RSN). Ως «θόρυβος» εννοούνται όλα εκείνα τα σήματα τα οποία καταγράφονται και δεν ανταποκρίνονται σε πραγματικές απορροφήσεις του δείγματος αλλά σε άλλους λόγους. Για να αξιολογηθούν τα σήματα χρησιμοποιείται ο όρος «λόγος σήματος προς θόρυβο». Οι κυριότερες αιτίες που δημιουργούν θόρυβο οφείλονται: α) στην κατάσταση του δείγματος, το οποίο όταν είναι σε στερεά κατάσταση ή δεν έχει διαλυθεί πλήρως στο διαλύτη διαχέει μέρος της προσπίπτουσας σε αυτό ακτινοβολίας, β) στην πηγή, γ) στο συμβολόμετρο, δ) στον ανιχνευτή, ε) στην ψηφιοποίηση του αναλογικού σήματος (αποδισμός), στ) στην υψηλή διαχωριστική ικανότητα που έχει ζητηθεί ζ) σε διάφορους θορύβους ηλεκτρονικής ή τυχαίας φύσης. 13
Τεχνικές Λήψης Φάσματος Α. Κλασικές τεχνικές (διαπερατότητας) 1. Υγρά δείγματα: μεταξύ διαφανών πλακιδίων ή/και σε κυψελίδες NaCl, KΒr, ZnSe 2. Στερεά δείγματα: α) Σε μορφή διαλύματος σε κυψελίδες 3. Αέρια δείγματα: σε κυψελίδες β) Σε μορφή δισκίων με KBr Β. Σύγχρονες τεχνικές (ανάκλασης) 1. Τεχνική της διάχυτης ανάκλασης (Diffuse Reflectance Infra- Red Fourier Transform spectroscopy DRIFTS) 2. Τεχνική της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (Attenuated Total Reflectance spectroscopy, ATR) 14
Τεχνικές Λήψης Φάσματος Πλακίδια ZnSe 15
Τεχνικές Λήψης Φάσματος (διαπερατότητας) Kυψελίδα διαλυμάτων 16
Τεχνικές Λήψης Φάσματος (διαπερατότητας) Μήτρα και πιεστήριο για την παρασκευή δισκίων με KBr 17
Τεχνικές Λήψης Φάσματος (διαπερατότητας) Kυψελίδα αερίων Δείγματα πλαστικών 18
Τεχνικές Λήψης Φάσματος (ανάκλασης) Τεχνική της διάχυτης ανάκλασης (Diffuse Reflectance Infra-Red Fourier Transform spectroscopy, DRIFTS) Εξάρτημα με υποδοχέα δείγματος για τη λήψη φασμάτων υπερύθρου με την τεχνική DRIFTS 19
Τεχνικές Λήψης Φάσματος (ανάκλασης) Τεχνική της διάχυτης ανάκλασης (Diffuse Reflectance Infra-Red Fourier Transform spectroscopy, DRIFTS) Μ=Κάτοπτρο M 4 M 3 S = Προσαρμοζόμενο ύψος Δέσμη προς ανιχνευτή M 6 S M 1 Μεγάλος υποδοχέας Μικρός υποδοχέας Δέσμη από συμβολόμετρο M 5 M 2 Εξάρτημα με υποδοχέα δείγματος για τη λήψη φασμάτων υπερύθρου με την τεχνική DRIFTS 20
Τεχνικές Λήψης Φάσματος (ανάκλασης) Τεχνική της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (Attenuated Total Reflectance spectroscopy, ATR) Εξάρτημα με υποδοχέα δείγματος για τη λήψη φασμάτων υπερύθρου με την τεχνική ΑTR 21
Τεχνικές Λήψης Φάσματος (ανάκλασης) Τεχνική της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (Attenuated Total Reflectance spectroscopy, ATR) Δείγμα Κρύσταλλος ZnSe Δέσμη προς τον ανιχνευτή Κάτοπτρο M 2 Κάτοπτρο M 1 Δέσμη από το συμβολόμετρο Εξάρτημα με υποδοχέα δείγματος για τη λήψη φασμάτων υπερύθρου με την τεχνική ΑTR 22
