ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Η Συνδεκάνη-3 διαμεσολαβεί τις βιολογικές δράσεις της HARP ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Παρασκευή Κίτσου Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Ιούνιος 2011

ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Φλυτζάνης Κων/νος Αναπληρωτής καθηγητής Μίντζας Αναστάσιος Καθηγητής Ο Επιβλέπων Καθηγητής Κατσώρης Παναγιώτης Αναπληρωτής καθηγητής

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1 ABSTACT 2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3 HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) 3 ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ HARP 6 H HARP ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ 8 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ HARP 10 RPTPβ/ζ (RECEPTOR-LIKE PROTEIN-TYROSINE PHOSPHATASE) 11 ALK (ANAPLASTIC LYMPHOMA KINASE) 13 ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ ΘΕΙΙΚΗΣ ΗΠΑΡΑΝΗΣ (HEPARAN SULFATE PROTEOGLYCANS, HSPGs) 14 Η HARP ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ 18 ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ 23 ΜΟΡΙΑ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ 24 SRC 25 FAK 27 PTEN 28 AKT 29 ΣΚΟΠΟΣ 31 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 32 ΑΝΑΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 32 ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΑΙΜΟΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ NEUBAUER 35 ΚΑΤΑΨΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 35 ΑΠΟΨΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 37 ΠΑΡΟΔΙΚΗ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ DU145 ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΠΑΡΕΜΒΑΛΟΜΕΝΟ RNA 38 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΟΥ ΙΩΔΟΥΣ (Crystal Violet) 41 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 42 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 44

ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΜΟΡΙΩΝ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ 46 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ 47 ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΣΕ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ (SDS-PAGE) 48 ΧΡΩΣΗ ΠΗΚΤΩΜΑΤΟΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ 51 ΑΝΑΛΥΣΗ WESTERN 51 ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΟΜΑΤΩΝ 54 ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΟΜΑΤΩΝ 54 ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΕΠΑΝΑΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑΤΩΝ 54 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ RNA ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ 55 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ RNA 57 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ 58 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΚΑΙ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ RT-PCR 59 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 61 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 63 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ SDC3 ΣΤΑ DU145 ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΑ 63 ΠΑΡΟΔΙΚΗ ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ SDC3 ΣΤΑ DU145 ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΧΡΗΣΗ sirna 64 Η SDC3 ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΕΙ ΤΗΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΤΩΝ DU145 και PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ 66 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ HARP ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΤΩΝ DU145 και PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ 67 Η SDC3 ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΕΙ ΤΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΤΩΝ DU145 και PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ 69 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ HARP ΣΤΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΤΩΝ DU145 και PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ 71 Η HARP ΕΠΗΡΑΖΕΙ ΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ SRC 74 Η HARP ΕΠΗΡΑΖΕΙ ΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ FAK 77 Η HARP ΕΠΗΡΑΖΕΙ ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ppten ΚΑΙ pakt 80

ΣΥΖΗΤΗΣΗ 85 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 89

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας ο οποίος εμφανίζει πλειάδα βιολογικών δράσεων εμπλεκόμενος στη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση πολλών τύπων κυττάρων, καθώς και στην αγγειογένεση και την ανάπτυξη όγκων. Η HARP έχει χρονοειδικό και ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης, υπερεκφράζεται όμως σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, σε ανθρώπινους καρκινικούς όγκους και βρίσκεται σε υψηλή συγκέντρωση στον ορό του αίματος ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου. Η HARP ασκεί τις βιολογικές της δράσεις μετά από δέσμευση στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς, SDC3, ALK και RPTPβ/ζ. Οι βιολογικές της δράσεις προσδιορίζονται από τη συνισταμένη των δράσεων που έχει κάθε υποδοχέας της, αντικατοπτρίζοντας τον περίπλοκο μηχανισμό δράσης της. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε τον τρόπο με τον οποίο η SDC3 διαμεσολαβεί τις βιολογικές δράσεις της HARP σε κύτταρα DU145 και PC3, κυτταρικές σειρές από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη. Χρησιμοποιώντας την RNAi τεχνολογία, διαμολύναμε παροδικά τα κύτταρα με sirna ειδικά σχεδιασμένο έναντι της SDC3, μειώνοντας τα επίπεδα έκφρασης της. Καλλιεργήσαμε κύτταρα, φυσιολογικά και μετασχηματισμένα, επιδράσαμε εξωγενώς με HARP και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, η SDC3 είναι θετικός ρυθμιστής της επαγόμενης από τη HARP κυτταρικής προσκόλλησης και μετανάστευσης. Παράλληλα, μελετήσαμε την ενεργοποίηση μορίων που εμπλέκονται στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος της SDC3 όπως της Src, Fak, Akt, Pten και Erk1/2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίησή της SDC3 από τη HARP οδηγεί στην αύξηση των επιπέδων των psrc, pfak, pakt και p Erk1/2, ενώ, βρέθηκε ότι μειώνεται η φωσφορυλίωση της Pten. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η συμμετοχή της συνδεκάνης 3 στις βιολογικές δράσεις της HARP, καθώς και μόρια του σηματοδοτικού μονοπατιού μεταγωγής σήματος του υποδοχέα αυτού. Βρέθηκε ότι η HARP προσδενόμενη στον υποδοχέα αυτό, επάγει την προσκόλληση και μετανάστευση των κυττάρων, δράσεις που συνδέονται με την ανάπτυξη όγκων και τη μετάσταση καρκινικών κυττάρων. 1

ABSTRACT HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), also known as Pleiotrophin, is a growth factor involved in several biological actions such as induction of cellular proliferation, migration and angiogenesis. Elevated concentrations of this growth factor are found in many tumours, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. HARP exerts its actions after binding to the transmembrane receptors RPTP β/ζ, ALK and N-Syndecan (SDC3). In the present work, we studied the role of the transmembrane receptor SDC3 in the biological actions of HARP. We used DU145 and PC3 transiently transfected with specific sirna to downregulate the accumulation of SDC3. Our results show that HARP binds to SDC3 and induces the cell adhesion and migration of DU145 and PC3 cells. We also studied the signal transduction through SDC3 receptor and the activation of signaling molecules such as Src, Fak, Akt, Pten and Erk 1/2. Our results revealed that HARP induces the phosphorylation of Src kinase, Fak and Erk1/2 after binding to SDC3 in both DU145 and PC3 cells. Also, HARP increases Akt signaling cascade in PC3 cells, while it suppresses the signaling cascade induced by PTEN in DU145 cells. Consequently, HARP interaction with SDC3, results in the activation of SDC3, which in turn triggers a signal transduction pathway that leads to specific biological cell responses activates other cytoplasmic effectors. Therefore, there starts a signaling cascade that targets specific genes and cell response. In conclusion, our results indicate that SDC3 contributes, as a positive regulator, to HARP-dependent cell adhesion and migration in both DU145 and PC3 cells. 2

ΕΙΣΑΓΩΓΗ HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας ο οποίος παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Χαρακτηρίζεται ως ένα πλειοτροπικό μόριο εμπλεκόμενο σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως στην κυτταρική διαφοροποίηση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό καθώς επίσης και σε διαδικασίες όπως η αγγειογένεση και η καρκινογένεση. Η HARP είναι ένα μόριο μοριακού βάρους 18 kda, όπως προσδιορίστηκε μετά από ανάλυση σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, κάτι όμως που δεν αντικατοπτρίζει την αμινοξική σύσταση του ώριμου μορίου, αφού μετά από ανάλυση με φασματοσκοπία μάζας, το μοριακό της βάρος προσδιορίστηκε στα 15,291 kda. Η διαφορά αυτή πιθανότατα οφείλεται στη μεγάλη περιεκτικότητα της HARP σε βασικά αμινοξέα (Hampton et al., 1992). Ο αυξητικός αυτός παράγοντας συντίθενται ως ένα πολυπεπτίδιο 168 αμινοξέων, όπως βρέθηκε ύστερα από μελέτη του cdna του γονιδίου της HARP. Τα 32 πρώτα αμινοξέα του αμινοτελικού άκρου του μορίου συγκροτούν μια εξαιρετικά υδρόφοβη περιοχή και αποτελούν το πεπτίδιο-σινιάλο, όπως φαίνεται στην εικόνα 1. Μ S S Q Q Y Q Q Q R R K F A Α A F L A L I F I L A Α V D T *A E A G K Κ E K P E K Κ V K Κ S D C G E W Q W S V C V P T S G T C G L G T R E G T R T G A E C K Q T M K T Q R C K I P C N W K Κ Q F G A E C K Y Q F Q A W G E C D L N T A L K T R T G S L T R A L H N A D C Q K T V T I S K P C G K L T K P K P Q A E S K Κ K Κ K E G K Κ Q E K M L D Εικόνα 1. Αμινοξική αλληλουχία της HARP. Το υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στο πεπτίδιο σινιάλο. Με * σημειώνεται το σημείο στο οποίο μπορεί να πραγματοποιηθεί η πέψη και η απομάκρυνση του πεπτιδίου αυτού. Η πρωτοταγής δομή της HARP είναι ιδιαίτερα συντηρημένη σε διάφορα είδη. Για παράδειγμα, η ανθρώπινη HARP είναι 99% ομόλογη με αυτή του αρουραίου και 3

