COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test ΓΙΑ IN VITRO ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test CMVCAP 72 Tests P/N: 04902068 190 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ To COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test είναι μια in vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση του DNA του κυτταρομεγαλοϊού σε ανθρώπινο πλάσμα EDTA με χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου για την αυτόματη επεξεργασία δειγμάτων και του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για αυτόματη ενίσχυση και ανίχνευση. Με την εξέταση μπορεί να εκτελεστεί ποσοτικοποίηση CMV DNA σε εύρος 150-10.000.000 αντιγράφων/ml. Ένα αντίγραφο CMV DNA (όπως ορίζεται από το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test) ισοδυναμεί με 0,91 ιεθνείς Μονάδες (IU) [1,1 cp/iu], βάσει του Πρώτου ιεθνούς Προτύπου του ΠΟΥ για τον Ανθρώπινο Κυτταρομεγαλοϊό για Τεχνικές Ενίσχυσης Νουκλεϊκού Οξέος (NIBSC 09/162) 40. Η εξέταση προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με την κλινική παρουσίαση και με άλλους εργαστηριακούς δείκτες για τη διάγνωση και αντιμετώπιση της μόλυνσης CMV σε ασθενείς που βρίσκονται σε κίνδυνο για μόλυνση από τη νόσο CMV. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test δεν προορίζεται για χρήση ως τεστ ελέγχου (screening test) για την παρουσία CMV σε αίμα ή παράγωγα αίματος ή ως διαγνωστική εξέταση για την επιβεβαίωση της παρουσίας μόλυνσης CMV. Τα αποτελέσματα του COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV Test πρέπει να ερμηνεύονται λαμβάνοντας υπόψη όλα τα σχετικά κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (HCMV ή CMV) είναι ένα ανθρώπινο ιικό παθογόνο που ανήκει στην οικογένεια των ιών έρπητα και βρίσκεται τόσο στις αναπτυγμένες βιομηχανικές κοινωνίες όσο και στις απομονωμένες αυτόχθονες ομάδες. 1,2 Μπορεί να μεταδοθεί με το αίμα, τις στοματοφαρυγγικές εκκρίσεις, τα ούρα, τις τραχηλικές και κολπικές απεκκρίσεις, τα σπερματικά υγρά, το μητρικό γάλα, τα δάκρυα και τα περιττώματα. 3-9 Οι πρωτοπαθείς μολύνσεις με CMV σε ανοσοεπαρκή άτομα είναι συνήθως ασυμπτωματικές και συχνά προκαλούν μη ανιχνεύσιμες λανθάνουσες μολύνσεις. Τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος και τα ενδοθηλιακά κύτταρα εμφανίζονται ως οι κυριότερες εστίες μόλυνσης. Ο CMV παραμένει σε λανθάνον στάδιο σε μονοκύτταρα/μακροφάγα στους ανθρώπους. 2 Τα άτομα με λανθάνουσες μολύνσεις μπορεί να αποβάλλουν περιοδικά τον ιό στα σωματικά τους υγρά και με αυτό τον τρόπο να μολύνουν άλλους. Τα ανοσοκατασταλμένα άτομα, συμπεριλαμβανομένων των νεογνών, των ασθενών που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση και των ασθενών με AIDS, είναι συνήθως σε υψηλό κίνδυνο για την ανάπτυξη σοβαρών μολύνσεων CMV που μπορεί να οδηγήσουν σε υψηλότερο ποσοστό νοσηρότητας και θνησιμότητας. 10 Οι σοβαρές κλινικές εκδηλώσεις της νόσου CMV περιλαμβάνουν το σύνδρομο CMV, την αμφιβληστροειδίτιδα, την γαστρεντερίτιδα, την ηπατίτιδα, την εγκεφαλίτιδα, την οισοφαγίτιδα, την εντεροκολίτιδα, την παγκρεατίτιδα και την πνευμονία. 1-13 Οι εργαστηριακές μέθοδοι για τη διάγνωση της διάχυτης μόλυνσης και της ενεργού νόσου τελικού οργάνου που οφείλεται στον ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό περιλαμβάνουν την απομόνωση του ιού με καλλιέργεια λευκοκυττάρων περιφερικού αίματος (PBL), ιστολογία βιοψιών, ορολογικές μεθόδους, μέτρηση του αντιγόνου pp65 και ανίχνευση του CMV DNA με μεθόδους αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). 14 Οι μέθοδοι ανάλυσης καλλιέργειας έχουν χαμηλή προγνωστική αξία, απαιτούν χρόνο εξαγωγής αποτελεσμάτων από 48 ώρες έως και 3 εβδομάδες και έχουν περιορισμένη χρήση ειδικότερα για ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. Η ανάλυση αντιγοναιμίας pp65 αποτελεί μια εντατική διαδικασία που απαιτεί την επεξεργασία του αίματος εντός έξι ωρών από τη συλλογή του λόγω της μείωσης της αντιγοναιμίας κατά την αποθήκευση. 15,22 Είναι επίσης δύσκολο να εκτελεστεί η ανάλυση pp65 σε ασθενείς με σοβαρή ουδετεροπενία. Τα θετικά αποτελέσματα CMV DNA στο πλάσμα με χρήση PCR έχουν επιδείξει καλό συσχετισμό με τη θετικότητα της καλλιέργειας των PBL και με τον αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης συστηματικής νόσου CMV. Ένας αριθμός μελετών έχει δείξει το συσχετισμό μεταξύ του ιικού φορτίου CMV και του κινδύνου ανάπτυξης της νόσου CMV. 16-19 Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου. 04898362052-05EL 1 Doc Rev. 5.0

