RIDASCREEN. Spec. IgE. Art. No.: A0041 RIDASCREEN Spec. IgE Reagents Art. No.: A0040 RIDASCREEN Spec. IgE Reagents

RIDASCREEN Spec. IgE Art. No.: A0041 RIDASCREEN Spec. IgE Reagents Art. No.: A0040 RIDASCREEN Spec. IgE Reagents Also applies to: Αρ. τεµ.: A0049 RIDASCREEN Allergen Disc Αρ. τεµ.: A0249 RIDASCREEN Spec. IgE Allergen Disc Αρ. τεµ.: A004006 RIDASCREEN Spec. IgE Set of Standards and Controls Αρ. τεµ.: A0251 RIDASCREEN Spec. IgE Allergy Panel 1, Atopy Αρ. τεµ.: A0252 RIDASCREEN Spec. IgE Allergy Panel 2, Inhalative Αρ. τεµ.: A0253 RIDASCREEN Spec. IgE Allergy Panel 3, Food Αρ. τεµ.: A0254 RIDASCREEN Spec. IgE Allergy Panel 4, Pediatric R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Γερµανία, Τηλ.: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Φαξ: +49 (0) 61 51 81 02-20

1. Πεδίο εφαρµογής Για διάγνωση in vitro. Η δοκιµή RIDASCREEN Spec. IgE είναι ένας ενζυµοανοσολογικός προσδιορισµός (EIA) για την ποσοτική µέτρηση ειδικών αντισωµάτων IgΕ στον ανθρώπειο ορό. Η δοκιµή πρέπει να χρησιµοποιείται εάν υπάρχει αιτιολογηµένη υποψία αλλεργίας βάσει του ιστορικού του ασθενούς και διάγνωσης invivo µε σκοπό την επιβεβαίωση. Επίσης, για την αποσαφήνιση αποτελεσµάτων της διάγνωσης in-vivo που δεν συµφωνούν µε το ιστορικό, µπορούν να µετρηθούν µε τη δοκιµή αυτή τα ειδικά αντισώµατα IgE έναντι αλλεργιογόνων. 2. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιµής Καθήκον του ανοσοποιητικού συστήµατος είναι η άµυνα σε παθογόνα βακτήρια, ιούς και µικροοργανισµούς. Με την άµυνα αυτή εξασφαλίζει την προστασία του οργανισµού κατά την πρώτη επαφή µε τους παθογόνους φορείς αλλά και την ανοσοποίηση σε περίπτωση επανειληµµένης επαφής. Πριν από κάθε αλλεργική αντίδραση έχει προηγηθεί επίσης µια πρώτη επαφή χωρίς συµπτώµατα, κατά την οποία σχηµατίστηκαν ήδη ειδικά αντισώµατα της κλάσης E (αντισώµατα IgE). Σε περίπτωση επανειληµµένης επαφής µε τον αλλεργιογόνο φορέα αυτά τα αντισώµατα IgE αντιδρούν µε τα αλλεργιογόνα και οδηγούν σε κατανοµή µεσαζόντων (κυρίως από κύτταρα παραγωγής) όπως ισταµίνη, λευκοτρίνη, προσταγλανδίνη κ.λπ., τα οποία προκαλούν τα συµπτώµατα της αλλεργίας. Με τη µέτρηση αυτών των ειδικών αντισωµάτων IgE στον ορό µπορούν να εντοπιστούν οι αλλεργιογόνες ουσίες σε περίπτωση αλλεργικών αντιδράσεων. Ωστόσο, είναι επίσης δυνατή και η µέτρηση ευαισθητοποίησης χωρίς συµπτώµατα. Η δοκιµή αποκαλείται Enzym-Allergo-Sorbent-Test (EAST) και έχει ως βάση τους δίσκους κυτταρίνης. Όλα τα αντιδραστήρια που αναφέρονται στο σηµείο 4. (A0041 ή A0040) έχουν επικυρωθεί µε το δίσκο αλλεργιογόνων της εταιρείας R-Biopharm (A0049). Σε περίπτωση χρήσης αυτών των αντιδραστηρίων µε δίσκους άλλων κατασκευαστών επαφίεται στον χρήστη να προβεί στην επαλήθευση της δοκιµής. 3. Αρχές της δοκιµής Όλα τα αλλεργιογόνα δεσµεύονται σε δίσκους κυτταρίνης. Για την εκτέλεση της δοκιµής οι δίσκοι αλλεργιογόνων τοποθετούνται στις κοιλότητες µιας µικροπλάκας ή σύµφωνα µε τις οδηγίες του ιατρού. Στις δοκιµές αλλεργίας (αρ. προϊόντος A0250 A0254) έχουν τοποθετηθεί ήδη οι δίσκοι των αλλεργιογόνων στις 16άρες λωρίδες µικροτίτλων. Σ ένα πλαίσιο µπορούν 2 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