του ποντικού (Merenmies and Rauvala, 1990), ενώ 90% ομολογία παρουσιάζει η HARP των θηλαστικών με την HARP της όρνιθας (Hampton, 1992), καθώς και αυτή των θηλαστικών με την HARP του Xenopus (Tsujimura, 1995). Το 24% των αμινοξέων του ώριμου μορίου της HARP είναι βασικά αμινοξέα, κυρίως λυσίνες, τα οποία είναι ομαδοποιημένα στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου, προσδίνοντάς του μια βασική συμπεριφορά (εικόνα 2). Εικόνα 2. Αναπαράσταση του μορίου της HARP, σύμφωνα με το οποίο όλες οι κυστεΐνες συμβάλλουν στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών. Διακρίνονται οι δύο κεντρικές περιοχές του μορίου, οι οποίες περιλαμβάνουν από τρεις αντιπαράλληλες β- πτυχωτές επιφάνειες, καθώς και τα δύο άκρα του μορίου, τα οποία έχουν τυχαία διαμόρφωση. Οι περιοχές αυτές είναι σημαντικές για την πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη (Bohlen et al., 1991) και στην εξωκυττάρια ύλη (Li et al., 1990; Kinnunen et al., 1996). Στο μόριο επίσης περιέχονται και δέκα κυστεΐνες, το ποσοστό όμως συμμετοχής τους στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών αποτελούσε ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα, αφού υπήρχαν αναφορές για συμμετοχή έξι μόνο κυστεϊνών (Hampton et al., 1992), ενώ οι περισσότερες μελέτες υποστηρίζουν τη συμμετοχή όλων (Seddon et al., 1994). Σήμερα γνωρίζουμε ότι οι δισουλφιδικοί δεσμοί δημιουργούνται μεταξύ της Cys15- Cys44, της Cys23- Cys53, της Cys30- Cys57, της Cys67-Cys 99 και της Cys77-Cys109 (Hulmes et al., 1993). Οι δισουλφιδικοί δεσμοί, αν και προσδίδουν σταθερότητα στο μόριο της HARP από αλλαγές στο ph ή από την 4

ύπαρξη οργανικών διαλυτών (Hampton, 1992), την καθιστούν ευαίσθητη σε αναγωγικές συνθήκες. Η ύπαρξη αυτών των δέκα κυστεϊνών εξηγεί τη δυσκολία απομόνωσης ανασυνδυασμένης HARP, από προκαρυωτικούς οργανισμούς, με σωστή δομή και πλήρη βιολογική δράση (Kuo et al.,1992). Μέχρι σήμερα δεν έχει πλήρως διασαφηνιστεί η τρισδιάστατη διαμόρφωση του μορίου της HARP. Ωστόσο, μελέτες με NMR έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη HARP που παράχθηκε τόσο σε κύτταρα εντόμων, όσο και σε βακτήρια E. coli, αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές, μία προς το αμινοτελικό και μια προς το καρβοξυτελικό άκρο του μορίου, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν ελαστικό σύνδεσμο. Κάθε κεντρική περιοχή περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχώσεις, που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 18-27, 32-39, 48-57, 70-78, 83-91 και 101-110. Το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου που είναι πλούσια σε λυσίνες, δεν έχουν μια συγκεκριμένη διαμόρφωση, αλλά σχηματίζουν τυχαίες περιελίξεις (Kilpeläinen et al., 2000). Μελέτη των κεντρικών περιοχών της HARP έδειξε ότι έχει αλληλουχίες που αντιστοιχούν στις επαναλαμβανόμενες περιοχές τύπου I της θρομβοσπονδίνης (Thrombospondin type I repeat, TSR) (Rauvala et al., 2000; Kilpenainen et al., 2000). Φαίνεται ότι οι περιοχές TSR των διάφορων πρωτεϊνών έχουν παρόμοια δομικά στοιχεία που δικαιολογούν την ικανότητα δέσμευσή τους στην ηπαρίνη. Οι δύο κεντρικές περιοχές της HARP δεσμεύονται με την ηπαρίνη, γεγονός που καθιστά δυνατή την απομόνωση και τον καθαρισμό της. Η HARP απομονώθηκε αρχικά από εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου, ως μόριο που μπορεί να επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala, 1989). Επιπλέον, η HARP παίζει σημαντικό ρόλο στα γεγονότα που λαμβάνουν χώρα κατά τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του εγκεφάλου (Rauvala, 1994). Μελέτες που ακολούθησαν έδειξαν ότι η πρωτεΐνη αυτή εκφράζεται και σε άλλους ιστούς, όπως η καρδιά (Hampton et al., 1992), η μήτρα (Milner et al., 1989), τα οστά και οι χόνδροι (Neame et al., 1993). Η έκφρασή της ακολουθεί συγκεκριμένο αναπτυξιακό πρότυπο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, ενώ στα ενήλικα άτομα τα επίπεδα έκφρασή της είναι ιδιαίτερα χαμηλά και περιορίζεται σε συγκεκριμένους ιστούς, με εξαίρεση τις περιπτώσεις τραυματισμών και καρκίνου, όπου παρατηρείται ραγδαία αύξηση. Στο νευρικό σύστημα ποντικού και αρουραίου, βρέθηκε με πειράματα in situ υβριδοποίησης ότι η HARP εκφράζεται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη στο νευροεξώδερμα και στο μεσόδερμα. Αρχικά εκφράζεται στα γάγγλια και στα 5

εγκεφαλικά ημισφαίρια, ενώ στη συνέχεια εντοπίζεται στο τελεγκέφαλο, στο διεγκέφαλο, στην οροφή του μεσεγκεφάλου, καθώς και στο περιφερειακό νευρικό σύστημα, κυρίως στα γάγγλια της ραχιαίας ρίζας και σε νευρικές προεκτάσεις (Mitsiadis et al., 1995). Η έκφρασή της όμως στον αναπτυσσόμενο φλοιό της παρεγκεφαλίδας γίνεται μέγιστη κατά την μετεμβρυϊκή περίοδο (Rauvala 1989; Li et al., 1990). Στα ενήλικα άτομα, η έκφραση της HARP φαίνεται να περιορίζεται στους νευρώνες του ιππόκαμπου. Η δράση της σχετίζεται με καθοδήγηση των νευρικών κυττάρων μέσα από συγκεκριμένα μονοπάτια, τα οποία καθορίζονται από τη HARP που βρίσκεται δεσμευμένη στην εξωκυττάρια ύλη. Εκτός από το νευρικό σύστημα, η HARP συμμετέχει και στις αλληλεπιδράσεις επιθηλίου-μεσεγχύματος. Η πρωτεΐνη εκφράζεται στα αισθητήρια όργανα, στα μαλλιά, στις καταβολές των άκρων, στον αναπτυσσόμενο μετάνεφρο, καθώς και στο πεπτικό και στο αναπνευστικό σύστημα (Mitsiadis et al., 1995). Επιπλέον, υψηλά επίπεδα HARP έχουν αναφερθεί και στα οστά (Τezuka et al., 1990) και συγκεκριμένα κατά την ανάπτυξη και κατά την αναγέννησή τους. Επίσης, η HARP εκφράζεται στο γεννητικό σύστημα τόσο του θηλυκού, όσο και του αρσενικού ατόμου. Το mrna και η πρωτεΐνη της HARP έχουν εντοπισθεί στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών του ενδομητρίου, στο αδενικό επιθήλιο (Milhiet et al., 1998) και στον ιστό του πλακούντα (Fan et al., 2000). Στο αναπαραγωγικό σύστημα του αρσενικού ατόμου, το mrna της HARP εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα του ανθρώπινου προστάτη και σε πολύ υψηλά επίπεδα στους όρχεις. ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ HARP Η HARP χαρακτηρίζεται ως πλειοτροπικό μόριο, εμφανίζοντας πλειάδα βιολογικών δράσεων εμπλεκόμενη στη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση πολλών τύπων κυττάρων, καθώς και στην αγγειογένεση και την ανάπτυξη όγκων. Η HARP απομονώθηκε αρχικά από εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου, ως μόριο που επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala, 1989). Στη συνέχεια όμως αποδείχτηκε και ο σημαντικός της ρόλος στην ανάπτυξη και ωρίμανση του εγκεφάλου. Η HARP έχει ικανότητα ρύθμισης της κυτταρικής κινητικότητας 6

