ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΟΞΙΝΗΣ ΠΡΟΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟ-ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ ΚΑΙ ΒΙΟ- ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑ ΒΙΟΜΑΖΑ

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΟΞΙΝΗΣ ΠΡΟΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟ-ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ ΚΑΙ ΒΙΟ- ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑ ΒΙΟΜΑΖΑ Γ. Αντωνοπούλου 1, Γ. Δημητρέλλος 1 και Γ.Λυμπεράτος 1,2 1 ΙΤΕ-ΙΕΧΜΗ, οδός Σταδίου 1, Πλατάνι, 1414, 2654, Πάτρα 2 Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ, Πολυτεχνειούπολη Ζωγράφου, 1578, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών μεθόδων όξινης προεπεξεργασίας στη ζυμωτική παραγωγή υδρογόνου και βιο-αιθανόλης, από τα υπολείμματα της συγκομιδής του ηλίανθου. Επιπλέον αποτιμήθηκε η επίδραση της προεπεξεργασίας στη διαλυτοποίηση και στον αποπολυμερισμό της κυτταρίνης και ημικυτταρίνης, αλλά και στην απελευθέρωση διαλυτών σακχάρων και παρεμποδιστών. Οι διεργασίες όξινης προεπεξεργασίας που αναπτύχθηκαν περιλαμβάνουν τη χρήση διαφορετικών τύπων ανόργανων οξέων (HCl,, H 3 ) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (2-2g οξέος /1g TS βιομάζας, στους 12 o C για 1h). Πραγματοποιήθηκε επίσης χαρακτηρισμός των προεπεξεργασμένων και μη δειγμάτων μέσω τεχνικών όπως η φασματοσκοπία υπερύθρου (ΑTR) και το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM). ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα αποτελεί μια ελκυστική, εναλλακτική, ανανεώσιμη πηγή ενέργειας, η οποία περιλαμβάνει γεωργικά και δασικά υπολείμματα και ενεργειακά φυτά. Παρά τον μεγάλο αριθμό των πλεονεκτημάτων που παρουσιάζει, η εμπορική αξιοποίησή της προς παραγωγή βιοκαυσίμων δεν έχει ακόμα επιτευχθεί, λόγω της χαμηλής περιεκτικότητάς της σε ζυμώσιμα σάκχαρα, τα οποία αποτελούν την κύρια πηγή άνθρακα και ενέργειας στις μικροβιακές ζυμωτικές διεργασίες, που λαμβάνουν χώρα κατά την παραγωγή βιοκαυσίμων. Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα αποτελείται κυρίως από πολύπλοκα πολυμερή υδατανθράκων όπως η κυτταρίνη (πολυμερές γλυκόζης) και η ημικυτταρίνη (πολυμερές κυρίως πεντοζών), τα οποία είναι στενά συνδεδεμένα και σχηματίζουν ένα σύμπλοκο με τη λιγνίνη [1], μια πολύπλοκη, υδρόφοβη ένωση, η οποία είναι δύσκολο να βιοδιασπαστεί. Για τη διάσπαση του συμπλόκου αυτού και τον αποπολυμερισμό της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης, που θα έχει ως αποτέλεσμα την επίτευξη επιτυχούς υδρόλυσης προς διαλυτά ζυμώσιμα σάκχαρα, απαιτείται ένα στάδιο προεπεξεργασίας [2]. Όσο υψηλότερο είναι το ποσοστό της λιγνίνης, τόσο δυσκολότερη είναι η ενζυμική / βιολογική / χημική υδρόλυσή της. Για να είναι μια μέθοδος προεπεξεργασίας επιτυχής, θα πρέπει πέρα από την απομάκρυνση σημαντικού μέρους της λιγνίνης, να μπορεί να προκαλέσει και μείωση της κρυσταλλικότητας της κυτταρίνης, που επίσης επηρεάζει σημαντικά την υδρόλυση της κυτταρίνης προς διαλυτά ζυμώσιμα σάκχαρα [3]. Δεδομένου ότι η χημική σύνθεση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας είναι αρκετά διαφορετική, είναι δύσκολο να αναπτυχθεί μια και μόνο διεργασία προεπεξεργασίας για όλα τα λιγνοκυτταρινούχα υποστρώματα και όλες τις διεργασίες παραγωγής βιοκαυσίμων. Συγκεκριμένα, η εφαρμογή της ίδιας μεθόδου προεπεξεργασίας στο ίδιο υπόστρωμα, μπορεί να επηρεάσει σε διαφορετικό βαθμό την απόδοση διαφορετικών βιοδιεργασιών και την παραγωγή βιοκαυσίμων από το υπόστρωμα αυτό. Διάφορα είδη προεπεξεργασίας (μηχανικές, φυσικο-χημικές και βιολογικές) έχουν