3. ΠΟΣΟΤΙΚΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΙ

3. ΠΟΣΟΤΙΚΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΙ 3.1 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ Η φασµατοφωτοµετρία είναι µια οπτική µέθοδος αναλύσεως που βασίζεται στην ικανότητα ορισµένων ουσιών να αλληλεπιδρούν µε ακτινοβολίες χαρακτηριστικών συχνοτήτων. Η απεικόνιση της απορρόφησης ή της διαπερατότητας σε συνάρτηση µε το µήκος κύµατος λέγεται φάσµα απορρόφησης. (Σχήµα 7) Πλατώ µέγιστης απορρόφησης Απορρόφηση λ max λ Σχήµα 7 Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα φασµατοφωτοµετρικών µεθόδων: Το κυριότερο πλεονέκτηµα είναι η µεγάλη ευαισθησία τους δηλ. ο δυνατός προσδιορισµός ουσιών σε πολύ µικρή συγκέντρωση (της τάξεως των 10 10 Μ) καθώς και η ταχύτητα, η εκλεκτικότητα και η δυνατότητα αυτοµατοποίησης της µεθόδου. Μειονεκτούν όµως σε σχέση µε τις κλασσικές µεθόδους στο ότι απαιτούν πρότυπα διαλύµατα για την βαθµονόµηση των οργάνων. 3.1.1 Εφαρµογές Η φασµατοφωτοµετρία χρησιµοποιείται για α) προσδιορισµό της δοµής µιας ένωσης β) ποιοτική και ποσοτική ανάλυση µιας ουσίας ή και ποσοτική ανάλυση µίγµατος ουσιών γ) προσδιορισµό του τύπου ενός συµπλόκου ιόντος δ) προσδιορισµό της σταθεράς ιονισµού ενός πρωτολυτικού δείκτη (δηλ. ουσίας που αλλάζει, χρώµα σε ορισµένη περιοχή pη). Είναι γνωστό ότι η εσωτερική ενέργεια ενός µορίου Ε εσ. είναι το άθροισµα τριών κβαντισµένων µεγεθών. ηλ. της ενέργειας των ηλεκτρονίων Ε n, της δονητικής ενέργειας Ε δ, και της περιστροφικής ενέργειας Ε π, που οφείλονται στην δυναµική ενέργεια των ηλεκτρονίων, την δόνηση και την περιστροφή των µορίων αντίστοιχα (Ε εσ. = Ε n + Ε δ + Ε π ). Όταν πολυχρωµατική ακτινοβολία περάσει µέσα από διάλυµα γίνεται εκλεκτική απορρόφηση εκείνων των συχνοτήτων που οδηγούν σε κατάσταση υηλότερης εσωτερικής ενέργειας του µορίου. Η απορρόφηση ορατής ή υπεριώδους ακτινοβολίας προκαλεί µεταπτώσεις στα ηλεκτρόνια των εξωτερικών στιβάδων. Εάν κάποιο διάλυµα απορροφά στο ορατό είναι έγχρωµο, το δε χρώµα που βλέπει το ανθρώπινο µάτι είναι το συµπληρωµατικό του απορροφόµενου.

