Ενόργανη Ανάλυση Εργαστήριο. Πέτρος Α. Ταραντίλης Χρήστος Παππάς

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Ενόργανη Ανάλυση Εργαστήριο. Πέτρος Α. Ταραντίλης Χρήστος Παππάς"

Ê Αλεξάκης
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Ενόργανη Ανάλυση Εργαστήριο Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Πέτρος Α. Ταραντίλης Χρήστος Παππάς

2 Υγρή χρωματογραφία: Στατική φάση: στερεό πορώδες υλικό ή υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα, Κινητή φάση: υγρό. 2

3 Χρωματογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) Κλασική Χρωματογραφία 3

4 Η υγρή χρωματογραφία στήλης διακρίνεται σε: κλασική όταν η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης μέσα από τη στατική φάση πετυχαίνεται λόγω της βαρύτητας, όταν η στατική φάση αποτελείται από σχετικά μεγάλης διαμέτρου σωματίδια, υψηλής απόδοσης όταν η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης μέσα από τη στατική φάση πετυχαίνεται με τη χρησιμοποίηση αντλιών υψηλής πίεσης, όταν η στατική φάση αποτελείται από πολύ μικρής διαμέτρου, και επομένως μεγάλης αντιστάσεως, σωματίδια υψηλής διαχωριστικής απόδοσης (υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ή High Chromatography, HPLC). 4

5 Κινητή Φάση Διαλύτης Αντλία Εισαγωγέας δείγματος Στήλη Ανιχνευτής H/Y Εισαγωγέας δείγματος Στήλη Ανιχνευτής Καταγραφικό Αντλία H/Y Κινητή Φάση Διαλύτης Χρωματογράφημα 5

6 Οργανολογία 1. Δοχείο κινητής φάσης - Διαλύτης 2. Αντλία 3. Σύστημα εισαγωγής δείγματος 4. Στήλη 5. Ανιχνευτής 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής

7 Οργανολογία 1. Δοχείο κινητής φάσης - Διαλύτης 1. Δοχείο ή δοχεία από γυαλί 500 ml. 2. Σωληνάκι με ειδικό φίλτρο (2μm) 3. Διαλύτες υψηλής καθαρότητας (HPLC grade) και να έχουν απαερωθεί (degassed). 7

8 Οργανολογία 2. Αντλία υψηλή πίεση ( psi) σταθερότητα στην ταχύτητα ροής (παροχή) Μια αντλία: ισοκρατική έκλουση (isocratic elution), η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση Σύστημα αντλιών: βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution), η σύσταση της κινητής φάσης μεταβάλλεται βαθμιαία

9 Οργανολογία 3. Σύστημα εισαγωγής δείγματος Χειροκίνητο Αυτόματο Σύριγγα Βαλβίδα εισαγωγής Χωρητικότητα: μl 9

10 Οργανολογία 3. Σύστημα εισαγωγής δείγματος Χειροκίνητο Αυτόματο Δοχεία διαλυτών Αυτόματος δειγματολήπτης Auto sampler Απαερωτής διαλυτών Solvent Degasser Βαλβίδα παράκαμψης διαλύτη στη στήλη Column Bypass Valve Αντλία Pump Στήλες Column Compartment Ανιχνευτής UV-Vis (DAD) 10

11 Οργανολογία 4. Στήλη Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Υλικό κατασκευής: ανοξείδωτος χάλυβας. Πάχος τοιχωμάτων: 2-3 mm Μήκος: cm Διάμετρος: 2-10 mm Διάμετρος κόκκων πληρωτικού υλικού: 3-10 μm, Μικρή διάμετρος κόκκων => Μικρό Υ.Ι.Θ.Π. Μεγάλος αριθμός Θ.Π. καλούς ταχύτατους διαχωρισμούς με στήλες μικρού μήκους 11

12 Οργανολογία 4. Στήλη Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Υλικό πλήρωσης: Υλικό στήριξης-αδρανές υλικό α) πορώδες, με βάση την πυριτική γη (silica), β) μη πορώδες (pellicular), γ) σκληρή πηκτή, με βάση το πολυστορόλιο. Υγρή στατική φάση Επικαλύπτει το αδρανές υλικό: α) φυσικά β) χημικά, δεσμευμένη στατική φάση (bonded stationary phase) Σωματίδιο - SiOH + (CH 3 CH 2 O) 3 SiR -CH 3 CH 2 OH Σωματίδιο -SiO - Si(OCH 2 CH 3 ) 2 - R R: (CH 2 ) 3 NH 2 ή (CH 2 ) 3 CN πολική φάση R: (CH 2 ) 17 CH 3 (C 18 ) ή (CH 2 ) 2 -C 6 H 5 (C 8 ) μη πολική φάση 12

13 Οργανολογία 4. Στήλη Η HPLC ανάλογα με την πολικότητα της στατικής - κινητής φάσης διακρίνεται σε: α) κανονικής φάσης (normal phase) υγρή στατική φάση: πολική κινητή φάση: μη πολική Διαχωρισμό: πολικών β) ανεστραμμένης φάσης (reversed phase) υγρή στατική φάση: μη πολική κινητή φάση: πολική Διαχωρισμό: μη πολικών ουσιών 13

14 Οργανολογία 4. Στήλη Χαρακτηριστικά συστήματα στατικής - κινητής φάσης Στατική φάση Κινητή φάση α. LLC κανονικής φάσης διμέθυλο σουλφοξείδιο ισοοκτάνιο αιθυλενοδιαμίνη εξάνιο νιτρομεθάνιο CCl 4 / εξάνιο νερό/αιθυλενογλυκόλη εξάνιο/ccl 4 β. LLC ανεστραμμένης φάσης κυανο αιθυλ-σιλικόνη MeOH-H 2 O διμεθυλοπολυσιλοξάνιο MeCN-H 2 O πολυμερείς H/C MeOH-H 2 O 14

