CytoCount Αρ. κωδικού S 2366 Έκδοση

CytoCount Αρ. κωδικού S 2366 Έκδοση 03.12.03 Χρήση για την οποία προορίζεται Εισαγωγή Αρχή της εξέτασης Για διαγνωστική χρήση in vitro. Το CytoCount προορίζεται για χρήση στην κυτταρομετρία ροής. Το CytoCount είναι ένα εναιώρημα φθοριζόντων μικροσφαιριδίων τα οποία είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν ως πληθυσμός αναφοράς για την απαρίθμηση ενός πληθυσμού λευκοκυττάρων για τον οποίο ενδιαφέρεστε. Το CytoCount είναι δυνατό να εφαρμοστεί σε δείγματα περιφερικού αίματος, προϊόντα λευκαφαίρεσης, προϊόντα αίματος που έχουν υποστεί μείωση λευκοκυττάρων και δείγματα αίματος από τα ομφαλικά αγγεία κατά τον τοκετό. Η απαρίθμηση των απόλυτων επιπέδων κυτταρικών υποσυνόλων σε κλινικά δείγματα είναι πρωτεύουσας σημασίας, για παράδειγμα, στην παρακολούθηση της ανοσολογικής κατάστασης ανοσοκατεσταλμένων ατόμων (απαρίθμηση Τ-λεμφοκυττάρων CD4+), στη χρονομέτρηση της λευκαφαίρεσης σε ασθενείς που είναι υποψήφιοι για αυτομεταμόσχευση (απαρίθμηση αιματοποιητικών προγονικών κυττάρων CD34+) και στην αξιολόγηση προϊόντων αίματος που έχουν υποστεί μείωση λευκοκυττάρων (απαρίθμηση υπολειμματικών λευκών αιμοσφαιρίων) (1). Η απαρίθμηση κυττάρων είναι δυνατό να επιτευχθεί με τεχνολογίες καταμέτρησης μονής ή διπλής πλατφόρμας, με εφαρμογή κυτταρομετρικών μεθόδων. Με την τεχνική μονής πλατφόρμας, οι απόλυτες κυτταρικές καταμετρήσεις των εντοπισμένων κυττάρων για τα οποία ενδιαφέρεστε εκτελούνται σε καθορισμένο, με μεγάλη ακρίβεια, όγκο δείγματος. Η προσθήκη φθοριζόντων μικροσφαιριδίων αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης, όπως το CytoCount, είναι δυνατό να χρησιμεύσει στον καθορισμό του όγκου του προς ανάλυση δείγματος. Η τεχνική μονής πλατφόρμας παρουσιάζει λιγότερες πηγές διακύμανσης από την τεχνική διπλής πλατφόρμας που εφαρμοζόταν συχνά στο παρελθόν, ενώ πολυκεντρικές μελέτες έχουν δείξει ότι παρέχει καλύτερο συντελεστή διακύμανσης (Σ.Δ.) και ενέχει λιγότερους κινδύνους λήψης παρεκκλινόντων αποτελεσμάτων (1). Ένας προσεκτικά μετρημένος όγκος του δείγματος που σας ενδιαφέρει υποβάλλεται σε χρώση με τα αντίστοιχα, συζευγμένα με φθοριόχρωμα, αντισώματα. Για απαρίθμηση CD4, είναι δυνατό να επιλεγούν αντισώματα έναντι των CD45, CD4, CD8 και CD3. Για απαρίθμηση CD34, χρησιμοποιείται κυρίως ένας συνδυασμός αντι-cd45/fitc και αντι-cd34/rpe. Μετά την επώαση με το συζευγμένο αντίσωμα, τα ερυθρά αιμοσφαίρια υποβάλλονται σε λύση. Μετά τη λύση, ένας προσεκτικά μετρημένος όγκος μικροσφαιριδίων CytoCount προστίθεται στο δείγμα με εφαρμογή της τεχνικής ανάστροφης αναρρόφησης με πιπέτα (η οποία περιγράφεται στην ενότητα Γενική διαδικασία ). Ο όγκος των μικροσφαιριδίων πρέπει να είναι ίδιος με τον όγκο του δείγματος. Το δείγμα αναλύεται σε κυτταρόμετρο ροής και τα κύτταρα που σας ενδιαφέρουν καταμετρώνται με μια συνιστώμενη στρατηγική ελέγχου μέσω πύλης ( gating ) (2, 3). Ο αριθμός μικροσφαιριδίων CytoCount λαμβάνεται με τον καθορισμό μιας περιοχής που περιβάλλει τα μικροσφαιρίδια σε ένα διάγραμμα κουκκίδων, όπου τα μικροσφαιρίδια διαχωρίζονται ευκρινώς από τα κεχρωσμένα κύτταρα. Τα συμβάντα μικροσφαιριδίων μέσω πύλης εμφανίζονται σε ένα ιστόγραμμα χρόνου ως προς FSC και σχεδιάζεται μια περιοχή που περιβάλλει τα μονο-διεσπαρμένα συμβάντα. Ο απόλυτος αριθμός των κυττάρων που σας ενδιαφέρουν (κύτταρα/µl) υπολογίζεται με τη βοήθεια της ακόλουθης μαθηματικής σχέσης: Αρι θμόςκαταμετρημένων κυττάρων (π.