Τεχνικές Λήψης Φάσματος Κλασικές τεχνικές (διαπερατότητας) Πλεονεκτήματα Το σύνολο της υπέρυθρης ακτινοβολίας προσπίπτει στο δείγμα. Μειονεκτήματα Η οπτική διαδρομή είναι μικρή. Έτσι οι πληροφορίες προέρχονται μόνον από το τμήμα του δείγματος στο οποίο προσπίπτει η υπέρυθρη ακτινοβολία. Με δεδομένο ότι τουλάχιστον τα στερεά μίγματα δεν είναι απόλυτα ομογενή, υπάρχει ο κίνδυνος το φάσμα να μην είναι αντιπροσωπευτικό. Για το λόγο αυτό πρέπει να λαμβάνονται φάσματα από 3 τουλάχιστον δισκία του ίδιου δείγματος. 23
Τεχνικές Λήψης Φάσματος Τεχνική της διάχυτης ανάκλασης (Diffuse Reflectance Infra-Red Fourier Transform spectroscopy, DRIFTS) Πλεονεκτήματα 1. Η οπτική διαδρομή είναι μεγάλη και με τις διαδοχικές ανακλάσεις της απορροφητικά ανακλώμενης υπέρυθρης ακτινοβολίας, οι πληροφορίες προέρχονται από μεγάλο τμήμα του δείγματος. 2. Είναι πολύ σύντομη Μειονεκτήματα Σύγχρονες τεχνικές (ανάκλασης) 1. Στο δείγμα προσπίπτει μέρος της υπέρυθρης ακτινοβολίας και επομένως η ένταση των κορυφών είναι σχετικά μικρή. 2. Οι κορυφές είναι σχετικά πλατειές. 24
Τεχνικές Λήψης Φάσματος Πλεονεκτήματα Τεχνική της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (Attenuated Total Reflectance spectroscopy, ATR) 1. Η οπτική διαδρομή είναι μεγάλη και με τις διαδοχικές ανακλάσεις της απορροφητικά ανακλώμενης υπέρυθρης ακτινοβολίας, οι πληροφορίες προέρχονται από μεγάλο τμήμα του δείγματος. 2. Είναι πολύ σύντομη Μειονεκτήματα Σύγχρονες τεχνικές (ανάκλασης) 1. Επειδή το μήκος της οπτικής διαδρομής είναι πολύ μεγάλο και οι διαδοχικές ανακλάσεις πολλές, μέρος τελικά της υπέρυθρης ακτινοβολίας προσπίπτει σε όλο το δείγμα και επομένως η ένταση των κορυφών είναι σχετικά μικρή. 2. Ο θόρυβος, κυρίως στα διαλύματα, είναι μεγάλος. 25
Επεξεργασία των φασμάτων FT-IR α) Εξομάλυνση του σήματος. β) Διόρθωση της βασικής γραμμής. 26
Επεξεργασία των φασμάτων FT-IR α) Εξομάλυνση του σήματος. 27
Επεξεργασία των φασμάτων FT-IR β) Διόρθωση της βασικής γραμμής. 28
Ταυτοποίηση με FT-IR - Ερμηνεία Φασμάτων Σ ένα υπέρυθρο φάσμα διακρίνονται δύο περιοχές: Α) των χαρακτηριστικών ομάδων (4.000 1.500 cm -1 ) και Β) των δακτυλικών αποτυπωμάτων (1.500-600 cm -1 ) Για την αναγνώριση και απόδοση των κορυφών ενός φάσματος υπάρχει η δυνατότητα αναφοράς σε πίνακες που περιέχουν τις διάφορες χαρακτηριστικές ομάδες με τους αντίστοιχους κυματαριθμούς 29
