ΣΤΕΡΕΟΛΟΓΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΛΕΚΙΘΙΚΩΝ ΩΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΕΙΔΗ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕ ΑΚΑΘΟΡΙΣΤΗ ΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑ ΟΠΩΣ Η ΣΑΡΔΕΛΑ

ΣΤΕΡΕΟΛΟΓΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΛΕΚΙΘΙΚΩΝ ΩΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΕΙΔΗ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕ ΑΚΑΘΟΡΙΣΤΗ ΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑ ΟΠΩΣ Η ΣΑΡΔΕΛΑ Γκάνιας Κ., Σταυρίδου Φ., Μαντζούκη Ε., Ντόκου Α. Τμήμα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, kganias@bio.auth.gr Περίληψη Στην παρούσα εργασία επιχειρείται η εφαρμογή των αρχών της στερεολογίας και της προηγμένης θεωρίας πυκνότητας μεριδίων στην εκτίμηση της παραγωγής λεκιθικών ωοκυττάρων σε ιστολογικά δείγματα ωοθήκης σαρδέλας, Sardina pilchardus. Επιπλέον παρουσιάζεται μία μέθοδος αναγνώρισης και μέτρησης των λεκιθικών ωοκυττάρων βασισμένη στην επεξεργασία φωτομικρογραφιών ιστολογικών τομών με τη χρήση λογισμικού ψηφιακής ανάλυσης εικόνας. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε ένα είδος με ακαθόριστη γονιμότητα όπως η σαρδέλα η στρατολόγηση νέων ομάδων λεκιθικών ωοκυττάρων είναι μία συνεχής διαδικασία κατά τη διάρκεια του κύκλου ωοτοκίας με αποτέλεσμα ειδικά στα πιο προηγμένα στάδια να συνυπάρχουν στην ωοθήκη δύο ή και περισσότερες ομάδες λεκιθικών ωοκυττάρων. επίσης, σε αντίθεση με τα είδη με καθορισμένη γονιμότητα στα οποία η γονιμότητα φθίνει με την αύξηση του μεγέθους των ωοκυττάρων, στη σαρδέλα ο αριθμός των λεκιθικών ωοκυττάρων αυξάνεται με το μέγεθος τους. Η σχέση αυτή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα επιπλέον κριτήριο κατά τον προσδιορισμό του προτύπου της γονιμότητας ενός είδους. Λέξεις κλειδιά: γονιμότητα, πολλαπλοί αποθέτες, ιστολογία, ανάλυση εικόνας STEREOLOGICAL ESTIMATION OF VITELLOGENIC OOCYTE PRODUCTION IN INDETERMINATE SPAWNERS LIKE SARDINE Ganias K., Stavridou F., Mantzouki E., Ntokou A. School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, kganias@bio.auth.gr Abstract The present study uses the principles of stereology combined with advanced packing density theory to estimate vitellogenic oocyte production in histological specimens of sardine, Sardina pilchardus, ovaries. Moreover, we present a method which recognizes and counts oocytes in histological specimens based on the processing of photomicrographs of ovarian tissue by means of digital image analysis software. Our results show that in an indeterminate spawner such as sardine the recruitment of oocyte batches during the spawning cycle is a continuous process which results in the co-occurrence of two or more batches of vitellogenic oocytes in the ovary. Also, oppositely to determinate spawners in which fecundity declines with the