χ.cd4 ή CD34 ) x συγκέντρωση CytoCount x συντελεστής αραί ωσης Αρι θμόςκαταμετρημένων μι κροσφαι ρι δί ωνcytocount Ορισμοί: Αριθμός καταμετρημένων κυττάρων: Για παράδειγμα, ο αριθμός CD4+ ή CD34+ που λαμβάνεται με μια συνιστώμενη στρατηγική ελέγχου μέσω πύλης (2, 3). Αριθμός καταμετρημένων μικροσφαιριδίων CytoCount : Αριθμός συμβάντων μικροσφαιριδίων από το ίδιο δείγμα όπως τα κύτταρα που σας ενδιαφέρουν. Συγκέντρωση CytoCount : Αριθμός μικροσφαιριδίων ανά µl, όπως αναφέρεται πάνω στο φιαλίδιο. Συντελεστής αραίωσης: Ο συντελεστής με τον οποίο έχει αραιωθεί το αρχικό δείγμα (το πρωτόκολλο αυτό είναι βελτιστοποιημένο για την ανάλυση 10 6 λευκοκυττάρων και συνεπώς το αρχικό δείγμα συχνά χρειάζεται αραίωση πριν από την εκτέλεση της ανάλυσης). Συνιστάται η εφαρμογή τεχνικής που δεν περιλαμβάνει έκπλυση του δείγματος, διότι σε αντίθετη περίπτωση η αρχική σχέση που συνδέει τον αριθμό των αιμοσφαιρίων με τον όγκο του αίματος ενδέχεται να χαθεί, οπότε δε θα είναι δυνατός ο ακριβής υπολογισμός των απόλυτων αριθμών κυττάρων (1). Η συσσωμάτωση μικροσφαιριδίων ελέγχου καταμέτρησης είναι ένα πολύ γνωστό φαινόμενο (1). Τα μικροσφαιρίδια CytoCount παρουσιάζουν έναν εξαιρετικά χαμηλό αριθμό πολλαπλών (κάτω του 3%), γεγονός που απλοποιεί περαιτέρω τον έλεγχο μέσω πύλης των μικροσφαιριδίων. Εάν παρατηρηθεί μεγαλύτερος αριθμός πολλαπλών CytoCount και πιθανολογείται πρόβλημα με το προϊόν, απευθυνθείτε στην Τεχνική Υπηρεσία μας. Παρεχόμενο αντιδραστήριο Το CytoCount είναι ένα εναιώρημα φθορο-μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου, μεγέθους 5,2 µm, σε υδατικό διάλυμα που περιέχει επιφανειοδραστικό παράγοντα. Τα μικροσφαιρίδια CytoCount περιέχουν ένα μίγμα χρωστικών που αναπτύχθηκαν και χρησιμοποιούνται αποκλειστικά από την εταιρεία, οι οποίες εκπέμπουν φως σε ένα ευρύ φάσμα μηκών κύματος. Οι χρωστικές αυτές είναι υδατοδιαλυτές φθορίζουσες ενώσεις με τις οποίες έχουν εμποτιστεί τα μικροσφαιρίδια ομοιόμορφα κατά τη διεργασία κατασκευής. Οι χρωστικές αυτές διεγείρονται σε μήκος κύματος 488 nm και εκπέμπουν φως σε μήκη κύματος 530-700 nm. Το CytoCount διατίθεται με τη μορφή ενός φιαλιδίου που περιέχει 17 ml εναιωρήματος μικροσφαιριδίων συγκέντρωσης 1100 μικροσφαιριδίων/µl (107199-002) S 2366/GR/TIA/03.12.03 p. 1/5

