QUANTA Lite TM Chromatin ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM Chromatin ELISA 708710 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM Chromatin αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων Χρωματίνης στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων της Χρωματίνης μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές εξετάσεις για να βοηθήσουν στη διάγνωση του λύκου που προκαλείται από φάρμακα (DIL) και του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (SLE). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η Χρωματίνη βρίσκεται φυσικά στον πυρήνα των κυττάρων. Συμπεριλαμβάνει καθαρό DNA που είναι τυλιγμένο γύρω από την ιστόνη octamer, με την ιστόνη Η1 και μερικές σχετικές μη-ιστονικές πρωτείνες. Τα αυτοαντισώματα αντι-χρωματίνης έχουν μετρηθεί με πλήθος από τεχνικές που περιλαμβάνουν το LE κυτταρικό τεστ 1, ανοσοκαθίζηση 2, ανασοφθορισμός των κυττάρων με ιστονικά-αναδομημένα όξινα εχκυλίσματα 3, και ELISA 4,5. Αυτά τα αντισώματα έχουν βρεθεί επικρατέστερα σε ανθρώπους με SLE 3,6,7,8, DIL 9,10, και μερικές φορές σε ανθρώπους με άλλες νόσους 11. Τα αντισώματα χρωματίνης είναι γνωστά επίσης και ως αντι-πυρηνοσωμάτια 5,8,11, anti-(h2a-h2b) DNA 9,13, anti-dnp 3,4, και παράγοντας LE-cell 1,11. Μια από τις κύριες χρήσεις αυτού του τεστ είναι να βοηθήσει στη διάγνωση του DIL. Έχουν βρεθεί αντισώματα και στην ιστόνη και στη χρωματίνη σε ασθενείς με λύκο που προκαλείται από προκαιναμίδιο 9,12,13. Ωστόσο, αντισώματα αντι-ιστόνης βρίσκονται επίσης σε ασθενείς που παίρνουν προκαιναμίδιο αλλά είναι χωρίς συμπτώματα για τα συμπτώματα που μοιάζουν για λύκο 9,13. Σε αντίθεση, αντισώματα αντι-χρωματίνης έχουν βρεθεί λιγότερο συχνά και σε χαμηλότερο τίτλο σε αυτούς του ασθενείς χωρίς συμπτώματα 9,13. Επιπλέον, οι ασθενείς με λύκο που προκαλείται από φάρμακα όπως η κινιδίνη, η πενικιλαμίνη, η μεθυλοδόπα και η ακεβουτολόλη έχουν αντισώματα αντι-χρωματίνης αλλά όχι αντιιστόνης 9,10. Για αυτό το λόγο, σύμφωνα με αυτές τις δημοσιευμένες αναφορές, η αντι-χρωματίνη είναι και πιο ευαίσθητη και πιο συγκεκριμένη για το λύκο που προκαλείται από φάρμακα, από ότι η αντι-ιστόνη. Έχει ενδιαφέρον ότι τα αντισώματα της αντι-χρωματίνης βρέθηκαν σε ανθρώπους που έπαιρναν προκαιναμίδιο ένα μικρό χρονικό διάστημα λίγο πριν αναπτύξουν συμπτώματα για το λύκο 13. Ένας αριθμός από μελέτες που χρησιμοποιούν τις μεθόδους ELISA για χρωματίνη έχουν βρει ότι ανάμεσα στο 50% και στο 90% των ασθενών με SLE έχουν αντισώματα αντι-χρωματίνης 6,7,8. Αυτό είναι το ίδιο ποσοστό όπως εκείνοι που είναι θετικοί στο LE cell 14. Γενικά, περισσότεροι ασθενείς με SLE είναι θετικοί για αντισώματα αντι-χρωματίνης από ότι για αντισώματα αντι-ιστόνης ή αντι-dna 6,7,8,11,14. Η παρουσία των αντισωμάτων της αντι-χρωματίνης έχουν επίσης συνδεθεί με την πρωτεϊνούρια στους ασθενείς με SLE 1. Τα αντισώματα χρωματίνης κατευθύνονται στόν αντιγονικο καθοριστή που περιέχονται στο καθαρό σύμπλεγμα ιστόνης-dna, στο καθαρό DNA, και στα σημεία των ιστόνων που είναι εκτεθειμένα στη χρωματίνη 7,9,11. Για αυτό το λόγο, τα αντισώματα του αντι-ndna είναι ένα τμήμα της αντι-χρωματίνης. Ωστόσο, κάποια αντισώματα αντι-ιστόνης κατευθύνονται ενάντια στόν αντιγονικο καθοριστή των νοθευμένων ιστόνων που δεν είναι εκτεθειμένες στη χρωματίνη 11. Αρχη Μεθοδου Η υψηλά καθαρή χρωματίνη θύμου που αποτελείται