να συνδυασθούν 5 16άρες λωρίδες µικροτίτλων διαφορετικών σετ σε µια ολόκληρη πλάκα, όπου οι πρώτες δύο στήλες Α και Β πρέπει πάντα να είναι κατειληµµένες µε τα πρότυπα και τα κοντρόλ. Οροί ασθενούς, πρότυποι οροί, αρνητικά και θετικά κοντρόλ τοποθετούνται µε πιπέτα στους κατάλληλους δίσκους και επωάζονται στους 37 C. Με τον τρόπο αυτό δεσµεύονται τα ειδικά για τα αλλεργιογόνα αντιγόνα IgE στα αλλεργιογόνα. Το υλικό που δεν δεσµεύεται αποµακρύνεται µε πλύση. Στη συνέχεια προστίθεται ένα αντι-ανθρώπειο µονοκλωνικό αντισώµα IgE συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση. Ο συζεύκτης που δεν δεσµεύεται αποµακρύνεται µε πλύση. Τέλος, προστίθεται το υπόστρωµα το οποίο αφαιρείται ο φώσφορος µέσω του συζευγµένου ενζύµου σε ένα κιτρινόχρωµο προϊόν. Η ένταση του κίτρινου χρώµατος είναι ανάλογη µε την ποσότητα των ειδικών για τα αλλεργιογόνα αντισωµάτων στον ορό. Η µέτρηση γίνεται µε τη φωτοµετρική µέθοδο σε 405 nm και σε µήκος αναφοράς κύµατος 620 nm. Ορισµένα αλλεργιογόνα ενώνονται µέσω του HSA (λευκωµατίνη ανθρώπειου ορού) στο δίσκο κυταρρίνης. Για τα αλλεργιογόνα αυτά πρέπει να χρησιµοποιηθεί επιπλέον ένας δίσκος HSA ανά ασθενή για τη µέτρηση της µη ειδικής για τα αλλεργιογόνα ένωσης. Τα σχετιζόµενα αλλεργιογόνα επισηµαίνονται στις λίστες κωδικών της R- Biopharm AG µε την προσθήκη του "- HSA". 4. Περιεχόµενα συσκευασίας Πίν.1: Περιεχόµενα συσκευασίας, RIDASCREEN Spec. IgE Reagents (αρ. τεµ. A 0041) Plate 1-96 προσδ. 1 µικροπλάκα DiscS 10 ίσκοι προτύπων DiscC 2 ίσκοι κοντρόλ DiscA AllergyWB 60 ml Standard 1 500 µl ίσκοι αλλεργιογόνων, αριθµός σύµφωνα µε τον πελάτη (δεν συµπεριλαµβάνονται στο σετ αντιδραστηρίων A 0041) ιάλυµα πλύσης, 16πλη συγκέντρωσης, 0,9% NaN 3, Χρώµα καλύµµατος: διαφανές Πρότυπος ορός 1, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 0,35, σε σταθεροποιηµένο 3 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

Standard 2 500 µl Standard 3 500 µl Standard 4 500 µl Standard 5 500 µl Control + 500 µl Control - 500 µl Πρότυπος ορός 2, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 0,70, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 3, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 3,50, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 4, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 17,50, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 5, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 50,00, σε σταθεροποιηµένο Θετικό κοντρόλ IgE, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, έτοιµος για χρήση, συγκέντρωση: βλ. πιστοποιητικό, σε σταθεροποιηµένο Χρώµα καλύµµατος: µικρό κόκκινο κάλυµµα Αρνητικό κοντρόλ IgE, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, έτοιµος για χρήση; συγκέντρωση: βλ. πιστοποιητικό, σε σταθεροποιηµένο Conjugate AllergySub AllergyStop 6 ml 12 ml 12 ml Χρώµα καλύµµατος: µικρό µπλε κάλυµµα Aντι-ανθρώπειος συζεύκτης IgE, (µονοκλωνικός). Έτοιµος προς χρήση. Αντισώµα συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση σε σταθεροποιηµένο Χρώµα καλύµµατος: µπλε διάλυµα υποστρώµατος, διάλυµα pnpp σε διαιθανολαµίνη, έτοιµο προς χρήση, Χρώµα καλύµµατος: µαύρο διάλυµα παύσης, 7,4% EDTA, έτοιµο προς χρήση Χρώµα καλύµµατος: πράσινο 4 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

Πίν.2: Περιεχόµενα συσκευασίας, RIDASCREEN Spec. IgE Reagents (αρ. τεµ. A 0040) Plate 1-192 προσδ 2 Μικροπλάκες DiscS 20 ίσκοι προτύπων DiscC 4 ίσκοι κοντρόλ DiscA AllergyWB 2 x 60 ml Standard 1 500 µl Standard 2 500 µl Standard 3 500 µl Standard 4 500 µl Standard 5 500 µl Control + 500 µl Control - 500 µl Conjugate 12 ml ίσκοι αλλεργιογόνων, αριθµός σύµφωνα µε τον πελάτη (δεν συµπεριλαµβάνονται στο σετ αντιδραστηρίων A 0040) ιάλυµα πλύσης, 16πλη συγκέντρωσης, 1% NaN 3, Χρώµα καλύµµατος: διαφανές Πρότυπος ορός 1, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 0,35, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 2, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 0,70, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 3, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 3,50, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 4, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 17,50, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 5, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 50,00, σε σταθεροποιηµένο Θετικό κοντρόλ IgE, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, έτοιµος για χρήση, συγκέντρωση: βλ. πιστοποιητικό, σε σταθεροποιηµένο, Χρώµα καλύµµατος: µικρό κόκκινο κάλυµµα Αρνητικό κοντρόλ IgE, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, έτοιµος για χρήση, συγκέντρωση: βλ. πιστοποιητικό, σε σταθεροποιηµένο, Χρώµα καλύµµατος: µικρό µπλε κάλυµµα Aντι-ανθρώπειος συζεύκτης IgE, (µονοκλωνικός), έτοιµος προς χρήση, αντισώµα συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση σε σταθεροποιηµένο, Χρώµα καλύµµατος: µπλε 5 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