νευρώνων (Rauvala et al., 2000), ενώ μπορεί να τροποποιεί την πλαστικότητα των συνάψεων (Amet et al., 2001) και να συμμετέχει στη μορφογένεση των συνάψεων των κυττάρων Purkinje στην αναπτυσσόμενη παρεγκεφαλίδα (Tanaka et al., 2003). Επίσης, η HARP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της μνήμης, καθώς ρυθμίζει το κατωφλιαίο επίπεδο της μακροχρόνιας ρύθμισης (long-term Potentiation, LTP) των νευρώνων της C1 περιοχής του ιππόκαμπου. Ποντίκια στα οποία έχει απαλειφθεί το γονίδιο της HARP, εμφανίζουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα LTP, φαινόμενο το οποίο αντιστρέφεται μετά τη χορήγηση εξωγενούς HARP (Amet et al., 2001). Η HARP συμμετέχει και στο σχηματισμό των οστών, προάγοντας την προσκόλληση, την μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των πρόδρομων οστικών κυττάρων (Sato et al., 2002), στοιχείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη θεραπείας για σκελετικές επιδιορθώσεις. Η πρωτεΐνη αυτή παίζει σημαντικό ρόλο και στο ουρογεννητικό σύστημα, ενώ έχει την ικανότητα να ρυθμίζει τη φυσιολογία της σπερματογένεσης, αφού καταστολή της έκφρασής της μπορεί να οδηγήσει σε στειρότητα. Όταν εμβρυϊκά κύτταρα ποντικών διαμολύνθηκαν με ανενεργές μορφές του μορίου, αναπτύχθηκαν μη γόνιμα άτομα. Επιπλέον, έφεραν ατροφικούς όρχεις, ενώ τα παραγόμενα σπερματοζωάρια παρουσίαζαν μεγάλο ποσοστό απόπτωσης σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησής τους (Zhang et al., 1999). Επίσης η HARP επάγει τον πολλαπλασιασμό διαφόρων τύπων κυττάρων, όπως επιθηλιακά (Fang et al., 1992; Vacherot et al., 1999), ενδοθηλιακά (Courty et al., 1991; Papadimitriou et al., 2000) και ινοβλάστες (Fang et al., 1992). Η HARP συμμετέχει και στην αγγειογένεση, διαδικασία σχηματισμού νέων αγγείων από προϋπάρχοντα. Αγγειογένεση κάτω από αυστηρό έλεγχο παρατηρείται στο αναπαραγωγικό σύστημα των θηλυκών ατόμων και κατά την επούλωση πληγών, ενώ σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, παρατηρείται ανεξέλεγκτη αγγειογένεση. Ο ρόλος της HARP στην φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε για πρώτη φορά όταν εντοπίσθηκε, τόσο η πρωτεΐνη όσο και το mrna της, σε ενδοθηλιακά κύτταρα από μαστικό αδένα ανθρώπου, σε ενδομήτριο αρουραίου (Milhiet et al., 1998) και σε ανθρώπινο προστάτη (Vacherot et al., 1999). Ωστόσο, ακόλουθες μελέτες απέδειξαν το ρόλο της HARP τόσο στην in vitro όσο και στην in vivo αγγειογένεση. Σε in vitro μελέτες, η HARP έχει την ικανότητα επαγωγής του 7

πολλαπλασιασμού (Courty et al., 1991; Papadimitriou et al., 2000), και της διαφοροποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων (Papadimitriou et al., 2000), καθώς και του σχηματισμού από ενδοθηλιακά κύτταρα, δικτύου ψευδαγγείων σε πήκτωμα κολλαγόνου. Η in vivo αγγειογενετική δράση της HARP έχει διαπιστωθεί στο σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Papadimitriou et al., 2001) και σε εμφυτεύματα Matrigel σε ποντίκια (Bernard-Pierrot et al., 2002). Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα έκφρασής της HARP είναι διαφορετικά κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου με τα μέγιστα ποσοστά να παρατηρούνται κατά την έναρξή του (Milhiet et al., 1998). H HARP ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ Η HARP έχει βρεθεί να εκφράζεται ή να υπερεκφράζεται σε διάφορους ιστούς σε περιπτώσεις καρκίνου. Επομένως είναι ένα μόριο το οποίο εμπλέκεται στην καρκινογένεση. Κλινικές μελέτες έδειξαν αυξημένα επίπεδα HARP στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του στομάχου, του παγκρέατος, του στήθους και του προστάτη (Fang et al., 1992; Souttou et al., 1998). Υπερέκφραση της HARP βρέθηκε και μετά από in vivo μελέτες, σε διάφορους τύπους καρκίνου, όπως το νευροβλάστωμα, το γλοιοβλάστωμα, το μελάνωμα, ο καρκίνος των ωοθηκών, του μαστού, του προστάτη, του πνεύμονα, καθώς και του παγκρέατος. Αυξημένη έκφραση του γονιδίου της HARP έχει πιστοποιηθεί και σε in vitro πειράματα με κυτταρικές σειρές. Σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη (PC3), μαστού (MDA-MB 231, MDA-MB 361 ), ωοθήκης (A1827, PA-1) και μελανώματος (WM 852, WM 239A), παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της HARP, ενώ σε άλλες καρκινικές σειρές, που προέρχονται όμως από τους ίδιους ιστούς, όπως για παράδειγμα οι καρκινικές σειρές DU145 και LNCaP που προέρχονται από καρκίνο του προστάτη, οι MCF-7, BT-474, MDA-MB-134 και SK-BR-3 από καρκίνο του μαστού και η Α2780 από καρκίνο της ωοθήκης, δεν παρατηρήθηκε ανάλογη έκφραση. Ενδιαφέρον στοιχείο αποτελεί το γεγονός ότι η έκφραση της HARP σχετίζεται και με την επιθετικότητα που εμφανίζει κάθε τύπος καρκίνου, αφού οι κυτταρικές σειρές που εκφράζουν το μόριο προέρχονται από ένα πιο επιθετικό καρκίνο, σε σύγκριση με αυτές των οποίων η έκφραση είναι περιορισμένη (Fang et al., 1992). 8

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η έκφραση της HARP στον καρκίνο του προστάτη. Το mrna της HARP εντοπίζεται στα κύτταρα του ινομυώδους στρώματος τόσο σε φυσιολογικούς, όσο και υπερπλασμένους ή καρκινικούς ιστούς. Ενώ όμως η πρωτεΐνη δεν ανιχνεύεται στα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη υπό φυσιολογικές συνθήκες, η παρουσία της είναι έντονη στο επιθήλιο των καρκινικών ιστών, υποδηλώνοντας τον παρακρινή τρόπο δράση της. Η δράση της HARP ως ογκογόνου παράγοντα αποδεικνύεται από την ικανότητα εξαλλαγής των κυττάρων σε καρκινικά. Μελέτες έδειξαν ότι η υπερέκφραση της HARP σε κυτταρική σειρά ινοβλαστών (NIH 3T3), οδηγεί σε καρκινικό φαινότυπο. Το συμπέρασμα αυτό εξήχθη από τη μελέτη του αριθμού των κυττάρων που είναι προσκολλημένα σε υπόστρωμα, του σχηματισμού εστιών προσκόλλησης, της ανάπτυξης των κυττάρων σε συνθήκες ανεξάρτητες από προσκόλληση σε υπόστρωμα και του σχηματισμού όγκων σε αθυμικά ποντίκια. Επίσης, εάν σε κύτταρα Colo357 (τα οποία προέρχονται από καρκίνο του παγκρέατος) κατασταλεί η έκφραση της HARP με χρησιμοποίηση αντίστοιχων ριβοζοενζύμων, τότε μειώνεται αισθητά ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων αυτών, η ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε συνθήκες ανεξάρτητες από προσκόλληση σε υπόστρωμα, καθώς και το μέγεθος των όγκων που δημιουργούν σε αθυμικά ποντίκια in vivo (Weber et al., 2000). Επίσης, η HARP που απομονώθηκε από καρκινικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα επάγει τον πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Όταν κύτταρα μελανώματος, στα οποία είχε κατασταλεί η έκφραση της HARP, ενέθηκαν σε αθυμικά ποντίκια, επιβραδύνθηκε σημαντικά τόσο η ανάπτυξη των όγκων, όσο και η επαγόμενη από αυτούς αγγειογένεση (Czubayko et al., 1996). Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα και μετά την ένεση σε αθυμικά ποντίκια κυττάρων γλοιοβλαστώματος, στα οποία είχε κατασταλεί η έκφραση της HARP (Grzelinski et al., 2005). Επίσης, καρκινικά κύτταρα μαστού τα οποία υπερεκφράζουν HARP, επάγουν τον πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και το σχηματισμό νέων αγγείων in vivo (Choundouri et al., 1997). 9