από DNA τυλιγμένο γύρω από το κεντρικό τμήμα της ιστόνης (Η2Α-Η2Β-Η3-ΗΑ) 2 οκταμερές είναι ενσωματωμένη στα πηγαδάκια της πλάκας. Οι πρωτεΐνες της ιστόνης Η1 και της μη-ιστόνης έχουν αφαιρεθεί από την χρωματίνη κατά τη διάρκεια της διαδικασίας του καθαρισμού. Προ-αραιωμένοι πρότυποι οροί και αραιωμένος ορός ασθενή προστίθενται σε ξεχωριστά πηγαδάκια, επιτρέποντας σε κάθε αντίσωμα χρωματίνης που είναι παρών να συνδεθεί με το ακίνητο αντιγόνο. Το μη-δεσμευμένο δείγμα ξεπλένεται και ένα ενζυμο αντι-ανθρώπινη IgG σφαιρίνη προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο αντι-ανθρώπινη IgG σφαιρίνη να συνδεθεί με κάθε αντίσωμα ασθενή, που έχει προσκολληθεί στα μικροπηγαδάκια. Αφού ξεπλυθεί κάθε μη-δεσμευμένο ένζυμο, η υπολειπόμενη ενζυματική δραστηριότητα μετριέται προσθέτοντας ένα χρωμογενές υπόστρωμα και μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσει. Η ανάλυση μπορεί να αξιολογηθεί φασματοφωτομετρικά μετρώντας και συγκρίνοντας τη χρωματική ένταση που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια του πρότυπου ορού. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ, (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ) 3. Chromatin ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ, προαραιωμένο, 1.2ml 4. Chromatin ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 1

6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 15 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. 2

Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 Chromatin ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος Chromatin Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος Chromatin High Υψηλο Θετικό (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 3

5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά Ποιοτικός έλεγχος 1. Το ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA (Low Positive), το ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προαραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 ο C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA High Positive πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA Low Positive, του οποίου η απορροφητικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από αυτή του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control. β. Το προ-αραιωμένο ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA High Positive πρέπει να έχει OD μεγαλύτερο από 1.0, ενώ η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από το 0.2. γ. Η απορροφητικότητα του ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA Low Positive πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA Negative Control ή πάνω από 0.25. δ. Το ELISA Negative Control και το ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA High Positive έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. To ΧΡΩΜΑΤΊΝΗΣ IgG ELISA High Positive δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο NCCLS Document C24-A για επιπλέον οδηγίες στις κατάλληλες πρακτικές QC. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του Chromatin ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του Chromatin ELISA Low. Η τιμή του Chromatin ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X Chromatin oρού ελέγχου (μονάδες) O.A Chromatin ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα τότε μπορεί να κατηγοριοποιηθεί ως αρνητικό, ασθενές θετικό, σχετικά θετικό ή ισχυρό θετικό σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Μονάδες Αρνητικό <20 Ασθενές θετικό 20-60 Ισχυρώς θετικό >60 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα δείχνει την παρουσία των αντισωμάτων της χρωματίνης και προτείνει την πιθανότητα της διάγνωσης του λύκου που προκαλείται από φάρμακα (DIL) ή του Συστηματικού Λύκου Ερυθηματώδη (SLE). 4