προταθεί μέχρι τώρα για την αποτελεσματική σακχαροποίηση των σύνθετων πολυμερικών υδατανθράκων που περιέχονται σε διαφορετικά είδη λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας [2]. Κατά τη διάρκεια της χημικής προεπεξεργασίας, η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα εκτίθεται σε χημικά (οξέα, βάσεις ή διαλύτες) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ή υψηλότερες, ενώ η χρήση υψηλών θερμοκρασιών, χωρίς την προσθήκη χημικών ονομάζεται θερμική προεπεξεργασία. Η όξινη προεπεξεργασία πραγματοποιείται με τη χρήση αραιού ή πυκνού διαλύματος οξέος σε υψηλές θερμοκρασίες και για λίγα λεπτά, με αποτέλεσμα την υδρόλυση της ημικυτταρίνης (κυρίως ξυλάνης) [4]. Το κύριο μειονέκτημά της είναι ότι σχετίζεται με το σχηματισμό και την απελευθέρωση ενώσεων όπως η 5- υδρόξυ-μέθυλ-φουρφουράλη (ΥΜΦ) και η φουρφουράλη, οι οποίες μπορεί να είναι παρεμποδιστικές για τους μικροοργανισμούς που χρησιμοποιούνται στις βιοδιεργασίες, για τη μετατροπή των σακχάρων σε βιοκαύσιμα [5]. Προκειμένου να προσδιοριστούν πιθανές αλλαγές τόσο στη χημική σύσταση όσο και στα δομικά χαρακτηριστικά της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας εξαιτίας μιας εφαρμοζόμενης μεθόδου προεπεξεργασίας, συχνά χρησιμοποιείται η φασματοσκοπία υπερύθρου [6-7]. Μέσω αυτής της τεχνικής λαμβάνονται φάσματα στο

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. προεπεξεργασμένο και μη δείγμα, στα οποία πραγματοποιείται ταυτοποίηση και σύγκριση, ώστε να προσδιορισθούν πιθανές αλλαγές που προκλήθηκαν λόγω της προεπεξεργασίας. Στην παρούσα εργασία, αναπτύχθηκαν διαφορετικές διεργασίες όξινης προεπεξεργασίας στα υπολείμματα της συγκομιδής του ηλίανθου και αποτιμήθηκε η επίδρασή τους στην παραγωγή υδρογόνου και βιοαιθανόλης από αυτό. Επιπλέον αποτιμήθηκε η επίδραση των διαφορετικών μεθόδων προεπεξεργασίας στην κατανομή του λιγνοκυτταρινούχου κλάσματος, στην παραγωγή διαλυτών σακχάρων και παρεμποδιστών. Τέλος, πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός των προεπεξεργασμένων και μη δειγμάτων μέσω φασματοσκοπίας υπερύθρου (ΑTR) και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM). ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Βιομάζα Τα υπολείμματα της συγκομιδής του ηλίανθου τεμαχίστηκαν σε μέγεθος <1mm χρησιμοποιώντας εργαστηριακό μύλο κοπής (IKA A 11 basic) και στη συνέχεια πέρασαν από κόσκινα μεγέθους πόρων.71mm. Τα αλεσμένα δείγματα ξηράνθηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για τις αναλύσεις. 2. Συνθήκες προεπεξεργασίας Σε όλες τις μεθόδους προεπεξεργασίας που δοκιμάστηκαν, η αναλογία μάζα/όγκου του στερεού (g) προς το υγρό (ml) ήταν 5:1 (οργανική φόρτιση 5% w/v). Η θερμική προεπεξεργασία διεξήχθη στους 12 ο C για 1h χρησιμοποιώντας αυτόκλειστο. Η όξινη προεπεξεργασία του ηλίανθου πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη υδατικού διαλύματος, HCl και H 3 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (2, 1 και 2 g/1g ΤS, αντίστοιχα) για 1h σε θερμοκρασία 12 ο C. 3. Αναλυτικές μέθοδοι Τα δείγματα αμέσως μετά την προεπεξεργασία που υπέστησαν διαχωρίστηκαν σε υγρό (υδρόλυμα) και στερεό μέρος (το οποίο και ξεπλύθηκε με νερό), μέσω διήθησης από φίλτρα.7μm. Η χημική σύσταση (κυταρρίνη, ημικυτταρίνη και λιγνίνη) των μη επεξεργασμένων υποστρωμάτων αλλά και του στερεού μέρους των προεπεξεργασμένων υποστρωμάτων προσδιορίστηκε με βάση τις αναλυτικές μεθόδους του National Renewable Εnergy Laboratory [8], ενώ τα διαλυτά σάκχαρα που περιέχονται στο υδρόλυμα, προσδιορίστηκαν με τη διαδικασία που αναφέρεται από τους Joseffson et al. [9]. Η γλυκόζη, η ξυλόζη και η αραβινόζη μετρήθηκαν μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης HPLC-RI και στήλη Αminex HPX-87H της Biorad. Ως εκλούτης χρησιμοποιήθηκε υδατικό διάλυμα.6ν με ροή.7ml/min και σε Τ=6 o C. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες εντωπίστηκαν ενώσεις όπως φουρφουράλη, ΥΜΦ και οξικό οξύ. Τα προεπεξεργασμένα και μη υποστρώματα χαρακτηρίστηκαν ως προς την περιεκτικότητά τους σε ολικά και πτητικά στερεά (TS και VS, αντίστοιχα), σύμφωνα με το APHA standard methods [1] ενώ οι πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν μέσω μέτρησης του Ολικού Ν κατά Kjeldahl και οι φαινολικές ενώσεις μέσω της Folin Ciocalteu μεθόδου [1]. Η σύσταση του παραγόμενου βιοαερίου προσδιορίστηκε με αέριο χρωματογράφο (SRI 861c MG#1), εξοπλισμένο με ανιχνευτή θερμικής αγωγιμότητας (ΤCD) και άζωτο ως φέρον αέριο. Για τον προσδιορισμό των πτητικών λιπαρών οξέων (ΠΛΟ) χρησιμοποιήθηκε αέριος χρωματογράφος (Varian Star 36) εξοπλισμένος με ανιχνευτή φλόγας ιονισμού (FID) και το ήλιο ως φέρον αέριο. Η συγκέντρωση της παραγόμενης βιοαιθανόλης προσδιορίστηκε μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, στις συνθήκες που αναφέρονται παραπάνω. 4. Πειράματα ζυμωτικής παραγωγής υδρογόνου (ΖΠΥ) Η ΖΠΥ από τα προεπεξεργασμένα υπολείμματα της συγκομιδής του ηλίανθου έλαβε χώρα σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου, όγκου 16 ml, με χρήση μικτών μικροβιακών καλλιεργειών. Η μικροβιακή καλλιέργεια προήλθε από τον αναερόβιο χωνευτήρα της μονάδας επεξεργασίας των λυμάτων της Πάτρας, η οποία είχε υποστεί θερμική προκατεργασία στους 1 o C για 15min, προκειμένου να εξαλειφθεί η δράση των μεθανογόνων βακτηρίων, με ταυτόχρονη επικράτηση των σπορογόνων υδρογονοπαραγωγών μικροοργανισμών [11]. Η ζύμωση έλαβε χώρα με ταυτόχρονη ενζυμική υδρόλυση, όπου χρησιμοποιήθηκε μίγμα εμπορικών ενζύμων. Συγκεκριμένα,.5g TS βιομάζας προεπεξεργάστηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο 2, (οργανικό φορτίο 5% w/v) και στη συνέχεια προστέθηκαν 1mL από την προεκατεργασμένη λάσπη και 3mL συνθετικού μέσου (Na *2 O: 8.98g/L, Na 2 H *2 O: 5.2g/L, εκχύλισμα ζύμης:.6g/l). Επιπλέον, προστέθηκαν τα εμπορικά ένζυμα Celluclast 1.5L (κυτταρινάση από το Trichoderma reesei, ATCC 26921) σε συγκέντρωση 4 FPU Celluclast /g TS και Novozyme 188 (κελλοβιάση από τον Aspergillus niger) σε αναλογία 3:1. Η τελική φόρτιση σε TS ηλίανθου, μέσα στους αντιδραστήρες ανήλθε στο 1%, ενώ η αρχική τιμή του ph ρυθμίστηκε στο 6, μέσω διαλύματος NaOH. Τα πειράματα επωάστηκαν στους 35 ο C, υπό ανάδευση σε 1rpm, υπό αυστηρά αναερόβιες συνθήκες. Επιπλέον, διεξήχθησαν τυφλά πειράματα για τον προσδιορισμό της παραγωγής υδρογόνου από τη λάσπη. Η παραγωγή του υδρογόνου και του βιοαερίου καταγραφόταν με το χρόνο. 5. Πειράματα ζυμωτικής παραγωγής αιθανόλης (ΖΠΑ) Η ΖΠΑ από τα προεπεξεργασμένα υπολείμματα της συγκομιδής του ηλίανθου πραγματοποιήθηκε σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου, στους 3 ο C, με τη χρήση της ζύμης Pichia Stipites και ταυτόχρονη ενζυμική υδρόλυση. Ο εμβολιασμός προήλθε από προκαλλιέργειες του P. Stipites, ώστε η αρχική συγκέντρωση στους