AllergySub AllergyStop 2 x 12 ml 12 ml διάλυµα υποστρώµατος, διάλυµα pnpp σε διαιθανολαµίνη, έτοιµο προς χρήση, Χρώµα καλύµµατος: µαύρο διάλυµα παύσης, 7,4% EDTA, έτοιµο προς χρήση Χρώµα καλύµµατος: πράσινο Πίν.3: Περιεχόµενα συσκευασίας, RIDASCREEN Spec. IgE Set of Standards and Controls (αρ. τεµ. A 004006) DiscS 40 ίσκοι προτύπων DiscC 8 ίσκοι κοντρόλ, Standard 1 500 µl Standard 2 500 µl Standard 3 500 µl Standard 4 500 µl Standard 5 500 µl Control + 500 µl Control - 500 µl Πρότυπος ορός 1, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 0,35, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 2, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 0,70, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 3, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 3,50, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 4, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 17,50, σε σταθεροποιηµένο Πρότυπος ορός 5, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, συγκέντρωση (σε IU IgE/ml): 50,00, σε σταθεροποιηµένο Θετικό κοντρόλ IgE, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, έτοιµος για χρήση, συγκέντρωση: βλ. πιστοποιητικό, σε σταθεροποιηµένο, Χρώµα καλύµµατος: µικρό κόκκινο κάλυµµα Αρνητικό κοντρόλ IgE, αραιωµ. ανθρώπειος ορός, έτοιµος για χρήση, συγκέντρωση: βλ. πιστοποιητικό, σε σταθεροποιηµένο, Χρώµα καλύµµατος: µικρό µπλε κάλυµµα 6 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

5. Αντιδραστήρια και η αποθήκευσή τους Το σετ δοκιµής πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C και να χρησιµοποιείται το αργότερο µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Το αραιωµένο διάλυµα πλύσης µπορεί να διατηρηθεί το πολύ για 4 εβδοµάδες στους 2-8 C. Πρέπει να αποφευχθεί η µικροβιακή µόλυνση. Μετά το πέρας της ηµεροµηνίας λήξης δεν αναλαµβάνεται πλέον καµία εγγύηση για την ποιότητα. Αποφύγετε µόλυνση του διαλύµατος υποστρώµατος µε συζεύκτη, καθώς έτσι προκαλείται αλλαγή του χρώµατος του υποστρώµατος. Επίσης, αποφύγετε την άµεση έκθεση του υποστρώµατος στο φως, ώστε να αποτραπεί η αποσύνθεση ή η αλλοίωση του χρώµατος εξαιτίας υδρόλυσης. Σε περίπτωση αλλοίωσης του χρώµατος το υπόστρωµα δεν µπορεί πλέον να χρησιµοποιηθεί. Ανατρέξτε επίσης στο σηµείο 10. Έλεγχος ποιότητας Ενδείξεις αλλοίωσης αντιδραστηρίων. 6. Πρόσθετα απαραίτητα αντιδραστήρια - απαιτούµενος εξοπλισµός 6.1. Αντιδραστήρια Αποστειρωµένο ή απιονισµένο νερό 6.2. Εξοπλισµός Φωτόµετρο για µικροπλάκες (µε φίλτρο 405 και 620 nm), περιοχή µέτρησης 0 έως 3,5 OD. Πλυντήριο για µικροπλάκες ή συσκευή χειροκίνητου πλυσίµατος (βούρτσα, αντλία, δοχείο για απόθεµα διαλύµατος και απορριµάτων) 37 C συσκευή επώασης Μικροπιπέτα 10-100 µl Μικροπιπέτα 8 καναλιών ή πολλών βηµάτων Ογκοµετρικός κύλινδρος (1000 ml) 7. Μέτρα προφύλαξης Μόνο για διάγνωση in vitro. Η δοκιµή αυτή πρέπει να εκτελείται µόνο από ειδικευµένο προσωπικό εργαστηρίου. Πρέπει να τηρούνται οι κανονισµοί για την εργασία σε ιατρικά εργαστήρια. Πρέπει να τηρούνται αυστηρώς οι οδηγίες για την εκτέλεση της δοκιµής. Μην χορηγείτε τα δείγµατα ή τα αντιδραστήρια µε το στόµα χρησιµοποιώντας πιπέτα, αποφύγετε την επαφή µε τραυµατισµένο δέρµα ή τους βλεννογόνους. Κατά τη 7 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