2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει την απουσία των αντισωμάτων της χρωματίνης ή επίπεδα χαμηλότερα από την αρνητική αποκοπή της ανάλυσης. 3. Προτείνεται να συμπεριλαμβάνεται στα αποτελέσματα που βγαίνουν από το εργαστήριο η παρακάτω δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα επιτεύχθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite TM Chromatin ELISA. Οι τιμές της χρωματίνης που επιτεύχθηκαν με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με τίτλο.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων ανοσοσφαίρινων συσσωρευμάτων στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο μη-συγκεκριμένου δεσίματος και να παράγουν ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Δεν είναι όλοι οι ασθενείς με λύκο που προκαλείται από φάρμακα (DIL) ή με Συστηματικού Λύκου Ερυθηματώδη (SLE) θετικοί στη χρωματίνη. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης έχουν καθιερωθεί μόνο για ορό. Αναμενόμενες Τιμές Φυσιολογικές Τιμές Εξετάστηκαν διακόσια δέκα δείγματα από υγιείς εθελοντές. Ο κανονικός πληθυσμός ήταν περίπου 68% γυναίκες με μια μέση ηλικία των 38 χρόνων. Οι ηλικίες ποίκιλλαν από 18 έως 75 χρόνια. Επιπλέον, εξετάστηκαν 29 καρδιακοί ασθενείς που δεν παίρνουν προκαιναμίδιο, αλλά ταιριάζουν σε ηλικία και φύλο με ασθενείς που παίρνουν προκαιναμίδιο. Διακόσια οκτώ από 210 δείγματα ήταν αρνητικά με το QUANTA Lite TM Chromatin ELISA, ή 99% ακρίβεια. Τα δύο θετικά κανονικά δείγματα είχαν 24 και 22 μονάδες δραστικότητας. Η θετική αποκοπή είναι 20 μονάδες. Το 90% του κανονικού πίνακα είχε 10 μονάδες ή λιγότερο. Όλοι οι καρδιακοί ασθενείς ήταν αρνητικοί. Κλινική Ευαισθησία και Ειδικότητα Σύγκριση με την Ιστόνη ELISA Στην Ιστόνη ELISA, οι νοθευμένες ατομικές ιστόνες (π.χ. Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4) δεσμεύονται στη πλάκα ELISA. Στην Χρωματίνη ELISA, η χρωματίνη H1-stripped (π.χ. η καθαρή (Η2Α-Η2Β-Η3-Η4) 2 ιστόνη οκταμερές τυλιγμένη με 145 ζευγάρια βάσης του DNA) δεσμεύεται στη πλάκα ELISA. Μια λεπτομερής σύγκριση της ιστόνης ELISA και της χρωματίνης ELISA δίνεται στην αναφορά 11. Εν συντομία, τα δύο αντιγόνα μοιράζονται μερικά σημαντικά επιτόπος (epitopes). Πιο συγκεκριμένα, οι ευαίσθητες στη θρυψίνη 0ουρές της ιστόνης, οι οποίες είναι εκτεθειμένες και στην χρωματίνη και στις νοθευμένες ιστόνες, αντιδρούν με αντισώματα και από ασθενείς με SLE και με ασθενείς με DIL. Ωστόσο, τα επιτόπους που συμπεριλαμβάνονται στο καθαρό Η2Α-Η2Β ή στο (Η2Α-Η2Β)-DNA σύμπλεγμα υπάρχουν στη χρωματίνη αλλά όχι στις νοθευμένες ιστόνες. Τα αντισώματα και από τους ασθενείς με SLE και από τους ασθενείς με DIL αναγνωρίζουν αυτά τα επιτόπος. Σε αντίθεση, μερικά επιτόπος που είναι εκτεθειμένα σε νοθευμένες ιστόνες είναι θαμμένα στη χρωματίνη. Αυτά τα επιτόπος αναγνωρίζονται από ασθενείς που παίρνουν προκαιναμίδιο αλλά είναι χωρίς συμπτώματα για λύκο που προκαλείται από φάρμακα, κάνοντας έτσι