περίπου. Ο ακριβής αριθμός μικροσφαιριδίων ανά µl αναφέρεται πάνω στο φιαλίδιο. Κάθε φιαλίδιο περιέχει ποσότητα που επαρκεί για τουλάχιστον 150 εξετάσεις(100 µl ανά εξέταση). Εκχώρηση τιμών Φύλαξη Προφυλάξεις Η συγκέντρωση μικροσφαιριδίων ( C ) και η αντίστοιχη τυπική απόκλιση ( S ) αναφέρονται πάνω στο φιαλίδιο, εκφρασμένες ως αριθμός μικροσφαιριδίων/µl. Οι τιμές αυτές έχουν προκύψει μετά από απαρίθμηση του προϊόντος σε ένα Coulter Particle Counter Z1. Η τυπική απόκλιση της συγκέντρωσης μικροσφαιριδίων αποτελεί ελάσσονα παράγοντα της συνολικής αβεβαιότητας του αναλυτικού αποτελέσματος. Φυλάσσεται στο σκότος, σε θερμοκρασία 2-8 C. Μην το χρησιμοποιείτε μετά την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στο φιαλίδιο. Εάν το προϊόν φυλάσσεται σε συνθήκες διαφορετικές από τις προδιαγεγραμμένες, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύει τις συνθήκες αυτές. Μη φυλάσσετε το φιαλίδιο σε περιστροφικό αναμείκτη σε θερμοκρασία δωματίου για περισσότερες από 2 ώρες κάθε φορά. 1. Για επαγγελματίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3), μια χημική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή μορφή. Στις συγκεντρώσεις του προϊόντος αυτού, το αζίδιο του νατρίου, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, ενδέχεται να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των υδραυλικών σωληνώσεων και να σχηματίσει ιδιαίτερα εκρηκτικές συσσωρεύσεις αζιδίων μετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε με άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων μετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις. 3. Βεβαιωθείτε ότι το φιαλίδιο CytoCount φυλάσσεται ερμητικά πωματισμένο σε όρθια θέση, για την αποτροπή τυχόν διαρροής του υγρού περιεχομένου του. Τα μικροσφαιρίδια CytoCount πρέπει να επανεναιωρούνται σχολαστικά πριν τη χρήση. Τυχόν βίαιη ανάμειξη των μικροσφαιριδίων CytoCount σε αναμείκτη στροβιλισμού ενδέχεται να προκαλέσει το σχηματισμό φυσαλίδων αέρα στο εσωτερικό του υγρού, γεγονός που είναι δυνατό να μειώσει τον εκτιμώμενο όγκο μικροσφαιριδίων CytoCount που αναρροφούνται με πιπέτα. Συνιστάται απαλή περιστροφή (π.χ. σε περιστροφικό αναμείκτη ή κύλινδρο σωληναρίων αίματος). 4. Πριν από την επανεναιώρηση, θα πρέπει να προσέχετε να μη χαθεί ποσότητα του εναιωρήματος CytoCount, διαφορετικά η καταμέτρηση των μικροσφαιριδίων θα καταστεί άκυρη. 5. Είναι σημαντικό να χρησιμοποιείτε την ίδια βαθμονομημένη πιπέτα και να εφαρμόζετε την ίδια τεχνική ανάστροφης αναρρόφησης με πιπέτα τύπου υγρού ρύγχους τόσο για το δείγμα όσο και για τα μικροσφαιρίδια CytoCount. Είναι σημαντικό οι όγκοι των μικροσφαιριδίων CytoCount και του δείγματος να είναι ακριβείς. Οι όγκοι των αντιδραστηρίων αντισωμάτων και του αντιδραστηρίου λύσης δεν είναι σημαντικοί για τον προσδιορισμό της καταμέτρησης του απόλυτου αριθμού, διότι ο σημαντικός παράγοντας είναι ο λόγος του όγκου του δείγματος προς τον όγκο των μικροσφαιριδίων. Γενική διαδικασία 1. Αραιώστε το αρχικό δείγμα σε αναλογία 10 6 λευκοκύτταρα ανά 100 µl περίπου. Καταγράψτε τον ακριβή συντελεστή αραίωσης. Σε μερικές περιπτώσεις, ενδέχεται να μην απαιτείται αραίωση. 2. Αναρροφήστε με πιπέτα 100 µl του δείγματος, τα οποία περιέχουν 10 6 λευκοκύτταρα, και διανείμετέ τα σε ένα δοκιμαστικό σωληνάριο. Εφαρμόστε την τεχνική της ανάστροφης αναρρόφησης με πιπέτα (ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες που ακολουθούν). 