διάρκεια της εργασίας µε δείγµατα, φοράτε γάντια µίας χρήσης και µετά την ολοκλήρωση της δοκιµής πλένετε τα χέρια σας. Μην καπνίζετε, τρώτε ή πίνετε σε περιοχές όπου διενεργούνται εργασίες µε δείγµατα ή αντιδραστήρια δοκιµών. Οι οροί κοντρόλ που υπάρχουν στο σετ (πρότυποι οροί, θετικά και αρνητικά κοντρόλ) εξετάστηκαν για HIV και HCV-Ak καθώς και HbsAg και σύφιλη CFR 21.640 και βρέθηκαν αρνητικά. Εντούτοις θα πρέπει να µεταχειρίζεστε τους ορούς όπως και όλα τα δείγµατα ασθενών και όλα τα υλικά που έρχονται σε επαφή µε αυτούς ως δυνητικά µολυσµένα και ο χειρισµός τους να γίνεται σύµφωνα µε τις εκάστοτε ισχύουσες εθνικές διατάξεις ασφαλείας. Το συγκεντρωµένο διάλυµα πλύσης περιέχει ως συντηρητικό αζίδιο του νατρίου. Αποφύγετε την επαφή µε το δέρµα ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση επαφής µε σωλήνες από µόλυβδο ή χαλκό ενδέχεται να δηµιουργηθούν µεταλλικά αζίδια. Όλα τα περιεχόµενα του σετ θα πρέπει να απορρίπτονται µετά τη χρήση όπως πρέπει και µε δική σας ευθύνη. Όλα τα αντιδραστήρια και τα υλικά, τα οποία έρχονται σε επαφή µε ενδεχοµένως µολυσµατικά δείγµατα, θα πρέπει να απολυµαίνονται µε κατάλληλα απολυµαντικά ή να αποστειρώνονται για τουλάχιστον 1 ώρα σε αυτόκαυστο στους 121 C. 8. Συλλογή και αποθήκευση δειγµάτων Η δοκιµή έχει αναπτυχθεί για την εξέταση ανθρώπειου ορού. Μετά τη λήψη αίµατος θα πρέπει να γίνει το συντοµότερο δυνατό διαχωρισµός του ορού από το πήγµα αίµατος, ώστε να αποφευχθεί αιµόλυση. Τα δείγµατα πρέπει να αποθηκεύονται µέχρι τη δοκιµή κρύα ή κατεψυγµένα. Αποφεύγετε οπωσδήποτε την επανειληµµένη ψύξη και απόψυξη του δείγµατος, καθώς και τη µικροβιακή µόλυνση. Η χρήση ορών που αδρονοποιούνται µε θερµότητα, λιπαιµικών, αιµολυτικών, ικτερικών ή θολών ορών µπορεί να οδηγήσει σε εσφαλµένα αποτελέσµατα. Πίνακας 2: Αποθήκευσης δείγµατος µη αραιωµένος ορός 2-8 C 20 C 1 εβδοµάδα > 1 εβδοµάδα 8 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

9. Εκτέλεση δοκιµής 9.1. Γενικά Πριν τη χρήση όλα τα αντιδραστήρια, οι οροί ασθενούς και η µικροπλάκα πρέπει να θερµαίνονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Τα αντιδραστήρια πρέπει να αναδεύονται καλά άµεσα πριν τη χρήση. Μετά τη χρήση, αποθηκεύστε αµέσως το σετ πάλι στους 2-8 C. Οι δίσκοι προτύπων, κοντρόλ και αλλεργιογόνων δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν ξανά. Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια και δίσκους, των οποίων η συσκευασία ήταν κατεστραµµένη ή το δοχείο µη αεροστεγές. Οι δίσκοι των αλλεργιογόνων απαγορεύεται να έχουν ξεραθεί. Εξαίρεση: Τα αντιβιοτικά β λακτάµης ( C1, C2, C49, C50, C54, C55, C56, C64, C67) σε σπαστά τεµάχια (A0049). εν επιτρέπεται η αντικατάσταση ή ο συνδυασµός τµηµάτων τουσετ µε σετ από παρτίδες µε διαφορετικό αριθµό. Αποκλίσεις από τους προκαθορισµένους χρόνους και θερµοκρασίες επώασης οδηγούν σε µετατόπιση της τυπικής καµπύλης σε σύγκριση µε το πιστοποιητικό. Μεγάλη µετατόπιση των τυπικών τιµών καµπύλης οδηγεί σε άκυρα αποτελέσµατα δοκιµής. Αποφύγετε την άµεση έκθεση σε ηλιακή ακτινοβολία κατά τη διεξαγωγή της δοκιµής. Συνιστάται η κάλυψη των µικροπλακών. Για τις επωάσεις των µικροπλακών δεν επιτρέπεται η χρήση υγρού θαλάµου! 9.2. Παρασκευή διαλύµατος πλύσης Κάθε φιάλες διαλύµατος πλύσης AllergyWB γεµίζεται µε αποστειρωµένο νερό µέχρι τα 1000 ml. ιαλύστε εκ των προτέρων τυχόν κρυστάλλους που υπάρχουν στο συµπύκνωµα µε θέρµανση (µπαν-µαρί στους 37 C). 9.3. Κάλυψη των µικροπλακών µε τους δίσκους αλλεργιογόνων Κατά την παράδοση της µικροπλάκας Plate πρέπει να είναι ήδη τοποθετηµένοι όλοι οι δίσκοι DiscS, DiscC και DiscA σύµφωνα µε το πρωτόκολλο του πελάτη. Για κάθε ορό ασθενούς που εξετάζεται για αλλεργιογόνο HSA, έχει τοποθετηθεί ένας δίσκος HSA επιπρόσθετα στους δίσκους αλλεργιογόνων. Κατά την παράδοση δίσκων αλλεργιογόνων σε σπαστά τεµάχια (Α0049) πρέπει να τοποθετηθούν οι κοιλότητες µε τους δίσκους αλλεργιογόνων DiscA στο πλαίσιο συγκράτησης του σετ αντιδραστηρίων σπάζοντας τα τεµάχια σύµφωνα µε το πρωτόκολλο επεξεργασίας. Στο πλαίσιο συγκράτησης του σετ αντιδραστηρίων οι 9 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