Ο κίνδυνος ανάπτυξης της νόσου CMV ορίζεται εμφανώς από υψηλό ιικό φορτίο, γεγονός που τονίζει το σημαντικό ρόλο του ιικού τίτλου στην παθογένεια της νόσου. 18,27,30,31 Οι μελέτες σε δέκτες μοσχευμάτων και ασθενείς με AIDS έδειξαν ότι η ανίχνευση PCR του CMV DNA παρουσιάζει υψηλή προγνωστική αξία όσον αφορά στην περαιτέρω εξέλιξη και το κλινικό αποτέλεσμα της νόσου. 17,23-26 Οι ποσοτικές αξιολογήσεις των επιπέδων CMV DNA έδειξαν ότι τα υψηλά ιικά φορτία, καθώς και οι αυξήσεις του ιικού φορτίου με την πάροδο του χρόνου, συσχετίζονται με χειρότερες κλινικές προγνώσεις για διάφορες καταστάσεις κινδύνου CMV. 18,27,28 Επιπλέον, οι ποσοτικές αναλύσεις PCR επιτρέπουν την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της αντιικής θεραπείας και την έμμεση αξιολόγηση της ιικής αντίστασης. 26,29,30,32 Η χρήση του ιικού φορτίου CMV συνιστάται στις τρέχουσες οδηγίες θεραπείας σε μοσχεύματα στερεών οργάνων για παρακολούθηση των ασθενών σε σχέση με τον κίνδυνο ανάπτυξης νόσου CMV και την ανάγκη προληπτικής θεραπείας, καθώς και για την παρακολούθηση ασθενών με ενεργή νόσο CMV για απόκριση στη θεραπεία. 21,22 Συνιστάται επίσης η συμπερίληψή του στα διαγνωστικά κριτήρια για την ταυτοποίηση της νόσου CMV σε δέκτες μοσχευμάτων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. 33 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test είναι μια εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση του DNA του κυτταρομεγαλοϊού (CMV) στο ανθρώπινο πλάσμα. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test βασίζεται σε δύο κύριες διαδικασίες: (1) στην προετοιμασία δειγμάτων για την απομόνωση του CMV DNA και (2) στην ταυτόχρονη ενίσχυση PCR του DNA στόχου και ανίχνευση διπλά επισημασμένου διασπώμενου ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη ανίχνευσης ειδικού για το στόχο. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test επιτρέπει την αυτοματοποιημένη προετοιμασία δειγμάτων συνοδευόμενη από ενίσχυση PCR και ανίχνευση του DNA στόχου του CMV και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS) CMV. Το αντιδραστήριο Κυρίου Μίγματος περιέχει εκκινητές και ιχνηθέτες ειδικούς για το CMV DNA και το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης του CMV. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNΑ εκτελείται με ειδικούς για το στόχο και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένους ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες που επιτρέπουν την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) CMV και του κλώνου (amplicon) Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Η ποσοτικοποίηση του ιικού CMV DNA εκτελείται με τη χρήση του Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Αντισταθμίζει τυχόν φαινόμενα αναστολής και ελέγχει τις διαδικασίες προετοιμασίας και ενίσχυσης, επιτρέποντας ακριβέστερη ποσοτικοποίηση του CMV DNA σε κάθε δείγμα. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV είναι μια μη μολυσματική σύνθεση DNA που περιέχει τις ίδιες ακριβώς περιοχές δέσμευσης εκκινητή με το CMV DNA στόχο και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη που επιτρέπει το διαχωρισμό του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV από τον κλώνο (amplicon) στόχο του CMV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV προστίθεται σε κάθε δείγμα σε γνωστό αριθμό αντιγράφων και μεταφέρεται μέσω διαδοχικών βημάτων προετοιμασίας δειγμάτων και ταυτόχρονης ενίσχυσης PCR και ανίχνευσης διπλά επισημασμένων διασπώμενων ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών ανίχνευσης. Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής υπολογίζει τη συγκέντρωση CMV DNA στα δείγματα εξέτασης συγκρίνοντας το σήμα CMV με το σήμα Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Επιλογή Στόχου Η γενική προετοιμασία δείγματος σε βάση διοξειδίου του πυριτίου χρησιμοποιείται για τη δέσμευση του CMV DNA και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV, ενώ τα καθορισμένα ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιούνται ως εκκινητές για την ενίσχυση του CMV DNA και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Ένας ειδικός για το στόχο και ένας ειδικός για το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένος ολιγονουκλεοτιδικός ιχνηθέτης καθιστούν δυνατή την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) CMV και του κλώνου (amplicon) Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test χρησιμοποιεί δύο εκκινητές ενίσχυσης για PCR. Ένας διπλά επισημασμένος ιχνηθέτης που παράγει σήμα υβριδίζεται σε έναν από τους δύο κλώνους και διασπάται από την Z05 DNA πολυμεράση κατά τη φάση της επιμήκυνσης των εκκινητών. Προετοιμασία ειγμάτων Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test χρησιμοποιεί αυτοματοποιημένη προετοιμασία δείγματος στο COBAS AmpliPrep Όργανο με τη γενική τεχνική δέσμευσης σε βάση διοξειδίου του πυριτίου. Η διαδικασία επεξεργάζεται 500 µl πλάσματος. Πραγματοποιείται λύση των σωματιδίων του ιού CMV μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο CMV DNA από DNase στο πλάσμα. Σε κάθε δείγμα εισάγεται πρωτεάση και ένας γνωστός αριθμός μορίων DΝΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV με το αντιδραστήριο λύσης και τα μαγνητικά σωματίδια γυαλιού. Στη συνέχεια, το μίγμα επωάζεται και το CMV DNA και το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV δεσμεύονται στην επιφάνεια των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού. Οι αδέσμευτες ουσίες όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ακαθαρσίες, απομακρύνονται με την πλύση των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού. Μετά το διαχωρισμό των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού και την ολοκλήρωση των βημάτων πλύσης, τα νουκλεϊκά οξέα που προσροφήθηκαν εκλούονται με υδατικό διάλυμα σε υψηλή θερμοκρασία. Το επεξεργασμένο δείγμα, που περιέχει το απελευθερωμένο CMV DNA και το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV, προστίθεται στο μίγμα ενίσχυσης και μεταφέρεται στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. 04898362052-05EL 2 Doc Rev. 5.0