3. Εκτελέστε χρώση και λύση του δείγματος, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για απαρίθμηση CD4+, συνιστούμε τη χρήση του Dako UtiLyse, αρ. κωδικού S 3325 ή S 3350. Για απαρίθμηση CD34+, συνιστούμε τη χρήση του Dako EasyLyse, αρ. κωδικού S 2364. Και για τις δύο διαδικασίες, συνιστάται λύση χωρίς έκπλυση. 4. Αφαιρέστε τα μικροσφαιρίδια CytoCount από τη συντήρηση του ψυγείου (2-8 C). Βεβαιωθείτε ότι το πώμα του φιαλιδίου είναι σφιγμένο, για την αποτροπή τυχόν διαρροής του υγρού περιεχομένου, και αναμείξτε καλά για να διασφαλίσετε την πλήρη επανεναιώρηση των μικροσφαιριδίων. Αποφύγετε την ανάμειξη με μηχανικά μέσα, όπως π.χ. με αναμείκτη περιδίνησης, στο στάδιο αυτό για την αποφυγή τυχόν σχηματισμού φυσαλίδων αέρα που θα μπορούσαν να μειώσουν τον πραγματικό όγκο μικροσφαιριδίων που θα αναρροφηθούν με πιπέτα. Συνιστάται να τοποθετήσετε τα μικροσφαιρίδια σε περιστροφικό αναμείκτη επί 5-60 λεπτά για να διασφαλίσετε ότι τα μικροσφαιρίδια θα παραμείνουν σε εναιώρηση μέχρι τη χρήση. 5. Αφήστε τα μικροσφαιρίδια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. 6. Προσθέστε 100 µl του CytoCount στο δείγμα που έχει ήδη υποβληθεί σε χρώση και λύση. Η αναρρόφηση με πιπέτα τόσο του δείγματος όσο και των μικροσφαιριδίων CytoCount πρέπει να εκτελεστεί με την ίδια βαθμονομημένη πιπέτα και με εφαρμογή της τεχνικής ανάστροφης αναρρόφησης με πιπέτα τύπου υγρού ρύγχους (1) (ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες που ακολουθούν). 7. Αναμείξτε τα μικροσφαιρίδια και το δείγμα απαλά με αναμείκτη περιδίνησης επί 3 δευτερόλεπτα πριν από τη δειγματοληψία, για να διασφαλιστεί η ομοιόμορφη κατανομή των μικροσφαιριδίων CytoCount σε ολόκληρο το δείγμα. 8. Η πρόσκτηση δεδομένων από το δείγμα πρέπει να λάβει χώρα εντός 4 ωρών από την προσθήκη των μικροσφαιριδίων CytoCount για να διασφαλιστεί η ακριβής συγκέντρωση των μικροσφαιριδίων στο δείγμα. Επίσης, όσον αφορά το μέγιστο χρόνο επώασης, ανατρέξτε στα ένθετα προϊόντων των αντίστοιχων αντιδραστηρίων αντισωμάτων και λύσης που χρησιμοποιείτε. 9. Εκτελέστε πρόσκτηση τουλάχιστον 1000 μικροσφαιριδίων CytoCount και τουλάχιστον 100 κυττάρων που σας ενδιαφέρουν (1). 10. Σας συμβουλεύουμε να μη χρησιμοποιήσετε την πρόσθια σκέδαση (FSC) ως παράμετρο κατωφλίου για τη συλλογή δεδομένων, διότι κάτι τέτοιο ενδέχεται να εξαλείψει μέρος των μικροσφαιριδίων CytoCount λόγω του μικρού τους μεγέθους (5,2 µm). Συνιστάται να χρησιμοποιήσετε το κανάλι που χρησιμοποιείται για το FITC (που συνήθως ονομάζεται FL1) ως παράμετρο κατωφλίου. Μια εναλλακτική μέθοδος είναι να ρυθμίσετε την τιμή κατωφλίου του FSC στο μηδέν και να εκτελέσετε πρόσκτηση δεδομένων μέσω πύλης not τοποθετημένης στην κάτω αριστερή γωνία ενός διαγράμματος κουκκίδων πρόσθιας σκέδασης (FSC) ως προς πλευρική σκέδαση (SSC) (περιοχή R8 στο Σχήμα 1). Με τον τρόπο αυτό, θα εξαλειφθεί η πλειονότητα των αχρήστων, χωρίς να εξαιρεθεί κανένα από τα μικροσφαιρίδια CytoCount (4). (107199-002) S 2366/GR/TIA/03.12.03 p. 2/5