increase of oocyte size, the number of vitellogenic oocytes in sardine was shown to increase with increasing oocyte size. This particular relationship could be used as an extra criterion for the designation of the fecundity pattern in fish species. Keywords: fecundity, image analysis, multiple spawners, histology 1. Εισαγωγή Ως δυνητική ετήσια γονιμότητα (potential annual fecundity) ορίζεται το σύνολο των ωοκυττάρων που παράγεται και τελικά αποτίθεται ανά θηλυκό σε μία αναπαραγωγική περίοδο. Γενικά στα ψάρια διακρίνονται δύο πρότυπα ετήσιας γονιμότητας (Hunter et al. 1992). Στο καθορισμένο πρότυπο (determinate fecundity) δεν υπάρχει de novo παραγωγή ομάδων ωοκυττάρων ωοτοκίας κατά τη διάρκεια της περιόδου ωοτοκίας. Αντίθετα στο ακαθόριστο

πρότυπο (indeterminate fecundity) η παραγωγή ωοκυττάρων ωοτοκίας κατά τη διάρκεια της περιόδου ωοτοκίας είναι συνεχής (Hunter et al. 1992). Η γνώση του προτύπου γονιμότητας ενός πληθυσμού έχει ιδιαίτερη σημασία, ειδικά σε πιο εμπορικά είδη ψαριών τα οποία βρίσκονται σε καθεστώς διαχείρισης, κυρίως διότι η ύπαρξη του ενός ή του άλλου προτύπου καθορίζει και τη μέθοδο εκτίμησης της βιομάζας που θα εφαρμοστεί (Stratoudakis et al. 2006). Έτσι, ενώ σε πληθυσμούς ψαριών με ακαθόριστο πρότυπο μπορούν να εφαρμοστούν τόσο η μέθοδος ημερήσιας παραγωγής αβγών (daily egg production method, DEPM) όσο και η μέθοδος ετήσιας παραγωγής αβγών (annual egg production method, AEPM), στους πληθυσμούς με καθορισμένη γονιμότητα εφαρμόζεται μόνο η AEPM και σε ειδικές περιπτώσεις η μέθοδος ημερήσιας μείωσης της γονιμότητας (daily fecundity reduction method, DFRM) (Stratoudakis et al. 2006). Υπάρχει μία σειρά από κριτήρια για να ελεγχθεί αν ένας πληθυσμός ακολουθεί το ένα πρότυπο γονιμότητας ή το άλλο. Το σημαντικότερο κριτήριο σχετίζεται με την κατανομή μεγέθους των ωοκυττάρων η οποία στο καθορισμένο πρότυπο είναι ασυνεχής, με το ετήσιο απόθεμα των ωοκυττάρων ωοτοκίας να ξεχωρίζει σε μέγεθος από τα μικρότερα ωοκύτταρα ήδη από την αρχή της περιόδου ωοτοκίας (Hunter et al. 1992). Αντίθετα, στο ακαθόριστο πρότυπο η κατανομή μεγεθών των ωοκυττάρων είναι συνεχής καθ όλη τη διάρκεια της περιόδου ωοτοκίας. Επίσης, η ολική γονιμότητα στο καθορισμένο πρότυπο μειώνεται κατά την περίοδο ωοτοκίας, ενώ αντίθετα το μέσο μέγεθος των ωοκυττάρων αυξάνεται. Την τελευταία δεκαετία έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος στη σωστή εκτίμηση του προτύπου γονιμότητας στους πληθυσμούς ψαριών. Μία από τις πιο σημαντικές εξελίξεις ήταν η εφαρμογή ψηφιακών συστημάτων ανάλυσης εικόνας στη μελέτη των μορφομετρικών και των ποιοτικών χαρακτηριστικών των ωοκυττάρων τόσο σε δείγματα συντηρημένου ιστού ωοθηκών (Thorsen and Kjesbu 2001) όσο και σε ιστολογικές τομές (Alén et al. 2006). Η εφαρμογή των αρχών της στερεολογίας, αλλά και της προηγμένης θεωρίας πυκνότητας μεριδίων (advanced packing density