πρότυποι δίσκοι DiscS και οι δίσκοι κοντρόλ DiscC βρίσκονται ήδη τοποθετηµένοι στη σωστή θέση. Για κάθε ασθενή που εξετάζεται για αλλεργιογόνα HSA, πρέπει να τοποθετηθεί µία κοιλότητα µε ένα δίσκο HSA επιπρόσθετα στους δίσκους αλλεργιογόνων. Στις δοκιµές πάνελ (A0250-A0254) έχουν τοποθητηθεί ήδη τα πάνελ µε 16 αλλεργιογόνα εκάστοτε στο πλαίσιο. Είναι δυνατή η αλληλοεπεξεργασία διαφορετικών πάνελ στο ίδιο πλαίσιο. Αυτό γίνεται αφαιρώντας τα πάνελ από την παραδοθείσα πλάκα και ανταλλάσσοντας αυτά µε τα πάνελ που επιθυµείτε. Λάβετε υπόψη ότι είναι δυνατή η επεξεργασία µόνο µιας ολόκληρης πλάκας γιατί η ποσότητα των αντιδραστηρίων έχει υπολογισθεί έτσι αντίστοιχα. 9.4. Πρώτη επώαση Αφαιρέστε την µεµβράνη από την πλάκα. Προσέξτε να µην κολλήσουν δίσκοι αλλεργιογόνων στην µεµβράνη και αφαιρεθούν µαζί µε την µεµβράνη. Το διάλυµα που υπάρχει στις κοιλότητες πρέπει να αφαιρεθεί τελείως µέσω απορρόφησης. Στις κοιλότητες εισάγονται µε πιπέτα από 50 µl πρότυπων ορών Standard 1, Standard 2, Standard 3, Standard 4 και Standard 5, θετικού κοντρόλ - Control + και αρνητικού κοντρόλ Control - και οι οροί του ασθενούς. Συνίσταται η χρήση και των πέντε προτύπων. Τέλος η πλάκα Plate καλύπτεται και ακολουθεί επώαση για 60 λεπτά στους 37 C. 9.5. Πλύση Οι κοιλότητες πλένονται 6 φορές µε πλήρωση αραιωµένου διαλύµατος πλύσης και απορρόφηση. Κατά την τελευταία απορρόφηση θα πρέπει οι δίσκοι να παραµένουν στις κοιλότητες. Σε περίπτωση χρήσης αυτόµατου πλυντηρίου (συνιστάται) γίνεται πλύση µε 700 µl αραιωµένο διάλυµα πλύσης µε ταυτόχρονη απορρόφηση (κατάλληλη ρύθµιση Overflow). Ελέγχετε από πριν τη σωστή ρύθµιση της συσκευής ανάλογα µε το µέγεθος του χρησιµοποιούµενου τύπου µικροπλάκας. Σε περίπτωση χρήσης χειροκίνητου συστήµατος πλύσης κάθε φάση εκτελείται µε τον ανώτατο όγκο πλήρωσης. Μην χρησιµοποιείτε πιπέττες για την πλύση! Τόσο για το αυτόµατο όσο και για το χειροκίνητο πλύσιµο, η δέσµη υγρού θα πρέπει να κατευθύνεται στο περιθώριο του δίσκου, ώστε οι δίσκοι να περιστρέφονται γύρω από τον άξονά τους κατά την προσθήκη διαλύµατος πλύσης, διαδικασία µε την οποία επιτυγχάνεται καλύτερη πλύση. εν πρέπει να µειώνεται ούτε ο αριθµός των φάσεων πλύσης ούτε ο όγκος του διαλύµατος πλύσης. 10 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