Η απορρόφηση στο εγγύς υπέρυθρο και το υπέρυθρο προκαλεί διεγέρσεις δονήσεως και παραµορφώσεως ενώ στο άπω υπέρυθρο διεγέρσεις περιστροφής των µορίων. (Σχήµα 8) Όταν µονοχρωµατική ακτινοβολία περάσει από διάλυµα που περιέχει ουσία που απορροφά, η ένταση της ακτινοβολίας ελαττώνεται µε το µήκος της διαδροµής. Η µείωση αυτή της έντασης εξαρτάται από την συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά και από την απόσταση που διανύει η φωτεινή δέσµη µέσα στο διάλυµα. Η µαθηµατική έκφραση δίνεται από τον νόµο των Beer-Lambert που είναι ο εξής: Ι = Ι 0 10 -ε C 1 εc1 = 10 ή log 0 = ε C 1 0 Αν ονοµάσω Ι Ι0 = Τ τότε Α = -logt = ε C 1 Όπου Α = απορρόφηση Ι 0 = η ένταση της ακτινοβολίας που πέφτει στο υλικό Ι = η ένταση της ακτινοβολίας που βγαίνει από το υλικό Τ = Ι Ι 0 η διαπερατότης που εκφράζεται συνήθως επί % C = η συγκέντρωση του διαλύµατος σε mol/lit ε = σταθερά αναλογίας που ονοµάζεται µοριακός συντελεστής απόσβεσης ή lit µοριακή απορροφητικότης και εκφράζεται σε mol cm (Όταν η C εκφράζεται σε gr/lit τότε η σταθερά αναλογίας καλείται απορροφητικότης). Εξαρτάται από το µήκος κύµατος της ακτινοβολίας, τον διαλύτη και την δοµή της ουσίας που απορροφά. 1 = το µήκος της διαδροµής που διανύει η δέσµη µέσο στο διάλυµα (αναφέρεται και σαν εσωτερικό πάχος κυελίδας) σε cm. Η καµπύλη Α = f(c) είναι ευθεία γραµµή που περνά από την αρχή των αξόνων και µε κλίση εl, πράγµα που σηµαίνει ότι αν για µια σειρά διαλυµάτων διαφόρων συγκεντρώσεων κάποιας ουσίας µετρηθεί η Α και γίνει το διάγραµµα, µπορεί να προσδιορισθεί η συγκέντρωση άγνωστου διαλύµατος της ουσίας µε µέτρηση της απορρόφησης. Αρκεί η C του άγνωστου δείγµατος να είναι στην περιοχή που ισχύει ο νόµος και η απορρόφηση µεταξύ 0,1 και 1. Το µήκος κύµατος της ακτινοβολίας για την φωτοµέτρηση διαλέγεται από το πλατώ µεγίστης απορρόφησης του φάσµατος απορροφήσεως (σχήµα 7) της ουσίας που εξετάζουµε για να αυξάνεται η ευαισθησία και η υπακοή στον νόµο των Beer Lambert. Ο νόµος των Beer Lambert ισχύει µε τις εξής προϋποθέσεις: α) Το µόνο που γίνεται µεταξύ διαλυµένης ουσίας και ακτινοβολίας είναι απορρόφηση β) Η ακτινοβολία που πέφτει στο δείγµα είναι µονοχρωµατική γ) Το δείγµα βρίσκεται σε κυελίδα µε οµοιόµορφη διατοµή δ) Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται δεν είναι πυκνά (C>0,01 F). Και τούτο γιατί σε πυκνά διαλύµατα η απόσταση µεταξύ των διαλυµένων µορίων ή ιόντων γίνεται τόσο µικρή, ώστε κάθε ένα µόριο να επιδρά στο φορτίο των γειτονικών του και στην ικανότητα τους να απορροφούν σε ορισµένο µήκος κύµατος. Αποτέλεσµα αυτής της