Ενίσχυση PCR Η αντίδραση ενίσχυσης PCR εκτελείται με το θερμοσταθερό ανασυνδυασμένο ένζυμο Thermus specie Z05 DNA Πολυμεράση (Z05). Παρουσία μαγνησίου (Mg 2+ ) και με τις κατάλληλες συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος, το Z05 παρουσιάζει δραστηριότητα DNA πολυμεράσης. 34 Αυτό επιτρέπει την εκτέλεση της ενίσχυσης PCR παράλληλα με την ανίχνευση του κλώνου (amplicon) σε πραγματικό χρόνο. Τα επεξεργασμένα δείγματα προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (Κ-tubes), στα οποία πραγματοποιείται ενίσχυση PCR. Παρουσία Mg 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntp), στους οποίους περιλαμβάνονται η τριφωσφορική δεοξυαδενοσίνη, δεοξυγουανοσίνη, δεοξυκυτιδίνη, δεοξυουριδίνη και δεοξυθυμιδίνη, η πολυμεράση Z05 επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές σχηματίζοντας κλώνους DNA. Ενίσχυση Στόχου Ο θερμοκυκλοποιητής στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή θερμαίνει το μίγμα αντίδρασης για την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA και την έκθεση των ειδικών αλληλουχιών στόχου εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA στόχο. Το Z05, παρουσία Mg 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος του προτύπου στόχου για τη δημιουργία μορίων δίκλωνου DNA που ονομάζεται κλώνος (amplicon). Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους προορίζεται για το διπλασιασμό του DNA κλώνου (amplicon). Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στην περιοχή του γονιδιώματος CMV μεταξύ των εκκινητών. εν ενισχύεται ολόκληρο το γονιδίωμα CMV. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-ν-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, 35 αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης ως ενός από τα dntp του αντιδραστηρίου Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. Επίσης, οποιοδήποτε μη ειδικό προϊόν που σχηματίζεται μετά την αρχική ενεργοποίηση του Κύριου Μίγματος από μαγνήσιο καταστρέφεται από το ένζυμο AmpErase. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος, καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήματα της δεοξυουριδίνης ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase παραμένει αδρανές για παρατεταμένο χρονικό διάστημα μόλις εκτεθεί σε θερμοκρασίες πάνω από 55 C, δηλαδή σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης και για το λόγο αυτόν δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon) στόχο που δημιουργείται κατά την ενίσχυση. Ανίχνευση Προϊόντων PCR σε ένα COBAS TaqMan Test Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου 36,37. Η χρήση ιχνηθετών με διπλή φθορίζουσα επισήμανση επιτρέπει την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο παρακολουθώντας την ένταση εκπομπής των φθοριζουσών χρωστικών αναφορέα (reporter) που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης. Οι ιχνηθέτες αποτελούνται από ειδικούς για το CMV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες με χρωστική αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher). Στο COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test, οι ιχνηθέτες CMV και Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV επισημαίνονται με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναφορέα (reporter). Όταν αυτοί οι ιχνηθέτες είναι ανέπαφοι, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) καταστέλλεται από την εγγύτητα της χρωστικής παρεμποδιστή (quencher), λόγω των φαινομένων μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Κατά τη διάρκεια της PCR, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε μια αλληλουχία στόχο και διασπάται από την 5' 3' δραστηριότητα νουκλεάσης της θερμοσταθερής Z05 DNA πολυμεράσης. Μόλις απελευθερωθούν και αποχωριστούν οι χρωστικές αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher), δεν πραγματοποιείται πλέον παρεμπόδιση και η φθορίζουσα δραστηριότητα της χρωστικής αναφορέα (reporter) αυξάνεται. Η ενίσχυση του CMV DNA και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV μετρούνται ανεξάρτητα σε διαφορετικά μήκη κύματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης εκπομπής των μεμονωμένων χρωστικών αναφορέα (reporter), επιτρέποντας την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του DNA του CMV και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Ο κύκλος PCR στον οποίο η καμπύλη αύξησης αρχίζει να παρουσιάζει εκθετική αύξηση σχετίζεται με την ποσότητα του υλικού εκκίνησης κατά την έναρξη της PCR. 04898362052-05EL 3 Doc Rev. 5.0

Βασικά Στοιχεία Ποσοτικοποίησης του COBAS TaqMan Test To COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test παρέχει ποσοτικά αποτελέσματα σε ιδιαίτερα ευρύ δυναμικό εύρος, καθώς η παρακολούθηση του κλώνου (amplicon) διεξάγεται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης. Όσο υψηλότερος είναι ο τίτλος CMV ενός δείγματος, τόσο συντομότερα ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) των ιχνηθετών CMV υπερβαίνει το αρχικό επίπεδο φθορισμού (βλέπε Εικόνα 1). Καθώς το ποσοστό DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV είναι σταθερό σε όλα τα δείγματα, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) του ιχνηθέτη Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV θα πρέπει να εμφανίζεται σε παρόμοιο κύκλο για όλα τα δείγματα (βλέπε Εικόνα 2). Σε δείγματα, στα οποία επηρεάζεται ο φθορισμός Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS), η συγκέντρωση ρυθμίζεται ανάλογα. Η εμφάνιση των συγκεκριμένων σημάτων φθορισμού αναφέρεται ως κρίσιμη τιμή κατωφλίου (Ct). Η τιμή Ct ορίζεται ως ο κλασματικός αριθμός κύκλων, όπου ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) υπερβαίνει την προκαθορισμένη τιμή κατωφλίου (Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού) και ξεκινά τη φάση εκθετικής αύξησης του σήματος αυτού (βλέπε Σχήμα 3). Μια υψηλότερη τιμή Ct υποδεικνύει χαμηλότερο τίτλο αρχικού υλικού στόχου CMV. Γενικά, η διπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 1 Ct για το CMV DNA στόχο, ενώ η δεκαπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 3,3 Ct. Στην εικόνα 1 φαίνονται ενδεικτικές καμπύλες αύξησης στόχου για μια σειρά αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του ιού, οι καμπύλες αύξησης μετατοπίζονται σε προηγούμενους κύκλους. Για το λόγο αυτό, η τέρμα αριστερή καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο υψηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου, ενώ η τέρμα δεξιά καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο χαμηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου. Εικόνα 1 Καμπύλες Αύξησης Στόχου για μια Σειρά Αραιώσεων Ιού που Κυμαίνονται σε Εύρος 5-log 10 Ομαλοποιημένος Φθορισμός Υψηλότερος Τίτλος Χαμηλότερος Τίτλος Αριθμός Κύκλου Στην εικόνα 2 φαίνονται ενδεικτικές καμπύλες αύξησης Προτύπου Ποσοτικοποίησης για δείγματα σειράς αραιώσεων ιού που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Η ποσότητα του Προτύπου Ποσοτικοποίησης που προστίθεται σε κάθε δείγμα είναι σταθερή για κάθε αντίδραση. Η τιμή Ct του Προτύπου Ποσοτικοποίησης είναι ίδια, ανεξάρτητα από τον ιικό τίτλο. 04898362052-05EL 4 Doc Rev. 5.0

Εικόνα 2 Καμπύλες Αύξησης Προτύπου Ποσοτικοποίησης για μια Σειρά Αραιώσεων Ιού που Κυμαίνονται σε Εύρος 5-Log 10 Ομαλοποιημένος Φθορισμός Χαμηλότερος Τίτλος Υψηλότερος Τίτλος Αριθμός Κύκλου Η εικόνα 3 παρέχει ένα παράδειγμα του τρόπου ομαλοποίησης των τιμών φθορισμού για κάθε καμπύλη αύξησης σε κάθε κύκλο. Ο κλασματικός αριθμός κύκλων (Ct) υπολογίζεται στο σημείο τομής του σήματος φθορισμού με το Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού. Εικόνα 3 Ομαλοποίηση Τιμών Φθορισμού σε Κάθε Κύκλο για Κάθε Καμπύλη Αύξησης Ομαλοποιημένος Φθορισμός Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισ Τιμή Ct = 27,3 Αριθμός Κύκλου 04898362052-05EL 5 Doc Rev. 5.0