9.6. εύτερη επώαση Εισαγωγή 50 µl συζεύκτη Conjugate στις κατειληµµένες κοιλότητες. Τέλος η πλάκα καλύπτεται και ακολουθεί επώαση για 60 λεπτά στους 37 C. 9.7. Πλύση Πλύσεις σύµφωνα µε το σηµείο 9.5. 9.8. Τρίτη επώαση και µέτρηση Προσθέστε µε πιπέτα 100 µl διαλύµατος υποστρώµατος AllergySub σε όλες τις κατειληµµένες κοιλότητες. Ακολουθεί επώαση µε καλυµµένη πλάκα για 15 λεπτά στους 37 C. Με την προσθήκη 50 µl αντιδραστηρίου παύσης AllergyStop σε όλες τις κοιλότητες διακόπτεται η αντίδραση. Η µέτρηση της εξάλειψης γίνεται σε 405 nm και σε µήκος αναφοράς κύµατος 620 σε όλους τους δίσκους αλλεργιογόνων. Η πλάκα µπορεί να µετρηθεί ξανά εντός 24 ωρών, εάν αποθηκευτεί σε κρύο µέρος και σκεπασµένη. 10. Έλεγχος ποιότητας Ενδείξεις αλλοίωσης αντιδραστηρίων Σε κάθε εκτέλεση δοκιµής πρέπει να χρησιµοποιούνται σε κάθε πλάκα τούς Πρότυπους ορούς 1-5 (µε διπλό προσδιορισµό) καθώς κι ένα θετικό και ένα αρνητικό κοντρόλ για τον έλεγχο ποιότητας. Η δοκιµή έχει εκτελεστεί σωστά, εάν η τιµή OD 405/620 για το πρότυπο είναι 5 > 1,0 και οι µετρηµένες κλάσεις EAST των δειγµάτων κυµαίνονται στην περιοχή τιµών που αναφέρεται στο συνηµµένο πιστοποιητικό. Απόκλιση από τις απαιτούµενες τιµές, όπως επίσης νεφέλες αντιδραστηρίων ή κίτρινος χρωµατισµός του άχρωµου υποστρώµατος πριν την εισαγωγή στις κοιλότητες, µπορεί να αποτελεί ένδειξη αλλοιωµένου αντιδραστηρίου. Σε περίπτωση που δεν σηµειωθούν οι προκαθορισµένες τιµές, πρέπει να ελεγχθούν τα παρακάτω πριν επαναληφθεί η δοκιµή: ηµεροµηνία λήξης του χρησιµοποιούµενου αντιδραστηρίου λειτουργική ικανότητα των χρησιµοποιούµενων συσκευών (π.χ. βαθµονόµηση) σωστή εκτέλεση της δοκιµής οπτικός έλεγχος των εξαρτηµάτων του σετ για µόλυνση ή έλλειψη στεγανότητας. Εάν το διάλυµα υποστρώµατος έχει κιτρινωπό χρώµα, δεν πρέπει να χρησιµοποιηθεί. Αν και µετά την επανάληψη της δοκιµής δεν πληρούνται οι προδιαγραφές, απευθυνθείτε στον τοπικό αντιπρόσωπο της R-Biopharm. 11 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

Συνιστάται η χρήση ήδη ελεγµένων δικών σας ορών ως κοντρόλ και η καταγραφή της κλάσης EAST που µετράται κάθε φορά. 11. Αξιολόγηση και ερµηνεία 11.1. Πόρισµα ορών 11.1.1. Βάσεις υπολογισµού Για την αξιολόγηση της δοκιµής απαιτείται η δηµιουργία µιας καµπύλης αναφοράς. Για το σκοπό αυτό εισάγονται τα πρότυπα µε διπλό προσδιορισµό σε κάθε πλάκα. Για τη δηµιουργία της καµπύλης αναφοράς εισάγονται οι µέσες τιµές εξάλειψης από τους διπλούς προσδιορισµούς των προτύπων ως συνάρτηση των αντίστοιχων συµπυκνώσεων (IU/ml) σύµφωνα µε το µισό λογάριθµο (y-lin-/x-log αρχείου καταγραφής) σε µια απεικόνιση point-to-point. Οι συγκεντρώσεις των αντισωµάτων ειδικού IgE µπορούν να υπολογιστούν βάσει της τυπικής καµπύλης από τις µετρηµένες τιµές OD και στη συνέχεια να υπολογιστούν εκ νέου σε κλάσεις EAST (βλ. πίνακα 5). Η αξιολόγηση µπορεί επίσης να γίνει µε την βοήθεια κατάλληλου λογισµικού. Η βαθµονόµηση της τυπικής καµπύλης του RIDASCREEN Spec. IgE γίνεται στο διεθνές παρασκεύασµα αναφοράς "2nd WHO IRP 75/502 for human IgE". 11.1.2. Συγκεντρώσεις, κλάσεις EAST, αξιολογήσεις Πίν. 5: Σχέση µεταξύ µετρηµένων τιµών IU/ml, κλάσεων EAST και ειδικών για τα αλλεργιογόνα τίτλων IgE ορού ασθενούς IU / ml Κλάση EAST Ειδικός για αλλεργιογόνα περιεχόµενα IgE 0,00 0,34 0 (0,0 0,9) µη µετρήσιµο ή δεν υπάρχει καθόλου 0,35 0,69 1 (1,0 1,9) χαµηλό 0,70 3,49 2 (2,0 2,9) υψηλό 3,50 17,49 3 (3,0 3,9) εµφανώς υψηλό 17,50 49,99 4 (4,0 4,9) υψηλό 50,00 99,99 5 (5,0 5,9) πολύ υψηλό 100,00 * 6 ( 6,0) * εξαιρετικά υψηλό* * προσδιορίζεται µε γραµµικό υπολογισµό κατά συµπερασµό, γιατί στη δοκιµή µπορούν να χρησιµοποιηθούν έως 5 πρότυπα. 12 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