πιο δύσκολη τη χρήση της Ιστόνης ELISA από την Χρωματίνη ELISA για τη διάγνωση της DIL. Η παρουσία του DNA στη χρωματίνη προκαλεί στα αντισώματα των ασθενών με SLE να αναγνωρίσουν τη χρωματίνη πιο πρόθυμα από τις ιστόνες. Ωστόσο, εφόσον το αντι-dna είναι σπάνιο σε ανθρώπους χωρίς SLE, ουσιαστικά δεν υπάρχουν ψευδή θετικά με τη χρωματίνη που προκαλείται από την δράση αντι-dna. Όπως φαίνεται στους δύο πίνακες παρακάτω, η Χρωματίνη ELISA είναι πιο ευαίσθητη και ακριβής από την Ιστόνη ELISA στην διαφοροποίηση των ασθενών με συμπτώματα που παίρνουν προκαιναμίδιο και στους ασθενείς χωρίς συμπτώματα που παίρνουν προκαιναμίδιο. Για τους ασθενείς με συμπτώματα σαν του λύκου, η Χρωματίνη ELISA παράγει 20 από 26 θετικά ενώ η Ιστόνη ELISA παράγει μόνο 19 θετικά. Ένας αριθμός από αυτά τα δείγματα δείχνουν περισσότερη δράση στην Χρωματίνη ELISA από ότι στην Ιστόνη ELISA. Από τους ασθενείς που παίρνουν προκαιναμίδιο αλλά είναι χωρίς συμπτώματα σαν του λύκου, μόνο 17 από τους 67 ήταν θετικοί στην Χρωματίνη ELISA, και μόνο 4 ήταν ισχυροί αντιδρώντες. Ωστόσο, 34 ήταν θετικοί με την Ιστόνη ELISA, και 21 από αυτούς ήταν ισχυροί αντιδρώντες. Επομένως, τα αντισώματα της αντι-χρωματίνης είναι περισσότερο ικανά να διαφοροποιούνται μεταξύ ομάδων με συμπτώματα και ομάδων χωρίς συμπτώματα από ότι τα αντισώματα της αντι-ιστόνης 9,10,13. Σύγκριση ασθενών (n=26) με συμπτώματα που παίρνουν προκαιναμίδιο με τη μέθοδο INOVA Chromatin ELISA και τη μέθοδο INOVA Histone ELISA. Ασθενείς με Συμπτώματα n=26 Χρωματίνη ELISA Αρνητικό Μέτριο Ισχυρό Αρνητικό 6 1 0 Histone ELISA Μέτριο 0 1 0 Ισχυρό 0 1 17 5

Σύγκριση ασθενών χωρίς συμπτώματα που παίρνουν προκαιναμίδιο με τη μέθοδο INOVA Chromatin ELISA και τη μέθοδο INOVA Histone ELISA. Ασθενείς χωρίς Συμπτώματα n=67 Χρωματίνη ELISA Αρνητικό Μέτριο Ισχυρό Αρνητικό 32 1 0 Histone ELISA Μέτριο 8 5 0 Ισχυρό 10 7 4 Η Χρωματίνη ELISA είναι επίσης πιο ευαίσθητη από την Ιστόνη ELISA για την ανίχνευση ασθενών με SLE. Ένα υψηλότερο ποσοστό ήταν θετικό στη Χρωματίνη ELISA και πολλά από αυτά έδειξαν ισχυρότερη δράση. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν αναμενόμενα, βασισμένα σε εκδομένες μελέτες. 6,7,8 Τα στοιχεία συνοψίζονται στον πίνακα παρακάτω. Σύγκριση ασθενών με SLE με τη μέθοδο INOVA Chromatin ELISA και τη μέθοδο INOVA Histone ELISA. SLE n=45 Χρωματίνη ELISA Αρνητικό Μέτριο Ισχυρό Αρνητικό 14 1 1 Histone ELISA Μέτριο 1 6 4 Ισχυρό 0 1 17 Συνδυάζοντας τα στοιχεία από τους παραπάνω πίνακες με τα αποτελέσματα από τον κανονικό πίνακα και τους καρδιακούς ελέγχους δημιουργήθηκε η σχετική ευαισθησία και ακρίβεια της Χρωματίνης ELISA συνδυασμένης με την Iστόνη ELISA. Συνολικά Δείγματα Χρωματίνη ELISA Αρνητικό Θετικό Ιστόνη ELISA Αρνητικό 280 5 Θετικό 28* 67 Σχετική ευαισθησία = 70%. Σχετική ακρίβεια = 98%. * Από τα 28 δείγματα θετικά με την Ιστόνη ELISA αλλά αρνητικά με την Χρωματίνη ELISA, 18 ήταν ασθενείς χωρίς συμπτώματα που παίρνουν προκαιναμίδιο, 8 ήταν υγιείς εθελοντές, και 1 ήταν δείγμα για καρδιακό έλεγχο. Κλινική Ευαισθησία και Ειδικότητα Χρωματίνη Θετικά Ομάδα Ασθενών Συνολικός Αριθμός # % Υγιείς εθελοντές 210 2 1% Λύκος που προκαλείται 26 20 77% από προκαιναμίδιο με συμπτώματα Λύκος που προκαλείται 67 17 25% από προκαιναμίδιο χωρίς συμπτώματα Καρδιακοί ασθενείς 29 0 0% που ταιριάζουν σε φύλο και ηλικία SLE 48 33 69% Βασισμένα στην παραπάνω μελέτη, η κλινική ευαισθησία της Χρωματίνης ELISA για το DIL και την SLE είναι 72% και η κλινική ακρίβεια είναι 94%. Αυτά τα νούμερα συμφωνούν με εκείνα στα βιβλία. 