Πλευρική σκέδαση Πρόσθια σκέδαση Σχήμα 1. Γραφική παράσταση πρόσθιας σκέδασης ως προς πλευρική σκέδαση για φυσιολογικό δείγμα αίματος. Το κατώφλι ρυθμίζεται στην παράμετρο FSC. Για να διασφαλιστεί ότι δε θα εξαιρεθούν τα μικροσφαιρίδια CytoCount, το κατώφλι FSC ρυθμίζεται στο μηδέν. Για την εξάλειψη των αχρήστων, ορίζεται πύλη not (περιοχή R8) στην κάτω αριστερή γωνία. 11. Θυμηθείτε να αποθηκεύσετε την παράμετρο χρόνου κατά την πρόσκτηση δεδομένων. 12. Η παροχή πρέπει να είναι σταθερή πριν από την έναρξη της πρόσκτησης δεδομένων. Κατευθυντήριες οδηγίες σχετικά με την τεχνική ανάστροφης αναρρόφησης με πιπέτα τύπου υγρού ρύγχους Για τη διανομή δείγματος και μικροσφαιριδίων, πρέπει να χρησιμοποιείτε την ίδια πιπέτα. Χρησιμοποιήστε ένα καθαρό ρύγχος πιπέτας για κάθε αντιδραστήριο. Με την υιοθέτηση της ίδιας τεχνικής για τη διανομή τόσο του δείγματος όσο και των μικροσφαιριδίων, διασφαλίζεται η βελτίωση της συνέπειας των αποτελεσμάτων. Δείγμα: 1. Ωθήστε το έμβολο μέχρι το δεύτερο σημείο ανάσχεσης, βυθίστε το ρύγχος στο υγρό και αναρροφήστε δείγμα. Κατόπιν, ωθήστε το έμβολο στο πρώτο σημείο ανάσχεσης για να διανείμετε δείγμα. Τότε, το ρύγχος της πιπέτας θα πρέπει να περιέχει την περίσσεια του υγρού. 2. Επαναλάβετε το βήμα αυτό τουλάχιστον δύο φορές, διατηρώντας το ρύγχος της πιπέτας διαρκώς βυθισμένο στο δείγμα. 3. Το ρύγχος πιπέτας είναι τώρα έτοιμο για χρήση. Ωθήστε το έμβολο μέχρι το δεύτερο σημείο ανάσχεσης, βυθίστε το ρύγχος στο υγρό και αναρροφήστε δείγμα. Βγάλτε προσεκτικά το ρύγχος της πιπέτας από το δείγμα και σκουπίστε το προσεκτικά με απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνετε τυχόν περίσσεια υγρού, προσέχοντας να μην αγγίξετε το στόμιο του ρύγχους και αφαιρέσετε ακούσια δείγμα από το εσωτερικό του ρύγχους της πιπέτας. 4. Προσπαθήστε να διατηρείτε την πιπέτα όσο το δυνατόν πιο κατακόρυφα. Ελέγξτε για τυχόν παρουσία φυσαλίδων αέρα μέσα στο ρύγχος. Εάν υπάρχουν φυσαλίδες αέρα, διανείμετε το υγρό πίσω στο δείγμα και επαναλάβετε τη διαδικασία δειγματοληψίας. 5. Διανείμετε δείγμα μέχρι το πρώτο σημείο ανάσχεσης του εμβόλου, οπότε θα πρέπει να διακρίνετε υπολειμματικό υγρό στο ρύγχος της πιπέτας μετά τη διανομή του υγρού. Μην αγγίζετε τα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα όταν αφαιρείτε το ρύγχος. Μικροσφαιρίδια: 6. Προετοιμάστε την πιπέτα, όπως περιγράφεται ανωτέρω για το δείγμα (βήματα 1-3). 7. Για τη διανομή διαλύματος μικροσφαιριδίων, τοποθετήστε το ρύγχος της πιπέτας πάνω στο τοίχωμα του σωληναρίου κοντά στην επιφάνεια του δείγματος. Εάν κρατάτε το σωληνάριο και την πιπέτα υπό ελαφριά κλίση, θα διευκολυνθείτε στο βήμα αυτό. Διανείμετε μέχρι το πρώτο σημείο ανάσχεσης του εμβόλου, οπότε θα πρέπει να διακρίνετε υπολειμματικό υγρό στο ρύγχος της πιπέτας μετά τη διανομή του υγρού. 8. Για την περαιτέρω αναρρόφηση μικροσφαιριδίων, βυθίστε το ρύγχος μέσα στο φιαλίδιο CytoCount και αναρροφήστε επιπρόσθετο εναιώρημα μικροσφαιριδίων χωρίς να διανείμετε το υπολειμματικό υγρό που έχει απομείνει μέσα στο ρύγχος μετά την πρώτη αναρρόφηση. 