Ποσοτικοποίηση του CMV DNA Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test ποσοτικοποιεί το ιικό CMV DNA χρησιμοποιώντας μια δεύτερη αλληλουχία στόχο (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV) που προστίθεται σε κάθε δείγμα εξέτασης σε γνωστή συγκέντρωση. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV είναι μια μη μολυσματική σύνθεση DNA που περιέχει τμήματα αλληλουχιών CMV με περιοχές δέσμευσης εκκινητή ακριβώς ίδιες με εκείνες της αλληλουχίας στόχου CMV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV περιέχει περιοχές δέσμευσης εκκινητή CMV και δημιουργεί ένα προϊόν ενίσχυσης με ίδιο μήκος και με ίδια σύνθεση βάσης όπως το DNA στόχος του CMV. Η περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη ανίχνευσης του Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV έχει τροποποιηθεί για τη διαφοροποίηση του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV από τον κλώνο (amplicon) στόχο του CMV. Κατά τη διάρκεια της φάσης υβριδισμού της PCR στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τα δείγματα εκτίθενται σε φως και διεγείρονται από φιλτραρισμένο φως, ενώ τα δεδομένα εκπομπής φθορισμού συλλέγονται φιλτραρισμένα για κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, οι τιμές κάθε δείγματος διορθώνονται για τυχόν διακυμάνσεις που προκύπτουν από το όργανο. Αυτές οι τιμές φθορισμού αποστέλλονται από το όργανο στο AMPLILINK λογισμικό και αποθηκεύονται σε βάση δεδομένων. Εκτελούνται προέλεγχοι για να προσδιορίσουν εάν τα δεδομένα του CMV DNA και του DNΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV αντιπροσωπεύουν έγκυρα σετ και στο σύστημα εμφανίζονται ενδείξεις όταν τα δεδομένα βρίσκονται εκτός των προκαθορισμένων ορίων. Μετά την επιτυχή ολοκλήρωση όλων των προελέγχων, οι τιμές φθορισμού υποβάλλονται σε επεξεργασία για τη δημιουργία τιμών Ct για το CMV DNA και το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Οι ειδικές για την παρτίδα σταθερές βαθμονόμησης που παρέχονται με το COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV Test χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της τιμής τίτλου για τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου με βάση τις τιμές Ct CMV DNΑ και DNΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Τα αποτελέσματα των τίτλων εκφράζονται σε ιεθνείς Μονάδες/mL (IU/mL) ή σε αντίγραφα/ml (cp/ml). ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: 04902068 190) CMV CS1 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού) Μαγνητικά σωματίδια γυαλιού Ρυθμιστικό διάλυμα με βάση tris 0,09% Αζίδιο του νατρίου 0,1% Μεθυλπαραμπένη CMV CS2 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης CMV) ιένυδρο κιτρικό νάτριο 42,5% Θειοκυανική γουανιδίνη 3,6% Πολυδοκανόλη 1,8% ιθειοθρεϊτόλη Xn 42,5% (w/w) Θειοκυανική γουανιδίνη CMVCAP 72 Εξετάσεις 1 x 72 Εξετάσεις 1 x 72 Εξετάσεις Επιβλαβές R20/21/22-R52/53-R32: S24/25-S36/37/39-S61: Επιβλαβές όταν εισπνέεται, σε επαφή με το δέρμα και σε περίπτωση καταπόσεως. Επιβλαβές για τους υδρόβιους οργανισμούς, μπορεί να προκαλέσει μακροχρόνιες δυσμενείς επιπτώσεις στο υδάτινο περιβάλλον. Σε επαφή με οξέα ελευθερώνονται πολύ τοξικά αέρια. Αποφεύγετε επαφή με το δέρμα και με τα μάτια. Φοράτε κατάλληλη προστατευτική ενδυμασία, γάντια και συσκευή προστασίας ματιών/προσώπου. Αποφύγετε την ελευθέρωσή του στο περιβάλλον. Αναφερθείτε σε ειδικές οδηγίες/ ελτίο δεδομένων ασφαλείας. 04898362052-05EL 6 Doc Rev. 5.0

CMV CS3 Κασέτα Πολλαπλού Αντιδραστηρίου CMV που περιέχει: Pase ( ιάλυμα Πρωτεϊνάσης) Ρυθμιστικό διάλυμα Tris < 0,05% EDTA Χλωριούχο ασβέστιο Οξικό ασβέστιο 7,8% Πρωτεϊνάση Γλυκερόλη Xn 7,8% (w/w) Πρωτεϊνάση 1 x 72 Εξετάσεις 1 x 3,8 ml Επιβλαβές R36-R42: Ερεθίζει τα μάτια. Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση όταν εισπνέεται. S23-S45: Μην αναπνέετε ατμούς. Σε περίπτωση ατυχήματος ή αν αισθανθείτε αδιαθεσία ζητήστε αμέσως ιατρική συμβουλή (δείξτε την ετικέτα αν είναι δυνατό). EB (Ρυθμιστικό ιάλυμα Έκλουσης) Ρυθμιστικό διάλυμα με βάση tris Υδροξείδιο του νατρίου 0,09% Αζίδιο του νατρίου CMV CS4 Κασέτα Αντιδραστηρίου ειδική για την εξέταση CMV που περιέχει: CMV QS (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) < 0,001% Μη μολυσματικό DNA πλασμιδίου (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχίες δέσμευσης εκκινητών CMV και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη 0,05% Αζίδιο του νατρίου CMV MMX (CMV Κύριο Μίγμα) Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Οξικό κάλιο Υδροξείδιο του καλίου < 20% ιμεθυλοσουλφοξείδιο Γλυκερόλη < 0,05% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές CMV < 0,01% Ολιγονουκλεοτιδικό απταμερές < 0,01% Ειδικοί για τον CMV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης CMV ολιγονουκλεοτιδικοί ιχνηθέτες με φθορίζουσα επισήμανση < 0,05% Z05 DNA Πολυμεράση (μικροβιακό) < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) 0,09% Αζίδιο του νατρίου MgCl 2 (CAP/CTM ιάλυμα Μαγνησίου) < 0,6% Χλωριούχο μαγνήσιο 0,09% Αζίδιο του νατρίου 1 x 8,1 ml 1 x 72 Εξετάσεις 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml 04898362052-05EL 7 Doc Rev. 5.0