11.1.3. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων αλλεργιογόνων µε δίσκους HSA Ορισµένα αλλεργιογόνα, όπως οι χηµικές ουσίες και τα περισσότερα φάρµακα, καθώς και ορισµένα τρόφιµα δεν δεσµεύονται άµεσα, αλλά µέσω της λευκωµατίνης ανθρώπειου ορού (HSA) στο δίσκο κυτταρίνης. Για την εξουδετέρωση της µη ειδικής ένωσης ή για τον αποκλεισµό µιας αλλεργίας έναντι HSA εξετάζεται ο ορός ασθενούς µεµονωµένα έναντι στο εξεταζόµενο αλλεργιογόνο HSA ή στο HSA. Εάν η τιµή της οπτικής πυκνότητας (OD) του καθαρού δίσκου λευκωµατίνης ανθρώπινου ορού (HSA) είναι χαµηλότερη από την τιµή της οπτικής πυκνότητας του προτύπου 1, τότε το αποτέλεσµα για τον δίσκο HSA είναι αρνητικό και µπορεί να γίνει η ποσοτική αξιολόγηση του αλλεργιογόνου HSA µε βάση την πρότυπη καµπύλη. Το αποτέλεσµα αποδίδεται σε κατηγορίες RAST. Εάν η τιµή της οπτικής πυκνότητας (OD) του καθαρού δίσκου λευκωµατίνης ανθρώπινου ορού (HSA) είναι ανώτερη ή ίση µε την τιµή της οπτικής πυκνότητας του προτύπου 1, τότε υπάρχουν ενδεχοµένως αντισώµατα IgE κατά της λευκωµατίνης ανθρώπινου ορού στον ορό του ασθενούς. Για τον ασθενή αυτόν δεν είναι δυνατή η αξιολόγηση των αλλεργιογόνων HSA. Εάν η τιµή της οπτικής πυκνότητας (OD) του καθαρού δίσκου λευκωµατίνης ανθρώπινου ορού (HSA) είναι µόνο µηδαµινά (έως το ανώτερο όπως η τιµή οπτικής πυκνότητας του προτύπου 2) θετική, συνιστάται η επανάληψη της δοκιµής έτσι ώστε να αποκλεισθεί λάθος από το σιφώνιο ή από φυσαλίδες αέρα στον δίσκο του αλλεργιογόνου που οδήγησαν ενδεχοµένως κατά τη διάρκεια της µέτρησης σε λανθασµένο θετικό αποτέλεσµα. 11.1.4. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων σε δίσκους πολλαπλών αλλεργιογόνων Πίν. 6: Σχέση µεταξύ µετρηµένων τιµών IU/ml, κλάσεων EAST και αξιολόγηση του ορού ασθενούς σε δίσκους πολλαπλών αλλεργιογόνων IU / ml Κλάση EAST Αξιολόγηση 0 0,34 0 αρνητικό 0,35 1 θετικό Εάν το αποτέλεσµα είναι θετικό θα πρέπει να ελεγχθεί ο σχετικός ορός για ειδικές αντιδράσεις στα αντίστοιχα µεµονωµένα αλλεργιογόνα. 13 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

12. Όρια της µεθόδου Οι συγκεντρώσεις IgE που µετρώνται µε αυτό το σύστηµα δοκιµής υποδεικνύουν το βαθµό ευαισθησίας του ασθενούς στα µεµονωµένα αλλεργιογόνα ή στο µίγµα αλλεργιογόνων που εξετάστηκαν. Από τη δοκιµή αυτή δεν είναι δυνατή η διαπίστωση µιας σχέσης µεταξύ του ύψους µιας µετρηµένης συγκέντρωσης IgE και την εµφάνιση ή την σοβαρότητα των κλινικών συµπτωµάτων. Τα αποτελέσµατα πρέπει να ερµηνεύονται πάντα σε συνδυασµό µε την πλήρη κλινική εικόνα. Σε περίπτωση απουσίας εθνικών ή διεθνών προτύπων και βάσει της ενδεχόµενης διαφοράς των διαλυµάτων αλλεργικής δερµατικής δοκιµής και των εκχυλισµάτων αλλεργιογόνων που χρησιµοποιούνται για δοκιµές in vitro, ενδέχεται τα αποτελέσµατα µεταξύ δοκιµών in vivo και in vitro να µην συµφωνούν. Ακόµη και ακριβώς µετά την εµφάνιση αναφυλακτικών αντιδράσεων υπάρχει το ενδεχόµενο µέτρησης εσφαλµένων αρνητικών ή πολύ χαµηλών τίτλων IgE. Σε περίπτωση ασύµφωνων αποτελεσµάτων µεταξύ διαγνώσεων in vivo και in vitro, θα πρέπει η δοκιµή να επαναληφθεί εντός 3-4 εβδοµάδων. Εάν εµφανιστούν ξανά οι ασυµφωνίες, θα πρέπει να εξεταστούν µε πρόσθετες δοκιµές in-vivo όπως δοκιµές πρόκλησης µε ένα αλλεργιογόνο. Οι δοκιµές πρόκλησης ενδέχεται να προκαλέσουν σοκ αναφυλαξίας. Τα θετικά αποτελέσµατα της δοκιµής µπορεί να οφείλονται στη διασταυρούµενη αντιδραστικότητα του εξεταζόµενου αλλεργιογόνου µε άλλα αλλεργιογόνα. εν µπορεί να αποκλειστεί το ενδεχόµενο κατά την παρασκευή των δίσκων αλλεργιογόνων να λείπουν αντιγονικές περιοχές αλλεργιογόνων, γεγονός που µπορεί να οδηγήσει σε εσφαλµένα αποτελέσµατα. 14 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