9. Εάν το ρύγχος δεν έχει αγγίξει το δείγμα, θα πρέπει να διανείμετε το υπολειμματικό υγρό, στο εσωτερικό του ρύγχους, μέσα στο φιαλίδιο CytoCount. Εάν επιλέξετε να απορρίψετε το υπολειμματικό υγρό, η ποσότητα στο φιαλίδιο δε θα επαρκεί πλέον για 150 εξετάσεις δειγμάτων. Απαρίθμηση CD34 και CD4 CytoCount Διαδικασία απαρίθμησης αρχέγονων κυττάρων CD34+ ή απαρίθμηση Τ-λεμφοκυττάρων CD4+ με το Το δείγμα πρέπει να υποβληθεί σε χρώση με συζευγμένα με φθοριόχρωμα αντισώματα και τα ερυθρά αιμοσφαίρια πρέπει να υποβληθούν σε λύση. Ανατρέξτε στο βήμα 3 της ενότητας Γενική διαδικασία. Συνιστούμε την εφαρμογή της στρατηγικής ελέγχου μέσω πύλης ISHAGE για τον εντοπισμό αρχέγονων κυττάρων CD34+ (1, 2) και μιας στρατηγικής ελέγχου μέσω πύλης CD45/SSC για την απαρίθμηση κυττάρων CD4+ (3). Το CytoCount έχει βελτιστοποιηθεί για χρήση με 100 µl δείγματος στο οποίο περιέχονται 10 6 λευκοκύτταρα το πολύ. (107199-002) S 2366/GR/TIA/03.12.03 p. 3/5

Πλευρική σκέδαση Πρόσθια σκέδαση Προσδιορισμός των συμβάντων CytoCount : 1. Κατασκευάστε διάγραμμα κουκκίδων για το κανάλι φθορισμού που χρησιμοποιείται για την R- φυκοερυθρίνη (συνήθως ονομάζεται FL2) ως προς το SSC. Τα μικροσφαιρίδια CytoCount διακρίνονται στο επάνω δεξί τεταρτημόριο του διαγράμματος. 2. Σχεδιάστε μια περιοχή που να περικλείει τον πληθυσμό των μικροσφαιριδίων CytoCount, διασφαλίζοντας ότι η διάσταση της περιοχής κατά μήκος του άξονα SSC είναι μεγαλύτερη, για να μπορέσετε να συμπεριλάβετε όλα τα μικροσφαιρίδια CytoCount (περιοχή R6 στο Διάγραμμα 2A). Θα πρέπει να προσέξετε να μη συμπεριλάβετε συμβάντα που δεν αντιστοιχούν σε μικροσφαιρίδια CytoCount, στην εν λόγω περιοχή. Σημείωση: ο συνδυασμός διαγραμμάτων κουκκίδων που προκύπτει από τη χρήση του καναλιού R-φυκοερυθρίνης ως προς SSC δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί εάν το CD45 έχει σημανθεί με R-φυκοερυθρίνη, διότι τα μικροσφαιρίδια και τα κεχρωσμένα ουδετερόφιλα θα αλληλεπικαλύπτονται. Στην περίπτωση αυτή, θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί το κανάλι του FITC ή του RPE-Cy5 για τον προσδιορισμό του αριθμού μικροσφαιριδίων. 3. Κατασκευάστε ένα διάγραμμα κουκκίδων για το χρόνο ως προς το FSC (Διάγραμμα 2B) και εκτελέστε υπέρθεση μέσω πύλης αυτού του διαγράμματος κουκκίδων πάνω στην περιοχή R6 του Διαγράμματος 2A. 4. Σχεδιάστε μια δεύτερη περιοχή (R7 στο Διάγραμμα 2B), η οποία να περικλείει το μονο-διασπαρμένο πληθυσμό μικροσφαιριδίων CytoCount, αποφεύγοντας τυχόν συμβάντα που ενδέχεται να βρίσκονται πιο χαμηλά ή πιο ψηλά στο FSC σε σύγκριση με τον κύριο πληθυσμό. 5. Δημιουργήστε ένα λογικό συνδυασμό μέσω πύλης των R6 και R7 (G7) για να ορίσετε με μεγαλύτερη ακρίβεια τον πληθυσμό μικροσφαιριδίων CytoCount (G7=R6 και R7). Διάγραμμα 2A Διάγραμμα 2B R7 CD34 PE Χρόνος (512,00 δευτ.) Σχήμα 2. Διάγραμμα 2A: CD34/RPE ως προς πλευρική σκέδαση για ένα δείγμα περιφερικού αίματος από ασθενή με διέγερση αυξητικού παράγοντα. Έχει σχεδιαστεί μια περιοχή γύρω από τον πληθυσμό μικροσφαιριδίων (R6). Για να συμπεριληφθούν όλα τα μικροσφαιρίδια CytoCount, η περιοχή R6 πρέπει να φτάνει μέχρι το επάνω όριο της πλευρικής σκέδασης ή να τοποθετηθεί "εκτός κλίμακας". Διάγραμμα 2B: Χρόνος ως προς πρόσθια σκέδαση, σε υπέρθεση μέσω πύλης πάνω στα συμβάντα της περιοχής R6. Για τον προσδιορισμό του