11 Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Κατά τη διάρκεια της εξέτασης Πέντε δείγματα εξετάστηκαν δεκαοκτώ φορές το καθένα σε μία πλάκα ELISA. Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Μέση τιμή 61 U 49 U 91 U 75 U 133 U SD 2.9 U 2.7 U 4.1 U 5.2 U 5.1 U CV 4.8% 5.6% 4.5% 7.0% 3.9% Για να καθοριστεί η ακρίβεια κατά τη διάρκεια της εξέτασης κοντά στην αποκοπή της χρωματίνης ELISA, εξετάστηκαν 5 δείγματα 14 φορές το καθένα σε μία πλάκα ELISA. Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Μέση τιμή 22 U 26 U 30 U 22 U 21 U SD 0.9 U 1.4 U 1.4 U 0.9 U 0.9 U CV 4.3% 5.3% 4.5% 3.9% 4.4% Ανάμεσα στην εξέταση Πέντε θετικά δείγματα εξετάστηκαν μια φορά κάθε μέρα για 5 ξεχωριστές ημέρες. Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Μέση τιμή 67 U 57 U 110 U 84 U 167 U SD 4.3 U 4.1 U 8.6 U 4.7 U 10.2 U CV 6.4% 7.1% 7.8% 5.6% 6.1% 6

Βιβλιογραφία 1. Lachman PJ: An attempt to characterize the lupus erythematosus cell antigen. Immunology 4:153-163, 1961. 2. Robitaille P, et al.: Relationship between deoxyribonucleo-protein and deoxyribonucleic acid antibodies in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 52:316-323, 1973. 3. Fritzler MJ and Tan EM: Antibodies to histones in drug-induced and idiopathic lupus. J Clin Invest 62:560-567, 1978. 4. Halbert SP, et al.: Studies on autoantibodies to deoxyribonucleic acid and deoxyribonucleoprotein with enzyme immunoassay (ELISA). J Lab Clin Med 97: 97-111, 1981. 5. Burlingame RW and Rubin RL: Subnucleosome structures as substrates in enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods 134: 187-199, 1990. 6. Karsh J, et al.: Anti-DNA, anti-deoxyribonucleoprotein and rheumatoid factor in patients with systemic lupus erythematosus, Sjogren s syndrome and rheumatoid arthritis. Int Arch Allergy Appl Immunol 68: 60-69, 1982. 7. Burlingame RW, et al.: The central role of chromatin in the autoimmune responses to histones and DNA in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 94: 184-192, 1994. 8. Chabre H, et al.: Presence of nucleosome-restricted antibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 38: 1485-1491, 1995. 9. Burlingame RW and Rubin RL: Drug-induced anti-histone autoantibodies display two patterns of reactivity with substructures of chromatin. J Clin Invest 88: 680-690, 1991. 10. Rubin RL, et al.: Autoantibodies associated with lupus induced by diverse drugs target a similar epitope in the (H2A-H2B)-DNA complex. J Clin Invest 90: 165-173, 1992. 11. Burlingame RW: The clinical utility of antihistone antibodies: Autoantibodies reactive with chromatin in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus. Clin Lab Med 17: 367-378, 1997. 12. Rubin RL: Autoantibody specificity in drug-induced lupus and neutrophil-mediated metabolism of lupus-inducing drugs. Clin Biochem 25: 223-234, 1992. 13. Rubin RL, et al.: IgG but not other classes of anti[(h2a-h2)-dna] is an early sign of procainamideinduced lupus. J Immunol 154: 2483-2493, 1995. 14. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: 1271-1277, 1982. 15. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628710GRC September 2009 Revision 5 7