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ HARP Παρόμοια με άλλους αυξητικούς παράγοντες, η HARP ασκεί τις βιολογικές της δράσεις μετά από τη δέσμευσή της με διαμεμβρανικούς υποδοχείς. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του υποδοχέα, ο οποίος επηρεάζει την ενεργότητα συγκεκριμένων ενδοκυτταρικών μορίων τελεστών, τα οποία με τη σειρά τους επηρεάζουν την ενεργότητα άλλων μορίων. Η ενεργοποίηση συνήθως περιλαμβάνει φωσφορυλίωση/απόφωσφορυλίωση συγκεκριμένων θέσεων των μορίων-στόχων. Με τον τρόπο αυτόν ξεκινά ένας καταρράκτης αντιδράσεων, που ως τελικό στόχο έχει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων και την κυτταρική απόκριση. Αναφορικά με τη HARP, έχουν χαρακτηριστεί τρεις υποδοχείς. Ο RPTPβ/ζ, ο ALK και η SDC3. Εικόνα 3. Υποδοχείς της HARP. H HARP ασκεί τις βιολογικές της δράσεις μετά από δέσμευσή της με τους διαμεμβρανικούς της υποδοχείς RPTPβ/ζ, ALK και SDC3. 10

RPTPβ/ζ (RECEPTOR-LIKE PROTEIN-TYROSINE PHOSPHATASE) Ο RPTPβ/ζ είναι μια διαμεμβρανική πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης, που εκφράζεται κυρίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Maeda et al., 1996). Ο RPTPβ/ζ μπορεί να αλληλεπιδράσει και με άλλα μόρια, εκτός της HARP, μέσω του τμήματός του που βρίσκεται στην εξωκυττάρια πλευρά. Το τμήμα του αυτό, στο ακραίο σημείο (αμινοτελικό άκρο), παρουσιάζει μεγάλη ομοιότητα με το ένζυμο καρβονική ανυδράση (CAH). Ακολουθείται από μία όμοια με την ινονεκτίνη ΙΙΙ (FNIII) αλληλουχία και από μια περιοχή που είναι πλούσια σε σερίνες και γλυκίνες, σημείο στο οποίο θεωρείται ότι προσδένονται οι αλυσίδες της θειικής χονδροϊτίνης. Το τμήμα αυτό συνδέεται μέσω της διαμεμβρανικής περιοχής με την κυτταροπλασματική, η οποία περιλαμβάνει δύο περιοχές με καταλυτική δράση φωσφατάσης και μια PDZ περιοχή. Από τις περιοχές με καταλυτική δράση φωσφατάσης, αυτή που είναι πιο κοντά στη διαμεμβρανική περιοχή έχει μεγαλύτερη ενεργότητα. Μέχρι σήμερα έχουν ανιχνευθεί τρεις διαφορετικές ισομορφές του RPTPβ/ζ - δυο διαμεβρανικές μορφές και μια εκκρινόμενη- οι οποίες είναι αποτέλεσμα εναλλακτικής ωρίμανσης του μεταγράφου. Η εκκρινόμενη μορφή, γνωστή και ως φωσφακάνη, ή 6Β4, αντιπροσωπεύει την κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης στον εγκέφαλο, και θεωρείται μια τροποποιημένη μορφή διαμεμβρανικού υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσινών β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ). Πειράματα δέσμευσης με τη φωσφακάνη, κατέδειξαν δύο περιοχές, μία χαμηλής (Kd=3 nm) και μια υψηλής (Kd=0.25 nm), συγγένειας με τη HARP. Οι αλυσίδες της θειικής χονδροϊτίνης έχουν σημαντικό ρόλο στη συγκεκριμένη δέσμευση, αφού επίδραση με χονδροϊτινάση μείωσε τη δέσμευση της HARP στην φωσφακάνη. Επίσης, η φωσφακάνη έχει καθοριστικό ρόλο στην επαγώμενη από τη HARP προέκταση των νευριτών (Maeda et al., 1996). Οι διαμεμβρανικές μορφές του RPTPβ/ζ ανιχνεύονται στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα σε ζώνες πολλαπλασιασμού. 11

Εικόνα 4. Ισομορφές του RPTPβ/ζ. Διακρίνεται η περιοχή που παρουσιάζει ομολογία με το ένζυμο καρβονική ανυδράση (CAH), η αλληλουχία της ινονεκτίνης ΙΙΙ (FN) και οι αλυσίδες της θειικής χονδροϊτίνης. Επίσης, οι διαμεμβρανικές μορφές του RPTPβ/ζ έχουν ανιχνευτεί στη γλοία, στα αστροκύτταρα και στους κώνους μετανάστευσης την νευρικών κυττάρων, ρυθμίζοντας τη μετανάστευση των νευρώνων και τον προσανατολισμό των νευριτών (Maeda et al., 1998; Ulbricht et al., 2006). Εκτός από τη HARP, Ο RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά και με άλλα μόρια, όπως ο FGF2, ενώ τόσο η φωσφακάνη, όσο και η διαμεμβρανικές ισομορφές του RPTPβ/ζ, είναι δυνατόν να αλληλεπιδράσουν με μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (Cell Adhesion Molecules CAMs) όπως N-CAM, Ng-CΑΜ και τενασίνη, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της προσκόλλησης και της προέκτασης των νευριτών (Rauvala et al., 2000). Ο RPTPβ/ζ είναι μόριο με ενδογενή δράση φωσφατάσης και έχει προταθεί το ότι η HARP επάγει τον διμερισμό ή τον ολιγομερισμό του, προκαλώντας την αυτοαποφωσφορυλίωσή του και αυξάνοντας τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των υποστρωμάτων του. Μερικά από τα υποστρώματα του RPTPβ/ζ είναι η β-κατενίνη, η β-αντουσίνη και η Fyn (Pariser et al., 2005). Αλληλεπίδραση της HARP με τον RPTPβ/ζ αυξάνει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της β-κατενίνης, εμποδίζοντας την αλληλεπίδρασή της με την α-κατενίνη και συνεπώς με τις καντερίνες, μόρια τα οποία έχουν πρωτεύοντα ρόλο στην διακυτταρική σύνδεση. Στο ίδιο πλαίσιο κινείται και η β-αντουσίνη, της οποίας η φωσφορυλίωση αποσταθεροποιεί τον κυτταροσκελετό και συγκεκριμένα τα ινίδια ακτίνης (Pariser et al., 2005). 12

Υπερέκφραση του RPTPβ/ζ έχει παρατηρηθεί σε πολλούς καρκίνους, όπως του προστάτη, του στομάχου, του λάρυγγα κ.α. Στην περίπτωση του γλοιοβλαστώματος η καταστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ κατέστειλε την ανάπτυξη όγκων σε αθυμικά ποντίκια, καθώς και τη μετανάστευση των κυττάρων (Ulbricht et al., 2006). ALK (ANAPLASTIC LYMPHOMA KINASE) Ένας ακόμα υποδοχέας της HARP είναι ο ALK, ο οποίος μέχρι πρόσφατα είχε θεωρηθεί ορφανός υποδοχέας (Stoica et al., 2001) και ανήκει στην οικογένεια υποδοχέων με ομοιότητα με τους υποδοχείς ινσουλίνης (Insulin like receptor). Είναι μια διαμεμβρανική πρωτείνη με μοριακό βάρος περίπου 200 kda έχει ενεργότητα κινάσης τυροσίνης και συγκροτείται από μια εξωκυττάρια, μια διαμεμβρανική και μια κυτταροπλασματική περιοχή. Η εξωκυττάρια περιοχή περιέχει μια LDLa (Low-Density Lipoprotein class A) περιοχή, μια περιοχή πλούσια σε γλυκίνες, και δύο ΜΜΑ περιοχές, οι οποίες ανάμεσα στην οικογένεια υποδοχέων με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, απαντώνται μόνο στον ALK. Ανιχνεύονται σε πρωτεΐνες όπως οι memprins, σε υποδοχείς με ενεργότητα φωσφατάσης τυροσίνης, και φαίνεται να εμπλέκονται στις κυτταρικές αλληλεπιδράσεις. Η διαμεμβρανική περιοχή είναι ο σύνδεσμος εξωκυττάριας και κυτταροπλασματικής περιοχής. Η τελευταία αποτελείται από 18 τυροσίνες που είναι θέσεις δυνητικής φωσφορυλίωσης του υποδοχέα. Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση του ALK. Στο εξωκυττάριο τμήμα διακρίνεται η περιοχή ΜΑΜ και η περιοχή που είναι πλούσια σε γλυκίνες, ενώ ενδοκυτταρικά υπάρχει η περιοχή με δράση κινάση τυροσίνης. 13