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. αντιδραστήρες να είναι.8g/l, ενώ προστέθηκαν K PO4, MgCl 2 *6 O και (NH 4 ) 2 σε συγκεντρώσεις 1g/L. Συγκεκριμένα,.75g TS βιομάζας προεπεξεργάστηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο 2, (οργανικό φορτίο 5% w/v) και στη συνέχεια προστέθηκαν τα ανόργανα άλατα με το μικροοργανισμό, καθώς και το μίγμα των εμπορικών ενζύμων που περιγράφεται στην παράγραφο 4, για την ενζυμική υδρόλυση, σε αναλογία 3:1, σε συγκέντρωση 3 FPU Celluclast /g TS. Η αρχική τιμή του ph ρυθμίστηκε στο 5 και τα πειράματα επωάστηκαν στους 3 ο C, υπό ανάδευση σε 1rpm, υπό μικροαερόβιες συνθήκες. Η παραγωγή της βιοαιθανόλης καταγραφόταν με το χρόνο. 6. Φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR) και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) Τα φάσματα υπερύθρου ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο υπερύθρου IR BRUKER EQUINOX55 χρησιμοποιώντας την τεχνική της Attenuated Total Reflection (ATR), στην περιοχή 5-18 cm - 1 με φασματική ανάλυση 4 cm -1. Οι φωτογραφίες SEM ελήφθησαν με χρήση του Zeiss SUPRA 35VP, μετά από επιχρύσωση των δειγμάτων. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1. Σύσταση βιομάζας Τα κύρια χαρακτηριστικά και η σύσταση του μη επεξεργασμένου υποστρώματος (μετά από άλεση και αεροξήρανση) παρουσιάζεται στον πίνακα 2, ενώ στο σχήμα 1 παρουσιάζεται η επίδραση της όξινης προεπεξεργασίας στην κλασματοποίηση της βιομάζας (ποσοστό λιγνίνης, κυτταρίνης και ημικυτταρίνης). Πίνακας 1. Σύσταση των μη προεπεξεργασμένων υπολειμμάτων ηλίανθου Χαρακτηριστικά Τιμές ΤS, (%) 9.9 ±.1 VS, (g/1 gts) 79.5±.1 Κυτταρίνη, (g/1 gts) 32.2 ±.2 Ημικυτταρίνη, (g/1 gts) 18.7 ± 2.4 Λιγνίνη, (g/1 gts) 22.3 ±.3 Πρωτεΐνες, (g/1 gts) 1.7 ±.2 g/ 1 gts 4 κυτταρίνη ημικυτταρίνη λιγνίνη 35 (g/1gts) 3 2 15 1 5 χωρίς επεξεργασία θερμική 2 1 2 g/ 1 gts 4 κυτταρίνη ημικυτταρίνη λιγνίνη 35 H 3 (g/1gts) 3 2 15 1 5 χωρίς επεξεργασία θερμική 2 1 2 α β γ g/ 1 gts 4 κυτταρίνη ημικυτταρίνη λιγνίνη 35 HCl (g/1gts) 3 2 15 1 5 χωρίς επεξεργασία θερμική 2 1 2 Σχήμα 1. Το ποσοστό κυτταρίνης, ημικυτταρίνης και λιγνίνης (g/1gts ) του μη επεξεργασμένου αλλά και του προεπεξεργασμένου υποστρώματος, είτε θερμικά είτε με οξύ ( (1α), H 3 (1β), HCl (1γ)), σε συγκεντρώσεις 2, 1 και 2 g/1gts Από τον πίνακα 2 είναι ορατό ότι ο ηλίανθος, ως ξυλώδης βιομάζα έχει μεγάλο ποσοστό σε λιγνίνη και κυτταρίνη, ενώ το κλάσμα της ημικυτταρίνης είναι χαμηλό. Στο σχήμα 1, οι τιμές έχουν εκφραστεί ανά 1g TS (αρχικού βάρους ηλίανθου), γεγονός που σημαίνει ότι η ανάκτηση του υλικού λόγω της απώλειας βάρους κατά τη διάρκεια της προεπεξεργασίας έχει ληφθεί υπ όψην. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι κατά τη διάρκεια όλων των τύπων της προεπεξεργασίας, η ανάκτηση του υλικού που σχετίζεται με την απώλεια μάζας κατά τη διάρκεια της προκατεργασίας ήταν μικρότερη από 1% και μάλιστα η τιμή της αυξήθηκε, με την ένταση της διεργασίας. Για παράδειγμα, η ανάκτηση μάζας μετά τη θερμική επεξεργασία ήταν 82.4%, μετά την επεξεργασία με 1 g /1gTS ήταν 75.4%, ενώ μετά την προσθήκη 2 g /1gTS και 2 ghcl/1gts μειώθηκε σε 67.4 και 64.1%, αντίστοιχα. Από το σχήμα 1, παρατηρείται ότι η χημική επεξεργασία με οξύ οδήγησε σε διαλυτοποίηση της ημικυτταρίνης και μάλιστα η διαλυτοποίηση ήταν μεγαλύτερη για τα πιο ισχυρά οξέα ( και HCl) στις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις. Έτσι η χρήση στη μεγαλύτερη συγκέντρωση (2g/1g TS) προκάλεσε μείωση της ημικυτταρίνης κατά 59.3%, ενώ με την προσθήκη HCl 1 και 2g/1gTS, η αντίστοιχη μείωση ανήλθε σε 64.3 και 76.9%, αντίστοιχα. 2. Χαρακτηρισμός μέσω SEM και IR