Ταυτοποίηση με FT-IR συστατικών του φυτού Crocus sativus L. -ΟΗ C-Η C=O C-O C-O Κροκίνες CH 3 CH 3 O R 1 O OR 2 C-Η C=O C-O C-O O CH 3 CH 3 R1, R2 =β-d-γεντιοβιοζυλ ή β-d-γλυκοζυλ Διμέθυλοκροκετίνη CH 3 CH 3 O H 3 CO OCH 3 C-Η -ΟΗ C=O C-O O HO CH 3 CH 3 Κροκετίνη CH 3 CH 3 O OH O CH 3 CH 3 30
Ποιοτική Ανάλυση με FT-IR Σύγκριση φάσματος άγνωστης ένωσης με βάση δεδομένων φασμάτων γνωστών ενώσεων 31
Ποσοτική Ανάλυση με FT-IR Ποσοτικός προσδιορισμός της λιγνίνης απευθείας στο ξύλο με την τεχνική DRIFTS CH 2 OH CH HC CH 2 OH CH HC CH 2 OH CH HC OH (1) OCH 3 H 3 CO OCH 3 OH OH (2) (3) OCH 3 OH (4) (1) κωνιφερυλική αλκοόλη, (2) σινναπυλική αλκοόλη, (3) γουαϊκόλη, (4) π-κουμαρυλική αλκοόλη 32
Ποσοτική Ανάλυση με FT-IR Ποσοτικός προσδιορισμός της λιγνίνης απευθείας στο ξύλο με την τεχνική DRIFTS Λιγνίνη της Cuba 108 0.5 1730 1598 1506 0.5 Φλοιός της Cuba 108 1739 1630 1506 7,0 6,0 Απορρόφηση 0.5 Ξύλο της Cuba 108 1742 1632 1598 1506 E1506 5,0 4,0 3,0 2,0 1.0 0.5 Ψίχα της Cuba 108 1743 1632 1598 1506 1,0 0,0 0 10 20 30 40 0.0 Λιγνίνη (%) 1900 1500 Κυματαριθμοί (cm -1 ) 1100 Ξύλο 20,5 20,6 %, Ψίχα 14,9 15,333 % Φλοιός 10,4 10,8 %
Συμπεράσματα H Φασματοσκοπία Υπερύθρου βοηθά στην 1. Ποιοτική και 2. Ποσοτική Ανάλυση 3. Είναι ταχύτατη τεχνική 4. Μπορεί να εφαρμοστεί χωρίς προηγούμενη κατεργασία του δείγματος 5. Δεν καταστρέφει τα δείγματα 34
Άσκηση 6η: Πρακτική εφαρμογή Προσδιορισμός λειτουργικών ομάδων - ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων με χρήση τη υπέρυθρης φασματοσκοπίας (Infra Red Spectroscopy, IR) Σκοπός Να αναγνωριστούν σε ένα φάσμα IR οι χαρακτηριστικές κορυφές των λειτουργικών ομάδων και να γίνει ταυτοποίηση μιας άγνωστης οργανικής ένωσης. Θεωρία Το φάσμα IR μιας οργανικής ένωσης αποτελεί το δακτυλικό αποτύπωμά της. Κάθε κορυφή στο φάσμα αποδίδεται σε χαρακτηριστική λειτουργική ομάδα. Καταγράφοντας τα φάσματα γνωστών χημικών ενώσεων μπορούμε να δημιουργήσουμε μια βιβλιοθήκη φασμάτων (library) με τη βοήθεια του λογισμικού του συνοδεύει το φασματόμετρο. Συγκρίνοντας το φάσμα μιας άγνωστης οργανικής ένωσης, ως προς την ομοιότητά του, με τα φάσματα επιλεγμένης βιβλιοθήκης, βρίσκετε με ποιο φάσμα παρουσιάζει το υψηλότερο ποσοστό ομοιότητας. 35
Άσκηση 6η: Πρακτική εφαρμογή Προσδιορισμός λειτουργικών ομάδων - ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων με χρήση τη υπέρυθρης φασματοσκοπίας (Infra Red Spectroscopy, IR) Συσκευές: Φασματόμετρο υπερύθρου με μετασχηματισμό κατά Fourier (Fourier Transform Infra Red spectroscopy, FT-IR) Thermo Nicolet 6700 και εξαρτήματα για την εφαρμογή της τεχνικής της διάχυτης ανάκλασης (Diffuse Reflectance Infra-Red Fourier Transform Spectroscopy DRIFTS) Χημικά: Βρωμιούχο