Πληροφορίες Παραγγελίας AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: Specimen Preparation Kit ART: US: 83267

COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test MTB ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. Πληροφορίες Παραγγελίας AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: 20756903 122 Specimen Preparation Kit ART: 07 5690 3 US: 83267 AMPLICOR M. tuberculosis MTB CTL 10 Sets P/N: 20756954 122 Positive Control Kit ART: 07 5695 4 US: 83263 AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 Tests P/N: 20756784 122 Amplification Kit ART: 07 5678 4 US: 83258 COBAS AMPLICOR MTB DK 100 Tests P/N: 20757551 122 M. tuberculosis Detection Kit ART: 07 5755 1 US: 83279 COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Το κιτ που ακολουθεί μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του Mycobacterium Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου που έχει ενισχυθεί με τη χρήση του Mycobacterium AMPLICOR Κιτ Ενίσχυσης. Η ανίχνευση του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου είναι επιλογή του χρήστη. COBAS AMPLICOR IC DK 100 Tests P/N: 20757608 122 Internal Control Detection Kit ART: 07 5760 8 US: 83281 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 1/30 P/N: 03788938 190

Προβλεπόμενη Χρήση To AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB) Test είναι μια ποιοτική in vitro εξέταση για την ανίχνευση οργανισμών του συμπλόκου M. tuberculosis σε κλινικά δείγματα με τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. Η εξέταση χρησιμοποιεί την τεχνική ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και τον υβριδισμό νουκλεϊκού οξέος για την ανίχνευση οργανισμών του συμπλόκου M. tuberculosis σε υγροποιημένα, απολυμασμένα και συμπυκνωμένα ανθρώπινα αναπνευστικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένων πτυέλων απόχρεμψης και προκλη-τών πτυέλων, βρογχικών εκκρίσεων και βρογχιοκυψελιδικών εκπλύσεων (BAL). Σύνοψη και Επεξήγηση της Εξέτασης Τα μυκοβακτήρια είναι οξεοάντοχα, μη κινητικά, ραβδόμορφα, αερόβια βακτήρια που δεν σχηματίζουν σπόρια. Περιλαμβάνουν αρκετά παθογόνα είδη για τον άνθρωπο. Πολλά είδη μυκοβακτηρίων είναι σαπρόφυτα χώματος και νερού. Τα κύρια παθογόνα για τον άνθρωπο είναι τα είδη του συμπλόκου M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum και M. microti), και M. leprae. Το M. tuberculosis είναι το πιο σημαντικό μυκοβακτηριακό παθογόνο. Το M. tuberculosis εντοπί-ζεται μόνο σε ανθρώπους, που αποτελούν τους ξενιστές του και μεταδίδουν το βάκι-λο της φυματίωσης από άτομο σε άτομο μέσω σταγονιδίων. Το ένα τρίτο περίπου του παγκόσμιου πληθυσμού φέρει το M. tuberculosis και κινδυνεύει να αναπτύξει την ασθένεια. Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, εκτιμάται ότι 15 εκατομμύρια άνθρωποι έχουν ήδη μολυνθεί με το φυμάτιο και ετησίως καταγράφονται περισσότερες από 18.000 περιπτώσεις ενεργούς φυματίωσης 1. Το M. tuberculosis μπορεί να προκαλέσει χρόνια πνευμονοπάθεια αλλά μπορεί επίσης να επηρεάσει οποιοδήποτε όργανο του σώματος. Εξαιτίας του κινδύνου εξάπλωσης της ασθένειας, της πιθανότητας ανάπτυξης στελεχών ανθεκτικών στα φάρμακα και της σοβαρότητας της ασθένειας σε ασθενείς μολυσμένους με τον HIV-1, είναι ιδιαίτερα σημαντική η ταχεία διάγνωση του συμπλόκου M. tuberculosis. Παγκοσμίως, η φυματίωση ευθύνεται για 3 εκατομμύρια θανάτους ετησίως και 26% θανάτων ενηλίκων στον αναπτυσσόμενο κόσμο που θα μπορούσαν να αποφευχθούν 1-5. Για την οριστική διάγνωση της φυματίωσης απαιτείται η απομόνωση ενός οργανισμού από το σύμπλοκο M. tuberculosis. Οι συνηθισμένες καλλιέργειες είναι χρονοβόρες και μπορεί να διαρκέσουν έως και οχτώ εβδομάδες για την οριστική διάγνωση. Η εξέταση με μικροσκόπιο οξεοαντόχων επιχρισμάτων αποτελεί την ταχύτερη μέθοδο ανίχνευσης μυκοβακτηρίων, δεν πρόκειται όμως για μια ευαίσθητη ή ειδική μέθοδο. Οι ανοσολογικές και ορολογικές τεχνικές παρουσιάζουν γενικά περιορισμούς λόγω μικρής ευαισθησίας και/ή ειδικότητας 6,7. Η ανάλυση μυκολικών οξέων μυκοβακτηριδίων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αποτελεί χρήσιμο βοήθημα για την καλλιέργεια και τις βιοχημικές εξετάσεις 8. Οι ειδικοί κατά είδος ανιχνευτές νουκλεϊκού οξέος έχουν βελτιώσει σημαντικά τη δυνατότητα ταχείας επαλήθευσης αποτελεσμάτων καλλιέργειας για διάφορα είδη μυκοβακτηρίων 9. Η ανάπτυξη ειδικών για μυκοβακτήρια εξετάσεων βασισμένων σε PCR έχει αποδειχτεί ότι βελτιώνει περαιτέρω την ταχεία διάγνωση της φυματίωσης επιτρέποντας την άμεση ανίχνευση μυκοβακτηρίων σε κλινικά δείγματα 10-22. Βασικές αρχές της Διαδικασίας To COBAS AMPLICOR MTB Test βασίζεται σε τέσσερις κύριες διαδικασίες: προετοιμασία δείγματος, ενίσχυση με PCR 23,24 του DNA-στόχου με τη χρήση βιοτινιλυόμενων εκκινητών, υβριδισμό των ενισχυμένων προϊόντων σε ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή ειδικό για το στόχο και ανίχνευση των δεσμευμένων στον ανιχνευτή ενισχυμένων προϊόντων με χρωματομετρικό προσδιορισμό. 2/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test Προετοιμασία Δείγματος Ενίσχυση PCR To COBAS AMPLICOR MTB Test επιτρέπει την ταυτόχρονη ενίσχυση του DNA-στόχου του συμπλόκου M. tuberculosis και του DNA του Mycobacterium AMPLICOR Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου. Το αντιδραστήριο Master Mix (κυρίου μίγματος) περιέχει ένα ζεύγος βιοτινιλυωμένων εκκινητών ειδικών για MTB και Mycobacterium Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNA Mycobacterium Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου πραγματοποιείται με επιλογή από τον χρήστη. Τα NALC/NaOH 25, NaOH 25 ή SDS-NaOH 26,27 υγροποιημένα, απολυμασμένα και συμπυκνωμένα ανθρώπινα αναπνευστικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένων πτυέλων απόχρεμψης και προκλητών πτυέλων, βρογχικών εκκρίσεων και BAL (βρογχιοκυψελιδικών εκπλύσεων), πλένονται με Διάλυμα Πλύσης Αναπνευστικού Δείγματος. Πραγματοποιείται λύση των οργανισμών μέσω επώασης στο Αντιδραστήριο Λύσης Αναπνευστικού Δείγματος και το δείγμα προετοιμάζεται για ενίσχυση με την προσθήκη Αντιδραστηρίου Εξουδετέρωσης Αναπνευστικού Δείγματος. Επιλογή Στόχου Η επιλογή μιας αλληλουχίας DNA-στόχου εξαρτάται από την ταυτοποίηση περιοχών εντός του μυκοβακτηριακού γονιδιώματος που επιδεικνύουν μέγιστο βαθμό διατήρησης αλληλουχίας μεταξύ των ειδών του συμπλόκου M. tuberculosis. Αντίστοιχα, η ορθή επιλογή εκκινητών και ανιχνευτή έχει αποφασιστική σημασία για τη δυνατότητα της εξέτασης να ανιχνεύσει όλους του οργανισμούς του συμπλόκου M. tuberculosis. Το Mycobacterium γονιδίωμα περιλαμβάνει μια περιοχή περίπου 1500 νουκλεοτιδίων που κωδικοποιεί το γονίδιο για16s rrna. To COBAS AMPLICOR MTB Test χρησιμοποιεί τους ειδικούς για το γένος Mycobacterium βιοτινιλυώμενους εκκινητές KY18 και KY75 για τον προσδιορισμό μιας αλληλουχίας 584 νουκλεοτιδίων περίπου εντός της συγκεκριμένης περιοχής. 