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. Στο σχήμα 2, παρουσιάζονται επιλεγμένες φωτογραφίες SEM, του μη επεξεργασμένου υπολείμματος ηλίανθου (2α), αλλά και του προεπεξεργασμένου ηλίανθου, με (2β), με H 3 (2γ) και με HCl (2δ), σε συγκέντρωση 2 g/1gts. Από τις φωτογραφίες γίνεται αντιληπτό ότι τα διάφορα είδη προεπεξεργασίας επηρέασαν διαφορετικά το υπόστρωμα. Όπως φαίνεται από το σχήμα 2α, το μη επεξεργασμένο υπόστρωμα αποτελείται από ενιαία δομή, που είχε λίγους πόρους διαθέσιμους για ενζυμική υδρόλυση. Από τα σχήματα 2β και 2δ, φαίνεται ότι η επίδραση 2g/1gTS ή HCl προκάλεσε καταστροφή του εξωτερικού λιγνοκυτταρινούχου στρώματος, εξαιτίας της απομάκρυνσης του μεγαλύτερου μέρους της ημικυτταρίνης. Ένα μεγάλο μέρος της βιομάζας φαίνεται να έχει απομακρυνθεί, μια και έχουν δημιουργηθεί οπές, γεγονός που ενισχύει την πεποίθηση ότι η ειδική επιφάνεια και το πορώδες έχουν αυξηθεί, μετά την επεξεργασία. α β γ δ Σχήμα 2. Φωτογραφίες SEM του μη επεξεργασμένου (2α) αλλά και του προεπεξεργασμένου υποστρώματος με (2β), H 3 (2γ) και HCl (2δ), σε συγκεντρώσεις 2 g/1gts. Προκειμένου να μελετηθούν και να προσδιοριστούν πιθανές αλλαγές που παρατηρούνται στη δομή και τη χημική σύσταση των προεπεξεργασμένων λιγνοκυτταρινούχων υποστρωμάτων, ελήφθησαν αντιπροσωπευτικά φάσματα υπερύθρου τύπου IR από τα προεπεξεργασμένα και μη, δείγματα. Συγκεκριμένα ελήφθησαν τα φάσματα υπερύθρου του ηλίανθου (μη επεξεργασμένο δείγμα), καθώς και των προεπεξεργασμένων δειγμάτων μετά από θερμική (12 o C, 1h) και όξινη προεπεξεργασία με Η 2 (3α), H 3 (3β) και HCl (3γ), σε συγκεντρώσεις 2 και 2g/1gTS, αντίστοιχα. α β γ ATR Aπορρόφηση, 2, 2 Θερμική 12 o C ATR Aπορρόφηση H 3, 2 H 3, 2 Θερμική 12 o C ATR Aπορρόφηση HCl, 2 HCl, 2 Θερμική 12 o C Χωρίς επεξεργασία Χωρίς επεξεργασία Χωρίς επεξεργασία 18 16 14 12 1 8 6 Κυματαριθμός, cm -1 18 16 14 12 1 8 6 Κυματαριθμός, cm -1 18 16 14 12 1 8 6 Κυματαριθμός, cm -1 Σχήμα 3. Φάσματα IR του μη επεξεργασμένου αλλά και του προεπεξεργασμένου υποστρώματος με (3α), H 3 (3β) και HCl (3γ), σε συγκεντρώσεις 2 και 2 g/1gts Οι κυριότερες κορυφές που παρουσιάζουν ενδιαφέρον οφείλονται στην κυτταρίνη και ημικυτταρίνη στην περιοχή των 161 cm -1, στο δεσμό C = C της λιγνίνης στα 1515 cm -1, στο δεσμό C-H της κρυσταλλικής κυτταρίνης στα 142 cm -1, στην κυτταρίνη και ημικυτταρίνη στα 137 cm -1, στο δεσμό C O C της κυτταρίνης και ημικυτταρίνης στα 116 cm -1 και στο δεσμό C H που οφείλεται στην άμορφη κυτταρίνη, στα 898 cm -1 [12]. Από το σχήμα 3 είναι φανερό ότι τα φάσματα του μη επεξεργασμένου και του θερμικά προεπεξεργασμένου δείγματος είναι παρόμοια, γεγονός που πιστοποιεί ότι η θερμική προεπεξεργασία δεν είχε σημαντική επίδραση στη χημική σύσταση αλλά και τα δομικά χαρακτηριστικά της βιομάζας του ηλίανθου. Το συμπέρασμα αυτό επαληθεύει τις σχετικές μετρήσεις των πολυμερικών υδατανθράκων αλλά και της λιγνίνης που παρουσιάζονται στο σχήμα 1. Στα όξινα προεπεξεργασμένα δείγματα, η κορυφή στα 161 cm -1, που οφείλεται στην κυτταρίνη και ημικυτταρίνη μειώθηκε, γεγονός που πιστοποιεί τη διαλυτοποίηση της ημικυτταρίνης. Το ύψος της κορυφής μάλιστα, ήταν ανάλογο με την ισχύ και τη συγκέντρωση του οξέος που χρησιμοποιήθηκε. Από το σχήμα 3β, όπου παρουσιάζονται τα φάσματα των προεπεξεργασμένων με H 3 δειγμάτων, είναι φανερό ότι το συγκεκριμένο οξύ δεν επηρέασε σημαντικά τη χημική δομή του ηλίανθου, μια και τα φάσματα αυτά είναι παρόμοια με το αντίστοιχο του μη κατεργασμένου δείγματος. Η κατεργασία με, HCl και H 3 δεν

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. επηρέασε την κορυφή στα ~17 που αντιστοιχεί στο δεσμό C=O της λιγνίνης, κάτι που επαληθεύεται και από το σχήμα 1, που παρουσιάζεται το λιγνοκυτταρινούχο κλάσμα των προεπεξεργασμένων δειγμάτων. 