CMV H(+)C (Θετικός Ορός Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης CMV) < 0,001% Φάγος Lambda που περιέχει CMV DNA Ανθρώπινο πλάσμα, μη αντιδρών σε εξετάσεις εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ για αντίσωμα HCV, αντίσωμα HIV-1/2 και HIV p24 αντιγόνο ή HIV-1 RNA, HBsAg. Το CMV DNA δεν ανιχνεύτηκε με μέθοδο PCR. 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης 6 x 0,65 ml Ερεθιστικό S24-S37: Αποφεύγετε την επαφή με το δέρμα. Να φοράτε κατάλληλα γάντια. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή με το δέρμα. CMV L(+)C (Θετικός Ορός Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης CMV) < 0,001% Φάγος Lambda που περιέχει CMV DNA σε μέση συγκέντρωση περίπου 100 φορές χαμηλότερη από τη μέση συγκέντρωση CMV DNA σε CMV H(+)C Ανθρώπινο πλάσμα, μη αντιδρών σε εξετάσεις εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ για αντίσωμα HCV, αντίσωμα HIV-1/2 και HIV p24 αντιγόνο ή HIV-1 RNA, HBsAg. Το CMV DNA δεν ανιχνεύτηκε με μέθοδο PCR. 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης 6 x 0,65 ml Ερεθιστικό S24-S37: Αποφεύγετε την επαφή με το δέρμα. Να φοράτε κατάλληλα γάντια. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή με το δέρμα. CMV ( ) C (Αρνητικός Ορός Ελέγχου CMV) Ανθρώπινο πλάσμα, μη αντιδρών σε εξετάσεις εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ για αντίσωμα HCV, αντίσωμα HIV-1/2 και HIV p24 αντιγόνο ή HIV-1 RNA, HBsAg. Το CMV DNA δεν ανιχνεύτηκε με μέθοδο PCR. 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 Xi μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης 6 x 0,65 ml Ερεθιστικό S24-S37: Αποφεύγετε την επαφή με το δέρμα. Να φοράτε κατάλληλα γάντια. R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή με το δέρμα. CMV H(+)C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης CMV) CMV L(+)C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης CMV) CMV ( ) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου CMV) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: 03587797 190) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) ιένυδρο κιτρικό νάτριο < 0,1% N-μεθυλισοθειαζολόνη-HCl PG WR 1 x 6 Κλιπ 1 x 6 Κλιπ 1 x 6 Κλιπ 1 x 5,1 L 04898362052-05EL 8 Doc Rev. 5.0

ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση με ανθρώπινο πλάσμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. C. Μην εκτελείτε αναρρόφηση με πιπέτα από το στόμα. D. Απαγορεύεται το κάπνισμα και η κατανάλωση τροφίμων και ποτών στους χώρους εργασίας του εργαστηρίου. Φοράτε προστατευτικά γάντια μίας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά κατά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων των κιτ. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων εξέτασης. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και νουκλεάση όταν αφαιρείτε τα κλάσματα δείγματος από τα φιαλίδια ορών ελέγχου. F. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μίας χρήσης με ακροφύσια χωρίς DNase. G. Μη συγκεντρώνετε ορούς ελέγχου από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικά φιαλίδια της ίδιας παρτίδας. H. Μη συνδυάζετε κασέτες αντιδραστηρίων ή ορούς ελέγχου από διαφορετικά κιτ. I. Μην ανοίγετε τις κασέτες COBAS AmpliPrep και μην αλλάζετε, αναμιγνύετε, αφαιρείτε ή προσθέτετε φιάλες. J. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. K. Μη χρησιμοποιείτε ένα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης του. L. ελτία εδομένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) διατίθενται κατόπιν αίτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. M. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να πραγματοποιείται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 και στο έγγραφο CLSI M29-A3. 39 Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. Σημείωση: Τα οικιακά υγρά λευκαντικά που διατίθενται στο εμπόριο περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Η αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγει διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. N. ΠΡΟΣΟΧΗ: Τα CMV ( ) C, CMV L(+)C και CMV H(+)C περιέχουν Ανθρώπινο Πλάσμα που προέρχεται από ανθρώπινο αίμα. Το υλικό προέλευσης έχει ελεγχθεί και έχει βρεθεί μη αντιδρών για την παρουσία Αντιγόνου Επιφανείας Ηπατίτιδας Β (HBsAg), αντισωμάτων HIV-1/2 και HCV και HIV p24 Αντιγόνου ή HIV-1 RNA. Η εξέταση του Αρνητικού Ανθρώπινου Πλάσματος με τη μέθοδο PCR δεν έδειξε ανιχνεύσιμο CMV DNA. Καμία γνωστή μέθοδος εξέτασης δεν διασφαλίζει απόλυτα ότι τα παράγωγα που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα δεν μεταδίδουν μολυσματικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό, όλα τα υλικά ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρούνται εν δυνάμει μολυσματικά. Τα CMV ( ) C, CMV L(+)C και CMV H(+)C πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να πραγματοποιείται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 και στο έγγραφο CLSI Document M29-A3. 39 Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. O. Τα MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 και CMV MMX περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Κατά την απόρριψη διαλυμάτων που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφευχθεί ο σχηματισμός αζιδίων. P. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφεύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Αν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Σε περίπτωση διαρροής αυτών των αντιδραστηρίων, αραιώστε με νερό πριν τα σκουπίσετε. Q. Μην επιτρέπετε την επαφή μεταξύ του CMV CS2 και των υγρών αποβλήτων από το COBAS AmpliPrep Όργανο που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη με το διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικού). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. R. Όταν απορρίπτετε χρησιμοποιημένες Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPUs) του COBAS AmpliPrep που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη αποφύγετε οποιαδήποτε επαφή με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικό). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. 04898362052-05EL 9 Doc Rev. 5.0

ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια ή τους ορούς ελέγχου. B. Αποθηκεύετε τα CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 και CMV CS4 στους 2-8 C. Τα αντιδραστήρια που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για 70 ημέρες στους 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Τα CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 και CMV CS4 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για έως και 6 κύκλους οργάνου, έως και 100 ώρες συνολικά μετά την τοποθέτησή τους στο COBAS AmpliPrep Όργανο. Τα αντιδραστήρια πρέπει να αποθηκεύονται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων των οργάνων. C. Αποθηκεύετε τα CMV H(+)C, CMV L(+)C και CMV ( ) C στους 2-8 C. Οι οροί ελέγχου παραμένουν σταθεροί μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. D. Αποθηκεύετε τα κλιπ Γραμμωτού κώδικα [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip και CMV ( ) C Clip] στους 2-30 C. E. Αποθηκεύετε το PG WR στους 2-30 C. Το PG WR είναι σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, το αντιδραστήριο αυτό παραμένει σταθερό για 28 ημέρες στους 2-30 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: 04902068 190) CMVCAP CMV CS1 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού CMV) CMV CS2 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης CMV) CMV CS3 (Κασέτα Πολλαπλού Αντιδραστηρίου CMV) CMV CS4 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Ειδική για την Εξέταση CMV) CMV H(+)C (Θετικός Ορός Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης CMV) CMV L(+)C (Θετικός Ορός Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης CMV) CMV ( ) C (Αρνητικός Ορός Ελέγχου CMV) CMV H(+)C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης CMV) CMV L(+)C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης CMV) CMV ( ) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου CMV) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) 04898362052-05EL 10 Doc Rev. 5.0

ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Όργανα και Λογισμικό COBAS AmpliPrep Όργανο COBAS TaqMan Αναλυτής ή COBAS TaqMan 48 Αναλυτής Προαιρετικά: Docking Station Προαιρετικά: cobas p 630 όργανο AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 Σταθμός εδομένων για το AMPLILINK λογισμικό, με εκτυπωτή. Υλικά μίας χρήσης Εγχειρίδια AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς v3.3: Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS AmpliPrep οργάνου για χρήση με τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή ή το cobas p 630 όργανο και το AMPLILINK λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan αναλυτή (και του προαιρετικού docking station), για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο εφαρμογής AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2 Μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων: SPUs Σωληνάρια εισόδου δειγμάτων (S-tubes) με κλιπ γραμμωτού κώδικα Υποδοχείς K-tips Υποδοχείς K-tubes ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Υποδοχέας ειγμάτων (υποδοχέας SK24) Υποδοχέας Αντιδραστηρίων Υποδοχέας SPU K-carrier Σύστημα μεταφοράς K-carrier Υποδοχέας K-carrier (απαιτείται για χρήση μόνο με τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή) Συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς DΝase (χωρητικότητα 1000 μl)* Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Αναδευτήρας τύπου Vortex * Οι πιπέτες πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ακροφύσια με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση, χωρίς DNase, πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου ορίζεται, για την αποφυγή της διασταυρούμενης μόλυνσης των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). 04898362052-05EL 11 Doc Rev. 5.0

ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Σημείωση: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Σημείωση: Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί μόνο για χρήση με ανθρώπινο πλάσμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. Η εξέταση άλλων τύπων δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. A. Συλλογή ειγμάτων Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test προορίζεται για χρήση με δείγματα πλάσματος. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται σε αποστειρωμένα σωληνάρια με χρήση αντιπηκτικού EDTA (μοβ πώμα) και να αναμιγνύεται επαρκώς σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή των σωληναρίων. B. Μεταφορά ειγμάτων Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για διάστημα 6 ωρών το μέγιστο. ιαχωρίστε το πλάσμα από το ολικό αίμα εντός 6 ωρών από τη συλλογή, με φυγοκέντριση στα 800-1600 x g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφέρετε το πλάσμα σε αποστειρωμένο σωληνάριο πολυπροπυλενίου. Η μεταφορά του ολικού αίματος ή του πλάσματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν στη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων. 41 Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται στους 2-25 C και να υποβάλλεται σε φυγοκέντριση εντός 6 ωρών από τη συλλογή. Το πλάσμα πρέπει να μεταφέρεται σε θερμοκρασία 2-8 C ή κατεψυγμένο σε θερμοκρασία -20 C. C. Αποθήκευση ειγμάτων Τα δείγματα πλάσματος μπορούν να αποθηκευτούν στους 2-8 C για έως 7 ημέρες. Τα δείγματα πλάσματος αποδείχθηκε ότι παραμένουν σταθερά για 6 εβδομάδες αν είναι κατεψυγμένα στους -20 C. Συνιστάται η αποθήκευση των δειγμάτων σε κλάσματα των 550-600 µl σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 2,0 ml με βιδωτό πώμα (όπως τα Sarstedt 72.694.006). Στην Εικόνα 4 απεικονίζονται τα δεδομένα σταθερότητας δείγματος από μελέτες αποθήκευσης δείγματος που πραγματοποιήθηκαν με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test. Εικόνα 4 Σταθερότητα CMV σε Πλάσμα EDTA 3,50 Τίτλος log10 (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 είγμα 2-8ºC 0 ημ. 2-8ºC 3 ημ. 2-8ºC 7 ημ. -20ºC 6 εβδ. 04898362052-05EL 12 Doc Rev. 5.0

Τα δείγματα πλάσματος μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως και 3 φορές χωρίς σημαντική απώλεια CMV DNA. Στην Εικόνα 5 απεικονίζονται τα δεδομένα από μια μελέτη κατάψυξης-απόψυξης που πραγματοποιήθηκε με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test. Εικόνα 5 Αποτελέσματα CMV μετά από 3 κύκλους κατάψυξης-απόψυξης (F-T) (πλάσμα EDTA) 3,50 Τίτλος log10 (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 είγμα 0x Κατάψυξη/Απόψυξη 2x Κατάψυξη/Απόψυξη 1x Κατάψυξη/Απόψυξη 3x Κατάψυξη/Απόψυξη Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Σημείωση: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, λεπτομερή περιγραφή των πιθανών διευθετήσεων, εκτύπωση αποτελεσμάτων και ερμηνεία ενδείξεων, σχολίων και μηνυμάτων σφάλματος, ανατρέξτε στο (1) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS AmpliPrep οργάνου για χρήση με τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή ή το cobas p 630 όργανο και το AMPLILINK λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3, (2) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan αναλυτή (και του προαιρετικού docking station) για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2 και 3.3, (3) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2 και 3.3, (4) Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή και τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το p 630 όργανο, (5) Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2. Μέγεθος Παρτίδας Κάθε κιτ περιέχει αντιδραστήρια για 72 εξετάσεις, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν σε παρτίδες των 12 έως 24 εξετάσεων. Ένα τουλάχιστον αντίγραφο από κάθε CMV ( ) C, CMV L(+)C και CMV H(+)C πρέπει να περιλαμβάνεται σε κάθε παρτίδα (βλέπε ενότητα «Ποιοτικός Έλεγχος»). Ροή Εργασιών Η ανάλυση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή πρέπει να ξεκινήσει εντός 120 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Σημείωση: Μην καταψύχετε ή αποθηκεύετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία στους 2-8 C. 04898362052-05EL 13 Doc Rev. 5.0