επίδρασης είναι η σχέση απορρόφησης και συγκέντρωσης να µην είναι πια γραµµική. Επίσης επειδή το ε εξαρτάται από τον δείκτη διαθλάσεως n του διαλύµατος που φασµατοφωτοµετρείται και ο n µεταβάλλεται στα πυκνά διαλύµατα παρατηρείται απόκλιση από των Beer Lambert. ε) Τα σωµατίδια που απορροφούν δρουν ξεχωριστά. ηλ. σε περίπτωση µίγµατος ουσιών η ολική απορρόφηση ισούται µε το άθροισµα των απορροφήσεων των συστατικών του µίγµατος. Α ολ = Α 1 + Α n +... + A n = ε 1 C 1 1 + ε 2 C 2 1 +... + ε n C n 1 () Για τον ποσοτικό προσδιορισµό ενός διαλύµατος µε δύο συστατικά τα x και αφού ληφθούν τα ολικά φάσµατα διαλέγουµε τα µήκη κύµατος λ 1, λ 2 από τα πλατώ µεγίστης απορρόφησης των x και. Προσδιορίζουµε τους συντελεστές µοριακής απόσβεσης για κάθε συστατικό λ 2 λ2 ε,ε, ε, ε σε µήκη κύµατος και λ 2, µετρώντας την απορρόφηση προτύπων χ χ (καθορισµένης συγκέντρωσης C x, C ) διαλυµάτων x και ξεχωριστά, σε µήκη κύµατος λ 1 και λ 2 και µε πάχος κυελίδας 1 = 1 cm, οπότε: ε A χ Α =, ε, κ.λπ. C C χ = xπρ Μετράµε την απορρόφηση του άγνωστου διαλύµατος µε τα δυο συστατικά στα λ 1 και λ 2 και εφαρµόζουµε την σχέση (Ι) για τα δύο µήκη κύµατος πρ Α = C ε + C ε x x Α = C ε + C ε λ2 λ2 λ 2 x x λύνουµε το σύστηµα και βρίσκουµε τα C x και C. 3.1.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤΗ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ Για την µέτρηση της απορρόφησης χρησιµοποιούνται κυρίως φωτόµετρα και φασµατοφωτόµετρα. Σε ορισµένες δε περιπτώσεις και χρωµατόµετρα. Το φωτόµετρο είναι όργανο που µετρά την ένταση της ακτινοβολίας και έχει φίλτρο για την αποµόνωση στενής περιοχής του φάσµατος. Ο όρος χρωµατόµετρο αναφέρεται στο όργανο που µετρά στο ορατό και το φασµατοφωτόµετρο µετρά τον λόγο ή µια συνάρτηση του λόγου της έντασης δυο ακτινοβολιών. Έχει µονοχρωµάτορα για την αποµόνωση ακτινοβολίας ορισµένου µήκους κύµατος και σαρώνει όλο το φάσµα.

Σχήµα 8 Πίνακας ηλεκτροµαγνητικού φάσµατος

3.1.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΧΛΩΡΟΦΥΛΛΗΣ 1 gr φρέσκων φύλλων από σπανάκι κόβονται και µεταφέρονται σε ιγδίο, όπου εκχυλίζονται µε 25 ml ακετόνης 80% κ.ο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση ή διήθηση υπό κενό. Το υπόλειµµα εκχυλίζεται πάλι µε 25 ml ακετόνης και διηθείται. Η ίδια δουλειά επαναλαµβάνεται µέχρις ότου η ακετόνη της εκχύλισης είναι άχρωµη. Όλα τα εκχυλίσµατα µεταφέρονται σε ογκοµετρική φιάλη των 100 ml και συµπληρώνουµε µε ακετόνη µέχρι τα 100. Το εκχύλισµα χρωµατοµετρείται σε µήκη κύµατος 645 και 663 nm µε µάρτυρα την ακετόνη. Οι ποσότητες των χλωροφυλλών α και β σε mgr/lit είναι: C α = 12,7 Α 663 2,69 Α 645 C β = 22,9 Α 645 4,68 Α 663 Για επαλήθευση του αποτελέσµατος µπορούµε να χρωµατοµετρήσουµε και σε λ=652 nm όπου τέµνονται τα φάσµατα απορροφήσεως των χλωροφυλλών α και β, οπότε για την ολική απορρόφηση σε mgr/lit θα έχουµε: C = C α + C β = Α 652 1000 34,5 ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ 1. ίνεται διάγραµµα αναφοράς για έγχρωµο διάλυµα Cu ++ που συνδέει, την απορρόφηση (log 0 ) στο