Ο ALK ανιχνεύεται στο νευρικό και το πεπτικό σύστημα, έχει δε εντοπιστεί στον άνθρωπο, στη Drosophila και στον ποντικό. Το πρότυπο έκφρασής του είναι παρόμοιο με αυτό της HARP. Η σύνδεσή του με τη HARP είναι πολύ ειδική (Kd 32 ± 9 pm) και πραγματοποιείται στην εξωκυτταρική περιοχή, μέσω του καρβοξυτελικού άκρου του υποδοχέα, και συγκεκριμένα των αμινοξέων 111-136 (Bernard-Pierrot et al., 2002). Χαρακτηριστικό του γονιδίου του ALK είναι οι χρωμοσωματικές μετατοπίσεις, ενώ παρουσιάζει συχνά σύντηξη του κυτταροπλασματικού του τμήματος με άλλα μόρια, συνήθη φαινόμενα σε πολλές μορφές καρκίνου (αναπλαστικό μεγαλοκυτταρικό λέμφωμα, φλεγμονώδης μυοϊνοβλαστικλος καρκίνος, διάχυτο Β-μεγαλοκυτταρικό λέμφωμα, μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα). Ανιχνεύεται υπό συνεχή έκφραση ανεξάρτητα από την παρουσία προσδέτη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές γλοιβλαστώματος, καθώς επίσης και σε άλλες κυτταρικές σειρές όπως ινοβλάστες NIH-3T3 και τα επιθηλιακά κύτταρα SW-13 (Bowden et al., 2002), στις οποίες μάλιστα η δέσμευση της HARP από τον ALK φαίνεται να επάγει τόσο τον πολλαπλασιασμό, όσο και τη μετανάστευση. Αναφορικά με το σύμπλοκο HARP-ALK, αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η καταστολή του ALK μέσω ριβοζοενζύμων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και γλοιοβλαστώματος είχε ως επακόλουθο την αύξηση βιωσιμότητας των κυττάρων και τη μείωση των όγκων σε αθυμικά ποντίκια. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην καταστολή του αποπτωτικού μονοπατιού PI3K/Akt μέσω δέσμευσης της HARP στον ALK, φωσφορυλίωση της Akt και απενεργοποίησή της. ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ ΘΕΙΙΚΗΣ ΗΠΑΡΑΝΗΣ (HEPARAN SULFATE PROTEOGLYCANS, HSPGs) Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η HARP παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Έρευνες έχουν δείξει ότι εκτός από την ηπαρίνη, οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης παρουσιάζουν επίσης ισχυρή ικανότητα δέσμευσης της HARP. Συγκεκριμένα, η HARP συνδέεται με τις αλυσίδες θειικής ηπαράνης των πρωτεογλυκανών της κυτταρικής επιφάνειας και της εξωκυττάριας ύλης. Άλλες πρωτεογλυκάνες, όπως η θειική δερματάνη και η θειική χονδροϊτίνη, παρουσιάζουν μικρότερη συγγένεια με τη HARP ενώ, με τη θειική κερατάνη δεν έχει καθόλου συγγένεια. (Vacherot et al., 1999). Οι συνδεκάνες σχηματίζουν μια οικογένεια πρωτεογλυκανών θειικής ηπαράνης, που αποτελείται από τέσσερις πρωτεΐνες (συνδεκάνη-1, συνδεκάνη-2 ή fibroglycan, 14

συνδεκάνη-3 ή N-syndecan, συνδεκάνη-4 ή rydican/amphiglycan) στα θηλαστικά, οι οποίες εκφράζονται σχεδόν σε όλα τα είδη των κυττάρων. Επίσης το γονίδιο της συνδεκάνης συναντάται και στη D. melanogaster, καθώς και στον σκώληκα C. elegans (Rapraeger, 2001). Εικόνα 6. Δομή συνδεκανών των σπονδυλωτών. Φαίνεται ο πρωτεϊνικός κορμός πάνω στον οποίο προσδένονται οι αλυσίδες των γλυκασαμινογλυκανών (GAGs). (Eugene et al., 2005) Πολλές μελέτες έδειξαν ότι η HARP αλληλεπιδρά με τη συνδεκάνη-3 (SDC3 ή Ν-συνδεκάνη), υποδεικνύοντας ότι είναι ένας από τους υποδοχείς της. (Raulo et al., 1994). Ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα έκφρασης της συνδεκάνης-3 έχουν παρατηρηθεί στο νευρικό σύστημα και στα οστά. Το πρότυπο έκφρασης της συνδεκάνης-3 είναι ιστοειδικά και χρονοειδικά παρόμοιο με αυτό της HARP (Nolo et al., 1996). Η αλληλεπίδραση της HARP με τη συνδεκάνη-3 είναι σχετικά ισχυρή (σταθερά διάστασης Kd= 0.6 nm), εξαρτάται από τις αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών που φέρει η πρωτεΐνη και πραγματοποιείται μέσω των κεντρικών περιοχών της HARP που διαθέτουν ομολογία με τις επαναλαμβανόμενες περιοχές της θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (ΤSR 1) (Kinnunen et al.,1998). Η διαμεμβρανική και κυτταροπλασματική περιοχή της συνδεκάνης-3 παρουσιάζει υψηλή ομολογία με αυτές των άλλων μελών της οικογένειας και είναι υψηλά συντηρημένη μεταξύ διαφορετικών ειδών. 15

Εικόνα 7. Πρωτεϊνικό μέρος του μορίου της συνδεκάνης. Οι εξωκυττάριες δομές των τεσσάρων συνδεκανών των θηλαστικών περιέχουν πολλαπλές θέσεις δέσμευσης των αλυσίδων θειικής ηπαράνης. Κοντά στη διαμεμβρανική περιοχή βρίσκεται το σημείο πρωτεόλυσης του μορίου. (Multhaupt et al., 2009) Η συνδεκάνη-3 δομείται από 442 αμινοξέα (ποντικός) και είναι η μεγαλύτερη από τις συνδεκάνες των θηλαστικών. Η εξωκυττάρια πλευρά της που φέρει 200 αμινοξέα πλούσια σε σερίνη, θρεονίνη και προλίνη, φέρει 3-8 θέσεις πρόσδεσης (πλούσιες σε σερίνη και γλυκίνη) θειικής ηπαράνης οι οποίες αποτελούν και το 50% του μοριακού της βάρους. Οι αλυσίδες θειικής ηπαράνης, που είναι γραμμικά πολυμερή εναλασσόμενου υαλουρονικού οξέος, L-ιδουρονικού οξέος και μονάδων γλυκοσαμινών, ουσιαστικά προσδίδουν ειδικότητα στην πρόσδεση με μόριαπροσδέτες, όπως FGFs, HARP, πρωτεάσες και λιποπρωτεΐνες. Στο κατώτερο άκρο της εξωκυττάριας περιοχής, βρίσκεται μια περιοχή που μπορεί να πεφθεί από πρωτεάσες (shedding domain). Η διαμεμβρανική περιοχή περιέχει ένα μοτίβο αλανίνης-γλυκίνης που παίζει ρόλο στο διμερισμό της SDC3. Το κυτταροπλασματικό κομμάτι (28-34 αμινοξέα) αποτελείται από τρία τμήματα: C1 (Conserved part), V (Variable part) και C2 (C-terminal part). Η φωσφορυλίωση τυροσινών και σερινών καθενός από αυτά τα τμήματα ρυθμίζει με ειδικό τρόπο την αλληλεπίδραση μιας σειράς κυτταροπλασματικών μορίων τελεστών, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση. Πολλά από τα μόρια αυτά είναι πρωτεΐνες, οι οποίες αλληλεπιδρούν μέσω των PDZ περιοχών τους με τη C2 περιοχή της SDC3. Οι 16