αριθμού μικροσφαιριδίων CytoCount, έχει σχεδιαστεί μια περιοχή γύρω από τα μονοδιασπαρμένα μικροσφαιρίδια στο Διάγραμμα 2B (R7). Αυτός ο αριθμός πρέπει να χρησιμοποιηθεί ως ο Αριθμός καταμετρημένων μικροσφαιριδίων CytoCount στον υπολογισμό του απόλυτου αριθμού του πληθυσμού των λευκοκυττάρων που σας ενδιαφέρουν. Ο χρόνος στον ποιοτικό έλεγχο Αντιμετώπιση προβλημάτων Χρήση του χρόνου στον εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο προσδιορισμών μονής πλατφόρμας Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός μικροσφαιριδίων που καταμετράται σε ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα είναι αξιοσημείωτα σταθερός για τα περισσότερα κυτταρόμετρα ροής. Έτσι, για κάθε νέα παρτίδα μικροσφαιριδίων, ο χρήστης μπορεί να υπολογίσει ένα εύρος τιμών με όρια τη μέση τιμή καταμέτρησης μικροσφαιριδίων ±2 Τ.Α. Εάν από ένα δείγμα προκύψει καταμέτρηση μικροσφαιριδίων εκτός αυτού του εύρους τιμών, αυτό δείχνει ενδεχόμενο σφάλμα στην αναρρόφηση με πιπέτα και το δείγμα πρέπει να υποβάλλεται εκ νέου σε χρώση (5). Απόλυτη καταμέτρηση κυττάρων μεγαλύτερη από την αναμενόμενη Μια απόλυτη καταμέτρηση κυττάρων μεγαλύτερη από την αναμενόμενη θα μπορούσε να είναι το σωστό αποτέλεσμα για το συγκεκριμένο δείγμα. Ωστόσο, θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε εσφαλμένη αύξηση του αριθμού καταμετρημένων κυτταρικών συμβάντων. Αυτό με τη σειρά του θα μπορούσε να οφείλεται σε κάποιο πρόβλημα κατά την αναρρόφηση με πιπέτα, όπως π.χ. στο γεγονός ότι ο όγκος του δείγματος ήταν μεγαλύτερος από τον όγκο μικροσφαιριδίων που προστέθηκε, λόγω ανεπαρκούς σκουπίσματος του ρύγχους της πιπέτας πριν από τη διανομή του δείγματος, ή επειδή χρησιμοποιήσατε διαφορετικές πιπέτες για τη διανομή δείγματος και μικροσφαιριδίων. Επίσης, αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε εσφαλμένη τοποθέτηση της κυτταρικής πύλης, γεγονός που επέτρεψε την καταμέτρηση υπερβολικά μεγάλου αριθμού μη κυτταρικών συμβάντων. (107199-002) S 2366/GR/TIA/03.12.03 p. 4/5

Η υψηλότερη καταμέτρηση κυττάρων από την αναμενόμενη θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε μείωση του αριθμού του καταμετρημένων μικροσφαιριδίων CytoCount. Αυτό με τη σειρά του θα μπορούσε να οφείλεται σε κάποιο πρόβλημα κατά την αναρρόφηση με πιπέτα, όπως π.χ. προσθήκη υπερβολικά μικρού αριθμού μικροσφαιριδίων λόγω ανεπαρκούς επανεναιώρησης των μικροσφαιριδίων πριν τη χρήση, παρουσία φυσαλίδων αέρα μέσα στο ρύγχος της πιπέτας κατά τη διανομή ή επειδή χρησιμοποιήσατε διαφορετικές πιπέτες για τη διανομή δείγματος και μικροσφαιριδίων. Μείωση των συμβάντων CytoCount ενδέχεται επίσης να προκληθεί λόγω ρύθμισης του κατωφλίου FSC σε υπερβολικά υψηλή τιμή ή λόγω εσφαλμένης τοποθέτησης της πύλης μικροσφαιριδίων με αποτέλεσμα την εξαίρεση μερικών από αυτά. Απόλυτη καταμέτρηση κυττάρων μικρότερη από την αναμενόμενη Μια καταμέτρηση κυττάρων μικρότερη από την αναμενόμενη θα μπορούσε να είναι το σωστό αποτέλεσμα για το συγκεκριμένο δείγμα. Ωστόσο, θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε εσφαλμένη μείωση του αριθμού καταμετρημένων κυτταρικών συμβάντων. Αυτό με τη σειρά του θα μπορούσε να οφείλεται σε κάποιο πρόβλημα κατά την αναρρόφηση με πιπέτα, όπως π.