28, 29,30 Ενίσχυση Στόχου Τα επεξεργασμένα δείγματα προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (σωληνάρια Α) στα οποία πραγματοποιείται η PCR Το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται και πάλι για την αποδιάταξη του έλικα δίκλωνου DNA και την έκθεση των αλληλουχιών-στόχου του εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι βιοτινιλυώμενοι εκκινητές KY18 και KY75 υβριδίζονται στο DNA-στόχο. Η θερμοσταθερή πολυμεράση DNA, πολυμεράση Thermus aquaticus (Taq pol), με την παρουσία Mg 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), στους οποίους περιλαμβάνονται η τριφωσφορική δεοξυαδενοσίνη, η δεοξυγουανοσίνη, η δεοξυκυτιδίνη και η δεοξυουριδίνη (αντί της δεοξυθυμιδίνης), επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος των προτύπων-στόχων για τη δημιουργία μιας αλληλουχίας DNA, που ονομάζεται κλώνος (amplicon). Ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα το διπλασιασμό των DNA κλώνων (amplicon). Ενίσχυση Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Στις διαδικασίες ενίσχυσης βάσει ενζύμων, όπως στην PCR, η αποτελεσματικότητα μπορεί να μειωθεί από αναστολείς που ενδέχεται να είναι παρόντες στο κλινικό δείγμα. Το Mycobacterium Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου προστέθηκε στo COBAS AMPLICOR MTB Test για την ταυτοποίηση επεξεργασμένων δειγμάτων τα οποία περιέχουν ουσίες που ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν με την ενίσχυση με PCR. Το Mycobacterium Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου είναι ένα DNA πλασμίδιο με εκκινητή που δεσμεύει περιοχές πανομοιότυπες με αυτές της αλληλουχίας MTB του DNA-στόχου, μια τυχαία εσωτερική αλληλουχία παρόμοιου μεγέθους και σύνθεσης βάσης με την αλληλουχία-στόχο MTB και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης εκκινητή που διαφοροποιεί o κλώνος (amplicon) Mycobacterium Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου από τον κλώνο (amplicon)-στόχο. Τα χαρακτηριστικά αυτά επιλέχθηκαν για να διασφαλίζουν ισοδύναμη ενίσχυση του Mycobacterium Εσωτερικού 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 3/30

Αντίδραση Υβριδισμού Προτύπου Ελέγχου και του DNA-στόχου του MTB. Το Mycobacterium Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου εισάγεται σε κάθε αντίδραση ενίσχυσης και συνενισχύεται με DNA-στόχο από το κλινικό δείγμα. Η ανίχνευση του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου MTB πραγματοποιείται με επιλογή από τον χρήστη. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του DNA - στόχου από το κλινικό δείγμα επιτυγχάνεται στo COBAS AMPLICOR MTB Test με τη χρήση του ενζύμου AmpErase LD (ουρακίλη-ν-γλυκοζυλάση) 31. Το ένζυμο AmpErase LD έχει καθαριστεί ώστε να απομακρυνθούν ενδεχόμενα βακτήρια που επιμολύνουν το DNA. Το ένζυμο AmpErase LD αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης, αντί της τριφωσφορικής δεοξυθυμιδίνης, ως ενός από τα dntps του αντιδραστηρίου κυρίου μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο σε διάσπαση από το ένζυμο AmpErase LD πριν από την ενίσχυση του DNA-στόχου. To ένζυμο AmpErase LD καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήματα της δεοξυουριδίνης ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμανθεί στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης στο αλκαλικό ph του κύριου μίγματος (Master Mix), η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase LD είναι αδρανές σε θερμοκρασίες πάνω από τους 55 C, δηλαδή, σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης, και για το λόγο αυτό δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon)- στόχο. Μετά την ενίσχυση, όλα τα υπολειμματικά ένζυμα αποδιατάσσονται με την προσθήκη του Διαλύματος Αποδιάταξης, προλαμβάνοντας έτσι την αποδόμηση οποιουδήποτε κλώνου (amplicon)-στόχου. Το ένζυμο AmpErase LD στo COBAS AMPLICOR MTB Test έχει αποδειχτεί ότι αδρανοποιεί τουλάχιστον 10 3 αντίγραφα κλώνου (amplicon) MTB που περιέχει δεοξυουριδίνη σε κάθε PCR. Μετά την ενίσχυση με PCR, ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής προσθέτει αυτόματα Διάλυμα Αποδιάταξης στα σωληνάρια Α για την χημική αποδιάταξη του κλώνου (amplicon) MTB και του κλώνου (amplicon) Mycobacterium Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου σχηματίζοντας μονοκλωνικό DNA. Τα κλάσματα του αποδιαταγμένου κλώνου (amplicon) μεταφέρονται στη συνέχεια σε σωληνάρια ανίχνευσης (D-cups). Ένα εναιώρημα μαγνητικών σωματιδίων ανίχνευσης με επίστρωση ενός ολιγονουκλεοτιδικού ανιχνευτή ειδικού για το σύμπλοκο M. tuberculosis (KY172T3) ή για το Mycobacterium Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου (SK535) προστίθεται στα μεμονωμένα D-cup. Το επισημασμένο με βιοτίνη MTB και ο κλώνος (amplicon) Mycobacterium Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου υβριδίζονται στους ολιγονουκλεοτιδικούς ειδικούς για το στόχο ανιχνευτές που είναι δεσμευμένοι στα μαγνητικά σωματίδια. Αυτός ο υβριδισμός του κλώνου (amplicon) στον ειδικό για το στόχο ανιχνευτή αυξάνει τη συνολική ειδικότητα της εξέτασης. Αντίδραση Ανίχνευσης Μετά την αντίδραση υβριδισμού, ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής πραγματοποιεί πλύση των μαγνητικών σωματιδίων στα D-cup για να απομακρυνθούν μη δεσμευμένα υλικά και στη συνέχεια προσθέτει συζεύκτη αβιδίνης-υπεροξειδάσης ραφανίδας. Ο συζεύκτης αβιδίνης-υπεροξειδάσης ραφανίδας δεσμεύεται στον επισημασμένο με βιοτίνη κλώνο (amplicon) που υβριδίζεται στους ειδικούς για το στόχο ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές που είναι δεσμευμένοι στα μαγνητικά σωματίδια. Ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής απομακρύνει το μη δεσμευμένο συζεύκτη πραγματοποιώντας πλύση των μαγνητικών σωματιδίων και στη συνέχεια σε κάθε D-cup προσθέτει διάλυμα υποστρώματος που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και 3,3',5,5'- τετραμεθυλοβενζιδίνη (TMB). Με την παρουσία του υπεροξειδίου του υδρογόνου, η δεσμευμένη υπεροξειδάση ραφανίδας καταλύει την οξείδωση της TMB για το σχηματισμό ενός έγχρωμου συμπλόκου, η απορρόφηση του οποίου μετράται σε μήκος κύματος των 660 nm από τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. 