3. Χαρακτηρισμός του υγρού κλάσματος που προκύπτει μετά την προεπεξεργασία Η διαλυτοποίηση μεγάλου μέρους της ημικυτταρίνης, που έλαβε χώρα κατά τη διάρκεια της όξινης προεπεξεργασίας μπορεί να επαληθευτεί και από τη συγκέντρωση των διαλυτών σακχάρων που παρουσιάζεται στον πίνακα 2. Είναι φανερό ότι η συγκέντρωσή τους αυξάνεται σε όλα τα είδη χημικής προεπεξεργασίας,ενώ η υψηλότερη τιμή τους παρατηρήθηκε στο υγρό κλάσμα που προήλθε από την όξινη προεπεξεργασία με και HCl, στη μεγαλύτερη συγκέντρωση, λόγω της μεγαλύτερης διαλυτοποίησης του στερεού υλικού (ημικυτταρίνης) (σχήμα 1), που είχε ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση ξυλόζης. Όπως αναφέρθηκε, κατά τη διάρκεια της όξινης προεπεξεργασίας μπορούν να δημιουργηθούν ενώσεις, ως αποτέλεσμα της διαλυτοποίησης των υδατανθράκων, οι οποίες μπορεί να δρουν παρεμποδιστικά στους μικροοργανισμούς που εμπλέκονται κατά τα στάδια της υδρόλυσης και της ζύμωσης [13]. Όταν η προεπεξεργασία της βιομάζας γίνεται σε ακραίες τιμές ph, υπό την παρουσία οξέων και υψηλών θερμοκρασιών, τότε είναι πιθανή η δημιουργία φουραλδεΰδων (φουρφουράλη και ΥΜΦ), οξέων, ή φαινολικών ενώσεων [2]. Η παρουσία και η συγκέντρωση τέτοιων ενώσεων εξαρτάται από το υλικό το οποίο έχει υποστεί την προεπεξεργασία αλλά και από την ένταση αυτής. Στον πίνακα 2, παρουσιάζεται η συγκέντρωση του οξικού οξέος καθώς επίσης της φουρφουράλης, της ΥΜΦ και των φαινολικών ενώσεων, κατά τη θερμική προεπεξεργασία (1h στους 12 ο C) αλλά και κατά την όξινη προεπεξεργασία με τα ανόργανα οξέα. Πίνακας 2. Σύσταση των υδρολυμάτων που προκύπτουν από την προεπεξεργασία Προεπεξεργασία Σάκχαρα, Οξικό οξύ, Φουρφουράλη, ΥΜΦ, Φαινολικές ενώσεις, Χωρίς 1.35 ±.8 Δ.δ Δ.δ Δ.δ.29 ±.2 επεξεργασία Θερμική 1.37 ±.1.2 ±.1 Δ.δ Δ.δ.46 ±.1 2* 1.44 ±..27 ±.4 Δ.δ.1 ±..54 ±. 1* 4.34 ±.31.35 ±..2 ±..3 ±..56 ±.2 2* 6.9 ±.6.85 ±.6.4 ±..36 ±.3.63 ±.5 H 3 2* 1.43 ±.1.27 ±. Δ.δ Δ.δ.54 ±. H 3 1* 1.74 ±.5.31 ±.2 Δ.δ.3 ±..54 ±.2 H 3 2* 2.23 ±.71.26 ±.1.1 ±..3 ±..61 ±.5 HCl 2* 1.44 ±.1.4 ±.8 n.d Δ.δ.71 ±.6 HCl 1* 5.68 ±.46.38 ±.1.5 ±..6 ±.1 1.42 ±.8 HCl 2* 7.5 ± 1.1.64 ±.3.12 ±.1.6 ±.1 1.42 ±.2 *2,1, 2 αναφέρεται σε 2, 1 και 2 g/1gts 4. Πειράματα ζυμωτικής παραγωγής υδρογόνου (ΖΠΥ) Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της προεπεξεργασίας στη ζυμωτική παραγωγή υδρογόνου, χρησιμοποιώντας μικτές μικροβιακές καλλιέργειες, από τα υπολείμματα της συγκομιδής του ηλίανθου. Στο σχήμα 4, παρουσιάζεται η παραγωγή υδρογόνου του μη επεξεργασμένου αλλά και του προεπεξεργασμένου υποστρώματος με (α), H 3 (β) και HCl (γ), σε συγκεντρώσεις 2, 1 και 2 g/1gts. Σε όλα τα πειράματα με τα όξινα προεπεξεργασμένα υποστρώματα, έλαβε χώρα ταυτόχρονη ενζυμική υδρόλυση με εμπορικά ένζυμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η όξινη επεξεργασία με HCl και σε συγκέντρωση 1g/1gTS αλλά και η επεξεργασία με H 3 σε συγκέντρωση 2g/1g TS, οδήγησαν στην μεγαλύτερη παραγωγή υδρογόνου. Συγκεκριμένα, η επεξεργασία με 1g/1g TS HCl προκάλεσε αύξηση της απόδοσης κατά 159% σε σχέση με το μη επεξεργασμένο υπόστρωμα. Επιπλέον είναι φανερό ότι η όξινη επεξεργασία με και HCl σε συγκέντρωση 2g/1g TS, προκάλεσε μείωση της απόδοσης σε σχέση με τις μικρότερες συγκεντρώσεις (2 και 1g/1gTS), γεγονός που μπορεί να αποδοθεί σε πιθανή παρεμπόδιση που προκλήθηκε στα υδρογονοπαραγωγά ζυμωτικά βακτήρια, λόγω των μεγάλων συγκεντρώσεων φουρφουράλης και ΥΜΘ που παρήχθησαν. Στο σχήμα 5, παρουσιάζονται οι συγκεντρώσεις των κύριων μεταβολικών προϊόντων (οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ), τα οποία παρήχθησαν κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Παρατηρήθηκε διαφορετική κατανομή μεταβολικών προϊόντων στα προεπεξεργασμένα υποστρώματα, με το οξικό και το βουτυρικό οξύ να είναι τα κυρίαρχα μεταβολικά προϊόντα, στις περισσότερες συνθήκες. Επιπλέον, η μεγαλύτερη απόδοση σε υδρογόνο συνοδεύτηκε από τη μεγαλύτερη συγκέντρωση σε βουτυρικό οξύ, γεγονός που πιστοποιείται και από άλλες εργασίες [14]. Συγκεκριμένα, η συγκέντρωση σε βουτυρικό ήταν η μεγαλύτερη, όταν ο ηλίανθος υπέστη όξινη