theory, APDT) επίσης συνέβαλαν σημαντικά τόσο στον προσδιορισμό του προτύπου γονιμότητας (Emerson et al. 1990, Kurita and Kjesbu 2010) όσο και στην κατανόηση του προτύπου στρατολόγησης των ωοκυττάρων (Korta et al. 2010). Στην παρούσα εργασία επιχειρείται η εφαρμογή των αρχών της στερεολογίας και της APDT στην εκτίμηση της παραγωγής λεκιθικών ωοκυττάρων σε ιστολογικά δείγματα ωοθήκης σαρδέλας, Sardina pilchardus. Η σαρδέλα παρουσιάζει ακαθόριστο πρότυπο γονιμότητας και η παραγωγή των ωοκυττάρων λαμβάνει χώρα σε μία παρατεταμένη περίοδο ωοτοκίας η οποία εκτείνεται κατά τους χειμερινούς μήνες του έτους. Ενώ έχει ήδη δειχθεί ότι στις ωοθήκες των αναπαραγωγικά ενεργών θηλυκών ατόμων σαρδέλας συνυπάρχουν περισσότερες ομάδες ωοκυττάρων, η έμφαση έως τώρα δίνονταν κυρίως στη δυναμική της προηγμένης ομάδας (Ganias et al. 2004, Ganias et al. 2010), ενώ λίγα είναι γνωστά για τη στρατολόγηση και την ανάπτυξη των υπόλοιπων ομάδων. Στην παρούσα εργασία εξετάζεται η παραγωγή και η δυναμική όλων των λεκιθικών ωοκυττάρων και όχι μόνο των προηγμένων. Τα αποτελέσματα συζητούνται στο πλαίσιο της ανάπτυξης ενός επιπλέον κριτηρίου για τον προσδιορισμό του προτύπου γονιμότητας στα ψάρια. 2. Υλικά και Μέθοδοι

Για το σκοπό της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ωοθήκες από 23 άτομα σαρδέλας, Sardina pilchardus οι οποίες είχαν προηγουμένως μονιμοποιηθεί σε διάλυμα AFA (65 μέρη κατ όγκο αιθανόλης 50%, 32 μέρη και 13 μέρη παγόμορφου οξικού οξέως). Τα άτομα αυτά ήταν αναπαραγωγικά ενεργά και περιείχαν ωοκύτταρα σε διαφορετικά στάδια του κύκλου ωοτοκίας που κυμαίνονταν από την αρχή της λεκιθογένεσης έως και την αρχή της ενυδάτωσης. Από το μέσο της κάθε ωοθήκης αφαιρούνταν ένα μικρό υποδείγμα περίπου 0.5cm το οποίο και τοποθετούνταν σε κασέτα ιστολογίας. Τα υποδείγματα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε 70% αιθυλική αλκοόλη, αφυδατωθήκαν σε διαδοχικά διαλύματα αιθανόλης έως 95% και εγκλείστηκαν σε ρητίνη ( Historesin LKB). Από κάθε δείγμα ιστού παρήχθησαν δύο τομές πάχους 3μm με μηχανοκίνητη μικροτόμο οι οποίες τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αφέθηκαν να στεγνώσουν σε μία θερμαινόμενη πλάκα στους 100 0 C. Αυτή η σχετικά υψηλή θερμοκρασία ήταν απαραίτητη τόσο για να επιταχυνθεί το στέγνωμα όσο και για να αποφευχθεί η συρρίκνωση των τομών (Emerson et al. 1990). Ακολούθησε χρώση των τομών με αιματοξηλίνη και ηωσίνη. Εικ. 1: Διαδοχικές φάσεις επεξεργασίας των φωτομικρογραφιών από ιστολογικές τομές ωοθηκών σαρδέλας για τη μέτρηση των λεκιθικών ωοκυττάρων με το λογισμικό ImageJ. Α: αρχική εικόνα. B: εφαρμογή του φίλτρου cut-out. Γ: διαχωρισμός των ωοκυττάρων (segmentation). Δ: αναγνώριση και μέτρηση ωοκυττάρων ανάλογα με το μέγεθος και την κυκλικότητα τους. Η παρατήρηση των ιστολογικών παρασκευασμάτων έγινε σε στερεοσκόπιο ZEISS Stemi 2000 εφοδιασμένο με κάμερα μικροσκοπίας (ZEISS, AxioCam ICc) η οποία ήταν συνδεδεμένη με ηλεκτρονικό υπολογιστή. Μετά από παρατήρηση της τομής για καταγραφή των γενικών ιστολογικών χαρακτηριστικών όπως το στάδιο ανάπτυξης των ωοκυττάρων και η ύπαρξη κενών ή ατρητικών ωοθυλακίων ακολούθησε η λήψη μικροφωτογραφίας σε μεγέθυνση που κυμαίνονταν