χ. στο γεγονός ότι ο όγκος του δείγματος ήταν μικρότερος από τον όγκο μικροσφαιριδίων που προστέθηκε, λόγω της παρουσίας φυσαλίδων αέρα κατά τη διανομή του δείγματος (δύσκολα εντοπίζονται οι φυσαλίδες αέρα σε ένα δείγμα αίματος), ή επειδή χρησιμοποιήσατε διαφορετικές πιπέτες για τη διανομή δείγματος και μικροσφαιριδίων. Αυτό ενδέχεται επίσης να οφείλεται στην εσφαλμένη τοποθέτηση της κυτταρικής πύλης, με αποτέλεσμα την εξαίρεση κυτταρικών συμβάντων, ή στην απώλεια κυττάρων λόγω παρατεταμένης επώασης με το αντιδραστήριο λύσης. Η χαμηλότερη καταμέτρηση κυττάρων από την αναμενόμενη θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε αύξηση του αριθμού του καταμετρημένων μικροσφαιριδίων CytoCount. Αυτό με τη σειρά του θα μπορούσε να οφείλεται σε κάποιο πρόβλημα κατά την αναρρόφηση με πιπέτα, όπως π.χ. προσθήκη μεγαλύτερου όγκου μικροσφαιριδίων από εκείνον του δείγματος, ανεπαρκές σκούπισμα του ρύγχους της πιπέτας πριν τη διανομή ή επειδή χρησιμοποιήσατε διαφορετικές πιπέτες για τη διανομή δείγματος και μικροσφαιριδίων. Επίσης, η αύξηση των συμβάντων CytoCount θα μπορούσε να οφείλεται σε εσφαλμένη τοποθέτηση της πύλης μικροσφαιριδίων, γεγονός που επέτρεψε την καταμέτρηση υπερβολικά μεγάλου αριθμού μη συμβάντων μικροσφαιριδίων. Τυχόν απώλεια εναιωρήματος CytoCount πριν από επαρκή επανεναιώρηση είναι δυνατό να οδηγήσει σε αυξημένη συγκέντρωση μικροσφαιριδίων. Η απώλεια εναιωρήματος θα μπορούσε να οφείλεται σε χαλαρό σφίξιμο του πώματος του φιαλιδίου, με αποτέλεσμα τη διαρροή υγρού ή την έκχυση του περιεχομένου του φιαλιδίου CytoCount πριν από την επανεναιώρηση. Βιβλιογραφικές αναφορές 1. Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood (review). Cytometry 2000;42:327-46. 2. Gratama JW, Keeney M, Sutherland DR. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. In: Robinson JP, Darzynkiewicz S, Dean PN, Dressler LG, Rabinovitch PS, Stewart CC, Tanke HJ, Wheeless LL. editors. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; 1999. p 6.4.1-6.4.22. 3. Schnizlein-Bick CT, Mandy FF, O Gorman MRG, Paxton H, Nicholson JKA, Hultin LE et al. Use of CD45 gating in three and four-color flow cytometric immunophenotyping: guideline from The National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry 2002;50:46-52. 4. Brocklebank AM, Sparrow RL. Enumeration of CD34+ cells in cord blood: a variation on a single-platform flow cytometric method based on the ISHAGE gating strategy. Cytometry 2001;46:254-261. 5. Bergeron M, Lustyik G, Phaneuf S, Ding T, Nicholson JKA, Janossy G, et al. Stability of currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric operation: time can tell all. Cytometry 2003;52B:37-40. Επεξήγηση συμβόλων Αριθμός καταλόγου Περιορισμοί θερμοκρασίας Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Μακριά από το ηλιακό φως (Συμβουλευτείτε την ενότητα Φύλαξη ) Κωδικός παρτίδας Κατασκευαστής (107199-002) S 2366/GR/TIA/03.12.03 p. 5/5