μεταβλητές (V) περιοχές δεν επηρεάζουν τις δράσεις της πρωτεΐνης με κάποιο συγκεκριμένο τρόπο, εντούτοις φαίνεται να διαδραματίζουν κάποιο ρόλο στα μονοπάτια σηματοδότησης του μορίου κατά τη δημιουργία εστιών προσκόλλησης. Η συνδεκάνη-3 εμπλέκεται στην προέκταση των νευριτών που προκαλείται από τη HARP, αφού -εάν χρησιμοποιηθούν αντισώματα έναντι της Ν-συνδεκάνης ή πραγματοποιηθεί επώαση των νευρώνων με ηπαρινάση (Rauvala et al., 1994)- η δράση αυτή αναστέλλεται (Raulo et al., 1994). Μελέτες σε κύτταρα νευροβλαστώματος (Ν18) έδειξαν ότι η HARP δεσμεύεται στη συνδεκάνη-3 και επάγει την προέκταση των νευριτών μέσω του μονοπατιού της cortactin-src κινάσης (Kinnunen et al., 1998). Συγκεκριμένα, κατά την επέκταση νευρικών κυττάρων και νευραξόνων, η δέσμευση της HARP στη συνδεκάνη-3 προκαλεί την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, μέσω της οικογένειας των Src κινασών, της cortactin και της β-τουμπουλίνης. Εικόνα 8. Σχηματική αναπαράσταση των σηματοδοτικών μονοπατιών που προκύπτουν από την πρόσδεση της HARP στην Ν-συνδεκάνη (Mikelis et al., 2007). Αυτό συμβαίνει μετά την πρόσδεση της HARP στην SDC3, το διμερισμό της τελευταίας, τη δέσμευση της cortactin στο κυτταροπλασματικό τμήμα της SDC3, την trans-φωσφορυλίωση της κινάσης Src από την cortactin και την αλληλεπίδραση στη συνέχεια της Src με τη β-τουμπουλίνη με τελικό αποτέλεσμα την επέκταση των νευρικών κυττάρων. Η δράση της συνδεκάνης-3 ως μόριο κυτταρικής προσκόλλησης 17

ενισχύεται και από την αλληλεπίδρασή της με καντερίνες, αυξάνοντας την εστιακή προσκόλληση και τη μετανάστευση. Είναι επίσης γνωστό ότι στην εξωκυττάρια πλευρά του μορίου απαντάται μια περιοχή πρωτεόλυσης, της οποίας ρόλος είναι η επαγωγή του διμερισμού του μορίου κατά τη δέσμευση αυξητικών παραγόντων και τη μεταγωγή σήματος. Επίσης, πρωτεόλυση στο σημείο αυτό, οδηγεί σε αποκοπή από τις αλυσίδες θειικής ηπαράνης και αύξηση της μετανάστευσης (Kaksonen, 2002). Επιπλέον, η συνδεκάνη-3 έχει χαρακτηρισθεί ως συνυποδοχέας, μιά και έχει βρεθεί ότι ο FGF καθώς (και ο υποδοχέας του FGFR) συνδέονται με τις αλυσίδες θειικής ηπαράνης της συνδεκάνης-3 και έτσι ενεργοποιείται το σύμπλεγμα FGF- FGFR (Rapraeger, 2001, Kaksonen, 2002). Η HARP ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ Η HARP έχει βρεθεί να εμπλέκεται στον καρκίνο του προστάτη. Το mrna της HARP εντοπίζεται στα κύτταρα του ινομυώδους στρώματος τόσο σε φυσιολογικούς, όσο και υπερπλασμένους ή καρκινικούς ιστούς. Ενώ όμως η πρωτεΐνη δεν ανιχνεύεται στα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη υπό φυσιολογικές συνθήκες, η παρουσία της είναι έντονη στο επιθήλιο των καρκινικών ιστών, υποδηλώνοντας τον παρακρινή τρόπο δράση της. Ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί μετά τον καρκίνο του πνεύμονα, τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Επίσης είναι η πιο κοινή κακοήθεια στους άνδρες. Καθώς ο μέσος όρος ζωής αυξάνεται, αναμένεται ότι θα αυξηθούν επίσης τόσο η επίπτωση όσο και η θνησιμότητα από τον καρκίνο του προστάτη. Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι το 60-70% των ανδρών που φτάνουν στην ηλικία των 80 ετών παρουσιάζουν μικροσκοπικά στοιχεία καρκίνου του προστάτη. Επειδή τα συμπτώματα εμφανίζονται όταν πλέον ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί πέραν του προστάτη, είναι απαραίτητοι οι τακτικοί έλεγχοι. Ο προστάτης είναι ένα αδενομυώδες, εσωτερικό όργανο του άνδρα, ο οποίος μαζί με τους ουρηθρικούς και βολβοουρηθραίους αδένες αποτελεί τους κύριους αδένες του ουρογεννητικού ανθρώπινου συστήματος. Ο φυσιολογικός προστάτης έχει 18

σχήμα κάστανου και βάρος περίπου 20 gr. Ανατομικά, βρίσκεται πίσω από την ηβική σύμφυση, μπροστά από το ορθό, κάτω από την ουροδόχο κύστη και περιβάλλει την οπίσθια προστατική ουρήθρα, στην οποία εκβάλλουν οι εκσπερματικοί και οι προστατικοί πόροι. Η πιο ευρέως αποδεκτή άποψη για τη μορφολογία του προστάτη φαίνεται στην εικόνα 9. Έπειτα από λεπτομερή ανατομική και ιστολογική μελέτη του ενήλικου προστάτη διατυπώθηκε ένα τρισδιάστατο μοντέλο του ανθρώπινου προστάτη όπου διακρίνονται τρεις μορφολογικά διαφορετικές ζώνες: η περιφερική, η μεταβατική ζώνη και η κεντρική. Εικόνα 9. Σχηματική αναπαράσταση της τομής ανθρώπινου προστάτη. Διακρίνονται τρεις μορφολογικά διαφορετικές ζώνες: η περιφερική, η μεταβατική ζώνη και η κεντρική ζώνη. Σημείο αναφοράς στην ταξινόμηση καταλαμβάνει η ουρήθρα. Η περιφερική ζώνη καταλαμβάνει το 75% του προστατικού αδενώματος και αποτελεί το πιο κοινό σημείο εμφάνισης ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας και καρκίνου. Η κεντρική ζώνη καταλαμβάνει το 25% και η μεταβατική 5% του αδενώματος. Ο προστάτης περιβάλλεται από την κάψα, η οποία είναι πλούσια σε αιμοφόρα αγγεία. Εσωτερικά αυτής βρίσκονται ίνες από κολλαγόνο, καθώς και κυκλοτερείς λείες μυϊκές ίνες που περιβάλλουν την ουρήθρα, συνιστώντας τον ακούσιο σφικτήρα της. Βαθύτερα βρίσκεται το προστατικό στρώμα, στο οποίο είναι βυθισμένοι 30-50 σωληνοκυψελιδωτοί αδένες. Οι αδένες αυτοί εκβάλλουν στους μείζονες εκφορητικούς πόρους που με τη σειρά τους εκβάλλουν στην οπίσθια ουρήθρα. Στην 19

εικόνα 10 φαίνονται σε τομή ανθρώπινου προστάτη κάτω από φυσιολογικές συνθήκες οι αδένες μεταξύ των οποίων υπάρχει το στρώμα. Είναι εμφανείς οι αυλοί των αδένων οι οποίοι περιβάλλονται από τα επιθηλιακά κύτταρα. Σε κακοήθη υπερπλασία οι αυλοί των αδένων έχουν καλυφθεί από συσσωματώματα κυττάρων και διακρίνονται οι μη φυσιολογικοί αδένες. Τέλος σε καλοήθη υπερπλασία παρατηρείται η αύξηση σε μέγεθος των επιθηλιακών κυττάρων καθώς επίσης και ο πολλαπλασιασμός αυτών στον αυλό του κάθε αδένα. Εικόνα 10. Τομές από ανθρώπινο προστάτη, κακοήθη υπερπλασία του προστάτη. και καλοήθη Στον προστάτη διακρίνονται τρεις τύποι επιθηλιακών κυττάρων: Τα εκκριτικά, τα βασικά μη εκκριτικά και τα νευροενδοκρινή (Coffey, 1993). Στην εικόνα 10 φαίνεται η δομή του επιθηλίου του προστάτη καθώς επίσης και τα κύτταρα του στρώματος. 20