από 2,5-3,2x (Εικ. 1Α). Η κλίμακα αυτή θεωρήθηκε ως βέλτιστη διότι επέτρεπε τόσο την απεικόνιση ενός αρκετά μεγάλου πεδίου της τομής όσο και την αναγνώριση των σημαντικών μορφολογικών χαρακτηριστικών των ωοκυττάρων όπως η ύπαρξη ή μη της λεκίθου. Η λήψη της φωτομικρογραφίας γίνονταν μέσω του λογισμικού Axio Vision vs. 4.7.1 μέσω του οποίου γίνονταν ρυθμίσεις του χρόνου έκθεσης της κάμερας (exposure), της αναλογίας λευκού (white balance) και της τιμής gamma (~0,45). Επίσης πριν τη λήψη της φωτομικρογραφίας γίνονταν διόρθωση της μη ομοιόμορφης κατανομής της φωτεινότητας της εικόνας μέσω της λειτουργίας shading correction σε κενό πεδίο. Η ανάλυση των ψηφιακών φωτομικροφωτογραφιών έγινε με το λογισμικό ImageJ vs. 1.45r και περιελάμβανε μετρήσεις των μορφομετρικών χαρακτηριστικών όλων των ωοκυττάρων της τομής που βρίσκονταν από τα πρώτα στάδια της εισόδου της λεκίθου στο ωόπλασμα μέχρι και τo στάδιο της ενυδάτωσης. Πιο συγκεκριμένα σε κάθε φωτογραφία, μετά την εφαρμογή της κατάλληλης κλίμακας μέτρησης σχεδιάζονταν η περίμετρος των ωοκυττάρων και δημιουργούνταν τα αντίστοιχα ROI (regions of interest). Για κάθε ROI το λογισμικό υπολόγιζε αυτόματα την επιφάνεια του ωοκυττάρου, A o, και το λόγο προβολής k (aspect ratio) ο οποίος ισούται με το λόγο της μεγαλύτερης προς τη μικρότερη διάμετρο του ωοκυττάρου και δηλώνει την απόκλιση του σχήματος από τον κύκλο. H συνολική επιφάνεια των λεκιθικών ΣΑ ο ωοκυττάρων προέκυπτε επιλέγοντας όλα τα ROI και κάνοντας μία συνολική μέτρηση. Επιπλέον, γίνονταν και μέτρηση της συνολικής επιφάνειας της τομής, Α sl. Εκτός από τον παραπάνω χειρονακτικό τρόπο, οι μετρήσεις της επιφάνειας των ωοκυττάρων πραγματοποιούνταν και με μία αυτοματοποιημένη διαδικασία οι οποία μοιάζει αρκετά με εκείνη που περιγράφεται από τους Ganias et al. (2010) για τη μέτρηση των ωοκυττάρων σε δείγματα συντηρημένου ιστού (whole mounts). Η πιο σημαντική διαφορά με την παρούσα μέθοδο σχετίζεται με το ανομοιογενές εσωτερικό των ωοκυττάρων στις ιστολογικές τομές το οποίο οφείλεται κυρίως στην παρουσία του πυρήνα αλλά και άλλων δομών όπως είναι τα σφαιρίδια της λεκίθου και οι σταγόνες λιπιδίων. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα η φωτομικρογραφία, μετά από τη μετατροπή της σε εικόνα 8-bit, τη στάθμιση της φωτεινότητας και της αντίθεσης και την εφαρμογή του αλγόριθμου rolling-ball για τελειοποίηση της ομογενοποίησης του φόντου μεταφέρονταν στο λογισμικό Adobe Photoshop CS2 στο οποίο και εφαρμόζονταν το φίλτρο Cutout το οποίο δείχθηκε ότι πετυχαίνει σε σημαντικό βαθμό την ομογενοποίηση του εσωτερικού των ωοκυττάρων (Εικ. 1Β). Η φωτομικρογραφία μεταφέρονταν ξανά στο ImageJ για να υποβληθεί σταδιακά στις λειτουργίες segmentation (διαχωρισμός ωοκυττάρων) και particle analysis με την οποία και μετρούνταν όλες οι δομές με επιφάνεια άνω των 0,05mm 2 και κυκλικότητα άνω του 0,4. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 1Δ με τη διαδικασία αύτη επιτυγχάνονταν ο εντοπισμός και η μέτρηση σχεδόν του συνόλου των λεκιθικών ωοκυττάρων της τομής. Σε τελική φάση γίνονταν η αφαίρεση των ROI των μη λεκιθικών ωοκυττάρων και η δημιουργία των ROI όσων λεκιθικών ωοκυττάρων δεν εντοπίζονταν μέσω της ρουτίνας. Μέσω της αυτοματοποιημένης αυτής διαδικασίας οι μετρήσεις γινόταν έως και 8 φορές γρηγορότερα ενώ ο έλεγχος αξιοπιστίας της μεθόδου δεν έδωσε στατιστικά σημαντικές διαφορές με τη χειρονακτική μέθοδο ούτε στον αριθμό των ωοκυττάρων αλλά ούτε και στο μέσο και ολικό μέγεθος τους.

Η πυκνότητα των λεκιθικών ωοκυττάρων, OPD, υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την προηγμένη θεωρία για την πυκνότητα των μεριδίων μέσω του τύπου (Kurita and Kjesbu 2009): log(opd)=log[v f * (1/p 0 ) * (1+k) 3 /(8+k))] + 12.28 * log(od v ) (1) όπου V f το κατ όγκο κλάσμα των λεκιθικών ωοκυττάρων, p 0 το ειδικό βάρος της ωοθήκης, k ο λόγος προβολής και OD v η βασισμένη στον όγκο μέση διάμετρος των ωοκυττάρων. Για την αναλυτική επεξήγηση της κάθε παραμέτρου παραπέμπουμε στους Korta et al.(2010). Σύμφωνα με την στερεολογική αρχή του Delesse το V f, ισούται με ΣΑ ο /Α sl.το ειδικό βάρος υπολογίστηκε αναλύοντας τη σχέση βάρους-όγκου ωοθήκης σε 52 λεκιθικά και 46 ενυδατωμένα άτομα σαρδέλας. Οι ογκομετρήσεις έγιναν με τη μέθοδο του όγκου εκτοπισμού κατά την οποία η ωοθήκη βυθίζονταν σε ογκομετρικό κύλινδρο ακριβείας 0,5ml. Η γονιμότητα, F, κάθε ατόμου υπολογίζονταν πολλαπλασιάζοντας την OPD με το βάρος της ωοθήκης ενώ η σχετική γονιμότητα, F r, διαιρώντας τη γονιμότητα με το βάρος σώματος χωρίς εντόσθια. 3. Αποτελέσματα και συζήτηση Στην Εικόνα 2Α φαίνεται η σχέση μεταξύ του βάρους και του όγκου της ωοθήκης στα στάδια της λεκιθογένεσης και της ενυδάτωσης. Η ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι και στις δύο σχέσεις ο συντελεστής ανόρθωσης δε διέφερε σημαντικά από το μηδέν (P>0,1) και για το λόγο αυτό η ευθεία ελαχίστων τετραγώνων ορίστηκε να διέρχεται από την αρχή των αξόνων. Με τον τρόπο αυτό η σχέση βάρους-όγκου ωοθήκης έγινε GW=1,051*GV (R 2 =0,99) και GW=1,025*GV (R 2 =0,99) για τα λεκιθικά και τα ενυδατωμένα θηλυκά αντίστοιχα. Κατά συνέπεια, το ειδικό βάρος της ωοθήκης υπολογίστηκε ότι στη μεν λεκιθογένεση ισούται με 1,051 και στην ενυδάτωση με 1,025. Οι τιμές αυτές είναι αρκετά μικρότερες από τις τιμές ειδικού βάρους που αναφέρουν οι Kurita & Kjesbu (2009) για τις ωοθήκες της ρέγγας, Clupea harengus, (λεκιθογένεση: 1,072, ενυδάτωση: 1,061) γεγονός που σημαίνει ότι κάθε είδος παρουσιάζει ιδιαίτερες τιμές ειδικού βάρους ωοθήκης κι ότι η παράμετρος αυτή πρέπει να υπολογίζεται κάθε φορά που γίνονται αντίστοιχες εκτιμήσεις γονιμότητας σε νέα είδη. Η σχέση του συντελεστή k με τη διάμετρο των ωοκυττάρων ήταν αρνητική για διαμέτρους μεταξύ 300-550μm (k=1.28-0.0003*od v, R 2 =0,88) και θετική για διαμέτρους πάνω από τα 550μm (k=0.57+0.001*od v ) (Εικ. 2Β). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το σχήμα των ωοκυττάρων τείνει να γίνεται από ελλειψοειδές-ακανόνιστο στα αρχικά στάδια της λεκιθογένεσης σχεδόν σφαιρικό κατά την έναρξη της μετανάστευσης του πυρήνα και να ξαναγίνεται ακανόνιστο στο στάδιο της ενυδάτωσης. Τα αποτελέσματα αυτά συμπίπτουν αρκετά με εκείνα των Kurita & Kjesbu (2009) για τη ρέγγα, C. harengus, τόσο ως προς τις τιμές του συντελεστή k όσο κι ως προς την κρίσιμη OD v στην οποία γίνεται αυτή η αλλαγή στη σχέση μεταξύ των δύο παραμέτρων. Για το λόγο αυτό, στις εκτιμήσεις της OPD η τιμή του k του κάθε ατόμου προβλέφθηκε από την αντίστοιχη τιμή OD v μέσω των παραπάνω εξισώσεων. Το κατ όγκο κλάσμα των λεκιθικών ωοκυττάρων, V f, αυξάνονταν σημαντικά με την OD v. (Εικ. 3Α). Αυτή η σχέση έχει δειχθεί τόσο σε είδη με καθορισμένη γονιμότητα (πχ. C. harengus:

Kurita & Kjesbu 2009) όσο και σε είδη με ακαθόριστη γονιμότητα (π.χ. Paralichthys olivaceus: Kurita & Kjesbu 2009, Merluccius merluccius: Korta et al. 2010) με μία τάση να εμφανίζει πολύ μεγαλύτερες τιμές στο καθορισμένο πρότυπο (~90%) σε σχέση το ακαθόριστο πρότυπο (60-80%). Η διαφορά αυτή οφείλεται στο ότι σε αντίθεση με τη ρέγγα στην οποία η ομάδα ωοτοκίας είναι κυρίαρχη στην ωοθήκη τα είδη με ακαθόριστη γονιμότητα έχουν εκτός από τα λεκιθικά ωοκύτταρα κι ένα σημαντικό αριθμό ωοκυττάρων σε προγενέστερα στάδια ανάπτυξης. Στη σαρδέλα η τιμή του V f, κυμαίνονταν μεταξύ 30-70%, γεγονός που ενδέχεται να οφείλεται στην ύπαρξη ακόμη μεγαλύτερου αριθμού προ-λεκιθικών ωοκυττάρων στην ωοθήκη. Εικ. 2: Α: σχέση ανάμεσα στο βάρος (GW) και τον όγκο (GV) των ωοθηκών. Β: σχέση ανάμεσα στο λόγο προβολής (k) και την κατ όγκο διάμετρο (OD v) των ωοκυττάρων. Vitel.: λεκιθικές ωοθήκες. Hydr.: ενυδατωμένες ωοθήκες. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3Β η σχετική γονιμότητα των λεκιθικών ωοκυττάρων δεν ήταν σταθερή στα 23 άτομα της μελέτης αλλά παρουσίασε μια στατιστικά σημαντική αύξηση με την OD v (P<0.01). Με άλλα λόγια η ποσότητα των λεκιθικών ωοκυττάρων στην ωοθήκη δείχθηκε να αυξάνεται με το στάδιο ανάπτυξης. Κατά την έναρξη της λεκιθογένεσης (OD v ~400μm) η τιμή της F r είναι περίπου 300-350ωοκύτταρα ανά γραμμάριο σωματικού βάρους τιμή που είναι αρκετά κοντά στη σχετική γονιμότητα ομάδας των πληθυσμών της σαρδέλας (Ganias et al. 2004). Παρόλα αυτά στο δευτερογενές στάδιο της λεκιθογένεσης (OD v ~470μm) η τιμή της F r σχεδόν διπλασιάζεται ενώ στα λίγα άτομα που βρίσκονται στα τελικά στάδια της ωρίμανσης η F r είναι σχεδόν τριπλάσια από τη γονιμότητα ομάδας. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι σε ένα είδος με ακαθόριστη γονιμότητα όπως η σαρδέλα, η στρατολόγηση νέων ομάδων λεκιθικών ωοκυττάρων είναι μία συνεχής διαδικασία κατά τη διάρκεια του κύκλου ωοτοκίας με αποτέλεσμα, ειδικά στα πιο προηγμένα στάδια, να συνυπάρχουν στην ωοθήκη δύο ή και περισσότερες ομάδες λεκιθικών ωοκυττάρων. Επίσης σε αντίθεση με τα είδη με καθορισμένη γονιμότητα στα οποία η γονιμότητα φθίνει με την αύξηση του μεγέθους των ωοκυττάρων, στη σαρδέλα και κατά συνέπεια και στα

υπόλοιπα είδη με ακαθόριστο πρότυπο η γονιμότητα αυξάνεται με το μέγεθος των ωοκυττάρων. Η σχέση αυτή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα επιπλέον κριτήριο κατά τον προσδιορισμό του προτύπου της γονιμότητας ενός είδους. Εικ. 3: Σχέση ανάμεσα στην την κατ όγκο διάμετρο των ωοκυττάρων (OD v) και Α: το κατ όγκο κλάσμα των λεκιθικών ωοκυττάρων (V f ) και Β) τη σχετική γονιμότητα F r 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Alén S., Cernadas E., Formella A., Domınguez R. & Saborido-Rey F 2006. Comparison of region and edge segmentation approaches to recognize fish oocytes in histological images. Lecture Notes in Computer Science, 4142: 853 864 Emerson, L.S., Greer Walker, M. & Witthames, P.R., 1990. A stereological method. for estimating fecundity. Journal of Fish Biology, 36: 721 730. Ganias K., Somarakis S., Machias A. & Theodorou A. 2004. Pattern of oocyte development and batch fecundity in the Mediterranean sardine. Fisheries Research, 67: 13-23 Ganias K., Rakka M., Vavalidis T. & Nunes C., 2010. Measuring batch fecundity in indeterminate spawners using automated particle counting. Fisheries Research, 106: 570-574 Hunter, J.R., Macewicz, B., Lo, N.C.H., & Kimbrell, A., 1992. Fecundity, spawning, and maturity of female Dover sole Microstomus pacificus, with an evaluation of assumptions and precision. Fishery Bulletin, 90, 101-128. Korta, M., Murua H., Kurita Y., Kjesbu O.S., 2010. How are the oocytes recruited in an indeterminate fish? Applications of stereological techniques along with advanced packing density theory on European hake (Merluccius merluccius L.). Fisheries Research, 104: 56-63 Kurita, Y., & Kjesbu, O.S., 2009. Fecundity estimation by oocyte packing density formulae in determinate and indeterminate spawners: Theoretical considerations and applications. Journal of Sea Research, 61: 188-196. Stratoudakis, Y., Bernal, M., Ganias, K., Uriarte, A., 2006. The Daily Egg Production Method (DEPM): recent advances, current applications and future challenges. Fish and Fisheries, 7, 35-57. Thorsen, A. & Kjesbu, O.S., 2001. A rapid method for estimation of oocyte size and potential fecundity in Atlantic cod using a computer-aided particle analysis system. Journal of Sea Research, 46, 295 308.