Προετοιμασία ειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση: Αν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα δείγματα, τοποθετήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου έως την πλήρη απόψυξή τους και στροβιλίστε για 3-5 δευτερόλεπτα πριν από τη χρήση. Οι οροί ελέγχου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C και να περιέρχονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Ρύθμιση του COBAS AmpliPrep Οργάνου Μέρος A. Συντήρηση και Εκκίνηση A1. Το COBAS AmpliPrep Όργανο είναι έτοιμο για λειτουργία στον τρόπο λειτουργίας αναμονής. A2. Ενεργοποιήστε το Σταθμό εδομένων για το AMPLILINK λογισμικό. Προετοιμάστε το Σταθμό εδομένων ως εξής: a. Συνδεθείτε στο λειτουργικό σύστημα Windows XP. b. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο του AMPLILINK λογισμικού. c. Συνδεθείτε στο AMPLILINK λογισμικό εισάγοντας τον καθορισμένο Κωδικό Χειριστή και τον κωδικό πρόσβασης. A3. Ελέγξτε την παροχή του PG WR χρησιμοποιώντας την οθόνη Status και αντικαταστήστε αν χρειάζεται. A4. ιεξάγετε όλες τις εργασίες συντήρησης που αναφέρονται στην καρτέλα Due. Το COBAS AmpliPrep Όργανο θα πραγματοποιήσει αυτόματη εκκίνηση στο σύστημα. Μέρος B. Φόρτωση Κασετών Αντιδραστηρίου Σημείωση: Όλες οι κασέτες αντιδραστηρίου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C, να φορτώνονται αμέσως στο COBAS AmpliPrep Όργανο και να περιέρχονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος στο όργανο για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την επεξεργασία του πρώτου δείγματος. Μην αφήσετε τις κασέτες αντιδραστηρίου να αποκτήσουν θερμοκρασία περιβάλλοντος εκτός οργάνου, καθώς ενδέχεται να σχηματιστεί υγρασία στις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. Μη σκουπίζετε την υγρασία από τις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. Β1. Τοποθετήστε το CMV CS1 σε μια υποδοχή αντιδραστηρίου. Τοποθετήστε τα CMV CS2, CMV CS3 και CMV CS4 σε ξεχωριστή υποδοχή αντιδραστηρίου. B2. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει το CMV CS1 στη θέση υποδοχέα A του COBAS AmpliPrep Οργάνου. B3. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει τα CMV CS2, CMV CS3 και CMV CS4 στις θέσεις υποδοχέα B, C, D ή E του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Βλέπε Πίνακα 1 για περισσότερες πληροφορίες. Μέρος Γ. Φόρτωση Υλικών μίας Χρήσης Σημείωση: Καθορίστε τον αριθμό των COBAS AmpliPrep κασετών αντιδραστηρίου, των Μονάδων Επεξεργασίας ειγμάτων (SPUs), των σωληναρίων ειγμάτων Εισόδου (S-tubes), των K-tips και των K-tubes που απαιτούνται. Απαιτείται μια μονάδα επεξεργασίας δείγματος (SPU), ένα S-tube Εισόδου, ένα K-tip και ένα Κ-tube για κάθε δείγμα ή ορό ελέγχου. Υπάρχει δυνατότητα πολλαπλών ροών εργασιών για χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου με τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Για αναφορά, βλέπε τον Πίνακα 1. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τον κατάλληλο αριθμό υποδοχέων κασετών αντιδραστηρίου, υποδοχέων δειγμάτων με S-tubes Εισόδου, υποδοχέων SPU, υποδοχέων K-tip, υποδοχέων K-tube και K-carriers σε υποδοχείς K-carrier στις αντίστοιχες θέσεις υποδοχέων του COBAS AmpliPrep Οργάνου (για περισσότερες πληροφορίες, βλέπε Πίνακα 1). Γ1. Τοποθετήστε τις μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων (SPU) στους υποδοχείς SPU και φορτώστε τους υποδοχείς στις θέσεις υποδοχέα J, K ή L του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ2. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tube στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ3. Φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tip στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ4. Για τη ροή εργασιών 3 που χρησιμοποιεί τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους K-carriers στους υποδοχείς K-carrier στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. 04898362052-05EL 14 Doc Rev. 5.0

Πίνακας 1 Πιθανές Ροές Εργασιών για χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου με τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Ροή Εργασιών Τρόπος μεταφοράς στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Υποδοχείς, φορείς και υλικά μίας χρήσης Θέση στο COBAS AmpliPrep Όργανο K-tubes σε γεμάτους υποδοχείς K-tube M P K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip M P 1 COBAS AmpliPrep Όργανο και Docking Station καθώς και COBAS TaqMan Αναλυτής Αυτόματη μεταφορά K-carrier S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU F H J L CS1 σε υποδοχέα κασετών A CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών B E K-tubes σε γεμάτους υποδοχείς K-tube M P K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip M P 2 COBAS AmpliPrep Όργανο και COBAS TaqMan Αναλυτής Χειροκίνητη μεταφορά των K-tubes μέσω υποδοχέων δειγμάτων στον COBAS TaqMan Αναλυτή S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών F H J L A CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών B E Μετά την ολοκλήρωση της επεξεργασίας δειγμάτων: K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων (έτοιμα για χειροκίνητη μεταφορά) Όπως παραπάνω (F H) K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων F - H K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip M P S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων F - H 3 COBAS AmpliPrep Όργανο και COBAS TaqMan 48 Αναλυτές Χειροκίνητη μεταφορά του K-carrier μέσω υποδοχέων K-carrier στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών J L A B E Άδειο K-carrier με γραμμωτό κώδικα σε υποδοχέα K-carrier M P Μετά την ολοκλήρωση της επεξεργασίας δειγμάτων: K-tubes σε K-carrier σε υποδοχέα K-carrier Όπως παραπάνω (M P) 04898362052-05EL 15 Doc Rev. 5.0