4/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test Αντιδραστήρια AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Εξετ. P/N: 20756903 122 Specimen Preparation Kit ART: 07 5690 3 AMPLICOR Κιτ Προετοιμασίας US: 83267 Αναπνευστικών Δειγμάτων RW (Διάλυμα Πλύσης Αναπνευστικού Δείγματος) Ρυθμιστικό Διάλυμα tris-hci < 1% Σταθεροποιητής Διαλύματος EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου RL (Αντιδραστήριο Λύσης Αναπνευστικού Δείγματος) 0,2% Υδροξείδιο του νατρίου < 1% Σταθεροποιητής Διαλύματος EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου RN (Αντιδραστήριο Εξουδετέρωσης Αναπνευστικού Δείγματος) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hcl Χλωριούχο μαγνήσιο 0,05% Αζίδιο του νατρίου 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml AMPLICOR M. tuberculosis MTB CTL 10 Σετ P/N: 20756954 122 Positive Control Kit ART: 07 5695 4 AMPLICOR M. tuberculosis US: 83263 Κιτ Θετικού Ορού Ελέγχου MTB (+) C 10 x 0,75 ml [M. tuberculosis (+) Ορός Ελέγχου] Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,001% Μη μολυσματικό DNA πλασμίδιο (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχίες M. tuberculosis < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 Εξετ. P/N: 20756784 122 Amplification Kit ART: 07 5678 4 AMPLICOR Mycobacterium US: 83258 Κιτ Ενίσχυσης MYCO MMX 3 x 1,7 ml (Master Mycobacterium) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci Γλυκερόλη < 0,01% AmpliTaq (Taq Πολυμεράση DNA, μικροβιακό) < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% Βιοτινιλυώμενοι εκκινητές KY18 και KY75 0,05% Αζίδιο του νατρίου 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 5/30

Ένζυμο AmpErase LD 3 x 0,1 ml (Χαμηλή συγκέντρωση Ουρακίλης-Ν-Γλυκοσυλάσης του DNA) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,01% Ουρακίλη Ν-Γλυκοσυλάση (μικροβιακό) EDTA Διθειεθρυτόλη Γλυκερόλη < 1% Σταθεροποιητής Διαλύματος Xλωριούχο νάτριο 0,05% Αζίδιο του νατρίου MYCO IC 3 x 0,1 ml (Mycobacterium Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,001% Μη μολυσματικό DNA πλασμίδιο (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχίες δέσμευσης Mycobacterium πανομοιότυπες με αυτές του DNA-στόχου του MTB και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης εκκινητή. < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA Χρωστική ύλη αμαράνθης 0,05% Αζίδιο του νατρίου MYCO ( ) C [Mycobacterium ( ) Ορός Ελέγχου] Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου 1 x 0,75 ml COBAS AMPLICOR MTB DK 100 Εξετ. P/N: 20757551 122 M. tuberculosis Detection Kit ART: 07 5755 1 COBAS AMPLICOR M. tuberculosis US: 83279 Κιτ Ανίχνευσης MT PS1 1 x 100 Εξετάσεις (Εναιώρημα Ανιχνευτή MTB 1) Ρυθμιστικό διάλυμα MES < 0,3% Εναιώρημα Dynabeads (παραμαγνητικά σωματίδια) επικαλυμμένο με ολιγονουκλεοτιδικό ιχνηθέτη δέσμευσης ειδικό για MTB (KY172T3) 0,09% Aζίδιο του νατρίου MT4 (Εναιώρημα Ιχνηθέτη MTB 2) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίοιυ 29,9% Θειοκυανικό νάτριο Χλωριούχο νάτριο < 0,2% Σταθεροποιητής διαλύματος + Xn 29,9% (w/w) Θειοκυανικό νάτριο 1 x 100 Εξετάσεις Επιβλαβές 6/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test COBAS AMPLICOR DK 100 Εξετ. P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR US: 83276 Κιτ Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης DN4 (Διάλυμα Αποδιάταξης) 1,6% υδροξείδιο του νατρίου EDTA Μπλε θυμόλης + Xi 1,6% (w/w) Υδροξείδιο του νατρίου 1 x 100 Εξετάσεις Ερεθιστικό CN4 1 x 100 Εξετάσεις (Συζεύκτης Αβιδίνης-Υπεροξειδάσης Ραφανίδας) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,001% Συζεύκτης αβιδίνης-υπεροξειδάσης ραφανίδας Λευκωματίνη βόειου ορού (θηλαστικού) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Φαινόλη 1% Συντηρητικό ProClin 150 SB3 (Υπόστρωμα A) Διάλυμα κιτρικού άλατος 0,01% Υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,1% Συντηρητικό ProClin 150 SB (Υπόστρωμα B) 0,1% 3,3',5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνη (TMB) 40% Διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) 5 x 75 Εξετάσεις 5 x 5 ml T 40% (w/w) Διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) Τοξικό R: 61-20/21-36 Μπορεί να βλάψει το έµβρυο κατά τη διάρκεια της κύησης. Επιβλαβές όταν εισπνέεται και σε επαφή µε το δέρµα. Ερεθίζει τα µάτια. S: 53-45 Αποφεύγετε την έκθεση - εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. Σε περίπτωση ατυχήµατος ή αν αισθανθείτε αδιαθεσία ζητήστε αµέσως ιατρική συµβουλή (δείξτε την ετικέτα αν είναι δυνατό). 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 7/30

COBAS AMPLICOR CN4 200 Εξετ. P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR US: 83305 Αντιδραστήριο Ανίχνευσης Συζεύκτη CN4 2 x 100 Εξετάσεις (Συζεύκτης αβιδίνης -υπεροξειδάσης Ραφανίδας) Ρυθμιστικό διάλυμα tris HCI < 0,001% Συζεύκτης αβιδίνης-υπεροξειδάσης ραφανίδας Λευκωματίνη βόειου ορού (θηλαστικού) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Φαινόλη 1% Συντηρητικό ProClin 150 COBAS AMPLICOR WB 500 Εξετ. P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR US: 83314 Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης WB (10Χ Πυκνό Διάλυμα Πλύσης) < 2% Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα < 9% Χλωριούχο νάτριο EDTA < 2% Καθαριστικό 0,5% Συντηρητικό ProClin 300 Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις 2 x 250 Εξετάσεις Για in vitro διαγνωστική χρήση. Η εξέταση αυτή προορίζεται αποκλειστικά για χρήση με υγροποιημένα, απολυμασμένα και συμπυκνωμένα ανθρώπινα αναπνευστικά δείγματα, που περιλαμβάνουν πτύελα απόχρεμψης και προκλητά πτύελα, βρογχικές εκκρίσεις και BAL που έχουν υγροποιηθεί, απολυμανθεί και συμπυκνωθεί με χρήση μεθόδων NALC-NaOH 25, NaOH 25 ή SDS-NaOH 26,27. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια μιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια όταν αφαιρείτε τα κλάσματα από τις φιάλες αντιδραστηρίων. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών και ακροφυσίων πιπετών μιας χρήσης. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων και των απορριμμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. Μη χρησιμοποιείτε ένα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης του. Διατίθενται Δελτία δεδομένων ασφάλειας υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. Η ροή των εργασιών στο εργαστήριο πρέπει να εκτελείται σε μονόδρομη κατεύθυνση, ξεκινώντας από την περιοχή επεξεργασίας πριν από την ενίσχυση και προχωρώντας προς την περιοχή επεξεργασίας μετά την ενίσχυση (ενίσχυση/ανίχνευση). Οι ενέργειες πριν από την ενίσχυση πρέπει να ξεκινούν με την προετοιμασία του 8/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test αντιδραστηρίου και να συνεχίζονται με την προετοιμασία του δείγματος. Τα υλικά και ο εξοπλισμός πρέπει να προορίζονται αποκλειστικά για κάθε ενέργεια που προηγείται της ενίσχυσης και όχι για άλλες ενέργειες, ούτε να μεταφέρονται μεταξύ των περιοχών. Πρέπει να φοράτε γάντια σε κάθε περιοχή και να τα αλλάζετε πριν από την έξοδό σας από τη συγκεκριμένη περιοχή. Ο εξοπλισμός και τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία του αντιδραστηρίου δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για ενέργειες προετοιμασίας δειγμάτων ή για το χειρισμό με πιπέτα ή την επεξεργασία ενισχυμένου DNA ή άλλων πηγών DNA-στόχου. Τα υλικά και ο εξοπλισμός που χρησιμοποιούνται μετά την ενίσχυση πρέπει να παραμένουν πάντοτε στον ειδικό χώρο που προορίζεται για την επεξεργασία μετά την ενίσχυση. Τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 32 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 33. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με ένα κατάλληλο διάλυμα απολύμανσης. Τα RW, RL, RN, MYCO MMX, ένζυμο AmpErase LD, MYCO IC, MTB (+) C, MYCO ( ) C και MT PS1 περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Όταν απορρίπτετε διαλύματα που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφύγετε το σχηματισμό αζιδίου. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μιας χρήσης κατά το χειρισμό RW, RL, RN, MYCO MMX, MT4, DN4, CN4, SB3, SB και του Υποστρώματος Εργασίας (αναμιγμένα SB3 και SB αντιδραστήρια). Αποφύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. Αποφύγετε την επαφή του δέρματος και των βλεννογόνων με το SB ή το υπόστρωμα εργασίας. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής με το δέρμα, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Το SB και το υπόστρωμα εργασίας περιέχουν διμεθυλοφορμαμίδιο, το οποίο έχει χαρακτηριστεί ως τοξικό σε υψηλές δόσεις από το στόμα και μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο έμβρυο. Θα πρέπει να αποφεύγεται η επαφή με το δέρμα, η εισπνοή αναθυμιάσεων και η κατάποση. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής με το δέρμα, πλύνετε καλά με σαπούνι και νερό και ζητήστε αμέσως ιατρική βοήθεια. Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. Αποθήκευση και Απαιτήσεις Χειρισμού Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια. Αποθηκεύστε το RW, RL και το RN στους 2-25 C. Αν δεν ανοιχτούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Αποθηκεύστε τα MYCO MMX, ένζυμο AmpErase LD και MYCO IC στους 2-8 C. Αν δεν ανοιχτούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Το κύριο μίγμα εργασίας (που έχει προετοιμαστεί με την προσθήκη ενζύμου AmpErase LD και MYCO IC σε MYCO MMX) πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C μετά το άνοιγμα και παραμένει σταθερό για 4 εβδομάδες. Αποθηκεύστε το MTB (+) C και MYCO ( ) C στους 2-8 C. Αν δεν ανοιχτούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 9/30

Παρεχόμενα Υλικά Αποθηκεύστε το MT PS1 και MT4 στους 2-8 C. Αν δεν ανοιχτούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μόλις αναμιχθούν τα MT PS1 και MT4, το αντιδραστήριο εργασίας παραμένει σταθερό για 30 ημέρες στους 2-8 C. Το αντιδραστήριο εργασίας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έξι κύκλους λειτουργίας του οργάνου το μέγιστο (12 ώρες ανά κύκλο) και πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων λειτουργίας του οργάνου. Αποθηκεύστε το DN4 σε θερμοκρασία 2-25 C. Το DN4 παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μόλις ανοιχτεί, το DN4 παραμένει σταθερό για 30 ημέρες σε θερμοκρασία 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Το DN4 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έξι κύκλους λειτουργίας του οργάνου το μέγιστο (12 ώρες ανάκύκλο) και πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων λειτουργίας του οργάνου. Αποθηκεύστε το CN4 σε θερμοκρασία 2-8 C. Το CN4 παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μόλις ανοιχτεί, το CN4 παραμένει σταθερό για 30 ημέρες σε θερμοκρασία 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Το CN4 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έξι κύκλους λειτουργίας του οργάνου το μέγιστο (12 ώρες ανά κύκλο) και πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων λειτουργίας του οργάνου. Αποθηκεύστε το SB3 και το SB στους 2-8 C. Αν δεν ανοιχτούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Το υπόστρωμα εργασίας πρέπει να προετοιμάζεται κάθε μέρα αναμιγνύοντας το SB3 με το SB. Το υπόστρωμα εργασίας παραμένει σταθερό στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή για 16 ώρες. Μην εκθέτετε τα SB3, SB ή το υπόστρωμα εργασίας σε μέταλλα, παράγοντες οξείδωσης ή σε άμεση ηλιακή ακτινοβολία. Αποθηκεύστε το WB σε θερμοκρασία 2-30 C. Το WB παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Εξετάστε το WBκαι, αν χρειάζεται, θερμάνετε στους 30-37 C για την επαναδιάλυση των κατακρημνίσεων. Το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης εργασίας (1Χ), που προετοιμάζεται με την αραίωση του WB σε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό, πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-25 C στο COBAS AMPLICOR Δοχείο Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης και παραμένει σταθερό για 2 εβδομάδες από την ημερομηνία προετοιμασίας. Αποθηκεύστε τα μερικώς χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια ανίχνευσης στους 2-8 C μεταξύ των αναλύσεων του οργάνου. Ελέγξτε την ημερομηνία λήξης των ανοιχτών αντιδραστηρίων εργασίας πριν τη φόρτωση στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. AMPLICOR Respiratory RSP PREP P/N: 20756903 122 Specimen Preparation Kit ART: 07 5690 3 AMPLICOR Κιτ Προετοιμασίας US: 83267 Αναπνευστικών Δειγμάτων RW (Διάλυμα Πλύσης Αναπνευστικού Δείγματος) RL (Αντιδραστήριο Λύσης Αναπνευστικού Δείγματος) RN (Αντιδραστήριο Εξουδετέρωσης Αναπνευστικού