κάλιο (KBr) Δείγμα για ανάλυση Διαδικασία Μέρος 1: Ανάλυση άγνωστου δείγματος Καταγράψατε το φάσμα IR του άγνωστου δείγματος, με την τεχνική DRIFTS. Προσδιορίστε τις θέσεις των κορυφών (τους κυματαριθμούς/cm -1 ) στο φάσμα. Μέρος 2: Ταυτοποίηση του άγνωστου δείγματος Χρησιμοποιώντας το λογισμικό του φασματόμετρου συγκρίνατε το φάσμα του άγνωστου δείγματος με τα φάσματα των βιβλιοθηκών που συνοδεύουν το φασματόμετρο βρείτε με ποιο ομοιάζει περισσότερο. 36
Άσκηση 6η: Πρακτική εφαρμογή Προσδιορισμός λειτουργικών ομάδων - ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων με χρήση τη υπέρυθρης φασματοσκοπίας (Infra Red Spectroscopy, IR) Απόδοση κορυφών, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία Αποτελέσματα - Συζήτηση - Συμπεράσματα Κυματαριθμοί (cm -1 ) Απόδοση Βιβλιογραφία 1746-1739 Τάση του C=O της εστερομάδας. Filip et al. 2001 1712-1708 Τάση του C=O του καρβοξυλίου. Tsai et al. 1990 1669-1649 Αμίδιο Ι (τάση των CO και CN, κάμψη NH) Xiangliang et al. 2005 1. Δημιουργείστε ένα πίνακα με τους κυματαριθμούς στους οποίους παρατηρούνται κορυφές στο φάσμα και αποδώστε τις σε χαρακτηριστικές ομάδες. 2. Η χρησιμοποιώντας τις πληροφορίες του πίνακα και τα αποτελέσματα της σύγκρισης του φάσματος του αγνώστου δείγματος με τα φάσματα των βιβλιοθηκών προσδιορίστε το άγνωστο δείγμα. 3. Σχολιάστε την απάντηση σας. 1550-1541 Αμίδιο ΙΙ (κάμψη ΝΗ, τάση CN) Kos et al. 2003 Κάμψη των -CH 2 - (λιπίδια) Erukhimovitch et al. 2005, 1460-1440 Ασύμμετρη κάμψη των τερματικών -CH 3 των αιθυλομάδων των πρωτεϊνών Filip et al. 2001 1416-1399 Συμμετρική τάση του C=O του COO - (λιπίδια) Erukhimovitch et al. 2005 1386-1377 C-H κάμψη του -CH 2, τάση του -CH 3 (λιπαρά οξέα) Erukhimovitch et al. 2005, Filip et al. 2001 1352-1341 Παραμόρφωση του CO-NH Paulino et al. 2005 1332-1300 Αμίδιο ΙΙΙ (κάμψη της ΝΗ και τάση -CN) Naumann et al. 2005 1256-1196 Αντισυμμετρική τάση της ΡΟ - 2 των φωσφολιπιδίων Erukhimovitch et al. 2005, Kamnev et al. 1999 1160-1143 Τάση του CO Duarte et al. 2002 1087-1076 Συμμετρική τάση της ΡΟ - 2 των φωσφολιπιδίων, τάση του Duarte et al. 2002, CO Erukhimovitch et al. 2005 Αλληλοεπικαλυπτόμενες κορυφές που οφείλονται στη Erukhimovitch et al. 2005, 1057-1044 τάση και κάμψη των ομάδων -CH 2 OH και C-O-C των σακχάρων Xiangliang et al. 2005 Τάση των CO, COH, COC CH 2 OH, Duarte et al. 2002, 1032-1022 P-O-C Kos et al. 2003, Ασύμμετρη τάση του CN (λιπίδια), τάση των P-O-C, P-O-P Filip et al. 2001, Kamnev et al. 998-929 (φωσφολιπίδια) 1999 Τάση της C-N-C, παραμόρφωση της 891-850 C-H Paulino et al. 2005 37