13. Χαρακτηριστικά απόδοσης Πίν. 7: Απόκλιση µεταξύ προσδιορισµών (Inter-Assay), βάσεις για τον υπολογισµό ήταν οι κλάσεις EAST µε 1 δεκαδικό ψηφίο. Inter-Assay Κλάση EAST 1-2 Κλάση EAST 3-4 Κλάση EAST 5-6 εξετασµένα αλλεργιογόνα Αρ. προσδιορισµών / αλλεργιογόνων Αριθµ. µέσο των VK G6, T3, W6, D2, E1, M6, 8 ανά 4 επαν./αλλεργιογόνα G6, T3, W6, D2, E1, I3, M6, F37, F4, F17, F49, F85, SX1, K82 8 ανά 4 επαν./αλλεργιογόνα G6, T3, W6, D2, I3, F27, F4, F85, K82 8 ανά 4 επαν./αλλεργιογόνα 11,7 % 3,44 % 3,65 % Πίν. 8: Απόκλιση στα πλαίσια ενός προσδιορισµού (Intra-Assay), βάσεις για τον υπολογισµό ήταν οι κλάσεις EAST µε 1 δεκαδικό ψηφίο. Intra-Assay Κλάση EAST 1-2 Κλάση EAST 3-4 Κλάση EAST 5-6 εξετασµένα αλλεργιογόνα Αρ. επαν./ αλλεργιογόνα Αριθµ. µέσο των VK G6, T3, W6, D2, E1, M6, F2, F37, F4, F17, K82 G6, T3, W6, D2, E1, I3, M6, F37, F4, F17, F49, F85, SX1, K82 G6, T3, W6, D2, I3, F27, F4, F85, K82 32 32 32 12,69 3,86 3,88% 13.1. Ευαισθησία Η ευαισθησία ανάλυσης των σετ δοκιµής που αναφέρεται αποδεικτικά στο πρότυπο υλικό, το οποίο βαθµονοµήθηκε σύµφωνα µε τα πρότυπα του ιεθνούς Οργανισµού Υγείας, µετρήθηκε µε την βοήθεια αλλεπάλληλων αραιώσεων του πρότυπου ορού και ανέρχεται κάτω από 0,24 IU/ml. Κριτήριο: Η µέση τιµή µέτρησης (OD 405-620 ) του βαθµού αραίωσης µε περιεχόµενο IgE 0,229 IU/ml διαφέρει από τη µέση τιµή µέτρησης περισσότερο από το διπλάσιο της τυπικής απόκλισης (95 % διάστηµα αξιοπιστίας). Η διαγνωστική ευαισθησία βρίσκεται κάτω από 0,35 IU/ml. 13.2. Ειδικότητα Μια επιλογή αντιπροσωπευτικών αλλεργιογόνων από 11 οµάδες αλλεργιογόνων εξετάστηκε µε διαφορετικούς ορούς σε σύστηµα άλλου προµηθευτή για διαγνώσεις αλλεργιών in-vitro. Το αποτέλεσµα ήταν ειδικότητα 91,2 % 15 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17

Βιβλιογραφία 1. Kersten, W., von Wahl, P.G., Lange, C.E., Wenning, J.: Empfehlungen zur invitro Diagnostik allergischer Erkrankungen. Allergologie, Jg. 23, Nr. 6, 304-307 (2000) 2. Kjellman, N.I.M.: Prediction and prevention of atopic allergy, Allergy 37, 463-473 (1982) 3. Debelic, M.: Die klinische Bedeutung der Bestimmung von Serum-Gesamt IgE und spezifischem IgE fur die Diagnostik und Verlaufsbeobachtung allergischer Krankheitsbilder. Therapiewoche 29, 2280-2295 (1979) 4. Urbanek, R,: Papier-Radio-Immuno-Sorbent-Test (PRIST) - IgE-Spiegel bei nicht allergischen und allergischen Kindern, Monatsschrift Kinderheilkunde 125, 583-585 (1977) 5. Kjellman, N.I.M., et al.: Serum IgE levels in healthy children quantified by a Sandwich technique (PRIST), Clin. Allergy 6, 51-59 (1976) 6. Turner, K.J.: IgE globulins and immunity. Medical Journal of Australia 2, 846 (1974) 7. Johannson, S.G.O.: Raised levels of a new immunoglobulin class (IgND) in asthma. Lancet II, 951-953 (1967) 8. Ishizaka, K., Ishizaka, T., Hornbook, M.M.: Physico-chemical properties of human reaginic antibody. IV. Presence of a unique immunoglobulin as a carrier of reaginic activity. Journal of Immunology 97, 75 (1966) 9. Bennich, H.H., et al.: Immunoglobulin E, a new class of human immunoglobulin. Bulletin World Health Organisation 38, 151 (1964) 16 RIDASCREEN Spec. IgE 2013-10-17