Δείγματος) AMPLICOR M. tuberculosis MYCO CTL P/N: 20756954 122 Positive Control Kit ART: 07 5695 4 AMPLICOR M. tuberculosis US: 83263 Κιτ Θετικού Ορού Ελέγχου MTB (+) C [M. tuberculosis (+) Ορός Ελέγχου] 10/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP P/N: 20756784 122 Amplification Kit ART: 07 5678 4 AMPLICOR Mycobacterium US: 83258 Κιτ Ενίσχυσης MYCO MMX (Mycobacterium Master Mix) Ένζυμο AmpErase LD (Χαμηλή συγκέντρωση Ουρακίλης-Ν-Γλυκοσυλάσης του DNA) MYCO IC (Mycobacterium Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου) MYCO ( ) C [Mycobacterium ( ) Ορός Ελέγχου] COBAS AMPLICOR MTB DK P/N: 20757551 122 M. tuberculosis Detection Kit ART: 07 5755 1 COBAS AMPLICOR M. tuberculosis US: 83279 Κιτ Ανίχνευσης MT PS1 (Εναιώρημα Ιχνηθέτη MTB 1) MT4 (Εναιώρημα Ιχνηθέτη MTB 2) COBAS AMPLICOR DK P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR US: 83276 Κιτ Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης DN4 (Διάλυμα Αποδιάταξης) CN4 (Συζεύκτης Αβιδίνης-Υπεροξειδάσης ραφανίδας) SB3 (Υπόστρωμα A) SB (Υπόστρωμα B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR US: 83305 Αντιδραστήριο Ανίχνευσης Συζεύκτη CN4 (Συζεύκτης Αβιδίνης -υπεροξειδάσης Ραφανίδας) COBAS AMPLICOR Wash Buffer WB P/N: 20759899 123 COBAS AMPLICOR ART: 07 5989 9 Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης US: 83314 WB 10Χ Πυκνό Διάλυμα Πλύσης 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 11/30

Απαιτούμενα Μη Παρεχόμενα Υλικά Περιοχή προετοιμασίας αντιδραστηρίων πριν από την ενίσχυση - COBAS AMPLICOR A-ring τοποθετημένος με 12 A-tubes - Συγκρατητήρας COBAS AMPLICOR A-ring - Πιπέτα Eppendorf Multipette με δοχείο 1,25 ml Combitip (αποστειρωμένη, σε μεμονωμένη συσκευασία) - Συσκευές πιπέτας (χωρητικότητα 100 μl)* με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης - Γάντια μιας χρήσης, χωρίς πούδρα Περιοχή Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου πριν από την Ενίσχυση - Σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα, αποστειρωμένα, χωρίς σιλικόνη, κωνικά (Sarstedt 72.692.105 ή αντίστοιχα)** - Υποδοχείς σωληναρίων (Sarstedt 93.1428 ή αντίστοιχα) - Αποστειρωμένες πιπέτες μεταφοράς με λεπτό ακροφύσιο - Συσκευές πιπέτας (χωρητικότητα 50 μl, 100 μl, 400 μl, 500 μl και 1000 μl)* με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης - Μικροφυγόκεντρος (μέγ. RCF 16.000 x g, ελάχ. RCF 12.500 x g), Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, ή ισοδύναμο - Αναδευτήρας τύπου Vortex - Μονάδα θέρμανσης 60 C ± 2 C - Γάντια μιας χρήσης, χωρίς πούδρα Περιοχή Ενίσχυσης/ Ανίχνευσης, μετά την Ενίσχυση - Αναλυτής και εκτυπωτής COBAS AMPLICOR - Εγχειρίδιο Χρήστη για τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή Προαιρετικά: AMPLILINK Λογισμικό, συμπεριλαμβανομένων: Σταθμός Δεδομένων για το AMPLILINK Λογισμικό, με εκτυπωτή Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή (για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.2), ή Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και το cobas p 630 όργανο (για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3). - Εγχειρίδιο Μεθόδου για τo COBAS AMPLICOR MTB Test - Υποδοχείς των D-cups - Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό - Ορολογικές πιπέτες 5 ml - Βαθμονομημένος κύλινδρος (ελάχιστο 1 λίτρο) - Αναδευτήρας τύπου Vortex - Γάντια μιας χρήσης, χωρίς πούδρα * Οι συσκευές πιπέτας πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ακροφύσια με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου προδιαγράφεται, για να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). ** Για την προετοιμασία των δειγμάτων πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. 12/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test Συλλογή, Μεταφορά και Αποθήκευση Δειγμάτων Σημείωση Συλλογή Δειγμάτων Μεταφορά Δειγμάτων Αποθήκευση Δειγμάτων Οδηγίες Χρήσης Σημείωση Σημείωση Σημείωση Σημείωση Προετοιμασία αντιδραστηρίου Όλα τα δείγματα πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά, και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Τα μόνα αποδεκτά αναπνευστικά δείγματα είναι: (α) πτύελα απόχρεμψης και προκλητά πτύελα (β) βρογχικές εκκρίσεις και (γ) BAL που έχουν συλλεχθεί σε αποστειρωμένα πλαστικά δοχεία. Τα δείγματα αυτά πρέπει να υγροποιηθούν, να απολυμανθούν και να συμπυκνωθούν με τη χρήση μεθόδων NALC-NaOH 25, NaOH 25 ή SDS-NaOH 26,27. Τα απολυμασμένα δείγματα πρέπει να μεταφέρονται στο εργαστήριο σε θερμοκρασία 2-25 C υπό την προϋπόθεση ότι θα φτάσουν μέσα σε 24 ώρες από τη συλλογή. Αν τα δείγματα δεν φτάσουν στο εργαστήριο μέσα σε 24 ώρες από τη συλλογή τους, θα πρέπει να αποθηκευτούν στους -70 C και να μεταφερθούν πάνω σε ξηρό πάγο. Τα δείγματα θα πρέπει να μεταφέρονται σύμφωνα με όλους τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς για τη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 34. Τα απολυμασμένα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν σε θερμοκρασία -70 C έως 8 μήνες. Τα επεξεργασμένα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν σε θερμοκρασία -70 C έως 6 μήνες ή στους 2-8 C έως 4 ημέρες. Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, την εκτύπωση αποτελεσμάτων και την ερμηνεία ενδείξεων και σχολίων, ανατρέξτε (1) στο Εγχειρίδιο Χειριστή για τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και (2), εάν χρησιμοποιείτε το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση 3.2, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή ή, εάν χρησιμοποιείτε το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση 3.3, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και το cobas p 630 όργανο. Αν η επεξεργασία των δειγμάτων, η ενίσχυση και η ανίχνευση πραγματοποιηθούν σε μία μέρα εργασίας, ακολουθήστε τη διαδικασία εξέτασης όπως περιγράφεται παρακάτω. Αν η προετοιμασία των δειγμάτων πραγματοποιηθεί σε διαφορετική μέρα από την ενίσχυση και την ανίχνευση, εκτελέστε την Προετοιμασία Αντιδραστηρίων την ίδια μέρα με την Ενίσχυση και την Ανίχνευση. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Όπου προδιαγράφεται, χρησιμοποιείτε συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για τη διασφάλιση της επιλεκτικής ενίσχυσης. Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. Εκτελείται στην: Περιοχή Προετοιμασίας Αντιδραστηρίων πριν από την Ενίσχυση 1. Καθορίστε τον απαιτούμενο αριθμό των A-rings που απαιτούνται για την εξέταση των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Ένας (+) ορός ελέγχου M. tuberculosis και ένας ( ) ορός ελέγχου Mycobacterium πρέπει να περιλαμβάνονται σε κάθε ανάλυση PCR (βλέπε ενότητα Ποιοτικό Έλεγχο ). Τοποθετήστε το A-ring στον αντίστοιχο συγκρατητή A-ring. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 13/30