Εικόνα 11. Σχηματική αναπαράσταση της σύστασης του επιθηλίου του προστάτη. Τα εκκριτικά κύτταρα βρίσκονται στο εσωτερικό των κυψελίδων. Διαθέτουν την ικανότητα να εκκρίνουν διάφορα προϊόντα όπως το Ειδικό Προστατικό Αντιγόνο (PSA) και την Όξινη Προστατική Φωσφατάση (PAP). Ως πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα, παρουσιάζουν το μικρότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού. Τα βασικά κύτταρα βρίσκονται στην περιφέρεια των κυψελίδων, πάνω ακριβώς από τη βασική μεμβράνη. Διαθέτουν τον εντονότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού και θεωρούνται προγονικά των εκκριτικών επιθηλιακών κυττάρων (Bonkhoff et al., 1996). Επίσης, τα βασικά κύτταρα στερούνται υποδοχέων ανδρογόνων, καθώς και προϊόντων των εκκριτικών κυττάρων. Τα νευροενδοκρινή κύτταρα μπορούν να ελέγχουν την ανάπτυξη και τη λειτουργία των επιθηλιακών κυττάρων μέσω νευροπεπτιδίων που εκκρίνουν (Coffey, 1992). Στο στρώμα διακρίνονται τα λεία μυϊκά κύτταρα, ινοβλάστες καθώς επίσης και τριχοειδή αγγεία. Ο προστάτης είναι ένας εξωκρινής αδένας που εκκρίνει ένα λεπτόρρευστο, γαλακτόχρωμο, αλκαλικό υγρό που περιέχει κιτρικό οξύ, ασβέστιο και διάφορες άλλες ουσίες. Κατά την εκσπερμάτιση, η κάψα του προστάτη συσπάται ταυτόχρονα με το σπερματικό πόρο, με αποτέλεσμα στο σπέρμα να προστίθεται το υγρό του προστάτη. Η αλκαλική σύσταση του προστατικού υγρού έχει μεγάλη σημασία για την επιτυχή γονιμοποίηση του ωαρίου, επειδή το υγρό του σπερματικού πόρου είναι σχετικά όξινο, εξαιτίας της παρουσίας σε αυτό τελικών προϊόντων του μεταβολισμού των σπερματοζωαρίων, με αποτέλεσμα την αναστολή της κινητικότητας και της γονιμότητάς τους. Επίσης όξινα είναι και τα εκκρίματα του γυναικείου κόλπου (ph 21

3,5-4). Τα σπερματοζωάρια δεν αποκτούν άριστη κινητικότητα αν το ph του περιβάλλοντός τους δεν είναι περίπου 6-6,5. Για το λόγο αυτό, το σπερματικό υγρό εξουδετερώνει την οξύτητα των άλλων υγρών μετά την εκσπερμάτιση και αυξάνει πολύ την κινητικότητα και τη γονιμότητα των σπερματοζωαρίων (Guyton, 1984). Ο προστάτης εμφανίζεται κατά τον τρίτο μήνα της ενδομήτριας ζωής, παραμένει ατροφικός κατά τη παιδική ηλικία και αναπτύσσεται στην εφηβεία. Η ρύθμιση και η ομοιόσταση του προστάτη βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο ενδοκρινών ορμονών, όπως FSH, LH και τεστοστερόνης καθώς επίσης και κάτω από την παρακρινή και αυτοκρινή δράση αυξητικών παραγόντων, όπως φαίνεται στη εικόνα 12. Εικόνα12. Οι κυριότεροι αυξητικοί παράγοντες και οι αντίστοιχοι υποδοχείς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και στην ομοιόσταση του προστάτη. Ωστόσο, είναι πιθανόν με τη πάροδο της ηλικίας, να παρατηρηθεί αύξηση του όγκου του προστάτη, κατάσταση που ονομάζεται καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (Benign Prostate Hyperplasia, BPH). Η αύξηση αυτή προκαλείται τόσο από διαταραχή της αναλογίας κυττάρων επιθηλίου/στρώματος, λόγω της μειωμένης απόπτωσης στα κύτταρα του στρώματος (Claus et al., 1997), αλλά και λόγω αύξησης της αναλογίας οιστρογόνων/ανδρογόνων (Κrieg et al., 1995). Περαιτέρω διαταραχές των αναλογιών που προαναφέρθηκαν, με ταυτόχρονη συσσώρευση χρωμοσωματικών ανωμαλιών και πολλαπλών αλλαγών στο πρότυπο έκφρασης και δράσης διαφόρων 22

αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους, οδηγούν στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ Ο καρκίνος του προστάτη εμφανίζεται σπάνια σε άλλα ζώα εκτός από τον άνθρωπο και για το λόγο αυτό δεν υπάρχει κάποιο ιδανικό μοντέλο μελέτης. Ένα τέτοιο μοντέλο θα έπρεπε να έχει μικρή διάρκεια γενιάς, να επηρεάζεται από τη δράση ανδρογόνων, να παράγει PSA και να δίνει μεταστάσεις σε λεμφαδένες και οστά (Coffey et al., 1980). Υπάρχουν μοντέλα τρωκτικών των οποίων ο προστάτης είναι χωρισμένος σε λοβούς. Παρόλο που υπάρχουν ανατομικές διαφορές με τον προστάτη του ανθρώπου, τα τρωκτικά αποτελούν πολύτιμα μοντέλα μελέτης, εξαιτίας της ανδρογονοεξαρτώμενης πρόκλησης καρκίνου, αλλά και γιατί είναι σχετικά οικονομικά και εύκολα στη χρήση (Lucia et al., 1998). Τέτοια μοντέλα είναι το MPR που επιτρέπει τη μελέτη των παρακρινών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των κυττάρων και το Dunning R-3327. Τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί και η τεχνολογία των διαγονιδιακών ζώων, που παρέχουν τη δυνατότητα εισαγωγής ξένου γενετικού υλικού στο γονιδίωμα του πειραματόζωου. Στη συγκεκριμένη περίπτωση επιτρέπεται η παρατήρηση της αλληλεπίδρασης των γονιδιακών προϊόντων και των κυτταρικών αποκρίσεων, σε in vivo σύστημα μελέτης. Αναφορικά με τον προστάτη, το TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma Mouse Prostate) αποτελεί το μοντέλο μελέτης το οποίο αναπτύσσει και μεταστάσεις (Gingrich et al., 1996). Επίσης, χρησιμοποιούνται και ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, οι περισσότερες από τις οποίες έχουν απομονωθεί από μεταστάσεις, με εξαίρεση τη PC- 93 που προέρχεται από πρωτογενή όγκο (Claas et al., 1983). Οι κυτταρικές σειρές οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν στην εργασία αυτή είναι οι DU-145 και PC3. Η καρκινική κυτταρική σειρά DU-145 απομονώθηκε από καρκίνο του προστάτη, με μετάσταση στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Η αρχική διάγνωση ήταν ελαφρώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, ενώ η μετάσταση χαρακτηρίσθηκε ως μετρίως διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, με εστίες ελαφρώς διαφοροποιημένων κυττάρων. Τα κύτταρα εμφανίζεται να είναι ευαίσθητα ή και εξαρτημένα από ορμόνες. Τα DU-145 παράγουν EGF, TGF-α καθώς και τον υποδοχέα EGFR σε 23

υψηλές συγκεντρώσεις, επάγοντας αυτοκρινώς τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, διαθέτουν την ικανότητα παραγωγής bfgf, IGF-1 TGF-β, εκφράζουν τους αντίστοιχους υποδοχείς και διεγείρονται από εξωγενή bfgf, IGF-1 και TGF-β. Χαρακτηριστικό τους επίσης αποτελεί η έκφραση υποδοχέων τρανσφερρίνης η οποία, επάγει την ανάπτυξή τους και ενισχύει την ικανότητα μετάστασης (Webber et al., 1997). Η PC3 είναι μια καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου προστάτη με μετάσταση στην οσφυϊκή μοίρα της σπονδυλικής στήλης. Η διάγνωση για τον ασθενή από τον οποίο προήλθε η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, ήταν τόσο αρχικά, όσο και στη μετάσταση, ελαφρώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα. Τα κύτταρα χαρακτηρίζονται από απουσία του Υ χρωμοσώματος, αναπτύσσονται εξίσου καλά σε καλλιέργειες δύο ή τριών διαστάσεων (άγαρ) και έχουν την ικανότητα ογκογένεσης σε αθυμικά ποντίκια. Δεν εκφράζουν PSA και είναι ορμονο-ανεξάρτητα. Ωστόσο, υπάρχουν και μελέτες που έδειξαν ότι πιθανώς να εκφράζονται πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις PSA και υποδοχείς ανδρογόνων. Τα κύτταρα PC3 εκφράζουν έντονα TGF-α, bfgf και τους υποδοχείς EGFR και FGFR, επάγοντας αυτοκρινώς την ανάπτυξή τους. Αξιοσημείωτο είναι το ότι μετά από επίδραση με εξωγενή bfgf δεν παρατηρείται καμιά απόκριση, αλλά μετά από επίδραση με εξωγενή TGF-β, παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξης, η οποία όμως επανέρχεται στα φυσιολογικά μετά από διαρκή επίδραση 6 ημερών. Επιπλέον, το μόριο κυτταρικής προσκόλλησης των επιθηλιακών κυττάρων C-CAM ρυθμίζεται από τα ανδρογόνα και παρατηρείται μείωση της αύξησης και της ογκογένεσης που τα PC3 προκαλούν, όταν μετασχηματιστούν με το γονίδιο της C-CAM. Τέλος, παρόμοια με τα DU-145, έχουν την ικανότητα έκφρασης του υποδοχέα της τρανσφερίνης (Webber et al., 1997). ΜΟΡΙΑ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ Μελέτες έχουν δείξει ότι η HARP όταν προσδεθεί στη SDC3 έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση μορίων μεταγωγής σήματος τα οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούν άλλα μόρια με τελικό αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, διαδικασία που οδηγεί σε διεργασίες όπως η κυτταρική προσκόλληση και η κυτταρική μετανάστευση. Έχει βρεθεί ότι ένα από τα μόρια που 24