15 Οργανολογία 5. Ανιχνευτής α) Φωτομέτρο UV-Vis 1) σταθερού μήκους κύματος 2) πολλαπλών σταθερών μηκών κύματος 3) μεταβαλλόμενου μήκους κύματος Diode Array Detector, DAD β) Διαφορικό διαθλασίμετρο γ) Φθορισμόμετρο δ) Ηλεκτροχημικός (αμπερομετρικός) ανιχνευτής 15

16 Οργανολογία 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής 16

17 Οργανολογία 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής 17

18 Ποιοτική Ανάλυση Σύγκριση του t Rχ της άγνωστης ουσίας με το t Rs συγκεκριμένης πρότυπης ουσίας. Με τη μέθοδο του εμβολιασμού (spiking)

19 Ποιοτική Ανάλυση Όλοι οι προαναφερθέντες ανιχνευτές δεν κάνουν ταυτοποίηση των συστατικών ενός δείγματος. Ο χρόνος συγκράτησης (retention times) από μόνος του δεν μπορεί να ταυτοποίηση ένα συστατικό Για να γίνει ταυτοποίηση χρειάζεται Φασματόμετρο Μαζών (Mass spectrometer, MS) Φασματόμετρο Υπερύθρου (Fourier Transform Infrared Spectrometer, FT-IR) Φασματόμετρο Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) Σύγκριση των φασμάτων με φάσματα γνωστών συστατικών (fingerprint)

20 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης - φασματομετρία μαζών Chromatography, Mass Spectrometry, HPLC-MS Chromatography, Mass Spectrometry, LC-MS) Η HPLC, είναι βασικά μέθοδος διαχωρισμού και όχι μέθοδος ταυτοποίησης. Όταν συνδυαστεί με τη φασματομετρία μαζών γίνεται ισχυρότατο μέσο ταυτοποίησης πολύπλοκων βιολογικών δειγμάτων. Μειονέκτημα: το κόστος αγοράς 20

21 Ποσοτική Ανάλυση Το εμβαδόν της κάθε κορυφής του χρωματογραφήματος σχετίζεται με την ποσότητα του αντίστοιχου συστατικού μέσα στο δείγμα 1. Προσδιορισμός της % αναλογίας των συστατικών του δείγματος (percentage of total). 2. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης των συστατικών του δείγματος i) Μέθοδος εσωτερικού προτύπου (internal standard). ii) Μέθοδος εξωτερικού προτύπου (external standard).

22 Άσκηση 4η: Διαχωρισμός και ποσοτικός προσδιορισμός της καφεΐνης σε αναψυκτικό με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης CH 3 Caffeine content Double espresso (2oz) mg O N N Instant coffee (8 oz) 70 mg Decaf coffee (8 oz) 1-5 mg N DAD1, (2618 mau, - ) of CAF00012.D mau H 2500 Tea - black (8 oz) 45 mg 3 C N 2000 Tea - green (8 oz) 20 mg CH O Tea - white (8 oz) 15 mg 1000 Coca Cola (12 oz can) 34 mg Pepsi (12 oz can) 38 mg Chocolate milk (8 oz) 4 mg Φάσμα UV-Vis καφεΐνης Dark chocolate (1 oz) 20 mg 1 US fluid ounce = 29.6 ml Milk chocolate (1 oz) 6 mg 2 US fluid ounces = 59.2 ml 8 US fluid ounces = ml 12 US fluid ounces = ml Υπεύθυνη Άσκησης: Νάντια Αστρακά, MSc στην Αναλυτική Χημεία 22 nm

23 Άσκηση 4η: Διαχωρισμός και ποσοτικός προσδιορισμός της καφεΐνης σε αναψυκτικό με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Σκοπός Εισαγωγή - Θεωρία Πειραματικό μέρος Δείγματα Περιγραφή Συσκευές-Όργανα (Εταιρεία Μοντέλο κλπ) Συνθήκες ανάλυσης (Κινητή φάση, ροή κινητής φάσης κλπ) 1: Ανάλυση πρότυπων διαλυμάτων Αναλύστε στο HPLC πρότυπα διαλύματα καφεΐνης, διαφορετικών συγκεντρώσεων. Με βάση τα αποτελέσματα των αναλύσεων κατασκευάστε καμπύλη αναφοράς Συγκέντρωσης Εμβαδού κορυφής καφεΐνης. 2: Ανάλυση δείγματος αναψυκτικού Αναλύστε στο HPLC μη αλκοολούχο διαιτητικό ποτό. Καταγράψτε το χρωματογράφημα, τα t R και το εμβαδόν για κάθε συστατικό που διαχωρίστηκε. Αποτελέσματα - Συζήτηση - Συμπεράσματα Χρησιμοποιήστε τα χρωματογραφικά δεδομένα και προσδιορίστε την περιεκτικότητα του δείγματος σας σε καφεΐνη. Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας και συγκρίνατε με βιβλιογραφικά δεδομένα. Βιβλιογραφία 23 Υπεύθυνη Άσκησης: Νάντια Αστρακά, MSc στην Αναλυτική Χημεία

Σχετικά έγγραφα

Υγρή χρωματογραφία: Στατική φάση: στερεό πορώδες υλικό ή υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα, Κινητή φάση: υγρό.

q, HPLC) Πέτρος Ταραντίλης Αναπληρωτής καθηγητής Χρήστος Παππάς Επίκουρος καθηγητής Υγρή χρωματογραφία: Στατική φάση: στερεό πορώδες υλικό ή υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα, Κινητή φάση: υγρό. 2 Κατάταξη