Σημείωση Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση Σημείωση Ακόμη και αν δεν πραγματοποιηθεί ανίχνευση MYCO IC, θα πρέπει να προστεθεί MYCO IC στο Κύριο Μίγμα. 2. Φυγοκεντρίστε το σωληνάριο του MYCO IC για 5 δευτερόλεπτα. Προετοιμάστε το Κύριο Μίγμα εργασίας προσθέτοντας 100 µl MYCO IC και 100 µl ενζύμου AmpErase LD σε ένα φιαλίδιο MYCO MMX (το μίγμα είναι επαρκές για 32 ενισχύσεις. Δεν απαιτείται η μέτρηση του όγκου του Master Mix. Προσθέστε 100 µl MYCO IC και 100 µl ενζύμου AmpErase LD σε ολόκληρο το φιαλίδιο MYCO MMX. Πωματίστε και πάλι το σωληνάριο και ανακατέψτε καλά αναστρέφοντας το σωληνάριο 10-15 φορές. Μην τοποθετείτε το κύριο μίγμα εργασίας στον αναδευτήρα τύπου vortex. Καταγράψτε την ημερομηνία προετοιμασίας πάνω στο φιαλίδιο. Απορρίψτε τα κενά φιαλίδια MYCO IC και ενζύμου AmpErase LD. Το Κύριο Μίγμα εργασίας παραμένει σταθερό για 4 εβδομάδες σε θερμοκρασία 2-8 C. 3. Προσθέστε 50 μl κύριο μίγμα εργασίας σε κάθε σωληνάριο Α χρησιμοποιώντας μια επαναληπτική συσκευή πιπέτας με δοχείο Combitip 1,25 ml ή μια συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Μην πωματίζετε το(α) σωληνάριο(α) Α στη φάση αυτή. 4. Ασφαλίστε το A-ring που περιέχει Κύριο Μίγμα Εργασίας σε πλαστικό επανασφραγιζόμενο σάκο. Μεταφέρετε το(α) A-ring στην Περιοχή προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου πριν από την ενίσχυση Αποθηκεύστε το(α) A-ring που περιέχουν κύριο μίγμα εργασίας στους 2-8 C στην περιοχή προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου πριν από την ενίσχυση μέχρι να ολοκληρωθεί η προετοιμασία δειγμάτων και ορών ελέγχου. Το κύριο μίγμα εργασίας είναι σταθερό για 24 ώρες στους 2-8 C σε σωληνάρια Α σφραγισμένα στον πλαστικό σάκο. Εκτελείται στην: Περιοχή Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου πριν από την Ενίσχυση Για την ενίσχυση δειγμάτων και ορών ελέγχου που είχαν υποστεί επεξεργασία σε προγενέστερο χρόνο, εκτελέστε πρώτα τα βήματα της ενότητας Προετοιμασία Αντιδραστηρίων. Αποψύξτε τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου σε θερμοκρασία δωματίου και συνεχίστε με το Βήμα 10 της ενότητας Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών ελέγχου. 1. Επικολλήστε ετικέτα σε σωληνάριο πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. Επικολλήστε ετικέτα με τον αναγνωριστικό αριθμό του δείγματος σε κάθε σωληνάριο προετοιμασίας δείγματος. 2. Προσθέστε 500 μl RW σε κάθε σωληνάριο δείγματος. 3. Προσθέστε 100 µl υγροποιημένου, απολυμασμένου και συμπυκνωμένου αναπνευστικού δείγματος στο σωληνάριο που περιέχει RW. Πωματίστε το σωληνάριο και φυγοκεντρίστε για 5 δευτερόλεπτα. 4. Φυγοκεντρίστε σε 12.500 x g για 10 λεπτά. 5. Αναρροφήστε το υπερκείμενο υγρό χρησιμοποιώντας μια πιπέτα μεταφοράς με λεπτό ακροφύσιο και προσθέστε 100 µl RL στα κυτταρικά καθιζήματα χρησιμοποιώντας συσκευή πιπέτας με νέο ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων για κάθε δείγμα. Φυγοκεντρίστε για 5 δευτερόλεπτα για να μετατρέψτε το καθίζημα σε εναιώρημα. 6. Προετοιμάστε τους Ορούς Ελέγχου ως εξής: Οι Οροί Ελέγχου εργασίας πρέπει να προετοιμάζονται την ίδια μέρα που πραγματοποιείται η εξέταση και να απορρίπτονται στο τέλος της μέρας. α. Φυγοκεντρίστε το MYCO ( ) C για 5 δευτερόλεπτα. Μεταφέρετε με πιπέτα 100 µl MYCO ( ) C σε σωληνάριο πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα χρησιμοποιώντας συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο φραγής 14/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test Ενίσχυση και Ανίχνευση αερολυμάτων. Προσθέστε 400 µl RL. Φυγοκεντρίστε για 5 δευτερόλεπτα. Αυτός είναι ο ( ) Ορός Ελέγχου εργασίας Mycobacterium. β. Φυγοκεντρίστε το MTB (+) C για 5 δευτερόλεπτα. Μεταφέρετε με πιπέτα 100 µl MTB (+) C σε σωληνάριο πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα χρησιμοποιώντας συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων. Προσθέστε 400 µl RL. Στροβιλίστε για 5 δευτερόλεπτα. Αυτός είναι ο Mycobacterium (+) Ορός Ελέγχου. γ. Μεταφέρετε με πιπέτα 100 µl από κάθε Ορό Ελέγχου εργασίας σε σωληνάριο πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα για να υποστεί επεξεργασία παράλληλα με τα κλινικά δείγματα. 7. Επωάστε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου σε μονάδα ξηρής θερμότητας 60 C ± 2 C για 45 λεπτά. 8. Απομακρύνετε τα σωληνάρια από τη μονάδα ξηρής θερμότητας και φυγοκεντρίστε στιγμιαία τα σωληνάρια για 5 δευτερόλεπτα ώστε να αφαιρεθούν τα συμπυκνώματα από το πώμα. 9. Χρησιμοποιώντας συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων, προσθέστε 100 µl RN σε κάθε σωληνάριο δείγματος και ορού ελέγχου. Φυγοκεντρίστε για 5 δευτερόλεπτα σε μισή ταχύτητα. Χρησιμοποιήστε ένα νέο ακροφύσιο πιπέτας με φραγή αερολυμάτων για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. 10. Χρησιμοποιώντας συσκευή(ές) πιπέτας με ακροφύσιο(α) φραγής αερολυμάτων, μεταφέρετε 50 µl από κάθε προετοιμασμένο δείγμα ασθενούς, (+) Ορό Ελέγχου εργασίας M. tuberculosis και ( ) Ορό Ελέγχου εργασίας Mycobacterium στα κατάλληλα A-tubes που περιέχουν Κύριο Μίγμα εργασίας. Προσέχετε να αποφεύγετε τη μεταφορά τυχόν υλικού που ενδέχεται να μην έχει μετατραπεί σε εναιώρημα. Τοποθετήστε τα πώματα στα σωληνάρια. Καταγράψτε τις θέσεις του(των) δείγματος(δειγμάτων) και ορών ελέγχου στο χάρτη των A-ring. 11. Μεταφέρετε τα προετοιμασμένα δείγματα (δείγματα ασθενών και ορούς ελέγχου) στα A-ring στην περιοχή ενίσχυσης/ ανίχνευσης. Τα επεξεργασμένα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν σε θερμοκρασία 2-8 C έως 8 ώρες. Εκτελείται στην: Περιοχή Ενίσχυσης/ Ανίχνευσης μετά την Ενίσχυση Εκτελείται Ημερήσια Συντήρηση του Οργάνου, συμπεριλαμβανομένων των εξής: Σκουπίστε τη θέση εκκίνησης με υγρό πανί που δεν αφήνει χνούδι και στεγνώστε Σκουπίστε το ακροφύσιο χειριστή D-cup με υγρό πανί που δεν αφήνει χνούδι και στεγνώστε Ελέγξτε το Δοχείο Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης και γεμίστε το, αν χρειάζεται Προετοιμάστε Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης Εργασίας (1Χ) ως εξής. Εξετάστε το WB και, αν χρειάζεται, θερμάνετε στους 30-37 C για την επαναδιάλυση ενδεχόμενων κατακρημνίσεων. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης Εργασίας προσθέτοντας 1 μέρος WB σε 9 μέρη απεσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Αναμίξτε καλά. Διατηρείτε ανά πάσα στιγμή τουλάχιστον 3-4 λίτρα Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης (1X) στο Δοχείο Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης του συστήματος. Αδειάστε το δοχείο απορριμμάτων Εκκινήστε τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή Κατά την εκκίνηση, ελέγξτε σύριγγες και σωληνάρια Κατά την εκκίνηση, ελέγξτε το ακροφύσιο μεταφοράς 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 15/30