Μέρος. Εντολή και Φόρτωση ειγμάτων Σημείωση: Αν χρησιμοποιείτε το cobas p 630 όργανο για την προετοιμασία δειγμάτων, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου. 1. Προετοιμάστε τους υποδοχείς δειγμάτων ως εξής: Προσαρμόστε ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα σε κάθε θέση υποδοχέα δειγμάτων όπου πρόκειται να τοποθετηθεί δείγμα (S-tube). Προσαρμόστε ένα από τα ειδικά για τους ορούς ελέγχου κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα [CMV ( ) C, CMV L(+)C και CMV H(+)C] σε κάθε θέση υποδοχής δείγματος όπου πρόκειται να τοποθετηθούν οροί ελέγχου (S-tube). Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Φροντίστε να τοποθετήσετε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Τοποθετήστε ένα S-tube Εισόδου σε κάθε θέση που περιλαμβάνει ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα. 2. Χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό, δημιουργήστε εντολές δείγματος για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου στο φάκελο Sample του παραθύρου Orders. Επιλέξτε το κατάλληλο αρχείο εξέτασης και ολοκληρώστε τη διαδικασία με αποθήκευση. 3. Αντιστοιχίστε τις εντολές δειγμάτων και ορών ελέγχου στις θέσεις υποδοχής δειγμάτων στο φάκελο Sample Rack του παραθύρου Orders. Ο αριθμός υποδοχέα δειγμάτων πρέπει να προορίζεται για τον υποδοχέα που προετοιμάστηκε στο Βήμα 1. 4. Εκτυπώστε την αναφορά Sample Rack Order για να τη χρησιμοποιήσετε ως φύλλο εργασίας. 5. Προετοιμάστε υποδοχείς δειγμάτων και ορών ελέγχου στην καθορισμένη περιοχή για προσθήκη δειγμάτων και ορών ελέγχου ως εξής: Στροβιλίστε κάθε δείγμα και ορό ελέγχου [CMV ( ) C, CMV L(+)C και CMV H(+)C] για 3 έως 5 δευτερόλεπτα. Φροντίστε να μην μολυνθούν τα γάντια κατά το χειρισμό των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. 6. Μεταφέρετε 500 µl κάθε δείγματος και ορού ελέγχου [CMV ( ) C, CMV L(+)C και CMV H(+)C] στο αντίστοιχο S-tube Εισόδου με επισήμανση γραμμωτού κώδικα χρησιμοποιώντας μια μικροπιπέτα με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς DNase. Αποφεύγετε τη μεταφορά σωματιδίων και/ή θρόμβων ινώδους από το αρχικό δείγμα στο S-tube Εισόδου. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να μεταφέρονται σε θέσεις σωληναρίων, όπως καθορίζεται και καταγράφεται στο φύλλο εργασίας στο βήμα 4. Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Τοποθετήστε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Αποφεύγετε την επιμόλυνση του επάνω μέρους των S-tubes με δείγματα ή ορούς ελέγχου. 7. Για τις ροές εργασιών 1 και 2, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων που είναι γεμάτοι με S-tubes Εισόδου στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. 8. Για τη ροή εργασιών 3, χρησιμοποιώντας τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων με S-tubes Εισόδου και K-tubes (ένα για κάθε S-tube Εισόδου, φορτωμένο στη δεξιά θέση, δίπλα στα S-tubes Εισόδου) στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Μέρος E. Έναρξη ανάλυσης στο COBAS AmpliPrep Όργανο E1. Θέστε σε λειτουργία το COBAS AmpliPrep Όργανο χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό. Μέρος ΣΤ. Τερματισμός ανάλυσης στο COBAS AmpliPrep Όργανο και Μεταφορά στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή (μόνο για τις ροές εργασιών 2 και 3) ΣΤ1. Ελέγξτε αν υπάρχουν τυχόν ενδείξεις ή μηνύματα σφάλματος. ΣΤ2. Μεταφέρετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία από το COBAS AmpliPrep Όργανο σε υποδοχείς δειγμάτων (για τον COBAS TaqMan Αναλυτή χωρίς Docking Station) ή σε υποδοχείς K-carrier (για τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή), ανάλογα με τη ροή εργασιών (για περαιτέρω λεπτομέρειες, βλέπε Μέρος Ζ). ΣΤ3. Απομακρύνετε τα απορρίμματα από το COBAS AmpliPrep Όργανο. Σημείωση: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία δεν πρέπει να εκτίθενται σε φως μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου. 04898362052-05EL 16 Doc Rev. 5.0

Ενίσχυση και Ανίχνευση Ρύθμιση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Η ανάλυση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή πρέπει να ξεκινήσει εντός 120 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Σημείωση: Μην καταψύχετε ή αποθηκεύετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία στους 2-8 C. Μέρος Ζ. Φόρτωση δειγμάτων που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία Ζ1. Ανάλογα με τη ροή εργασιών, εκτελέστε τα κατάλληλα βήματα για τη μεταφορά των K-tubes στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή: Ροή εργασιών 1: Αυτόματη μεταφορά των K-carrier μέσω docking station στον COBAS TaqMan Αναλυτή. εν απαιτείται χειροκίνητη παρέμβαση. Ροή εργασιών 2: Χειροκίνητη μεταφορά των K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων στον COBAS TaqMan Αναλυτή Ροή εργασιών 3: Χειροκίνητη μεταφορά των K-carrier σε υποδοχείς K-carrier στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Χειροκίνητη μεταφορά των K-carriers στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή με χρήση του Μεταφορέα K-carrier. Μέρος Η. Έναρξη ανάλυσης στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή H1. Θέστε σε λειτουργία τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή χρησιμοποιώντας μία από τις παρακάτω επιλογές, ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται: Ροή εργασιών 1: εν απαιτείται παρέμβαση. Ροή εργασιών 2: Αυτόματη έναρξη του COBAS TaqMan Αναλυτή μετά την εισαγωγή των υποδοχέων δειγμάτων. Ροή εργασιών 3: Γεμίστε το K-carrier με άδεια K-tubes, σε περίπτωση που υπάρχουν λιγότερα από 6 K-tubes στο K-carrier. Η πλήρωση ελέγχεται από το AMPLILINK λογισμικό. Ανοίξτε το κάλυμμα του θερμοκυκλοποιητή, φορτώστε τα K-carrier και κλείστε το καπάκι. Ξεκινήστε την ανάλυση στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Μέρος Θ. Τερματισμός ανάλυσης στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Θ1. Μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, εκτυπώστε την Αναφορά Αποτελεσμάτων. Ελέγξτε αν υπάρχουν τυχόν ενδείξεις ή μηνύματα σφάλματος στην Αναφορά αποτελεσμάτων. Τα δείγματα με ενδείξεις και σχόλια ερμηνεύονται όπως περιγράφεται στην ενότητα «Αποτελέσματα». Μετά την αποδοχή, αποθηκεύστε τα δεδομένα σε αρχείο. Θ2. Αφαιρέστε τα χρησιμοποιημένα K-tubes από τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή από τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής προσδιορίζει αυτόματα τη συγκέντρωση CMV DNA των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Η συγκέντρωση CMV DNA εκφράζεται σε αντίγραφα (cp)/ml. Ο συντελεστής μετατροπής μεταξύ CMV DNA αντιγράφων/ml (όπως ορίζεται από το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test) και ιεθνών Μονάδων (IU)/mL είναι 1,1 cp/iu [0,91 IU/cp], χρησιμοποιώντας το Πρώτο ιεθνές Πρότυπο του ΠΟΥ για τον Ανθρώπινο Κυτταρομεγαλοϊό για Τεχνικές Ενίσχυσης Νουκλεϊκού Οξέος (NIBSC 09/162) 40. Αυτός ο συντελεστής μετατροπής μεταξύ «αντιγράφων» και «IU» ενδέχεται να διαφέρει για άλλες αναλύσεις CMV-DNA. AMPLILINK Λογισμικό: Καθορίζει την τιμή Κατωφλίου του Κύκλου (Ct) για το CMV DNA και το DNΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV. Καθορίζει τη συγκέντρωση CMV DNA με βάση τις τιμές Ct για το CMV DNA και το DNΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης CMV και τους ειδικούς για την παρτίδα συντελεστές βαθμονόμησης που παρέχονται στους γραμμωτούς κώδικες της κασέτας. Καθορίζει ότι ο υπολογισμένος αριθμός cp/ml για τα CMV L(+)C και CMV H(+)C βρίσκεται εντός του καθορισμένου εύρους. 04898362052-05EL 17 Doc Rev. 5.0