ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Γκαντέρης Γεώργιος Βιοπαθολόγος Αναπληρωτής Διευθυντής ΓΝΑ «Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ»
GRAM ΘΕΤΙΚΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙA Gram θετικά βακτηρίδια σπορογόνα Gram θετικοί αναερόβιοι κόκκοι Peptostreptococcus sp Micromonas sp Finegoldia sp Peptoniphillus sp Anaerococcus sp σπορογόνα (Clostridium sp) sp P. anaerobius M. micros F. magna sp P. acaccharolyticus,, P. indolicus, P. harei,, P. lacrimalis sp A. prevotii,, A. tetradius,, A. octavius, A. hydrogenalis, A. lactolyticus,, A. vaginalis Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα (Actimomyces sp, Propionibacterium sp, Lactobacillus sp, Bifidobacterium sp, Eubacterium sp )
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Α. Κλινικές πληροφορίες Β. Μακροσκοπική εξέταση Γ. Άμεση μικροσκοπική εξέταση Δ. Ταυτοποίηση (προκαταρκτική & τελική)
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Α. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ 1. Θέση λοίμωξης 2. Προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών 3. Παραγωγή αερίου 4. Δυσοσμία
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ B. Μακροσκοπική εξέταση Μαύρα πυώδη ή αιματηρά εξιδρώματα Πιθανόν φθορισμός Κοκκία θείου
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Γ. ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Νωπό: Μικροσκόπηση σε σκοτεινό πεδίο για παρατήρηση των σπόρων και της κινητικότητας Χρώση Gram: Θέτει την αρχική υποψία της παρουσίας αναεροβίων βακτηρίων Προσφέρει σημαντική βοήθεια στην αρχική εμπειρική θεραπεία
Χλωρίδα εντέρου
Lactobacillus sp
Δ. Προκαταρκτική ταυτοποίηση αναεροβίων Mορφολογία των αποικιών Xρώση Gram Aπλέςπλές δοκιμασίες Πλήρης ταυτοποίηση Βιοχημικές δοκιμασίες Συστήματα ταυτοποίησης ταυτοποίησης (Rapid ID 32A, BBL Crystal ANR, RapID ANA II ) Δισκία ενζυματικών αντιδράσεων Υγρή-αέρια χρωματογραφία
Θρεπτικά υλικά για αναερόβια Brucella blood agar εμπλουτισμένο με αιμίνη και βιταμίνη Κ1 Phenyl ethyl alcohol blood agar (PEA) kanamycin-vancomycin laked blood agar (KVLB) Bacteroides bile-esculin esculin agar (BBE) Thioglycolate broth εμπλουτισμένο με βιταμίνη K 1 και αιμίνη
Εξέταση των καλλιεργημάτων Συνήθως πολυμικροβιακή ανάπτυξη με άλλα αναερόβια και αερόβια Ενδείξεις αναεροβίων: 1. Δυσοσμία 2. Περισσότεροι τύποι αποικιών στο αιματούχο αναερόβιο από το σοκολατόχρωμο 3. Ανάπτυξη στο υλικό ΒΒΕ ή στο KVLB 4. Κεραμιδί φθορισμός (μετά έκθεση σε UV φως μαύρες αποικίες στο KVLB ή στο αιματούχο αναερόβιο φως 366 nm) ή
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΓΡΗΓΟΡΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ Clostridium sp (από καθαρό καλλιέργημα) Χρώση Gram Μορφολογία αποικιών Έλεγχος αεροβίωσης Δίσκοι ειδικής περιεκτικότητας (Vancomycin 5 μg, Kanamycin 1000 μg,colistin 10 μg) Λιπάση Λεκιθινάση Παραγωγή ινδόλης Αναγωγή νιτρικών δισκία Καταλάση Φθορισμός Παραγωγή ουρεάσης Δοκιμασία παραγωγής σπόρων (alcohol shock) Ανάστροφη CAMP Nagler test
Χαρακτηριστικά αποικιών κλωστηριδίων Μεγάλες αποικίες με διπλή ζώνη αιμόλυσης (C. perfringens, C.novyi ) Μεγάλες ριζοειδείς ( Clostridium sp ) Ερπύζουσες αποικίες (C. septicum, C. tetani, C. sordellii, C. sporogenes) Οσμή (στάβλου αλόγων C. difficile) Χρώμα αποικιών
C. novyi
C. difficile
ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΠΟΡΟΓΟΝΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ C. difficile κιτρινοπράσινος C. innocuum κιτρινοπράσινος C. ramosum κόκκινος
Μικροσκοπική εικόνα C. perfringens: Gram (+) βακτηρίδια μεγάλα με τετραγωνισμένα άκρα, χωρίς σπόρους C. septicum: Μακρύ, λεπτό, πολύμορφο νηματοειδές με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. novyi : Mεσαίου μεγέθους με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. difficile: Μακρύ, λεπτό, με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους
C. perfringens
C.difficile
C. difficile
C.novyi
C. tetani
C. septicum
Λεκιθινάση + C. perfringens
Λιπάση + C. sporogenes
ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟ C. perfringens 1 C. Sordellii 1 C. bifermentans C. barati 1 C. limosum C. novyi A C. sporogenes 1 ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗ + + + + + + - ΛΙΠΑΣΗ - - - - - + + 1 Nagler θετικά
C. perfringens Ανάστροφη δοκιμασία CAMP
Nagler test aντιτοξίνη C. perfrringens
ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Ινδόλη Νιτρικά Φθορισμός Λεκιθινάση Λιπάση Ουρεάση Τετράγωνα άκρα Διπλή β-αιμόλυση C. perfringens - - + - + - - + + C. bifermentans + - - + - - - - C. sordellii + - - + - + - - C. septicum - - + - - - - - - C. sporogenes - - - - + - - -
Προκαταρκτική ταυτοποίηση κλωστηριδίων + Λεκιθινάση - + Λιπάση - + Λιπάση - C. novyi C. bifermenntas C. sporogenes Closridium sp C. sordelli C. barati C. limosum + C. perfringens ινδόλη - C. bifermenntas C. sordelli + Ουρεάση - C. sordelli C. bifermenntas C. barati C. limosum C. perfringens + C. limosum C. perfringens Ζελατίνη - C. barati
Ένζυμα Glutamic acid decarboxylase ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΕΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ Θετικό αποτέλεσμα Βακτήρια amine (μπλε χρώμα) C. sordelii (+) C. bifermentans (-) L-prolineproline aminopeptedase β-naphythylamine + cinnamaldehyde ( ροζ-πορφυρό χρώμα) C. difficile (+) C. innocuum (-) α-glucosidase μπλε φθορισμός (με UV 360 nm) 4-methylumbelliferone C. septicum (+) C. sporogenes (-)
Σακχαρολυτικά πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεθινά ση Λιπά ση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλίνη C. bifermentans + - + - - - + ΩΥ + C. Sordelii + - + - +- - + ΩΥ - C. perfringens + - - - - +- - Οχι - C. novyi + + - - - - + ΩΥ - C. sporogenes - + - - - - + ΩΥ +. C. cadaveris - - + - - - + ΩΥ - C Septicum - - - - - Π + ΩΥ + C. difficile - - - - - - + ΩΤ + C. putrificum - - - - - - + Τ -+
Σακχαρολυτικά μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεκιθιν άση Λιπάση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλίνη C. barati + - + - - - + Τελικός ΟΧΙ + C. tertium - - - + - - + AN + C. butyricum - - - - - - - ΩΤ + C. innocum - - - - - - ΩΤ + C. ramosum C Clostridioform - - - - - - + Σ, ΩΤ Σπάνιος - - - - - +_ + ΩΥ, ΟΧΙ + +
Μη σακχαρολυτικά μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεκιθι νάση Λιπάση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλίνη C. tetani - - Π - - - + Σ,Τ - C. hastiform - - - - - _+ + Υ - C. Subterminale -+ - - - - - + ΩΥ, ΟΧΙ -+ C. histoyticum - - - +- - - + ΩΥ - C. limosum + - - - - - + Υ -
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΚΟΚΚΩΝ E Δίσκοι SPS A Peptostreptococcus anaerobius Ινδόλη + - + An. prevotii An. terradius + α-γαλακτοσιδάση - Ουρεάση - Micromonas micros <0,6 μm Finegoldia magna > 0,6 μm + Pn. asaccharolyticus An. hydrogenalis Αλκαλική φωσφατάση ήζύμωσηγλυκόζης - - An. prevotii An. tetradius An. hydrogenalis Pn.αsaccharolyticus
P. anaerobius
Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα A. israeli
A. israeli
A. odondolyticus
Propionibacterium acnes
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΜΗ ΣΠΟΡΟΓΟΝΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ Βακτήρια Νιτρικά Καταλάση Ινδόλη Εσκουλίνη Ουρεάση Χρώμα αποικιών Ανάπτυξη Actinomyces sp + -+ - +- +- A. israelii +- - - + - - Α, Μ A. odontolyticus + - -- +- - +- Α, Μ A. naeslundii +- - - +- + - Α, Δ A. viscosus +- + - +- + - Α, Μ A. meyeri -+ - - -+ - - Α Propionibacterium sp +- +- -+ +- Α, Μ P. acnes +- +- +- - Α, Μ - + - - P. granulosum P. anidum - + - + Bifidobacterium sp - -+ - +- Α, Μ B. dentium - - - + Α Lactobacillus sp -+ - - +- Α, Μ Eubacterium sp +- - -+ +- Α + -+ - - E. lentum Α Α: αναερόβια Isenberg 2005 Δ: δυνητικά αναερόβια Μ: μικροαερόφιλα
Ερώτηση 1 η Gram θετικό, σπορογόνο αναερόβιο βακτηρίδιο βακτηρίδιο, (απομονώθηκε από κ/α αποστήματος σε χρήστη ενδοφλεβίων ναρκωτικών ουσιών) με: διπλή ζώνη β- αιμόλυσης λεκιθινάση( ( +) λιπάση (+) είναι: 1. C. perfringens 2. C. sporogenes 3. C. novyi 4. Όλα τα ανωτέρω
Ερώτηση 1 η Gram θετικό, σπορογόνο αναερόβιο βακτηρίδιο βακτηρίδιο, (απομονώθηκε από κ/α αποστήματος σε χρήστη ενδοφλεβίων ναρκωτικών ουσιών) με: διπλή ζώνη β- αιμόλυσης λεκιθινάση( ( +) λιπάση (+) είναι: 1. C. perfringens 2. C. sporogenes 3. C. novyi 4. Όλα τα ανωτέρω
Ερώτηση 2 η Gram (+) αναερόβιος κόκκος, ευαίσθητος στη Metronidazole με ζώνη αναστολής στο SPS >= 12 mm είναι: 1. Micromonas micros 2. Pertosrteptococcus anaerobius 3. Finegoldia magna 4. Όλα τα ανωτέρω
Ερώτηση 2 η Gram (+) αναερόβιος κόκκος, ευαίσθητος στη Metronidazole με ζώνη αναστολής στο SPS >= 12 mm είναι: 1. Micromonas micros 2. Pertosrteptococcus anaerobius 3. Finegoldia magna 4. Όλα τα ανωτέρω