Πριν από κάθε ανάλυση: Σημείωση Ελέγξτε το δοχείο απορριμμάτων και, αν χρειάζεται, αδειάστε το Ελέγξτε το Δοχείο Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης και προσθέστε ρυθμιστικό διάλυμα, αν χρειάζεται Αντικαταστήστε τις χρησιμοποιημένες υποδοχές D-cup Εκκινήστε τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή Φόρτωση και Λειτουργία Συστήματος του COBAS AMPLICOR Αναλυτή 1. Εξετάστε τις ποσότητες των αντιδραστηρίων μετά την τοποθέτησή τους στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. Προετοιμάστε αρκετές κασέτες αντιδραστηρίων για την ολοκλήρωση της εργασίας. 2. Ανακατέψτε καλά το MT PS1 φυγοκεντρίζοντάς το. Προσθέστε 2,5 ml MT PS1 στην κασσέτα MT4. Τοποθετήστε την κασέτα στην ειδική υποδοχή αντιδραστηρίου για την εξέταση. Απορρίψτε το χρησιμοποιημένο φιαλίδιο MT PS1 Καταγράψτε την ημερομηνία προετοιμασίας του αντιδραστηρίου στην κασέτα MT4. Αν η ανίχνευση του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου δεν πρόκειται να πραγματοποιηθεί, περάστε στο Βήμα 4. Διαφορετικά, συνεχίστε με το Βήμα 3. 3. Ανακατέψτε καλά το IC PS1 φυγοκεντρίζοντάς το. Προσθέστε 2,5 ml IC PS1 στην κασέτα IC4. Τοποθετήστε την κασέτα στην ειδική υποδοχή αντιδραστηρίου για την εξέταση. Απορρίψτε το χρησιμοποιημένο φιαλίδιο IC PS1 Καταγράψτε την ημερομηνία προετοιμασίας του αντιδραστηρίου στην κασέτα IC4. 4. Προετοιμάστε το Υπόστρωμα Εργασίας εγχύοντας με πιπέτα 5 ml SB σε μια κασέτα SB3. Αναρροφήστε και εγχύστε με πιπέτα για ανάμιξη. Απορρίψτε το χρησιμοποιημένο φιαλίδιο SB. Καταγράψτε την ημερομηνία προετοιμασίας του αντιδραστηρίου στην κασέτα SB3. 5. Τοποθετήστε το Υπόστρωμα Εργασίας στην κασέτα SB3 στην υποδοχή αντιδραστηρίου γενικής χρήσης. 6. Τοποθετήστε τις κασέτες DN4 και CN4 στην υποδοχή αντιδραστηρίου γενικής χρήσης. Καταγράψτε πάνω στην κασέτα την ημερομηνία που αυτή ανοίχτηκε. 7. Προσδιορίστε εάν οι υποδοχείς αντιδραστηρίων είναι γενικής χρήσης ή ειδικοί για την εξέταση, χρησιμοποιώντας το πληκτρολόγιο, το σαρωτή ανάγνωσης γραμμωτού κώδικα ή το AMPLILINK λογισμικό. 8. Ρυθμίστε τους υποδοχείς αντιδραστηρίων εισάγοντας τις θέσεις των αντιδραστηρίων και τους αριθμούς παρτίδων στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή χρησιμοποιώντας το πληκτρολόγιο, το σαρωτή ανάγνωσης γραμμωτού κώδικα ή το AMPLILINK λογισμικό. 9. Φορτώστε τους υποδοχείς αντιδραστηρίων στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή χρησιμοποιώντας το πληκτρολόγιο, το σαρωτή ανάγνωσης γραμμωτού κώδικα ή το AMPLILINK λογισμικό. Βεβαιωθείτε ότι κάθε κασέτα αντιδραστηρίου βρίσκεται στην καθορισμένη θέση και ότι κάθε κασέτα εφαρμόζει καλά στην υποδοχή της. 10. Τοποθετήστε την υποδοχή D-cup στην πλατφόρμα D-cup. Για κάθε αντίδραση ανίχνευσης απαιτείται ένα D-cup και για κάθε κασέτα Υποστρώματος εργασίας απαιτούνται δύο D-cup για να καταστεί δυνατή η βαθμονόμηση τυφλού από τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. 11. Τοποθετήστε το(α) A-ring στους στο(α) τμήμα(τα) θερμοκυκλοποιητή του COBAS AMPLICOR Αναλυτή. 12. Φορτώστε τα A-rings στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή χρησιμοποιώντας το πληκτρολόγιο, το σαρωτή ανάγνωσης γραμμωτού κώδικα ή το AMPLILINK λογισμικό. 16/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test Σημείωση 13. Δημιουργήστε μια Λίστα Εργασιών A-ring. 14. Κλείστε σφιχτά το κάλυμμα του τμήματος ( ων) του θερμοκυκλοποιητή. 15. Θέστε σε λειτουργία τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. 16. Περιμένετε την υπόδειξη του COBAS AMPLICOR Αναλυτή για την ολοκλήρωση του ελέγχου φόρτωσης. Ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής επιτρέπει 6 μεμονωμένες ανιχνεύσεις στο περιεχόμενο κάθε A-tube. Η απαιτούμενη ποσότητα κάθε αντιδραστηρίου ανίχνευσης υπολογίζεται από τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και ο έλεγχος φόρτωσης που πραγματοποιείται στην αρχή κάθε ανάλυσης προσδιορίζει αν υπάρχουν αρκετά διαθέσιμα αντιδραστήρια για τις απαιτούμενες εξετάσεις. 17. Η ενίσχυση και η ανίχνευση διεξάγονται αυτόματα από τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως τιμή απορρόφησης στα 660 nm και ως θετικά ή αρνητικά. Ποιοτικός Έλεγχος Τουλάχιστον ένα αντίγραφο από τον (+) Ορό Ελέγχου M. tuberculosis και ένα αντίγραφο από τον ( ) Ορό Ελέγχου Mycobacterium πρέπει να υποστούν επεξεργασία με κάθε παρτίδα δειγμάτων. Όπως συμβαίνει με κάθε νέα εργαστηριακή διαδικασία, οι νέοι χειριστές θα πρέπει να εξετάσουν το ενδεχόμενο χρήσης πρόσθετων θετικών και αρνητικών ορών ελέγχου κάθε φορά που εκτελείται η εξέταση, μέχρις ότου αποκτήσουν υψηλό βαθμό εμπιστοσύνης στην ικανότητά τους για ορθή εκτέλεση της εξέτασης. Δεν υπάρχουν απαιτήσεις όσον αφορά τη θέση των ορών ελέγχου στο(α) A-ring. Ελέγξτε την εκτύπωση της ανάλυσης για ενδείκτες και σχόλια για να βεβαιωθείτε ότι η ανάλυση είναι έγκυρη. Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χρήστη για τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή για αποτελέσματα εκτύπωσης και ερμηνεία ενδεικτών και σχολίων. Αρνητικός Ορός Ελέγχου Θετικός Ορός Ελέγχου Έλεγχος Επεξεργασίας Δειγμάτων Η απορρόφηση του ( ) Ορού Ελέγχου Mycobacterium θα πρέπει να είναι μικρότερη από 0,25 στα 660 nm. Αν η απορρόφηση του ( ) Ορού Ελέγχου Mycobacterium είναι μεγαλύτερη ή ίση με 0,25, ολόκληρη η ανάλυση ακυρώνεται. Επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία εξέτασης (προετοιμασία δείγματος, ενίσχυση και ανίχνευση). Εάν η απορρόφηση του ( ) Ορού Ελέγχου Mycobacterium είναι σταθερά μεγαλύτερη από 0,25, επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. Η απορρόφηση του (+) Ορού Ελέγχου Mycobacterium θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη ή ίση με 2,0 στα 660 nm. Αν η απορρόφηση του (+) Ορού Ελέγχου Mycobacterium είναι μικρότερη από 2,0, ολόκληρη η ανάλυση ακυρώνεται. Επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία εξέτασης (προετοιμασία δείγματος, ενίσχυση και ανίχνευση). Εάν η απορρόφηση του (+) Ορού Ελέγχου Mycobacterium είναι σταθερά μικρότερη από 2,0, επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για παροχή τεχνικής υποστήριξης. Προκειμένου να εξετάσετε την αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας δειγμάτων (συνιστάται να πραγματοποιείται σε μηνιαία βάση), θα πρέπει να επεξεργαστείτε 10 4 κύτταρα M. tuberculosis όπως περιγράφεται στην ενότητα Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών ελέγχου και στη συνέχεια να εξεταστούν κατά τον ίδιο τρόπο όπως ένα κλινικό δείγμα. Θα πρέπει να ληφθεί τιμή απορρόφησης μεγαλύτερη ή ίση με 0,35 στα 660 nm με τo COBAS AMPLICOR MTB Test, αν το δείγμα υπέστη σωστή επεξεργασία. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 17/30

Αποτελέσματα Ερμηνεία Αποτελεσμάτων Μη Ανίχνευση Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου 1. Ελέγξτε την εκτύπωση της ανάλυσης για ενδείκτες (FLG) και σχόλια για να βεβαιωθείτε ότι η ανάλυση είναι έγκυρη. Εάν η ανάλυση δεν είναι έγκυρη, επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση (προετοιμασία δείγματος, ενίσχυση και ανίχνευση). 2. Για μια έγκυρη ανάλυση, τα αποτελέσματα δειγμάτων ερμηνεύονται ως εξής: A 660 Σχόλιο Ερμηνεία < 0,35 NEGATIVE Δεν ανιχνεύτηκε DNA του MTB. Το δείγμα είναι πιθανόν αρνητικό για M. tuberculosis. Ένα αρνητικό δείγμα δεν αποκλείει την παρουσία μόλυνσης MTB γιατί τα αποτελέσματα εξαρτώνται από την επαρκή συλλογή δείγματος, την απουσία αναστολέων και την ανίχνευση επαρκούς DNA. 0,35 POSITIVE Ανιχνεύτηκε DNA του MTB. Το δείγμα είναι θετικό για την παρουσία M. tuberculosis. Ερμηνεία Αποτελεσμάτων Με Ανίχνευση Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου 1. Ελέγξτε την εκτύπωση της ανάλυσης για ενδείκτες (FLG) και σχόλια για να βεβαιωθείτε ότι η ανάλυση είναι έγκυρη. Εάν η ανάλυση δεν είναι έγκυρη, επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση (προετοιμασία δείγματος, ενίσχυση και ανίχνευση). 2. Για μια έγκυρη ανάλυση, τα αποτελέσματα δειγμάτων ερμηνεύονται ως εξής: Αποτέλ. Δείγμ. MTB Αποτέλ. Δείγμ. IC Ερμηνεία A 660 Σχόλιο A 660 Σχόλιο < 0,35 NEGATIVE 0,35 POSITIVE Δεν ανιχνεύτηκε DNA του MTB. Το δείγμα είναι πιθανόν αρνητικό για M. tuberculosis. Ένα αρνητικό δείγμα δεν αποκλείει την παρουσία μόλυνσης MTB γιατί τα αποτελέσματα εξαρτώνται από την επαρκή συλλογή δείγματος, την απουσία αναστολέων και την ανίχνευση επαρκούς DNA. < 0,35 NEGATIVE < 0,35 NEGATIVE Άκυρο αρνητικό αποτέλεσμα. Επεξεργαστείτε ένα άλλο κλάσμα από το αρχικό δείγμα. Αν το αρχικό δείγμα δεν είναι διαθέσιμο, θα πρέπει να συλλεχθεί νέο δείγμα. 0,35 POSITIVE ΟΠΟΙΟΔΗ- ΟΠΟΙΟΔΗΠΟΤΕ DNA του MTB ανιχνεύτηκε. Το δείγμα ΠΟΤΕ είναι θετικό για την παρουσία MTB. 18/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

Mycobacterium tuberculosis Test Προφυλάξεις κατά τη διαδικασία Η ροή των εργασιών στο εργαστήριο πρέπει να εκτελείται σε μονόδρομη κατεύθυνση, ξεκινώντας από την περιοχή επεξεργασίας πριν από την ενίσχυση και προχωρώντας προς την περιοχή επεξεργασίας μετά την ενίσχυση (ενίσχυση/ανίχνευση). Οι ενέργειες πριν από την ενίσχυση πρέπει να ξεκινούν με την προετοιμασία του αντιδραστηρίου και να συνεχίζονται με την προετοιμασία του δείγματος. Τα υλικά και ο εξοπλισμός πρέπει να προορίζονται αποκλειστικά για κάθε ενέργεια που προηγείται της ενίσχυσης και όχι για άλλες ενέργειες, ούτε να μεταφέρονται μεταξύ των περιοχών. Πρέπει να φοράτε γάντια σε κάθε περιοχή και να τα αλλάζετε πριν από την έξοδό σας από τη συγκεκριμένη περιοχή. Ο εξοπλισμός και τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία του αντιδραστηρίου δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για ενέργειες προετοιμασίας δειγμάτων ή για το χειρισμό με πιπέτα ή την επεξεργασία ενισχυμένου DNA ή άλλων πηγών DNA-στόχου. Τα υλικά και ο εξοπλισμός που χρησιμοποιούνται μετά την ενίσχυση πρέπει να παραμένουν πάντοτε στον ειδικό χώρο που προορίζεται για την επεξεργασία μετά την ενίσχυση. Όπως συμβαίνει με όλες τις διαδικασίες εξέτασης, η ορθή εργαστηριακή πρακτική είναι απαραίτητη για τη σωστή εκτέλεση αυτής της εξέτασης. Λόγω της υψηλής αναλυτικής ευαισθησίας της παρούσας εξέτασης, θα πρέπει να είστε ιδιαίτερα προσεκτικοί σε ό,τι αφορά τη διατήρηση της καθαρότητας των αντιδραστηρίων του κιτ ή των μιγμάτων ενίσχυσης. Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να παρακολουθούνται σχολαστικά για την καθαρότητά τους. Απορρίψτε οποιοδήποτε αντιδραστήριο ενδέχεται να είναι ύποπτο. Περιορισμοί της διαδικασίας Η εξέταση έχει εγκριθεί αποκλειστικά για χρήση με υγροποιημένα, απολυμασμένα και συμπυκνωμένα ανθρώπινα αναπνευστικά δείγματα, που περιλαμβάνουν πτύελα απόχρεμψης και προκλητά πτύελα, βρογχικές εκκρίσεις και BAL που έχουν υγροποιηθεί, απολυμανθεί και συμπυκνωθεί με χρήση μεθόδων NALC-NaOH 25, NaOH 25 ή SDS-NaOH 26,27. Η εξέταση άλλων τύπων δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων εξαρτάται από τις ορθές διαδικασίες συλλογής, μεταφοράς, αποθήκευσης και επεξεργασίας δειγμάτων. Η ανίχνευση του συμπλόκου M. tuberculosis εξαρτάται από τον αριθμό των οργανισμών που βρίσκονται στο δείγμα και που ενδέχεται να επηρεαστούν από τις μεθόδους συλλογής δειγμάτων, παράγοντες που σχετίζονται με τους ασθενείς (όπως ηλικία, παρουσία συμπτωμάτων) και/ή στάδιο της μόλυνσης. Μπορεί να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα λόγω αναστολής της πολυμεράσης. Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Mycobacterium προστέθηκε στo COBAS AMPLICOR MTB Test για την ταυτοποίηση επεξεργασμένων δειγμάτων τα οποία περιέχουν ουσίες που ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν με την ενίσχυση με PCR. Η προσθήκη του ενζύμου AmpErase LD στο Κύριο Μίγμα μειώνει τον κίνδυνο μόλυνσης των κλώνων (amplicon). Ωστόσο, η μόλυνση από MTB-θετικούς ορούς ελέγχου και MTB-θετικά κλινικά δείγματα μπορεί να αποφευχθεί μόνο με τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές και με την τήρηση των διαδικασιών που περιγράφονται στο Εγχειρίδιο Μεθόδων. Όπως συμβαίνει με κάθε εξέταση, τα αποτελέσματα του COBAS AMPLICOR MTB Test θα πρέπει να ερμηνεύονται λαμβάνοντας υπόψη όλα τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 19/30