ορατό µε την αντίστοιχη συγκέντρωση του. Να βρείτε την συντοµότερη πειραµατική πορεία για τον υπολογισµό της συγκέντρωσης αγνώστου διαλύµατος Cu ++ µε απορρόφηση 0,3. log(o/) 0.08 0.06 0.04 0.02 1 2 3 4 5 ppm C 2. ιάλυµα καθαρής ουσίας Β µε συγκέντρωση 2,24 10-4 Μ, µοριακού βάρους 160 έχει απορρόφηση 0,672 σε 273 nm σε κυελίδα 1 cm. 0,1258 gr ενός φαρµακευτικού σκευάσµατος της ουσίας Β διαλύονται σε 1 lit νερού και η διαπερατότητα του διαλύµατος που δηµιουργείται είναι 0,362. Να υπολογισθεί η % σύσταση του σκευάσµατος σε ουσία Β. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Οπτική, Κ.. Αλεξόπουλου 2. Εργαστηριακές ασκήσεις ποσοτικής Αναλυτικής Χηµείας Θ. Π. Χατζηιωάννου 3. Fundamentals of Analytical Chemistry, Skoog and West 4. Plant Physiology (1949) 24:1 Daniel Arnon 5. Organic Chemistry, Hendrickson Gram Hammond 6. Biochemistry, Lehninger 7. Μαθήµατα Πανεπιστηµιακής Χηµείας (Τεύχος Α) Μ.Π. Γεωργιάδη

3.1.4 ΧΛΩΡΟΦΥΛΛΗ Για τον µεταβολισµό ενός ζωντανού κυττάρου απαραίτητα είναι: η ύλη και η ενέργεια. Τα φυτά, την ενέργεια την παίρνουν από τον ήλιο και σαν πρώτη ύλη για την σύνθεση των απαραίτητων συστατικών τους χρησιµοποιούν νερό και µια ουσία που δέχεται ηλεκτρόνια π. χ. CO 2 6 CO + hv 2 + 6H 2O C6H12O6 6O2 αλυσίδα φυτόλης Η αντίδραση αυτή που είναι η πιο χαρακτηριστική της φωτοσύνθεσης γίνεται στους χλωροπλάστες. Εκεί υπάρχουν και οι χλωροφύλλες που δρουν ως φωτοπαγίδες H 3 C H 3 C H 2 C O CH N V H 3 C X N N Mg O N V O CO 2 CH 2 λόγω των πολλών συζυγιακών διπλών δεσµών τους. Τα κύτταρα που κατά την φωτοσύνθεση παράγουν O 2, περιέχουν δύο είδη χλωροφύλλης, από τα οποία το ένα πάντα είναι η χλωροφύλλη α. Τα ανώτερα πράσινα φυτά περιέχουν δύο τύπους χλωροφύλλης, την χλωροφύλλη α και την χλωροφύλλη β. Η δοµή της χλωροφύλλης α καθορίστηκε από τον H. Fischer το 1940 και αποδείχτηκε µε την ολική σύνθεση από τον R. Woodward το 1960. Η χλωροφύλλη α είναι ένα χηλικό σύµπλοκο µαγνησίουπορφυρίνης. Η πορφυρίνη της χλωροφύλλης διαφέρει από την πρωτοπορφυρίνη α) στη φύση και τη θέση των υποκαταστατών των πυρολλικών δακτυλίων β) στο ότι περιέχει συµπυκνωµένο δακτύλιο κυκλοπεντανόνης. Τα τέσσερα κεντρικά άτοµα αζώτου είναι συµπλεγµένα µε Μg 2+ για να σχηµατίσουν ένα εξαιρετικά σταθερό, επίπεδο ουσιαστικά σύµπλοκο. Η χλωροφύλλη έχε ι επίσης µια µακριά υδρόφοβο τερπενοειδή πλευρική αλυσίδα που αποτελείται από µια αλκοόλη, τη φυτόλη, εστεροποιηµέν η µε ένα προπιονικό οξύ που υπάρχει σαν υποκαταστάτης στον δακτύλιο (V) (σχήµα 9). Η καθαρή χλωροφύλλη α σε ακετόνη έχει µέγιστα απορροφήσεως στα 663 nm και 420 nm ενώ η β στα 645 nm. Σχήµα 9 Η δοµή των χλωροφυλλών. Στην χλωροφύλλη α: Χ =, στην χλωροφύλλη β: Χ = -CHO. Σ ηµειώστε ότι υπάρχει, ένας συµπυκνωµένος δακτύλιος κυκλοπεντανόνης (V) επιπλέον στους τέσσερις δακτυλίους πυρρολίου.