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. προεπεξεργασία με HCl και σε συγκέντρωση 1g/1gTS και με H 3 σε συγκέντρωση 2g/1g TS. Τέλος, παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση του βουτυρικού οξέος ήταν πολύ χαμηλή όταν δεν υπήρξε παραγωγή υδρογόνου ( και HCl σε συγκέντρωση 2g/1g TS), λόγω της παρεμπόδισης που προκλήθηκε από την παραγωγή τοξικών ενώσεων. (L/kg TS) 2 15 1 5 (g/1gts) (L /kg TS) 2 H 15 3 (g/1gts) α β γ 1 1 5 (L /kgts) 2 HCl (g/1gts) 15 5 Μ.Ε TEY 2 1 2 Μ.Ε TEY 2 1 2 Μ.Ε TEY 2 1 2 Σχήμα 4. Απόδοση σε υδρογόνο (L/kgTS ) του μη επεξεργασμένου είτε χωρίς (Μ.Ε) ή με ταυτόχρονη ενζυμική υδρόλυση (ΤΕΥ), αλλά και του προεπεξεργασμένου υποστρώματος με οξύ ( (4α), H 3 (4β), HCl (4γ)), σε συγκεντρώσεις 2, 1 και 2 g/1gts. g/kgts 3 2 15 1 Οξικό Προπιονικό Βουτυρικό Οξικό Προπιονικό Βουτυρικό Οξικό Προπιονικό Βουτυρικό 3 3 α (g/1gts) β H 3 (g/1gts) γ HCl (g/1gts) g/kgts 2 15 1 g/kgts 2 15 1 5 5 5 Μ.Ε TEY 1 2 2 Μ.Ε TEY 2 1 2 Μ.Ε TEY 2 1 2 Σχήμα 5. Μεταβολικά προϊόντα (g/kgts ) του μη επεξεργασμένου είτε χωρίς (Μ.Ε) ή με ταυτόχρονη ενζυμική υδρόλυση (ΤΕΥ), αλλά και του προεπεξεργασμένου υποστρώματος με οξύ ( (5α), H 3 (5β), HCl (5γ)), σε συγκεντρώσεις 2, 1 και 2 g/1gts. 5. Πειράματα ζυμωτικής παραγωγής αιθανόλης (ΖΠΑ) Μελετήθηκε η επίδραση της προεπεξεργασίας στη ζυμωτική παραγωγή της βιοαιθανόλης από τα υπολείμματα της συγκομιδής του ηλίανθου, χρησιμοποιώντας τη ζύμη Pichia stipitis (strain CECT 1922), η οποία έχει την ικανότητα να βιομετατρέπει προς αιθανόλη, όχι μόνο εξόζες (C6- σάκχαρα) αλλά και πεντόζες (C5- σάκχαρα), όπως είναι η ξυλόζη, που είναι το κύριο προϊόν της υδρόλυσης της ημικυτταρίνης, λόγω της όξινης προεπεξεργασίας. Αρχικά, έγινε χαρακτηρισμός της απόδοσής του μικροοργανισμού σε αιθανόλη, σε πειράματα με συνθετικά υποστρώματα γλυκόζης και ξυλόζης (σχήμα 6). 1 1 8 6 α Γλυκόζη Αιθανόλη 8 6 β Ξυλόζη Αιθανόλη g/l 4 g/l 4 2 2 5 1 15 2 Χρόνος (h) 5 1 15 2 Χρόνος (h) Σχήμα 6. ΖΠΥ από το P. stipitis με συνθετικά υποστρώματα 6α) γλυκόζης και 6β) ξυλόζης Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι παρήχθησαν.28g αιθανόλης ανά g γλυκόζης ή 1.8 mol αιθανόλης ανά mol γλυκόζης, όπου βάσει την αντίδρασης (1) αντιστοιχεί στο 54% της μέγιστης θεωρητικής απόδοσης ή.28g

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. αιθανόλης ανά g ξυλόζης ή.91 mol αιθανόλης ανά mol ξυλόζης, όπου αντιστοιχεί στο 55% της μέγιστης θεωρητικής απόδοσης (αντίδραση 2). C 6 H 12 O 6 2CH 3 C OH + 2CO 2 (1) 3C 5 H 1 O 5 5CH 3 C OH + 5CO 2 + 5 O (2) Στη συνέχεια, μελετήθηκε η παραγωγή της βιο-αιθανόλης από προεπεξεργασμένο ηλίανθο, με τη χρήση της ζύμης P. Stipites με ταυτόχρονη ενζυμική υδρόλυση. Τα αποτελέσματα τις ζύμωσης δίνονται στο σχήμα 7 όπου παρατηρείται ότι η επεξεργασία με HCl και H 3 σε συγκέντρωση 2g /1 g TS οδήγησε στη μεγαλύτερη απόδοση παραγωγής αιθανόλης, με βέλτιστη απόδοση να λαμβάνεται από το προεπεξεργασμένο με HCl δείγμα (78% του μέγιστου θεωρητικού). Επιπλέον παρατηρήθηκε παρεμπόδιση του P. stipitis στα προεπεξεργασμένα υποστρώματα με σε συγκέντρωση 2g/1gTS, λόγω της παρουσίας ΥΜΦ, σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Ethanol (g/kg TS) 1 1 75 5 (g/1gts) α ΜΕ 2 1 2 Ethanol (g/kg TS) 1 1 75 5 β H 3 (g/1gts). ΜΕ 2 1 2 Ethanol (g /kg TS) 1 1 75 5 γ ΜΕ HCl (g/1gts) 2 1 2 Σχήμα 7. Απόδοση σε αιθανόλη (g/kgts ) του μη επεξεργασμένου (Μ.Ε) αλλά και του προεπεξεργασμένου υποστρώματος με οξύ ( (7α), H 3 (7β), HCl (7γ)), σε συγκεντρώσεις 2, 1 και 2 g/1gts. Σε όλα τα πειράματα έλαβε χώρα ταυτόχρονη ενζυμική υδρόλυση. 1. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η όξινη προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας ηλίανθου επηρέασε θετικά τη ζυμωτική παραγωγή υδρογόνου και βιοαιθανόλης. Όμως, η μέθοδος προεπεξεργασίας που βρέθηκε να είναι βέλτιστη για την παραγωγή του υδρογόνου, δεν ήταν η βέλτιστη για την παραγωγή της αιθανόλης, γεγονός που μπορεί να αποδοθεί στη διαφορετική αντοχή των χρησιμοποιούμενων ζυμών (βιο-αιθανόλη) και βακτηρίων (βιο-υδρογόνο), σε ενώσεις με παρεμποδιστική, προς αυτούς, δράση, οι οποίες απελευθερώνονται λόγω της όξινης προ επεξεργασίας. Επιπλέον, κάθε είδος προεπεξεργασίας είχε διαφορετική επίδραση στη διαλυτοποίηση της ημικυτταρίνης και της κυτταρίνης, γεγονός που πιστοποιήθηκε και από φάσματα υπερύθρου ή φωτογραφίες SEM που ελήφθησαν στα προεπεξεργασμένα και μη, δείγματα. Παρατηρήθηκε ακόμα, ότι όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση και η ισχύς του οξέος, τόσο μεγαλύτερη είναι η διαλυτοποίηση της ημικυτταρίνης, αλλά και η παραγόμενη συγκέντρωση των φουραλδεϋδών, των οξέων και των φαινολικών ενώσεων. Τα πειράματα ζυμωτικής παραγωγής υδρογόνου έδειξαν ότι η όξινη επεξεργασία με HCl και σε συγκέντρωση 1g/1gTS και με H 3 σε συγκέντρωση 2g/1g TS, οδήγησαν στη μεγαλύτερη παραγωγή υδρογόνου, η οποία συσχετίστηκε με την παραγωγή μεγάλης συγκέντρωσης βουτυρικού οξέος. Επιπλέον η όξινη επεξεργασία με και HCl σε συγκέντρωση 2g/1g TS προκάλεσε παρεμπόδιση στα υδρογονοπαραγωγά βακτήρια, λόγο του σχηματισμού τοξικών για αυτά- ενώσεων σε υψηλές συγκεντρώσεις. Τέλος, τα πειράματα ζυμωτικής παραγωγής αιθανόλης με το P. Stipitis, έδειξαν ότι η επεξεργασία με HCl και H 3 σε συγκέντρωση 2g/ 1 g TS οδήγησε στη μεγαλύτερη απόδοση παραγωγής αιθανόλης. Επιπλέον παρατηρήθηκε παρεμπόδιση του P. stipitis στα δείγματα που περιείχαν σε συγκέντρωση 2g/1gTS λόγω της παρουσίας σε μεγάλες συγκεντρώσεις, ΥΜΦ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. van Wyk J.P.H., Mohulatsi M., Bioresour. Technol. 86: 21 23 (23). [2]. Hendriks A.T.W.M. and Zeeman G., Bioresour. Technol. 1: 1 18 (29). [3]. Jeihanipour A., Karimi, K., Taherzadeh, M.J., Biotechnol. Bioeng. 15: 469 476 (21) [4]. Monlau F., Barakat A., Trably E., Dumas C., Steyer J.-P., Carrere, H., Critical Reviews in Environment. Sci. Technol. 43 (3): 26-322 (213).

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. [5]. Larsson S., Palmqvist E., Hahn-Hagerdal B., Tengborg C., Stenberg K., Zacchi G., Nilvebrant N.O., Enzyme Microbial. Technol. 24 (3 4): 151 159 (1999). [6]. Faix O. and Bottcher J.H., Eur. J. Wood Prod. 5 (6): 221-226 (1992) [7]. Kumar R., Mago G., Balan V., Wyman C.E., Bioresour. Technol. 1: 3948 3962 (29). [8]. National Renewable Energy Laboratory (NREL). Chemical Analysis and Testing Laboratory Analytical Procedures: LAP-2 (1996), LAP-1 (1994) and LAP 17 (1998). NREL, Golden, CO, USA. [9]. Joseffson B. Methods of seawater analysis. p 34-342. Verlag Chemie GmbH. (1983). [1]. APHA, AWWA, WPCF. Standard Methods for the examination of water and wastewater. Franson MA, editors. Washington, DC: American Public Health Association (1995). [11]. Chen C.C., Lin C.Y. Acta Biotechnol. 21: 371-379 (21). [12]. Monlau, F., Barakat, Α., Steyer, J-P., Carrère, H. Bioresour. Technol. 12: 241-247 (212). [13]. Kont R., Kurašin M., Teugjas H., Valjamae P., (213). Biotechnol. Biofuels. 6: 135 [14]. Αntonopoulou G., Dimitrellow G., Vayenas D., Lyberatos G. Proceedings Venice 214, Fifth International Symposium on Energy from Biomass and Waste.