εμπλέκονται στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος της συνδεκάνης 3 είναι η SRC. Βέβαια, η ενεργοποίηση της SRC έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση και άλλων σηματοδοτικών μορίων όπως της FAK, PTEN και AKT. Src Είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών με ενεργότητα κινάση τυροσίνης που αποτελείται από εννέα μέλη. Η Src, η Fyn και η Yes έχουν μεγάλο εύρος έκφρασης, ενώ η Lck, η Hck, η Fgr, η Lyn, η Ykr και η Blk παρουσιάζουν ιστοειδική έκφραση. Στα θηλαστικά, οι πρωτεΐνες της Src έχουν παρόμοια δομή, με μοριακό βάρος που κυμαίνεται από 52-62 kda. Κάθε μέλος αποτελείται από μια αμινοτελική περιοχή (αμινοξέα 1-17) που είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση της Src στην πλασματική μεμβράνη. Ακολουθείται από μια μη συντηρημένη, μοναδική περιοχή (αμινοξέα 18-84), η οποία θεωρείται υπεύθυνη για την ειδική πρόσδεση σε συγκεκριμένους υποδοχείς και πρωτεΐνες-στόχους. Τα αμινοξέα 85-140 αντιστοιχούν στην SH 3 περιοχή που αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες πλούσιες σε προλίνη, ρυθμίζοντας την καταλυτική δράση, τη θέση της πρωτεΐνης στο κύτταρο και την αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες-στόχους (Pawson, 1995). Ωστόσο, η Src διαθέτει και δεύτερη ρυθμιστική περιοχή, την SH 2, (αμινοξέα 141-260), που αλληλεπιδρά με φωσφορυλιωμένες τυροσίνες και που καθορίζει το εύρος των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με αυτήν. Η περιοχή που αποτελείται από τα αμινοξέα 261-516 είναι η καταλυτική περιοχή με δράση κινάσης τυροσίνης, ενώ η καρβοξυτελική περιοχή (αμινοξέα 517-536) έχει ρυθμιστικό ρόλο στη δράση της κινάσης (Abram and Courtneidge, 2000). Εικόνα 13. Απεικόνιση των περιοχών του μορίου της κινάσης Src (Cole et al., 2003). Μελέτες έδειξαν ότι τόσο η φωσφορυλίωση, όσο και οι διαμεμβρανικές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών μέσω SH 2 και SH 3 περιοχών ρυθμίζουν την ενεργότητα της Src. Συγκεκριμένα, η φωσφορυλίωση στην Tyr-527 του καρβοξυτελικού άκρου από την Csk οδηγεί στην αλληλεπίδραση αυτής της περιοχής με την SH 2 περιοχή, με αποτέλεσμα την αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της και την δημιουργία της «κλειστής» ανενεργούς μορφής. Το ίδιο αποτέλεσμα έχει και η αλληλεπίδραση της SH 3 περιοχής με την καταλυτική περιοχή ή τον συνδέτη μεταξύ της SH 2 και της 25

καταλυτικής περιοχής. Ωστόσο, η φωσφορυλίωση της Tyr-416 και η αποφωσφορυλίωση της Tyr-527 οδηγεί στην ενεργοποίηση της Src, που επιτρέπει στις SH 2 και SH 3 περιοχές να αλληλεπιδράσουν με άλλα μόρια, επηρεάζοντας τη μεταγωγή σήματος. Αρκετές φωσφατάσες -όπως η PTP-α, η PTP1 και η SHP-1- έχουν την ικανότητα ρύθμισης της Src. Πράγματι, τόσο η PTP-α, όσο και η PTP1B μπορούν να αποφωσφορυλιώσουν την Tyr-527, όπως πιστοποιήθηκε με in vivo και in vitro πειράματα. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση της SH 3 περιοχής με τη FAK οδηγεί σε ενεργοποίηση της Src (Cole et al., 2003). Εικόνα 14. Αναπαράσταση του μηχανισμού ρύθμισης της ενεργότητας της κινάσης Src. Όταν η τυροσίνη στη θέση 527 είναι φωσφορυλιωμένη, αλληλεπιδρά με την SH2 περιοχή του μορίου της και αποκτά την «κλειστή» ανενεργή μορφή. Όταν η τυροσίνη στη θέση 527 δεν είναι φωσφορυλιωμένη, αποκτά την «ανοιχτή» μορφή και επιτρέπει στην τυροσίνη στη θέση 416 να φωσφορυλιωθεί και να ενεργοποιηθεί το μόριο (Cole et al., 2003). Η Src συμμετέχει στην προσκόλληση των κυττάρων και στην αναδιοργάνωση των εστιών προσκόλλησης, αλληλεπιδρώντας με τη FAK. Έχει βρεθεί ότι η Src δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει τη FAK, συμμετέχοντας στους μηχανισμούς της κυτταρικής μετανάστευσης. Η κυτταρική μετανάστευση επάγεται και από τη μεταγωγή σήματος από το μονοπάτι των MAP κινασών, το οποίο μπορεί να ενεργοποιήσει η Src (Abram and Courtneidge, 2000). Είναι γνωστό όμως το ότι η Src συμμετέχει και στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Η Src ήταν το πρώτο ογκογονίδιο που ανακαλύφθηκε, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο κατά τη μετάσταση. (Mon et al., 2006). 26

FAK Η FAK ανιχνεύτηκε το 1992 ως μια πρωτεΐνη με υψηλά επίπεδα φωσφωρυλιωμένης τυροσίνης, που εντοπίζεται σε σημεία εστιακής προσκόλλησης των κυττάρων. Η FAK αποτελείται από μια κεντρική καταλυτική περιοχή, υψηλά συντηρημένη μεταξύ των ειδών. Στο μόριο υπάρχει και μια μεγάλη αμινοτελική περιοχή, η οποία είναι υπεύθυνη για τη μεταγωγή σήματος από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων όπως ο PDGF και ο EGF (περιοχή FERM). Η καρβοξυτελική περιοχή, μέσω αλληλεπίδρασης με την ταλίνη και την παξιλίνη, αποτελεί θέση δέσμευσης για τη β υπομονάδα των ιντεγκρινών και επάγει τον εντοπισμό της FAK σε σημεία εστιακής προσκόλλησης (περιοχή FAT). Η καρβοξυτελική περιοχή επίσης περιέχει δύο περιοχές πλούσιες σε προλίνη, οι οποίες λειτουργούν ως θέση δέσμευσης για πρωτεΐνες που περιέχουν SH 3 περιοχές όπως η p130cas ή η GRAF(Schlaepfer and Mitra, 2004). Η FAK μπορεί να φωσφορυλιωθεί στην Tyr-397, στην Tyr-576, στην Tyr-577, στην Tyr-861 και στην Tyr-925. Ειδικά η Tyr-397, μπορεί να φωσφορυλιωθεί από την ίδια τη FAK. Η περίπτωση αυτή της αυτοφωσφορυλίωσης δημιουργεί θέσεις πρόσδεσης για τις κινάσες της οικογένειας της Src μέσω των SH 2 περιοχών τους. Η πρόσδεση αυτή επάγει τη δημιουργία της «ανοιχτής», ενεργούς μορφής της Src η οποία μπορεί να φωσφορυλιώσει τη FAK στην καρβοξυτελική της περιοχή, δημιουργώντας επιπρόσθετες περιοχές φωσφορυλιωμένων τυροσινών που μπορούν να αλληλεπιδράσουν με πρωτεΐνες που περιέχουν SH 2 περιοχές. Το σύμπλοκο που δημιουργείται, οδηγεί στην ενεργοποίηση των οδών των MAPK και της PI3K (Mon et al., 2006). Εικόνα 15. Απεικόνιση των περιοχών του μορίου της Fak (Mon et al., 2006). 27